Summary
Traditionelle fototrombotiske slagtilfælde (PTS) modeller inducerer hovedsageligt tætte blodpladeaggregater med en høj modstandsdygtighed over for vævsplasminogenaktivator (tPA)-lytisk behandling. Her introduceres en modificeret murin PTS-model ved samtidig injektion af thrombin og lysfølsomt farvestof til fotoaktivering. Den trombinforstærkede PTS-model producerer blandede blodplader: fibrinpropper og er meget følsom over for tPA-trombolyse.
Abstract
En ideel tromboembolisk slagtilfældemodel kræver visse egenskaber, herunder relativt enkle kirurgiske procedurer med lav dødelighed, en konsekvent infarktstørrelse og placering, udfældning af blodplader:fibrin blandede blodpropper svarende til dem hos patienter og en tilstrækkelig følsomhed over for fibrinolytisk behandling. Den rosenbengalske (RB) farvestofbaserede fototrombotiske slagtilfældemodel opfylder de to første krav, men er meget ildfast over for tPA-medieret lytisk behandling, formodentlig på grund af dens blodpladerige, men fibrinfattige koagulationssammensætning. Vi ræsonnerer, at kombinationen af RB-farvestof (50 mg / kg) og en subtrombotisk dosis thrombin (80 E / kg) til fotoaktivering rettet mod den proksimale gren af den midterste cerebrale arterie (MCA) kan producere fibrinberigede og tPA-følsomme blodpropper. Faktisk udløste trombin- og RB (T + RB) -kombineret fototrombosemodel blandet blodplade: fibrinblodpropper, som vist ved immunfarvning og immunoblots, og opretholdt konsistente infarktstørrelser og placeringer plus lav dødelighed. Desuden reducerede intravenøs injektion af tPA (Alteplase, 10 mg/kg) inden for 2 timer efter fotoaktivering signifikant infarktstørrelsen ved T+RB-fototrombose. Således kan den trombinforstærkede fototrombotiske slagtilfældemodel være en nyttig eksperimentel model til test af nye trombolytiske terapier.
Introduction
Endovaskulær trombektomi og tPA-medieret trombolyse er de eneste to amerikanske Food and Drug Administration (FDA) -godkendte terapier af akut iskæmisk slagtilfælde, der rammer ~ 700.000 patienter årligt i USA1. Fordi anvendelsen af trombektomi er begrænset til stor karokklusion (LVO), mens tPA-trombolyse kan lindre små karokklusioner, er begge værdifulde terapier af akut iskæmisk slagtilfælde2. Desuden forbedrer kombinationen af begge terapier (f.eks. initiering af tPA-trombolyse inden for 4,5 timer efter slagtilfælde efterfulgt af trombektomi) reperfusion og de funktionelle resultater3. Således forbliver optimering af trombolyse et vigtigt mål for slagtilfældeforskning, selv i trombektomiens æra.
Tromboemboliske modeller er et vigtigt redskab til præklinisk slagtilfældeforskning, der sigter mod at forbedre trombolytiske terapier. Dette skyldes, at mekaniske vaskulære okklusionsmodeller (f.eks. intraluminal sutur MCA-okklusion) ikke producerer blodpropper, og dens hurtige genopretning af cerebral blodgennemstrømning efter fjernelse af mekanisk okklusion er alt for idealiseret 4,5. Til dato omfatter større tromboemboliske modeller fototrombose 6,7,8, topisk jernchlorid (FeCl3) applikation9, mikroinjektion af thrombin i MCA-grenen 10,11, injektion af ex vivo (mikro)emboli i MCA eller almindelig carotisarterie (CCA)12,13,14 og forbigående hypoxi-iskæmi (tHI)15,16, 17,18. Disse slagtilfældemodeller adskiller sig i den histologiske sammensætning af efterfølgende blodpropper og følsomheden over for tPA-medierede lytiske terapier (tabel 1). De varierer også i det kirurgiske krav til kraniotomi (nødvendigt for in situ trombininjektion og topisk anvendelse afFeCl3), konsistensen af infarkts størrelse og placering (f.eks. CCA-infusion af mikroemboli giver meget variable resultater) og globale virkninger på det kardiovaskulære system (f.eks. øger tHI hjertefrekvensen og hjerteudgangen for at kompensere for hypoxi-induceret perifer vasodilatation).
RB-farvestofbaseret fototrombotisk slagtilfælde (PTS) -modellen har mange attraktive funktioner, herunder enkle kraniotomifrie kirurgiske procedurer, lav dødelighed (typisk < 5%) og en forudsigelig størrelse og placering af infarkt (i MCA-forsyningsområdet), men den har to store begrænsninger. 8 Den første advarsel er svag til nul respons på tPA-medieret trombolytisk behandling, hvilket også er en ulempe ved FeCl3-model 7,19,20. Den anden advarsel ved PTS- og FeCl 3-taktsmodeller er, at den efterfølgende trombi består af tætpakkede blodpladeaggregater med en lille mængde fibrin, hvilket ikke kun fører til dets modstandsdygtighed over for tPA-lytisk terapi, men også afviger fra mønsteret af blandet blodplade: fibrintrombi hos patienter med akut iskæmisk slagtilfælde 21,22. I modsætning hertil omfatter in situ thrombin-mikroinjektionsmodellen hovedsageligt polymeriseret fibrin og et usikkert indhold af blodplader10.
