Summary
מודלים מסורתיים של שבץ פוטוטרומבוטי (PTS) גורמים בעיקר לצברי טסיות צפופים בעלי עמידות גבוהה לטיפול ליטי במפעיל פלסמינוגן רקמתי (tPA). כאן מוצג מודל PTS מורין שונה על ידי הזרקה משותפת של תרומבין וצבע רגיש לאור לצורך פוטואקטיבציה. מודל PTS משופר תרומבין מייצר קרישי טסיות מעורבים:פיברין והוא רגיש מאוד לפקקת tPA.
Abstract
מודל שבץ טרומבואמבולי אידיאלי דורש תכונות מסוימות, כולל הליכים כירורגיים פשוטים יחסית עם תמותה נמוכה, גודל אוטם עקבי ומיקום, משקעים של טסיות:פיברין קרישי דם מעורבים דומים לאלה בחולים, ורגישות נאותה לטיפול פיברינוליטי. מודל שבץ פוטוטרומבוטי מבוסס צבע ורד בנגל (RB) עונה על שתי הדרישות הראשונות, אך הוא עמיד מאוד לטיפול ליטי בתיווך tPA, ככל הנראה בשל הרכב הקריש העשיר בטסיות אך דל בפיברין. אנו סבורים כי שילוב של צבע RB (50 מ"ג/ק"ג) ומינון תת-טרומבוטי של תרומבין (80 U/kg) עבור פוטואקטיבציה המכוונת לענף הפרוקסימלי של עורק המוח האמצעי (MCA) עשוי לייצר קרישי דם מועשרים בפיברין ורגישים ל-tPA. ואכן, מודל הפוטוטרומבוזיס המשולב של טרומבין ו-RB (T+RB) גרם לקרישי דם מעורבים של טסיות דם:פיברין, כפי שמראים חיסונים ואימונובלוטים, ושמר על גדלים ומיקומים עקביים של אוטם בתוספת תמותה נמוכה. יתר על כן, הזרקה תוך ורידית של tPA (Alteplase, 10 מ"ג/ק"ג) תוך שעתיים לאחר הפוטואקטיבציה הפחיתה באופן משמעותי את גודל האוטם בפוטוטרומבוזיס T+RB. לפיכך, מודל שבץ פוטוטרומבוטי משופר טרומבין עשוי להיות מודל ניסיוני שימושי לבדיקת טיפולים טרומבוליטיים חדשניים.
Introduction
Endovascular thrombectomy ו- tPA-mediated thrombolysis הם שני הטיפולים היחידים שאושרו על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) לשבץ איסכמי חריף, אשר סובל ~ 700,000 חולים מדי שנה בארצות הברית1. מכיוון שהיישום של טרומבקטומיה מוגבל לחסימת כלי דם גדולים (LVO), בעוד tPA-thrombolysis עשוי להקל על חסימות כלי דם קטנים, שניהם טיפולים יקרי ערך של שבץ איסכמי חריף2. יתר על כן, השילוב של שני הטיפולים (למשל, התחלת tPA-thrombolysis בתוך 4.5 שעות מתחילת שבץ, ואחריו טרומבקטומיה) משפר את הרפרפוזיה ואת התוצאות התפקודיות3. לפיכך, אופטימיזציה של פקקת נותרה מטרה חשובה לחקר שבץ, גם בעידן של טרומבקטומיה.
מודלים טרומבואמבוליים הם כלי חיוני למחקר שבץ פרה-קליני שמטרתו לשפר טיפולים טרומבוליטיים. הסיבה לכך היא שמודלים מכניים של חסימת כלי דם (למשל, חסימת MCA בתפר תוך לומינלי) אינם מייצרים קרישי דם, וההתאוששות המהירה של זרימת הדם במוח לאחר הסרת החסימה המכנית היא אידיאליזציה מוגזמת 4,5. נכון להיום, מודלים טרומבואמבוליים עיקריים כוללים פוטוטרומבוזיס 6,7,8, כלוריד ברזל מקומי (FeCl3) יישום9, מיקרו-הזרקה של תרומבין לענף MCA 10,11, הזרקת אקס ויו (מיקרו)אמבולי לתוך MCA או עורק התרדמה המשותף (CCA)12,13,14, והיפוקסיה איסכמיה חולפת (tHI)15,16, 17,18. מודלים אלה של שבץ נבדלים זה מזה בהרכב ההיסטולוגי של קרישי הדם הבאים וברגישות לטיפולים ליטיים בתיווך tPA (טבלה 1). הם גם משתנים בדרישה הכירורגית של קרניוטומיה (דרושה להזרקת תרומבין באתרו וליישום מקומי של FeCl3), עקביות גודל אוטם ומיקום (למשל, עירוי CCA של מיקרואמבולי מניב תוצאות משתנות מאוד), והשפעות גלובליות על מערכת הלב וכלי הדם (למשל, tHI מגביר את קצב הלב ואת תפוקת הלב כדי לפצות על התרחבות כלי דם היקפית הנגרמת על ידי היפוקסיה).
למודל שבץ פוטוטרומבוטי מבוסס צבע RB (PTS) יש תכונות אטרקטיביות רבות, כולל הליכים כירורגיים פשוטים ללא קרניוטומיה, תמותה נמוכה (בדרך כלל < 5%), וגודל ומיקום צפויים של אוטם (בשטח אספקת MCA), אך יש לו שתי מגבלות עיקריות. 8 האזהרה הראשונה היא תגובה חלשה עד אפסית לטיפול תרומבוליטי בתיווך tPA, שהוא גם חיסרון של FeCl3 מודל 7,19,20. האזהרה השנייה של מודלים של שבץ מוחי PTS ו- FeCl3 היא שהטרומבי שנוצר כתוצאה מכך מורכב מאגרגטים צפופים של טסיות עם כמות קטנה של פיברין, אשר לא רק מובילים לעמידותו לטיפול tPA-lytic, אלא גם חורגים מהדפוס של טסיות מעורבות:תרומבי פיברין בחולי שבץ איסכמי חריף21,22. לעומת זאת, מודל המיקרו-הזרקה באתרו כולל בעיקר פיברין פולימרי ותכולה לא ודאית של טסיות10.
בהתחשב בהנמקה לעיל, שיערנו כי תערובת של RB ומינון תת-טרומבוטי של תרומבין עבור פוטואקטיבציה ממוקדת MCA באמצעות גולגולת מדוללת עשויה להגדיל את מרכיב הפיברין בטרומבי שנוצר ולהגביר את הרגישות לטיפול ליטי בתיווך tPA. איששנו השערה זו,23 וכאן אנו מתארים הליכים מפורטים של מודל שבץ פוטוטרומבוטי שונה (T+RB).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה מאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת וירג'יניה ועוקב אחר הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. איור 1A מתאר את רצף ההליכים הכירורגיים של פרוטוקול זה.
1. מערך הניתוח
- הניחו כרית חימום עם טמפרטורה של 37°C על מתאם בעלי החיים הקטנים לפחות 15 דקות לפני הניתוח. הכינו גליל אטב לאף למתאם המאפשר סיבוב ראש החיה. הכינו את חומרי ההרדמה קטמין (60 מ"ג/ק"ג)/קסילזין (10 מ"ג/ק"ג).
- לעקר את כלי הניתוח כולל מספריים, מלקחיים, מחזיקי מיקרו-מחט, המוסטטים, צמר גפן ותפרים עם autoclave (121 ° C ב 15 psi במשך 60 דקות). הכינו דבק רקמות ומשחת עיניים. הכינו את משקפת ההגנה מפני לייזר 532 ננומטר למנתחים.
הערה: פרוטוקול זה מתאר הליך ניתוח הישרדות גדול ויש לבצע אותו בטכניקות אספטיות. - הגדר את מערכת התאורה עם מקור לייזר 532 ננומטר. הכינו מקדחה דנטלית.
- הכינו את תמיסת רוז בנגל במי מלח (10 מ"ג/מ"ל). מניחים תרומבין בקר aliquot (0.1 U/μL) על דלי קרח.
- הזריקו קטופרופן (4.0 מ"ג/ק"ג) תת עורית לעכבר כמשכך כאבים 30 דקות לפני הניתוח או השתמשו במשטר משככי הכאבים המומלץ על ידי ההנחיות המוסדיות המקומיות.
2. קשירת עורק התרדמה המשותף ipsilateral
- מרדימים עכברי C57BL/6NCrl זכרים בני 10-14 שבועות במשקל 22 עד 30 גרם על ידי הזרקה תוך שרירית של קטמין (60 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג).
הערה: ההליך הכירורגי כולו, המקיף את קשירת עורק התרדמה המשותף האיפסילטרלי באמצעות ניטור זרימת הדם במוח, צפוי להימשך ~ 120 דקות. משטר ההרדמה יהיה יעיל בדרך כלל למשך כל הזמן הזה, אך יש להעריך מחדש את עומק ההרדמה לפחות כל 15 דקות. תוך כדי לימוד נהלים אלה, ייתכן שיהיה צורך במינון מחדש של ההרדמה. - בצע צביטה בבוהן כדי לוודא שבעל החיים מורדם לחלוטין. הסר את השיער על הצוואר השמאלי עבור קשירת CCA ואת הראש עבור גולגולת דילול עם קרם הסרת שיער.
- הניחו את העכבר על מתאם בעלי החיים הקטנים במצב שכיבה. לעקר את אזור הניתוח על ידי ניגוב העור עם שלוש החלקות לסירוגין של פובידון-יוד ו -70% אתנול.
- אבטחו את ראש העכבר באמצעות אוזניות. תחת מיקרוסקופ מנתח, יש לבצע חתך שמאלי-צווארי בקוטר 0.5 ס"מ באמצעות זוג מיקרו-מספריים ומלקחיים ישרים ברוחב של כ-0.2 ס"מ לקו האמצע.
- השתמשו בזוג מלקחיים משוננים עדינים כדי לפרק את הרקמה הרכה ואת הפאשיה כדי לחשוף את עורק התרדמה המשותף השמאלי (LCCA). יש להפריד בזהירות את ה-CCA השמאלי מהעצב הווגאלי באמצעות זוג מלקחיים עדינים וחלקים.
- מניחים תפר קבוע בעל קשר כפול סביב LCCA באמצעות תפר משי 5-0 חתוך למקטעים של 20 מ"מ, ולאחר מכן סוגרים את הפצע באמצעות אטבי פצע סטריליים.
3. דילול גולגולת מעל ענף MCA ופוטואקטיבציה
- הפוך את העכבר למצב נוטה על מתאם בעלי החיים הקטנים. סובבו את גליל האטב לאף ל-15°. לעקר את אזור הניתוח על ידי ניגוב העור עם שלוש החלקות לסירוגין של betadine ו 70% אתנול.
- בצעו חתך של 0.8 ס"מ בקרקפת באמצעות זוג מיקרו-מספריים ומלקחיים ישרים לאורך עין שמאל ואוזן כדי לחשוף את שריר הרקתי, שנמצא בין העין לאוזן (איור 1B).
- תחת המיקרוסקופ המנתח מבצעים חתך של 0.5 ס"מ לאורך קצה שריר הטמפורליס בעצם הקודקודית השמאלית על ידי זוג מלקחיים משוננים עדינים. בצע חתך אנכי שני של 0.3 ס"מ בשריר טמפורליס על ידי מספריים מיקרו. משכו את השריר הרקתי כדי לחשוף את קצה העצם הקודקודית ואת עצם הקשקש. הקפידו לדמיין את נקודת הציון של התפר העטרתי בין העצמות הקדמיות והקודקודיות (איור 1B,C).
- לחות הגולגולת על ידי מריחת מי מלח סטריליים כדי לחשוף את ה-MCA השמאלי. סמן את ענף MCA הפרוקסימלי על עצם הקשקש בעט טוש. ציירו בעדינות עיגול בקוטר של כ-1 מ"מ המקיף את האזור המסומן עם מקדח שיניים פנאומטי (קביעת מהירות בור ב-50% מבקר המהירות), ולאחר מכן דקלו את הגולגולת בעומק של כ-0.2 מ"מ מבלי לגעת מתחת לדורה. מפסיקים את הקידוח עד שנשארת שכבה דקה מאוד של עצם.