På baggrund af ovenstående ræsonnement antog vi, at blanding af RB og en subtrombotisk dosis thrombin til MCA-målrettet fotoaktivering gennem fortyndet kranium kan øge fibrinkomponenten i den resulterende trombi og øge følsomheden over for tPA-medieret lytisk behandling. Vi har bekræftet denne hypotese,23 og heri beskriver vi detaljerede procedurer for den modificerede (T+RB) fototrombotiske slagtilfældemodel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol er godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Virginia og følger National Institutes of Health Guideline for Care and Use of Laboratory Animals. Figur 1A skitserer sekvensen af kirurgiske procedurer i denne protokol.
1. Opsætning af kirurgi
- Anbring en varmepude med temperaturindstilling på 37 °C på smådyrsadapteren mindst 15 minutter før operationen. Forbered en næseklemmerulle til adapteren, som tillader dyrets hovedrotation. Forbered bedøvelsesmidlerne Ketamin (60 mg / kg) / Xylazin (10 mg / kg).
- Steriliser de kirurgiske værktøjer, herunder saks, tang, mikronåleholdere, hæmostater, vatpinde og suturer med autoklave (121 °C ved 15 psi i 60 min). Forbered vævslim og øjensalve. Forbered 532 nm laserbeskyttelsesbriller til kirurger.
BEMÆRK: Denne protokol beskriver en større overlevelseskirurgisk procedure og bør udføres ved hjælp af aseptiske teknikker. - Opsæt belysningssystemet med en 532 nm laserkilde. Forbered en tandboremaskine.
- Forbered Rose Bengal-opløsningen i saltvand (10 mg / ml). En alikvot bovin thrombin (0,1 E/μL) anbringes på isspanden.
- Injicer ketoprofen (4,0 mg/kg) subkutant på musen som analgesi 30 minutter før operationen, eller brug det smertestillende regime, der anbefales af de lokale institutionelle retningslinjer.
2. Ligering af den ipsilaterale fælles halspulsåre
- Bedøv 10-14 uger gamle C57BL/6NCrl-hanmus, der vejer 22 til 30 g, ved intramuskulær injektion af ketamin (60 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg).
BEMÆRK: Hele den kirurgiske procedure, der omfatter ligering af den ipsilaterale fælles halspulsåre gennem overvågning af cerebral blodgennemstrømning, forventes at tage ~ 120 min. Anæstesiregimet vil typisk være effektivt i hele denne varighed, men bedøvelsesdybden skal revurderes mindst hvert 15. minut. Mens du lærer disse procedurer, kan det være nødvendigt at dosere anæstesien igen. - Udfør en tåklemme for at sikre, at dyret er fuldt bedøvet. Fjern hårene på venstre hals for CCA-ligering og hovedet for kranieudtynding med hårfjerningscremen.
- Placer musen på adapteren til små dyr i liggende stilling. Steriliser det kirurgiske område ved at tørre huden af med tre skiftevis swipes af povidon-jod og 70% ethanol.
- Fastgør musehovedet ved hjælp af ørestænger. Under et dissekerende mikroskop laves et 0,5 cm venstre cervikal snit ved hjælp af et par mikrosaks og lige tang på ca. 0,2 cm lateralt til midterlinjen.
- Brug et par fine takkede tang til at trække blødt væv og fascia fra hinanden for at udsætte den venstre fælles halspulsåre (LCCA). Adskil forsigtigt venstre CCA fra vagusnerven ved hjælp af et par fine glatte tang.
- Placer en permanent dobbeltknudesutur omkring LCCA ved hjælp af 5-0 silkesutur skåret i 20 mm segmenter, og luk derefter såret ved hjælp af sterile sårklip.
3. Udtynding af kraniet over MCA-grenen og fotoaktivering
- Vend musen til en udsat position på adapteren til små dyr. Drej næseklemmerullen i 15°. Steriliser det kirurgiske område ved at tørre huden af med tre skiftevis swipes af betadin og 70% ethanol.
- Lav et 0,8 cm snit i hovedbunden ved hjælp af en mikrosaks og lige tang langs venstre øje og øre for at udsætte temporalismusklen, som er placeret mellem øjet og øret (figur 1B).
- Under dissekeringsmikroskopet laves et 0,5 cm snit langs kanten af temporalis muskel på venstre parietalben med et par fine serrated tang. Lav et andet 0,3 cm lodret snit på temporalis muskel med en mikrosaks. Træk den temporale muskel tilbage for at udsætte kanten af parietalben og pladebenet. Sørg for at visualisere landemærket for koronal sutur mellem frontal- og parietalbenene (figur 1B, C).
- Fugt kraniet ved at anvende sterilt saltvand for at afsløre den venstre MCA. Marker den proksimale MCA-gren på pladebenet med en markørpen. Tegn forsigtigt en cirkel i ca. 1 mm i diameter, der omgiver det markerede område med det pneumatiske tandbor (grathastighedsindstilling ved 50% af hastighedsregulatoren), og tynd derefter kraniet ca. 0,2 mm i dybden uden at røre ved underenden af duraen. Stop boringen, indtil der er et meget tyndt lag knogle tilbage.