- ערבבו את תמיסת התרומבין (T, 0.1 U/μL, 80 U/kg) ואת תמיסת Rose bengal (RB, 10 מ"ג/מ"ל, 50 מ"ג/ק"ג) בהתבסס על משקל גוף העכבר. לדוגמה, עבור עכבר של 25 גרם משקל גוף, לערבב 20 μL של תרומבין (0.1 U / μL) ו 125 μL של RB (10 מ"ג / מ"ל).
- הזריקו באיטיות תמיסת T+RB (145 מיקרוליטר לכל 25 גרם משקל גוף) לתוך הסינוס הרטרו-אורביטלי בעזרת מזרק אינסולין (מחט #31G).
הערה: בניסויי פיילוט, שיעור התמותה של מינונים הולכים וגדלים של תרומבין מעורבב עם המינון הסטנדרטי של צבע RB (50 מ"ג / ק"ג) נבדק עבור photoactivation. התמותה הייתה 0% עבור תרומבין 80 U/kg (n=13), 43% עבור תרומבין 120 U/kg (n=7), ו-100% עבור תרומבין 160 U/kg (n = 5) ו- 200 U/kg thrombin (n = 5). לכן נבחרה מנה של 80 U/kg טרומבין לדגם זה. הדמיית חוזה כתמי לייזר שימשה גם כדי לשלול את האפשרות של קרישת דם משתוללת ליד חלל המסלול לאחר הזרקת סינוס רטרו-אורביטלית של T+RB (איור משלים 1), כמו גם שקיעת פיברין נרחבת בהמיספרה הנגדית שלא הייתה נתונה להארה בלייזר (איור משלים 2). - יש למרוח משחת עיניים על שתי העיניים למניעת יובש.
- החל את התאורה עם אור לייזר 532 ננומטר (עם אנרגיה של 0.5 mW) באתר שנקדח במרחק של 2 אינץ 'למשך 20 דקות. דמיינו את התאורה על הענף הפרוקסימלי של MCA באמצעות משקפת הגנה מפני לייזר (איור 1, C,D).
הערה: MCA עם תאורה של 532 ננומטר מראה פלואורסצנטיות אדומה מתחת למשקפת. ה-MCA הדיסטלי ייעלם לאחר הארה של 10 דקות. אין לכלול את בעל החיים אם זרימת ה-MCA הדיסטלית עדיין קיימת לאחר הארה של 20 דקות. - הפסק את תאורת הלייזר לאחר 20 דקות. סגור את הפצע עם אטבי פצע סטריליים.
4. הדמיה תוך חיונית (אופציונלית)
הערה: כדי לאפיין את היווצרות הפקקת in-vivo, השתמש בהדמיה תוך ויראלית על ידי קונפוקל דיסק ספין עם מערכת פוטואקטיבציה23.
- צור חלון גולגולתי ~ 3 מ"מ בקוטר על עצם הקודקוד של הגולגולת.
- הניחו כוסית כיסוי על חלון הגולגולת ואתרו את ה-MCA הדיסטלי (~ 50 מיקרומטר קוטר) תחת יעד טבילה במים פי 20.
- יש לתייג את טסיות הדם במחזור הדם על ידי הזרקת וריד זנב של נוגדן אנטי-GPIbβ מצומד DyLight488-(0.1 מ"ג/ק"ג) 5 דקות לפני ההדמיה.
- הזריקו את תמיסת התערובת של טרומבין (80 U/kg) ו-Rose bengal (50 מ"ג/ק"ג) על ידי רטרו-אורביטל 5 דקות לפני ההדמיה.
- צלם את ה- MCA באמצעות מערכת לייזר 561 ננומטר עם קרן לייזר בקוטר 10 מיקרומטר והקלט את התמונה עד להיווצרות פקקת.
5. ניהול tPA
- הניחו את בעל החיים המרדים על כרית חמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בנקודת הזמן שלאחר הפוטואקטיבציה שנבחרה, הרטיבו גזה עם ~ 45 מעלות צלזיוס מים חמים ועטפו אותה על הזנב למשך דקה.
- הזריקו tPA אנושי רקומביננטי (10 מ"ג/ק"ג) דרך וריד הזנב עם 50% בולוס ו-50% במשך 30 דקות על ידי משאבת עירוי.
הערה: למרות שהמינון הקליני של tPA רקומביננטי אנושי לטיפול בשבץ איסכמי חריף הוא 0.9 מ"ג/ק"ג, מינון גבוה יותר (10 מ"ג/ק"ג) משמש בדרך כלל במכרסמים כדי לפצות על תגובתיות tPA חוצת מינים מופחתת. כמו כן, עקבנו אחר הפרוטוקול הסטנדרטי של מתן tPA במודלים פרה-קליניים של שבץ, והשתמשנו ב-50% כבולוס וב-50% שהוחדרו דרך וריד הזנב במשך 30 דקות.24
6. ניטור זרימת הדם במוח (CBF)
הערה: כדי לאשר התאוששות CBF לאחר טיפול tPA, השתמש במערכת הדמיית ניגודיות לייזר דו-ממדית15 והקלט מיד לאחר פוטוטרומבוזיס (שלב 3.9) או ב -24 שעות לאחר טיפול tPA.
- מניחים בעל חיים מורדם במצב נוטה ומבצעים חתך בקו האמצע בקרקפת כשהגולגולת חשופה.
- לחות את הגולגולת עם מלוחים סטריליים בעדינות להחיל את ג'ל אולטרסאונד על הגולגולת. הימנע מכל שיער ובועה בג'ל, אשר יפריע את אות CBF.
- עקוב אחר CBF בשתי ההמיספרות המוחיות תחת תמונת ניגודיות של נקודות לייזר במשך 10 דקות.
- לאחר הקלטת תמונת CBF, סגור את הקרקפת עם דבק רקמות והחזיר את החיה לכלוב.
- נתח CBF באזורים שנבחרו וחשב את אחוז ההתאוששות CBF בהשוואה לאזור נגדי.
- לאחר מכן, החזירו את בעל החיים לכלוב חם להתאוששות. עקוב אחר העכברים במשך 5-10 דקות עד שהם מתאוששים מההרדמה. הניחו מזון רטוב בכלוב והחזירו למתקן לטיפול בבעלי חיים.
הערה: ספק משככי כאבים לאחר ניתוח כפי שהומלץ על ידי ההנחיות המוסדיות המקומיות.
7. מדידת נפח Infarct על ידי צביעת triphenyl tetrazolium chloride (TTC)
- עשרים וארבע שעות לאחר פוטוטרומבוזיס, יש להרדים את בעל החיים עמוקות בהתאם להנחיות המוסדיות המקומיות לניתוח שאינו הישרדותי.
הערה: אנו נותנים tribromoethanol (avertin) 250 מ"ג / ק"ג באמצעות הזרקה intraperitoneal (IP). - בצע זילוח transcardial עם PBS, לאסוף מוח טרי להטביע 3% ג'ל אגר.
- חתכו את פרוסת המוח בעובי 1 מ"מ על ידי ויברטום, ודגרו בתמיסת 2% TTC למשך 10 דקות.
- כמת את נפח האוטם הכולל מ-6 פרוסות מוח כנפח המוחלט על ידי תוכנת ImageJ.
הערה: בצקת במוח לא שימשה כמדידת תוצאה משתי סיבות. ראשית, כתם TTC מודד את כדאיות הרקמה (באמצעות פעילות הפחתת המיטוכונדריה) שהיא תוצאה חמורה יותר מאשר בצקת. שנית, ככל שהאוטם מתקדם, הן בצקת ואסוגנית והן בצקת ציטוטוקסית מתרחשות ולא ניתן להבחין בהן בקלות על ידי שיטות מדידת בצקת המוח הסטנדרטיות. אולם השתמשנו בתיוג אנטי-אימונוגלובין (IgG) כדי להעריך את שלמות מחסום הדם-מוח (BBB), ומצאנו אקסטרווסציה דומה של IgG לאחר 6 שעות לאחר פוטואקטיבציה הן במודלים של שבץ RB והן ב-T+RB (איור משלים 3).
8. מדידת היווצרות פקקת
הערה: כדי למדוד את היווצרות הפקקת, אסוף את המוח בשעה אחת ושעתיים לאחר פוטוטרומבוזיס למדידת פקקת ב- MCA על ידי אימונוכימיה (IHC) ולמדידת פיברין בהמיספרה של המוח על ידי אימונובלוט, בהתאמה.
- ביצוע IHC לאפיון הרכב קרישי דם. תקן את המוח עם 4% paraformaldehyde במשך הלילה ולאחר מכן לייבש את המוח עם 30% סוכרוז עבור הטבעה OCT.
- חתכו את המוח עם אוריינטציה סגיטלית בעובי 20 מיקרומטר, ובצעו את IHC עם נוגדנים ספציפיים נגד פיברינוגן, טסיות דם (גליקופרוטאין IIb), תאי דם אדומים (TER119) וכלי דם (איזולקטין GS-IB4).
- בצע את המדידה של פיברין בחצי המוח על ידי immunoblot עם נוגדן נגד פיברינוגן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ראשית, השווינו את תכולת הפיברין ב-RB לעומת קרישי דם הנגרמים על-ידי T+RB כתוצאה מפוטוטרומבוזיס. עכברים הוקרבו על ידי זילוח טרנסקרדיאלי של מקבעים בשעה 2 לאחר הפוטואקטיבציה, ומוחות הוסרו לצורך צביעה אימונופלואורסצנטית של ענף MCA במישורים אורכיים ורוחביים. בפוטוטרומבוזיס RB, ענף ה-MCA היה עמוס בצפיפות בטסיות CD41+ ומעט פיברין (איור 2A,C). לעומת זאת, ענף MCA בפוטוטרומבוזיס T+RB נחסם על-ידי קרישי טסיות מעורבבים אקראיים:פיברין (איור 2B,D, n>3 עבור כל אחד מהם). השתמשנו גם באימונובלוטים כדי להשוות את רמת הפיברין (עוגן) בקליפת המוח בין שני המודלים, לאחר זילוח טרנסקרדיאלי עם מי מלח שעתיים לאחר הפוטואקטיבציה. ניתוח זה הראה > עלייה של פי 2 בשקיעת פיברין בחצי הכדור האיפסילטרלי ב-T+RB מאשר פוטוטרומבוזיס RB (איור 2E, p=0.027 על-ידי בדיקת t לא מזווגת; n=3 עבור כל קבוצה). בדו"ח המקורי שלנו, השתמשנו גם בפוטואקטיבציה של כלי דם יחיד המבוסס על מיקרוסקופ קונפוקלי ובהדמיה תוך-חיונית כדי להשוות את ההתנהגויות של טסיות דם מצומדות נגד GP1bβ המסומנות ב-FITC. 23 הניסויים האלה הראו שהזרקה תוך-ורידית של תרומבין של 80 U/kg לא הצליחה לגרום לצברי טסיות אפילו תחת תאורת לייזר (איור 3A), ושטסיות יוצרים קרישי דם הומוגניים במודל הפוטוטרומבוזיס של RB (איור 3B), אבל אגרגטים לא אחידים עם אזורים חלשים מרובים בפוטוטרומבוזיס T+RB (איור 3C). תוצאות אלה מצביעות על כך שפוטוטרומבוזיס T+RB מגביר את תכולת הפיברין בטרומבי שלאחר מכן.