- Trombinopløsningen (T, 0,1 E/μL, 80 E/kg) og rosenbengalopløsningen (RB, 10 mg/ml, 50 mg/kg) blandes baseret på musens kropsvægt. For eksempel blandes 20 μL thrombin (0,1 E / μL) og 125 μL RB (10 mg / ml til en mus med 25 g legemsvægt).
- Injicer langsomt T+RB-opløsningen (145 μL pr. 25 g legemsvægt) i den retroorbitale sinus med en insulinsprøjte (#31G kanyle).
BEMÆRK: I pilotforsøg blev dødeligheden af stigende doser thrombin blandet med standarddosis af RB-farvestof (50 mg/kg) undersøgt for fotoaktivering. Mortaliteten var 0 % for 80 E/kg thrombin (n=13), 43 % for 120 E/kg thrombin (n=7) og 100 % for både 160 E/kg (n=5) og 200 E/kg thrombin (n=5). Der blev derfor valgt en dosis på 80 E/kg thrombin til denne model. Laser speckle kontrakt billeddannelse blev også brugt til at udelukke muligheden for voldsom blodkoagulation nær orbitalhulen efter retro-orbital sinusinjektion af T + RB (supplerende figur 1) samt udbredt fibrinaflejring i den kontralaterale halvkugle, der ikke blev udsat for laserbelysning (supplerende figur 2). - Påfør øjensalve på begge øjne for at forhindre tørhed.
- Anvend belysningen med et 532 nm laserlys (med 0,5 mW energi) på det borede sted med 2 tommers afstand i 20 minutter. Visualiser belysningen på den proksimale gren af MCA gennem en laserbeskyttelsesbrille (figur 1C, D).
BEMÆRK: MCA med 532 nm belysning viser rød fluorescens under brillen. Den distale MCA forsvinder efter 10 minutters belysning. Dyret udelukkes, hvis det distale MCA-flow stadig er til stede efter 20 minutters belysning. - Stop laserbelysningen efter 20 min. Luk såret med sterile sårklip.
4. Intravital billeddannelse (valgfrit)
BEMÆRK: For at karakterisere trombosedannelsen in vivo skal du bruge intraviral billeddannelse ved hjælp af en spin-disk konfokal med fotoaktiveringssystem23.
- Lav et kranievindue ~ 3 mm i diameter på parietalbenet af kraniet.
- Placer et dækglas på kranievinduet, og find den distale MCA (~ 50 μm i diameter) under et 20x vandnedsænkningsmål.
- Mærk den cirkulerende blodplade ved haleveneinjektion af DyLight488-konjugeret anti-GPIbβ-antistof (0,1 mg/kg) 5 minutter før billeddannelse.
- Blandingsopløsningen af thrombin (80 E/kg) og rosenbengal (50 mg/kg) injiceres i retroorbital 5 minutter før billeddannelse.
- Fotoaktiver MCA ved hjælp af et 561 nm lasersystem med laserstråle 10 μm i diameter, og optag billedet indtil trombosedannelsen.
5. Administration af TPA
- Anbring det bedøvede dyr på en 37 °C varm pude. På det valgte tidspunkt efter fotoaktivering vådes en gaze med ~45 °C varmt vand og vikles ind på halen i 1 min.
- Injicer rekombinant humant tPA (10 mg/kg) gennem halevenen med en 50 % bolus og 50 % over 30 minutter ved infusionspumpe.
BEMÆRK: Selvom den kliniske dosis af rekombinant human tPA til akut iskæmisk slagtilfældebehandling er 0,9 mg / kg, anvendes en højere dosis (10 mg / kg) almindeligvis hos gnavere for at kompensere for reduceret tPA-reaktivitet på tværs af arter. Vi fulgte også standardprotokollen for tPA-administration i prækliniske apopleksimodeller ved hjælp af 50% som bolus og 50% infunderet gennem halevenen over 30 min.24
6. Overvågning af cerebral blodgennemstrømning (CBF)
BEMÆRK: For at bekræfte CBF-genopretning efter tPA-behandling skal du bruge et todimensionelt laserpletkontrastbilleddannelsessystem15 og optage umiddelbart efter fototrombose (trin 3.9) eller 24 timer efter tPA-behandling.
- Placer bedøvet dyr i den udsatte position og lav et midterlinjesnit i hovedbunden med kraniet udsat.
- Fugt kraniet med sterilt saltvand og påfør forsigtigt ultralydgelen på kraniet. Undgå hår og bobler i gelen, som vil forstyrre CBF-signalet.
- Overvåg CBF i begge hjernehalvdele under laser speckle kontrastkamera i 10 min.
- Efter optagelse af CBF-billedet skal du lukke hovedbunden med vævslim og returnere dyret til buret.
- Analyser CBF i de valgte regioner og beregn CBF-genopretningsprocenten sammenlignet med kontralateral region.
- Placer derefter dyret tilbage til et varmt bur til genopretning. Overvåg musene i 5-10 minutter, indtil de kommer sig efter anæstesi. Placer fugtet mad i buret og returner det til dyreplejeanlægget.
BEMÆRK: Giv post-op analgesi som anbefalet af de lokale institutionelle retningslinjer.
7. Måling af infarktvolumen ved farvning af triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)
- Fireogtyve timer efter fototrombose bedøves dyret dybt i henhold til de lokale institutionelle retningslinjer for ikke-overlevelseskirurgi.