לאחר מכן, השווינו את ההשפעות של טיפול חריף ב- tPA תוך ורידי (10 מ"ג / ק"ג Alteplase, 30 דקות לאחר פוטואקטיבציה) על התאוששות זרימת הדם במוח (CBF) בין שני המודלים. ה-CBF של אותו עכבר לפני ו-24 שעות לאחר הטיפול ב-tPA-vsus-vehicle נמדד באמצעות הדמיית ניגודיות של כתמי לייזר ונורמל לחצי הכדור הנגדי (איור 4A,B). בפוטוטרומבוזיס RB, הטיפול ב-tPA הוביל למגמה של התאוששות CBF, במיוחד באזור הגבול האיסכמי, בהשוואה לעכברים שטופלו ברכב (איור 4C, רכב 51 ± 9% לעומת tPA 65 ± 7%, p=0.3 על ידי מבחן t לא מזווג, n=4 עבור כל אחד). בפוטוטרומבוזיס T+RB, ההתאוששות של CBF בעכברים שטופלו ב-tPA הייתה בולטת יותר, וענפי ה-MCA הפרוקסימליים נראו לעתים קרובות לאחר 24 שעות (איור 4D, רכב 55 ± 3% לעומת tPA 81 ± 7%, p=0.02 על-ידי מבחן t לא מזווג, n=6 עבור כל קבוצה). תוצאות אלה מצביעות על רגישות גבוהה יותר לטיפול tPA-lytic על ידי T+RB מאשר RB photothrombosis.
לבסוף, השתמשנו בכתם TTC כדי לכמת את ההשפעות של טיפול tPA על גודל אוטם במודלים של שבץ פוטוטרומבוטי RB ו- T+RB. בפוטוטרומבוזיס RB, גודל אוטם דומה זוהה בעכברים שטופלו ברכב (18 ± 2.80 מ"מ 3, n=6) ובעכברים שטופלו ב-tPA (18 ± 1.95 מ"מ3, n=10; 10 מ"ג/ק"ג tPA הוזרק 30 דקות לאחר הפוטואקטיבציה) (איור 5A). לעומת זאת, הטיפול tPA-lytic הפחית באופן משמעותי אוטם כאשר tPA הוזרק ב 0.5 שעות (7 ± 2.1 מ"מ 3, n = 9), 1 שעות (4.6 ± 1 מ"מ 3, n = 10), או 2 שעות (6.4 ± 1.5 מ"מ 3, n = 8), אך לא 6 שעות לאחר photoactivation (15.2 ± 3.1 מ"מ 3, n = 7), בהשוואה לעכברים שטופלו ברכב (14.8 ± 2 מ"מ 3, n=19) (איור 5B, ערך ה-p שנקבע על-ידי מבחן t לא מזווג). תוצאות אלה מצביעות על כך שלמודל שבץ פוטוטרומבוטי T+RB יש רגישות לטיפול tPA-lytic ב.
תרשים 1: מתווה הנהלים. (A) תרשים הזרימה של הליכים כירורגיים עיקריים במודל שבץ פוטוטרומבוטי T+RB. קשירה של עורק התרדמה המשותף איפסילטרלי (CCA) היא אופציונלית, אך מצאנו שהיא הופכת את גודל האוטם לעקבי יותר, ככל הנראה בשל ירידה במחזור הדם. (B) מבט עליון ורוחבי על מוח העכבר ביחס לגולגולת. כמו כן מצוינים העיניים, האוזן, שריר הטמפורליס, עורק המוח האמצעי (MCA) והענפים, תפר העטרה ואתר תאורת הלייזר. (C) הדמיה של ענף MCA ממוקד מתחת לגולגולת הדקה (C1) ובמהלך תאורת לייזר (C2), והפסקת זרימת הדם לאחר פוטואקטיבציה (C3). שימו לב לקשר בין ענף MCA לתפר העטרה. (D) הגדרת עכבר במהלך תאורת לייזר על ענף MCA השמאלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תכולת פיברין שונה בקרישי הדם. (א-ד) תיוג אימונופלואורסצנטי של תרומבי המושרה על ידי פוטוטרומבוזיס RB ו- T + RB בענף MCA דיסטלי במישור אורכי (A, B) או רוחבי (C, D) באמצעות אנטי פיברין (ירוק), אנטי CD41 / טסיות (אדום), ואיזולקטין B4 / תאי אנדותל (כחול). שימו לב לעלייה הניכרת של אותות חיסוניים נגד פיברין בקרישי דם הנגרמים על ידי T+RB פוטוטרומבוזיס (B, D, n=3 עבור כל קבוצה). (E) אימונובלוטינג הצביע על שקיעת פיברין גדולה יותר בקליפת המוח האיפסילטרלית ב-T+RB מאשר RB פוטוטרומבוזיס ב-2 שעות לאחר הפוטואקטיבציה (n=3 לכל אחת). האו"ם: עכברים שלא נפגעו; קונט: קליפת המוח הנגדית; Ipsi: קליפת המוח ipsilateral. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. נתון זה שונה באישור [23]. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הדמיה תוך-חיונית של תגובות טסיות הדם. הדמיה תוך-חיונית מבוססת מיקרוסקופ קונפוקלי של טסיות דם מצומדות נגד GP1bβ תחת תאורת לייזר של כלי דם יחיד (באתר המסומן על ידי חיצים לבנים). קבוצות הניסוי הן: (A) תרומבין לבד, (B) רוז בנגל לבד, ו-(C) תרומבין פלוס רוז בנגל. הזמנים שלאחר תאורת לייזר מסומנים. ראה את הסרטון באתר JoVE עבור כתב יד זה. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. נתון זה שונה באישור [23]. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: השפעות הטיפול ב-tPA על החלמת CBF. tPA אנושי רקומביננטי (Alteplase, 10 מ"ג/ק"ג) או רכב ניתן דרך וריד הזנב לעכבר מאותגר פוטוטרומבוזיס RB ו- T+RB ב- 30 דקות לאחר הארה בלייזר, וזרימת דם מוחית (CBF) לפני ו- 24 שעות לאחר הטיפול באותו עכבר הושוותה עם הדמיית ניגודיות כתמי לייזר. נמדד CBF בשטח של 3X4.8 מ"מ בשני חצאי הכדור. קבוצות הניסוי הן: (A, C) RB photothrombosis; (ב, ד) T+RB פוטוטרומבוזיס. שימו לב להתאוששות המשמעותית של CBF על ידי טיפול tPA בקבוצת הפוטוטרומבוזיס T+RB (p=0.02 על ידי מבחן t לא מזווג, n=4 לרכב ו-n=6 לטיפול ב-tPA) והדמיה תכופה של ענף MCA פרוקסימלי. בפוטוטרומבוזיס RB, הטיפול ב- tPA הוביל למגמה של CBF טוב יותר, בעיקר באזור האיסכמי ההיקפי (p=0.3 על ידי בדיקת t לא מזווגת, n = 4 לרכב ו- n = 5 לטיפול ב- tPA). חיצים לבנים מציינים את האתר של MCA-photoactivation. נתון זה שונה באישור [23]. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: השפעות הטיפול ב-tPA על גודל האוטם. (A) טיפול תוך ורידי ב-tPA (Alteplase, 10 מ"ג/ק"ג) לאחר שפוטוטרומבוזיס RB לא הצליח להקטין את גודל האוטם (n=6 ברכב שטופל ו-n=10 בעכברים שטופלו ב-tPA). (B) לעומת זאת, בפוטוטרומבוזיס T+RB, טיפול תוך ורידי של 10 מ"ג/ק"ג ב-Alteplase ב-0.5, 1 או 2 שעות, אך לא ב-6 שעות לאחר הפוטואקטיבציה הוביל להפחתה משמעותית בגודל האוטם. ערך ה-p נקבע על ידי ANOVA חד-כיווני עם מבחן ההשוואות המרובות של Tukey. נתון זה שונה באישור [23]. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| מודל | הליך כירורגי | קרישי דם | טסיות | פיברין | תגובתיות tPA | תכונות עיקריות / השירות | הפניות מרכזיות |
| MCAO תפר תוך לומינלי | חסימת MCA אנדוסקולרית | לא | לא ישים | לא ישים | לא | זילוח מהיר; מחקר נוירופרקציה; פציעת BBB כתוצאה מ-tPA | Longa et al. 1989 (Ref #5) |
| פוטוטרומבוזיס | דילול גולגולת ופוטואקטיבציה | כן | חלש | יכולת שחזור גבוהה; תמותה נמוכה | ווטסון ואחרים 1985 (Ref #6) | ||
| טרומבין-פוטוטרומבוזיס | UCCAO, דילול גולגולת ופוטואקטיבציה | כן | כן | יכולת שחזור גבוהה; תמותה נמוכה | Sun et al. 2020 (Ref #23) | ||
| FeCl3 (על MCA) | דילול גולגולת והפעלה כימית | כן | לא | יכולת שחזור גבוהה; תמותה נמוכה | Karatas et al. 2011 (Ref #69) | ||
| הזרקת תרומבין באתרו | קרניוטומיה ומיקרו-הזרקת MCA | כן | כן | יכולת שחזור גבוהה; תמותה נמוכה; טיפול tPA-lytic | Orset et al. 2007 (Ref #10) | ||
| אמבולי-מקאו | חסימת MCA אנדוסקולרית | כן | כן | טיפול tPA-lytic; קשיות קריש משתנה | בוש ואחרים 1997 (Ref #13) | ||
| היפוקסיה חולפת איסכמיה (tHI) | UCCAO פלוס היפוקסיה | כן | כן | Infarct > אזור MCA; השפעות מערכתיות של קורות חיים | Sun et al. 2014 (Ref #15) |
טבלה 1: השוואה בין מודלים נבחרים של שבץ מוחי פרה-קליני. קופסאות מלאות מצביעות על חיוביות (נוכחות של קרישי דם, טסיות דם ופיברין) או תגובתיות משמעותית של tPA.
איור משלים 1: צג CBF לאחר הזרקה רטרו-מסלולית של טרומבין. (A) התמונות המייצגות של סינוס רטרו-אורביטלי (פאנל עליון) וזרימת דם על ידי הדמיית ניגודיות כתמי לייזר (פאנל תחתון). שלושת אתרי כלי הדם (1~3 כפי שסומן) נוטרו לאחר הזרקת טרומבין (80 U / kg) לתוך הסינוס רטרו-אורביטלי. (B) גרף המעקב המייצג של זרימת הדם במשך 15 דקות לאחר הזרקת טרומבין (חץ). (C) הכימות מבוסס כתמי הלייזר לא הראה ירידה בזרימת הדם ליד הסינוס הרטרו-אורביטלי תוך 15 דקות לאחר הזרקת טרומבין (n=4, ערך p שנקבע על ידי מבחן t לא מזווג). אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.
איור משלים 2: חוסר שקיעת פיברין בהמיספרה הנגדית ב-6 שעות לאחר הפוטואקטיבציה. צביעה חיסונית של האנטי-פיברינוגן (ירוק) הראתה שקיעת פיברין בקליפת המוח האיפסילטרלית לאחר 6 שעות לאחר פוטוטרומבוזה של RB ו-T+RB. לעומת זאת, לא נמצאה שקיעת פיברין ניכרת בקליפת המוח הנגדית בעקבות פוטוטרומבוזה משופרת תרובין. N=4 לכל קבוצה. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. פלואורסצנטיות כצבע גרעין DAPI. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.
איור משלים 3: חוסר אקסטרווציה של אימונוגלובולין (IgG) לאחר פוטוטרומבוזיס. לאחר 6 שעות לאחר פוטואקטיבציה חד-צדדית ממוקדת MCA, אימונוסטיין הראה אקסטרווסציה של IgG בחצי הכדור האיפסילטרלי, אך לא בהמיספרה הנגדית, מה שמרמז על נזק מוגבל ל-BBB לאחר פוטוטרומבוזה משופרת על ידי טרומבין. N=4 עבור כל אחד. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שבץ פוטוטרומבוטי RB מסורתי, שהוצג בשנת 1985, הוא מודל אטרקטיבי של איסכמיה מוחית מוקדית עבור הליכים כירורגיים פשוטים, תמותה נמוכה, ושחזור גבוה של אוטם מוחי. 5 במודל זה, הצבע הפוטודינמי RB מפעיל במהירות טסיות דם עם עירור אור, מה שמוביל לצברים צפופים החוסמים את כלי הדם 5,8,23. עם זאת, הכמות הקטנה של פיברין בקרישי דם הנגרמים על ידי RB (איור 2) חורגת מהדפוס הדומיננטי של טסיות הדם: תבנית מעורבת של פיברין של תרומבי שאוחזרה בחריפות בחולי שבץ איסכמי21,22. תכולת הפיברין הנמוכה בטרומבי המושרה על ידי RB תורמת ככל הנראה גם לעמידותו לטיפול tPA-lytic 7,8,19. למרות הקרנת לייזר אולטרה סגול גורם recanalization כלי הדם ב RB photothrombosis, טיפול ניסיוני זה לא סביר לשמש קלינית7. לפיכך, שבץ פוטוטרומבוטי RB מסורתי שימש בעיקר כמודל חסימה קבוע, פחות מתאים למחקר פקקת והגנה עצבית (האחרון משתמש לעתים קרובות במודל MCAO תפר תוך לומינלי הכולל זילוח כלי דם מהיר עם הסרת החסימה המכנית).
שיערנו כי שימוש בתערובת של RB ומינון תת-טרומבוטי של תרומבין עבור פוטואקטיבציה עשוי להגדיל את תכולת הפיברין בתרומבי שלאחר מכן ולשפר את התגובות לטרומבוליזה tPA, הטיפול בשבץ בעולם האמיתי. השערה זו נתמכת בתוצאות שהוצגו כאן ובדו"ח המקורי שלנו. 23 מודל שבץ פוטוטרומבוטי משופר טרומבין שומר גם על היתרונות של תמותה נמוכה, הליכים כירורגיים פשוטים ועקביות גבוהה בגודל אוטם ובמיקום, כמו במודל הפוטוטרומבוזיס RB המסורתי. לפיכך, אנו מאמינים כי פוטוטרומבוזיס משופר תרומבין הוא תוספת רבת ערך לרפרטואר של מודלים שבץ טרומבואמבולי (טבלה 1). שני פרטים פרוצדורליים של מודל הפוטוטרומבוזיס המשופר בטרומבין מצדיקים דיון. ראשית, מנת יתר של תרומבין תוך ורידי עלולה לעורר טרומבואמבוליזם ריאתי חריף ותמותת בעלי חיים25. בחנו מגוון מינונים של טרומבין בשילוב עם פוטוטרומבוזיס RB, והמינון שנבחר של 80 U/kg לא גרם לתמותה ב->100 עכברים זכרים בוגרים C57Bl/6 שנבדקו עד כה. סביר להניח כי מינון תרומבין צריך התאמה עבור עכברים עם hypercoagulation מדינות26. שנית, קישרנו באופן שגרתי את ה- CCA האיפסילטרלי מלבד פוטוטרומבוזיס ממוקד MCA בהליכים שלנו. מצאנו כי קשירה של CCA ipsilateral מגבירה עוד יותר את העקביות בגודל האוטם, אשר עשוי להיות בשל ירידה במחזור הדם הבטחוני בין MCA לבין עורקי המוח הקדמיים והאחוריים.
עם המאפיינים הייחודיים שלו, מודל שבץ פוטוטרומבוטי משופר טרומבין עשוי להיות שימושי במיוחד עבור לפחות שלושה נושאי מחקר. ראשית, מודל חדש זה מתאים באופן אידיאלי להשוואה ראש בראש של tPA וחומרים פיברינוליטיים אחרים כגון Tenecteplase (TNKase)27. TNKase הוא וריאנט מוטנטי tPA מהונדס עם ספציפיות מוגברת של פיברין וסיכון נמוך יותר לדימום יאטרוגני בניסויי ex vivo. עם זאת, עליונותו על tPA נבדקה רק במודל שבץ מיקרו-תסחיף ובאמצעות ניתוח תוצאות נוירולוגיות בינאריות14. בהתחשב ביכולת השחזור הגבוהה שלו ובניתוח גודל אוטם כמותי, ניתן להשתמש במודל שבץ פוטוטרומבוטי משופר טרומבין כדי להשוות את היתרונות וההשפעות השליליות של tPA-לעומת TNKase בהיבטים רבים (למשל, תגובות מינון, חלון טיפולי, השפעות תחלואה נלווית ותופעות לוואי פוטנציאליות בטיפול מאוחר). שנית, מודל הפוטוטרומבוזיס המשופר על ידי טרומבין עשוי להיות שימושי לחקר ההשפעות של טיפול משולב tPA ואנטי טסיות בשבץ איסכמי חריף28. ההתקדמות האחרונה של הליכים אנדו-וסקולריים בשבץ איסכמי אפשרה לחוקרים לנתח את ההרכב ההיסטולוגי של תרומבי חריף וזיהו דומיננטי, טסיות מעורבות:תבנית פיברין21,22. בהתאם לכך, השילוב של סוכן פיברינוליטי (tPA) ותרופות נוגדות טסיות עשוי להגביר את היעילות הכוללת של פקקת, אך מודל שבץ המדמה את הרכב טסיות הדם הקליניות:פיברין של פקקת הוא חיוני למחקר כזה. יחד עם מודלים tHI ו emboli-MCAO, טרומבין-פוטוטרומבוזיס עונה על דרישה זו ובולט בתמותה נמוכה, הליכים כירורגיים פשוטים, והיעדר השפעות קרדיווסקולריות מערכתיות (טבלה 1).