BEMÆRK: Vi administrerer tribromethanol (avertin) 250 mg/kg via intraperitoneal (IP) injektion. - Udfør transkardial perfusion med PBS, saml frisk hjerne og indlejr i 3% agargel.
- Skær hjerneskiven med 1 mm tykkelse ved vibratom, og inkuber i 2% TTC-opløsning i 10 min.
- Kvantificer det samlede infarktvolumen fra 6 hjerneskiver som det absolutte volumen af ImageJ-software.
BEMÆRK: Hjerneødem blev ikke brugt som resultatmåling af to grunde. For det første måler TTC-pletten vævets levedygtighed (via mitokondriereduktionsaktiviteten), hvilket er en mere alvorlig konsekvens end ødem. For det andet, efterhånden som infarkt skrider frem, forekommer både vasogent og cytotoksisk ødem og kan ikke let skelnes ved standard hjerneødemmålemetoder. Vi har imidlertid brugt anti-immunoglobin (IgG) mærkning til at vurdere integriteten af blod-hjerne-barrieren (BBB) og fundet sammenlignelig IgG-ekstravasation 6 timer efter fotoaktivering i både RB og T + RB slagtilfælde modeller (supplerende figur 3).
8. Måling af trombosedannelse
BEMÆRK: For at måle trombosedannelsen indsamles hjernen 1 time og 2 timer efter fototrombose til trombosemåling i MCA ved immunkemi (IHC) og til fibrinmåling i hjernehalvkuglen ved immunblot.
- Udfør IHC til karakterisering af koagulationssammensætning. Fix hjernen med 4% paraformaldehyd natten over og dehydrer derefter hjernen med 30% saccharose til OCT-indlejring.
- Sektion hjernen med sagittal orientering i 20 μm tykkelse, og udfør IHC med specifikke antistoffer mod fibrinogen, blodplade (glycoprotein IIb), røde blodlegemer (TER119) og blodkar (isolectin GS-IB4).
- Udfør måling af fibrin i hjernehalvkuglen ved immunoblot med et antistof mod fibrinogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Først sammenlignede vi fibrinindholdet i RB versus T + RB fototrombose-inducerede blodpropper. Mus blev ofret ved transkardial perfusion af fikseringsmidler 2 timer efter fotoaktivering, og hjerner blev fjernet til immunofluorescensfarvning af MCA-grenen i langsgående og tværgående planer. I RB-fototrombose var MCA-grenen tæt pakket med CD41+ blodplader og lidt fibrin (figur 2A,C). I modsætning hertil blev MCA-grenen i T + RB-fototrombose okkluderet af tilfældigt blandede blodplader: fibrinpropper (figur 2B, D, n>3 for hver). Vi brugte også immunoblots til at sammenligne fibrin(ogen) niveauet i hjernebarken mellem de to modeller efter transkardieperfusion med saltvand 2 timer efter fotoaktivering. Denne analyse viste > dobbelt stigning i fibrinaflejring i den ipsilaterale halvkugle i T + RB end RB-fototrombose (figur 2E, p = 0,027 ved uparret t-test; n = 3 for hver gruppe). I vores oprindelige rapport brugte vi også konfokalmikroskopbaseret enkeltkarfotoaktivering og intravital billeddannelse til at sammenligne adfærden hos FITC-konjugerede anti-GP1bβ-mærkede blodplader. 23 Disse forsøg viste, at intravenøs injektion af 80 E/kg trombin ikke inducerede trombocytaggregater selv under laserbelysning (figur 3A), og at blodplader danner homogene blodpropper i RB-fototrombosemodellen (figur 3B), men ujævne aggregater med flere svage områder i T+RB-fototrombose (figur 3C). Disse resultater tyder på, at T + RB fototrombose øger fibrinindholdet i den efterfølgende trombi.
Dernæst sammenlignede vi virkningerne af akut intravenøs tPA-behandling (10 mg/kg Alteplase, 30 minutter efter fotoaktivering) på genopretning af cerebral blodgennemstrømning (CBF) mellem de to modeller. CBF for den samme mus ved præ- og 24 timers post-tPA-versus-køretøjsbehandling blev målt ved laserspeckle kontrastbilleddannelse og normaliseret til den kontralaterale halvkugle (figur 4A, B). I RB-fototrombose førte tPA-behandlingen til en tendens til CBF-genopretning, især i det iskæmiske grænseområde, sammenlignet med køretøjsbehandlede mus (figur 4C, køretøj 51 ± 9% vs tPA 65 ± 7%, p = 0,3 ved uparret t-test, n = 4 for hver). I T + RB fototrombose var genopretningen af CBF i tPA-behandlede mus mere fremtrædende, og de proksimale MCA-grene blev ofte synlige ved 24 timer (figur 4D, køretøj 55 ± 3% vs tPA 81 ± 7%, p = 0,02 ved uparret t-test, n = 6 for hver gruppe). Disse resultater tyder på større følsomhed over for tPA-lytisk behandling ved T + RB end RB fototrombose.
Endelig brugte vi TTC-plet til at kvantificere virkningerne af tPA-behandling på infarktstørrelse i RB- og T + RB-fototrombotiske slagtilfældemodeller. I RB-fototrombose blev der påvist en lignende infarktstørrelse hos vehikelbehandlede (18 ± 2,80 mm 3, n=6) og tPA-behandlede mus (18 ± 1,95 mm3, n=10; 10 mg/kg tPA blev injiceret 30 minutter efter fotoaktivering) (figur 5A). I modsætning hertil reducerede tPA-lytisk behandling signifikant infarkt, når tPA blev injiceret ved 0,5 timer (7 ± 2,1 mm 3, n = 9), 1 time (4,6 ± 1 mm 3, n = 10) eller 2 timer (6,4 ± 1,5 mm 3, n = 8 ), men ikke ved 6 timer efter fotoaktivering (15,2 ± 3,1 mm 3, n = 7) sammenlignet med køretøjsbehandlede mus (14,8 ± 2 mm 3, n=19) (figur 5B, p-værdien bestemt ved uparret t-test). Disse resultater indikerer, at T+RB fototrombotisk slagtilfælde model har følsomhed over for tPA-lytisk behandling i.
Figur 1: Oversigt over procedurer. (A) Flowdiagrammet over de vigtigste kirurgiske procedurer i T + RB fototrombotisk slagtilfælde model. Ligering af den ipsilaterale fælles halspulsåre (CCA) er valgfri, men vi fandt, at det gør infarktstørrelsen mere konsistent, formodentlig på grund af nedsat sikkerhedscirkulation. (B) Set fra top og side af musehjernen i forhold til kraniet. Også indikeret er øjne, øre, temporalis muskel, den midterste cerebrale arterie (MCA) og grene, koronal sutur og laserbelysningsstedet. (C) Visualisering af den målrettede MCA-gren under det fortyndede kranium (C1) og under laserbelysning (C2) og ophør af blodgennemstrømning efter fotoaktivering (C3). Bemærk forholdet mellem MCA-grenen og koronal sutur. D) Opstilling af en mus under laserbelysning på venstre MCA-gren. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Forskellige fibrinindhold i blodpropperne. (A-D) Immunofluorescensmærkning af RB og T + RB fototrombose-induceret trombi i den distale MCA-gren i et enten langsgående (A, B) eller tværgående plan (C, D) ved hjælp af anti-fibrin (grøn), anti-CD41 / blodplade (rød) og isolectin B4 / endotelcelle (blå) markører. Bemærk den markante stigning i antifibrinimmunsignaler i de T+RB fototrombose-inducerede blodpropper (B, D, n=3 for hver gruppe). (E) Immunoblotting indikerede større fibrinaflejring i ipsilateral hjernebark i T+RB end RB-fototrombose 2 timer efter fotoaktivering (n=3 for hver). FN: uskadte mus; Fortsat: kontralateral cortex; Ipsi: ipsilateral cortex. Skalabjælke: 50 μm. Dette tal er ændret med tilladelse fra [23]. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Intravital billeddannelse af blodpladeresponserne. Konfokal mikroskopbaseret intravital billeddannelse af FITC-konjugerede anti-GP1bβ-mærkede blodplader under enkeltbeholderlaserbelysning (på stedet angivet med hvide pile). De eksperimentelle grupper er: (A) thrombin alene, (B) Rose Bengal alene og (C) thrombin plus Rose Bengal. Tiderne efter laserbelysning er mærket. Se videoen på JoVE-webstedet for dette manuskript. Skalabjælke: 50 μm. Dette tal er ændret med tilladelse fra [23]. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Effekter af tPA-behandling på CBF-genopretning. Rekombinant human tPA (Alteplase, 10 mg/kg) eller vehikel blev administreret via halevene til RB og T+RB fototrombose-udfordret mus ved 30 min postlaserbelysning, og cerebral blodgennemstrømning (CBF) før og 24 timer efter behandling i samme mus blev sammenlignet med laserspeckle kontrastbilleddannelse. CBF i et område på 3 x 4,8 mm på begge halvkugler blev målt. De eksperimentelle grupper er: (A, C) RB fototrombose; (B, D) T + RB fototrombose. Bemærk den signifikante genopretning af CBF ved tPA-behandling i T+RB-fototrombosegruppen (p = 0,02 ved uparret t-test, n = 4 for køretøj og n = 6 for tPA-behandling) og hyppig visualisering af den proksimale MCA-gren. Ved RB-fototrombose førte tPA-behandlingen til en tendens til bedre CBF, overvejende i det perifere iskæmiske område (p = 0,3 ved uparret t-test, n = 4 for køretøj og n = 5 for tPA-behandling). Hvide pile angiver stedet for MCA-fotoaktivering. Dette tal er ændret med tilladelse fra [23]. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Effekter af tPA-behandling på infarktstørrelsen. (A) Intravenøs tPA-behandling (Alteplase, 10 mg/kg) 30 minutter efter RB-fototrombose reducerede ikke infarktstørrelsen (n=6 hos vehikelbehandlede og n=10 hos tPA-behandlede mus). (B) I modsætning hertil førte intravenøs 10 mg/kg Alteplasebehandling ved enten 0,5, 1 eller 2 timer, men ikke 6 timer efter fotoaktivering ved T+RB-fototrombose til signifikant reduktion af infarktstørrelsen. P-værdien blev bestemt af envejs ANOVA med Tukeys multiple sammenligningstest. Dette tal er ændret med tilladelse fra [23]. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Model | Kirurgisk procedure | Blodpropper | Blodplader | Fibrin | tPA-reaktivitet | Hovedtræk/hjælpeprogram | Vigtige referencer |