אחרון חביב, פוטוטרומבוזיס משופר תרומבין עשוי להיות שימושי במיוחד לחקר זרימת בטחונות הנגרמת על ידי שבץ, בהתחשב במיקום הצפוי של אוטם פרי-אוטם בשטח אספקת MCA. על ידי שמירה על הפנומברה כדי לקזז את צמיחת האוטם, זרימת הדם הבטחונית מוכרת יותר ויותר כמנבא חשוב לתוצאות שבץ איסכמי, מכיוון שחסימת כלי דם חריפה מקדמת את זרימת הדם על פני רשת בטחונות, ואחריה שיפוץ ואנגיוגנזה ליצירת כלי דם ניאו-בטחונים 29,30. התוצאות מצביעות על כך ש-tPA לא רק מקדם תיעול מחדש של ה-MCA הפרוקסימלי, אלא גם מגדיל את זרימת הבטחונות בפריפריה של האזור המספק MCA (איור 4). הבנה טובה יותר של המנגנונים המווסתים את הפלסטיות של מחזור הבטחונות עשויה להציע טיפולים חדשניים. מכיוון שמודל שבץ פוטוטרומבוטי משופר טרומבין מציע את היתרון של אזור פרי-אוטם צפוי ורגישות לטיפול ליטי, הוא יסייע במחקר של מחזור בטחונות לאחר שבץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי ה-NIH (NS108763, NS100419, NS095064 ו-HD080429 ל-C.Y. K. ו-NS106592 ל-Y.Y.S).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | infarct |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 543nm laser beam | Melles Griot | 25-LGP-193-249 | photothrombosis |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~14 weeks old (22~30 g) |
| Anesthesia bar for mouse adaptor | machine shop, UVA | surgical setup | |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Dental drill | Dentamerica | Rotex 782 | surgical setup |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | brain imaging |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| infusion pump | KD Scientific | 200 | thrombolytic treatment |
| Insulin syringe with 31G needle | BD | 328291 | photothrombosis |
| Ketamine | CCM, UVA | anesthesia | |
| Laser protective google 532nm | Thorlabs | LG3 | photothrombosis |
| Ketoprofen | CCM, UVA | NSAID analgesia | |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mouse adaptor | RWD | 68014 | surgical setup |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| Retractor tips | Kent Scientific | Surgi-5014-2 | surgical setup |
| Rose Bengal | Sigma | 198250 | photothrombosis |
| Thrombin | Sigma | T7513 | photothrombosis |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| tPA | Genetech | Cathflo activase 2mg | thrombolytic treatment |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | TTC infacrt |
| Xylazine | CCM, UVA | anesthesia |
References
- Lyden, P. D. Thrombolytic Therapy for Acute Stroke. 3/e. , Springer. (2015).
- Linfante, I., Cipolla, M. J. Improving reperfusion therapies in the era of mechanical thrombectomy. Translational Stroke Research. 7 (4), 294-302 (2016).
- Campbell, B. C., et al. Endovascular Therapy for Ischemic stroke with perfusion-imaging selection. The New England Journal of Medicine. 372 (11), 1009-1018 (2015).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (7), 1310-1316 (2012).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
- Watson, B. D., Prado, R., Veloso, A., Brunschwig, J. P., Dietrich, W. D. Cerebral blood flow restoration and reperfusion injury after ultraviolet laser-facilitated middle cerebral artery recanalization in rat thrombotic stroke. Stroke. 33 (2), 428-434 (2002).
- Uzdensky, A. B. Photothrombotic stroke as a model of ischemic stroke. Translational Stroke Research. 9 (5), 437-451 (2018).
- Karatas, H., et al. Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (3), 1452-1460 (2011).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Orset, C., et al. Efficacy of Alteplase in a mouse model of acute ischemic stroke: A retrospective pooled analysis. Stroke. 47 (5), 1312-1318 (2016).
- Kudo, M., Aoyama, A., Ichimori, S., Fukunaga, N. An animal model of cerebral infarction. Homologous blood clot emboli in rats. Stroke. 13 (4), 505-508 (1982).
- Busch, E., Kruger, K., Hossmann, K. A. Improved model of thromboembolic stroke and rt-PA induced reperfusion in the rat. Brain Research. 778 (1), 16-24 (1997).
- Lapchak, P. A., Araujo, D. M., Zivin, J. A. Comparison of Tenecteplase with Alteplase on clinical rating scores following small clot embolic strokes in rabbits. Experimental Neurology. 185 (1), 154-159 (2004).
- Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-Edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9 (6), 98807 (2014).
- Sun, Y. Y., et al. Prophylactic Edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: Implications for perioperative neuroprotection. Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).
- Sun, Y. Y., et al. Sickle mice are sensitive to hypoxia/ischemia-induced stroke but respond to tissue-type plasminogen activator treatment. Stroke. 48 (12), 3347-3355 (2017).
- Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. A thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxia-ischemia. Journal of Visualized Experiments. (102), e52978 (2015).
- Pena-Martinez, C., et al. Pharmacological modulation of neutrophil extracellular traps reverses thrombotic stroke tPA (tissue-type plasminogen activator) resistance. Stroke. 50 (11), 3228-3237 (2019).
- Denorme, F., et al. ADAMTS13-mediated thrombolysis of t-PA-resistant occlusions in ischemic stroke in mice. Blood. 127 (19), 2337-2345 (2016).
- Marder, V. J., et al. Analysis of thrombi retrieved from cerebral arteries of patients with acute ischemic stroke. Stroke. 37 (8), 2086-2093 (2006).
- Bacigaluppi, M., Semerano, A., Gullotta, G. S., Strambo, D. Insights from thrombi retrieved in stroke due to large vessel occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (8), 1433-1451 (2019).
- Sun, Y. Y., et al. A murine photothrombotic stroke model with an increased fibrin content and improved responses to tPA-lytic treatment. Blood Advances. 4 (7), 1222-1231 (2020).
- Su, E. J., et al. Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke. Nature Medicine. 14 (7), 731-737 (2008).
- Gupta, A. K., et al. Protective effects of gelsolin in acute pulmonary thromboembolism and thrombosis in the carotid artery of mice. PLoS One. 14 (4), 0215717 (2019).
- Carroll, B. J., Piazza, G. Hypercoagulable states in arterial and venous thrombosis: When, how, and who to test. Vascular Medicine. 23 (4), 388-399 (2018).
- Coutts, S. B., Berge, E., Campbell, B. C., Muir, K. W., Parsons, M. W. Tenecteplase for the treatment of acute ischemic stroke: A review of completed and ongoing randomized controlled trials. International Journal of Stroke. 13 (9), 885-892 (2018).
- McFadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. Current and future antiplatelet therapies: emphasis on preserving haemostasis. Nature Reviews Cardiology. 15 (3), 181-191 (2018).
- Bang, O. Y., Goyal, M., Liebeskind, D. S. Collateral crculation in ischemic stroke: Assessment tools and therapeutic strategies. Stroke. 46 (11), 3302-3309 (2015).
- Faber, J. E., Chilian, W. M., Deindl, E., van Royen, N., Simons, M. A brief etymology of the collateral circulation. Arteriosclerosis, Thrombsis, Vascular Biology. 34 (9), 1854-1859 (2014).