| Intraluminal sutur MCAO | Endovaskulær MCA-okklusion | Nej | NIELSEN | NIELSEN | Nej | Hurtig reperfusion; Neuroprection undersøgelse; tPA-induceret BBB-skade | Longa et al. 1989 (Ref #5) |
| Fototrombose | Kranieudtynding og fotoaktivering | Ja | Svag | Høj reproducerbarhed; lav dødelighed | Watson et al. 1985 (Ref #6) | ||
| Trombin-fototrombose | UCCAO, Udtynding af kraniet og fotoaktivering | Ja | Ja | Høj reproducerbarhed; lav dødelighed | Søn et al. 2020 (Ref #23) | ||
| FeCl3 (på MCA) | Kranieudtynding og kemisk aktivering | Ja | Nej | Høj reproducerbarhed; lav dødelighed | Karatas et al. 2011 (Ref #69) | ||
| in situ thrombin injektion | Kraniotomi og MCA mikroinjektion | Ja | Ja | Høj reproducerbarhed; lav dødelighed; tPA-lytisk behandling | Orset et al. 2007 (Ref #10) | ||
| Emboli-MCAO | Endovaskulær MCA-okklusion | Ja | Ja | tPA-lytisk behandling; Variabel koagulationshårdhed | Busch et al. 1997 (Ref #13) | ||
| Forbigående hypoxi-iskæmi (tHI) | UCCAO plus hypoxi | Ja | Ja | infarkt > MCA-området Systemiske CV-effekter | Sun et al. 2014 (Ref #15) |
Tabel 1: Sammenligning af udvalgte prækliniske apopleksimodeller. Fyldte kasser indikerer positivitet (tilstedeværelsen af blodpropper, blodplader og fibrin) eller signifikant tPA-reaktivitet.
Supplerende figur 1: CBF-monitor efter retroorbital injektion af thrombin. (A) De repræsentative fotos af retro-orbital sinus (øverste panel) og blodgennemstrømning ved laserspeckle kontrastbilleddannelse (nederste panel). De tre vaskulære steder (1 ~ 3 som mærket) blev overvåget efter trombininjektion (80 U / kg) i retro-orbital sinus. (B) Den repræsentative sporingsgraf for blodgennemstrømningen i 15 minutter efter thrombininjektion (pil). (C) Den laserspecklebaserede kvantificering viste ingen reduktion af blodgennemstrømningen nær retroorbital sinus inden for 15 minutter efter thrombininjektion (n = 4, p-værdi bestemt ved uparret t-test). Klik her for at downloade denne figur.
Supplerende figur 2: Manglende fibrinaflejring i den kontralaterale halvkugle 6 timer efter fotoaktivering. Immunfarvning af antifibrinogen (grøn) viste fibrinaflejring i den ipsilaterale cortex 6 timer efter RB og T + RB fototrombose. I modsætning hertil var der ingen mærkbar fibrinaflejring i den kontralaterale cortex efter trombinforstærket fototrombose. N=4 for hver gruppe. Skalabjælke: 50 μm. Blå fluorescens som DAPI-kernefarvning. Klik her for at downloade denne figur.
Supplerende figur 3: Mangel på ekstravasation af immunglobulin (IgG) efter fototrombose. 6 timer efter ensidig MCA-målrettet fotoaktivering viste immunfarvning ekstravasation af IgG på den ipsilaterale halvkugle, men ikke på den kontralaterale halvkugle, hvilket tyder på begrænset BBB-skade efter trombinforstærket fototrombose. N=4 for hver. Skalabjælke: 50 μm. Klik her for at downloade denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det traditionelle RB fototrombotiske slagtilfælde, der blev introduceret i 1985, er en attraktiv model for fokal cerebral iskæmi til enkle kirurgiske procedurer, lav dødelighed og høj reproducerbarhed af hjerneinfarkt. 5 I denne model aktiverer det fotodynamiske farvestof RB hurtigt blodplader ved lysexcitation, hvilket fører til tætte aggregater, der okkluderer blodkarret 5,8,23. Den lille mængde fibrin i RB-inducerede blodpropper (figur 2) afviger imidlertid fra det dominerende blodplade:fibrin intermixed mønster af trombi hentet akut hos iskæmiske slagtilfældepatienter 21,22. Det lave fibrinindhold i RB-induceret trombi bidrager sandsynligvis også til dets modstandsdygtighed over for tPA-lytisk behandling 7,8,19. Selvom ultraviolet laserbestråling inducerer vaskulær rekanalisering i RB-fototrombose, er det usandsynligt, at denne eksperimentelle terapi vil blive anvendt klinisk7. Således er det traditionelle RB fototrombotiske slagtilfælde hovedsageligt blevet anvendt som en permanent okklusionsmodel, mindre egnet til trombolyse og neuroprotektionsforskning (sidstnævnte bruger ofte intraluminal sutur MCAO-model, der har hurtig vaskulær reperfusion ved fjernelse af den mekaniske okklusion).
Vi antog, at anvendelse af blanding af RB og en subtrombotisk dosis thrombin til fotoaktivering kan øge fibrinindholdet i efterfølgende trombi og forbedre responserne på tPA-trombolyse, den virkelige verden slagtilfælde terapi. Denne hypotese understøttes af de resultater, der præsenteres her og i vores oprindelige rapport. 23 Den trombinforstærkede fototrombotiske slagtilfældemodel opretholder også fordelene ved lav dødelighed, enkle kirurgiske procedurer og høj konsistens i infarkts størrelse og placering som i traditionel RB-fototrombosemodel. Derfor mener vi, at trombinforstærket fototrombose er en værdifuld tilføjelse til repertoiret af tromboemboliske slagtilfældemodeller (tabel 1). To proceduremæssige detaljer i trombinforstærket fototrombosemodel fortjener diskussion. For det første kan overdosering af intravenøs thrombin fremkalde akut lungetromboemboli og dyredødelighed25. Vi undersøgte en række trombindoser for kombination med RB-fototrombose, og den valgte dosis på 80 E/kg har indtil videre ikke induceret dødelighed hos >100 eksperimenterede voksne C57Bl/6-hanmus. Det er sandsynligt, at trombindosis skal justeres for mus med hyperkoagulationstilstande26. For det andet ligerede vi rutinemæssigt den ipsilaterale CCA udover MCA-målrettet fototrombose i vores procedurer. Vi fandt, at ligering af den ipsilaterale CCA yderligere øger konsistensen i infarktstørrelse, hvilket kan skyldes nedsat sikkerhedscirkulation mellem MCA og de forreste plus bageste cerebrale arterier.
Med sine unikke egenskaber kan den trombinforstærkede fototrombotiske slagtilfældemodel være særlig nyttig til mindst tre forskningsemner. For det første er denne nye model ideel til head-to-head sammenligning af tPA og andre fibrinolytiske midler såsom Tenecteplase (TNKase)27. TNKase er en konstrueret tPA-mutant variant med øget fibrinspecificitet og en lavere risiko for iatrogen blødning i ex vivo-eksperimenter. Alligevel er dets overlegenhed i forhold til tPA kun blevet testet i en mikroembolisk slagtilfældemodel og ved hjælp af en binær neurologisk resultatanalyse14. På grund af sin høje reproducerbarhed og kvantitative infarktstørrelsesanalyse kan den trombinforstærkede fototrombotiske slagtilfældemodel bruges til at sammenligne fordele og bivirkninger af tPA-versus-TNKase i flere aspekter (f.eks. dosisresponser, terapeutisk vindue, comorbiditetsvirkninger og potentielle bivirkninger ved forsinket behandling). For det andet kan den trombinforstærkede fototrombosemodel være nyttig til undersøgelse af virkningerne af kombineret tPA og blodpladebehandling ved akut iskæmisk slagtilfælde28. Nylige fremskridt inden for endovaskulære procedurer i iskæmisk slagtilfælde har gjort det muligt for forskere at analysere den histologiske sammensætning af akut trombi og identificeret et dominerende, blandet blodplade: fibrinmønster21,22. Derfor kan kombinationen af et fibrinolytisk middel (tPA) og anti-blodplademidler øge den samlede effekt af trombolyse, men en slagtilfældemodel, der simulerer den kliniske blodplade:fibrinsammensætning af trombose er afgørende for sådan forskning. Sammen med tHI- og emboli-MCAO-modellerne opfylder thrombin-fototrombose dette krav og skiller sig ud for dets lave dødelighed, enkle kirurgiske procedurer og mangel på systemiske kardiovaskulære virkninger (tabel 1).
Sidst, men ikke mindst, kan trombinforstærket fototrombose være særlig nyttig til undersøgelse af slagtilfælde-induceret sikkerhedscirkulation på grund af dens forudsigelige peri-infarktplacering i MCA-forsyningsområdet. Ved at opretholde penumbra for at kompensere for infarktvækst anerkendes sikkerhedscirkulation i stigende grad som en vigtig forudsigelse for iskæmiske slagtilfælderesultater, fordi akut vaskulær obstruktion fremmer blodgennemstrømningen på tværs af sikkerhedsnetværk efterfulgt af ombygning og angiogenese til dannelse af neo-sikkerhedsfartøjer29,30. Resultaterne tyder på, at tPA ikke kun fremmer rekanalisering af den proksimale MCA, men også øger sikkerhedscirkulationen i periferien af MCA-forsyningsområdet (figur 4). Bedre forståelse af de mekanismer, der regulerer plasticiteten af sikkerhedscirkulation, kan foreslå nye terapier. Da den trombinforstærkede fototrombotiske slagtilfældemodel giver fordelen ved forudsigelig periinfarktregion og følsomhed over for lytisk behandling, vil den hjælpe forskningen i sikkerhedscirkulation efter slagtilfælde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud (NS108763, NS100419, NS095064 og HD080429 til C.Y. K. og NS106592 til YS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | infarct |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 543nm laser beam | Melles Griot | 25-LGP-193-249 | photothrombosis |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~14 weeks old (22~30 g) |
| Anesthesia bar for mouse adaptor | machine shop, UVA | surgical setup | |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Dental drill | Dentamerica | Rotex 782 | surgical setup |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | brain imaging |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| infusion pump | KD Scientific | 200 | thrombolytic treatment |
| Insulin syringe with 31G needle | BD | 328291 | photothrombosis |
| Ketamine | CCM, UVA | anesthesia | |
| Laser protective google 532nm | Thorlabs | LG3 | photothrombosis |
| Ketoprofen | CCM, UVA | NSAID analgesia | |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mouse adaptor | RWD | 68014 | surgical setup |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| Retractor tips | Kent Scientific | Surgi-5014-2 | surgical setup |
| Rose Bengal | Sigma | 198250 | photothrombosis |
| Thrombin | Sigma | T7513 | photothrombosis |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| tPA | Genetech | Cathflo activase 2mg | thrombolytic treatment |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | TTC infacrt |
| Xylazine | CCM, UVA | anesthesia |
References
- Lyden, P. D. Thrombolytic Therapy for Acute Stroke. 3/e. , Springer. (2015).
- Linfante, I., Cipolla, M. J. Improving reperfusion therapies in the era of mechanical thrombectomy. Translational Stroke Research. 7 (4), 294-302 (2016).
- Campbell, B. C., et al. Endovascular Therapy for Ischemic stroke with perfusion-imaging selection. The New England Journal of Medicine. 372 (11), 1009-1018 (2015).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (7), 1310-1316 (2012).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
- Watson, B. D., Prado, R., Veloso, A., Brunschwig, J. P., Dietrich, W. D. Cerebral blood flow restoration and reperfusion injury after ultraviolet laser-facilitated middle cerebral artery recanalization in rat thrombotic stroke. Stroke. 33 (2), 428-434 (2002).
- Uzdensky, A. B. Photothrombotic stroke as a model of ischemic stroke. Translational Stroke Research. 9 (5), 437-451 (2018).
- Karatas, H., et al. Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (3), 1452-1460 (2011).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Orset, C., et al. Efficacy of Alteplase in a mouse model of acute ischemic stroke: A retrospective pooled analysis. Stroke. 47 (5), 1312-1318 (2016).
- Kudo, M., Aoyama, A., Ichimori, S., Fukunaga, N. An animal model of cerebral infarction. Homologous blood clot emboli in rats. Stroke. 13 (4), 505-508 (1982).
- Busch, E., Kruger, K., Hossmann, K. A. Improved model of thromboembolic stroke and rt-PA induced reperfusion in the rat. Brain Research. 778 (1), 16-24 (1997).
- Lapchak, P. A., Araujo, D. M., Zivin, J. A. Comparison of Tenecteplase with Alteplase on clinical rating scores following small clot embolic strokes in rabbits. Experimental Neurology. 185 (1), 154-159 (2004).
- Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-Edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9 (6), 98807 (2014).
- Sun, Y. Y., et al. Prophylactic Edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: Implications for perioperative neuroprotection. Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).
- Sun, Y. Y., et al. Sickle mice are sensitive to hypoxia/ischemia-induced stroke but respond to tissue-type plasminogen activator treatment. Stroke. 48 (12), 3347-3355 (2017).
- Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. A thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxia-ischemia. Journal of Visualized Experiments. (102), e52978 (2015).
- Pena-Martinez, C., et al. Pharmacological modulation of neutrophil extracellular traps reverses thrombotic stroke tPA (tissue-type plasminogen activator) resistance. Stroke. 50 (11), 3228-3237 (2019).
- Denorme, F., et al. ADAMTS13-mediated thrombolysis of t-PA-resistant occlusions in ischemic stroke in mice. Blood. 127 (19), 2337-2345 (2016).
- Marder, V. J., et al. Analysis of thrombi retrieved from cerebral arteries of patients with acute ischemic stroke. Stroke. 37 (8), 2086-2093 (2006).
- Bacigaluppi, M., Semerano, A., Gullotta, G. S., Strambo, D. Insights from thrombi retrieved in stroke due to large vessel occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (8), 1433-1451 (2019).
- Sun, Y. Y., et al. A murine photothrombotic stroke model with an increased fibrin content and improved responses to tPA-lytic treatment. Blood Advances. 4 (7), 1222-1231 (2020).
- Su, E. J., et al. Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke. Nature Medicine. 14 (7), 731-737 (2008).
- Gupta, A. K., et al. Protective effects of gelsolin in acute pulmonary thromboembolism and thrombosis in the carotid artery of mice. PLoS One. 14 (4), 0215717 (2019).
- Carroll, B. J., Piazza, G. Hypercoagulable states in arterial and venous thrombosis: When, how, and who to test. Vascular Medicine. 23 (4), 388-399 (2018).
- Coutts, S. B., Berge, E., Campbell, B. C., Muir, K. W., Parsons, M. W. Tenecteplase for the treatment of acute ischemic stroke: A review of completed and ongoing randomized controlled trials. International Journal of Stroke. 13 (9), 885-892 (2018).
- McFadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. Current and future antiplatelet therapies: emphasis on preserving haemostasis. Nature Reviews Cardiology. 15 (3), 181-191 (2018).
- Bang, O. Y., Goyal, M., Liebeskind, D. S. Collateral crculation in ischemic stroke: Assessment tools and therapeutic strategies. Stroke. 46 (11), 3302-3309 (2015).
- Faber, J. E., Chilian, W. M., Deindl, E., van Royen, N., Simons, M. A brief etymology of the collateral circulation. Arteriosclerosis, Thrombsis, Vascular Biology. 34 (9), 1854-1859 (2014).
