Summary
Traditionele modellen met fototrombotische beroerte (PTS) induceren voornamelijk dichte bloedplaatjesaggregaten met een hoge weerstand tegen weefselplasminogeenactivator (tPA)-lytische behandeling. Hier wordt een gemodificeerd muizen PTS-model geïntroduceerd door trombine en lichtgevoelige kleurstof samen te injecteren voor fotoactivering. Het trombine-versterkte PTS-model produceert gemengde bloedplaatjes:fibrinestolsels en is zeer gevoelig voor tPA-trombolyse.
Abstract
Een ideaal trombo-embolisch beroertemodel vereist bepaalde eigenschappen, waaronder relatief eenvoudige chirurgische ingrepen met een lage mortaliteit, een consistente infarctgrootte en -locatie, precipitatie van bloedplaatjes:fibrine vermengde bloedstolsels vergelijkbaar met die bij patiënten, en een adequate gevoeligheid voor fibrinolytische behandeling. Het op kleurstof gebaseerde fototrombotische beroertemodel van de bengaalse roos (RB) voldoet aan de eerste twee vereisten, maar is zeer ongevoelig voor tPA-gemedieerde lytische behandeling, vermoedelijk vanwege de bloedplaatjesrijke, maar fibrine-arme stolselsamenstelling. We redeneren dat een combinatie van RB-kleurstof (50 mg/kg) en een subtrombotische dosis trombine (80 E/kg) voor fotoactivatie gericht op de proximale tak van de middelste hersenslagader (MCA) fibrine-verrijkte en tPA-gevoelige stolsels kan produceren. Inderdaad, het trombine en RB (T+RB)-gecombineerde fototrombosemodel veroorzaakte gemengde bloedplaatjes:fibrine-bloedstolsels, zoals aangetoond door immunokleuring en immunoblots, en handhaafde consistente infarctgroottes en -locaties plus een lage mortaliteit. Bovendien verminderde intraveneuze injectie van tPA (Alteplase, 10 mg/kg) binnen 2 uur na fotoactivatie de infarctgrootte bij T+RB-fototrombose aanzienlijk. Het trombine-versterkte fototrombotische beroertemodel kan dus een nuttig experimenteel model zijn om nieuwe trombolytische therapieën te testen.
Introduction
Endovasculaire trombectomie en tPA-gemedieerde trombolyse zijn de enige twee door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) goedgekeurde therapieën van acute ischemische beroerte, die jaarlijks ~700.000 patiënten in deVerenigde Staten treft. Omdat de toepassing van trombectomie beperkt is tot occlusie van grote bloedvaten (LVO), terwijl tPA-trombolyse occlusies van kleine bloedvaten kan verlichten, zijn beide waardevolle therapieën voor acute ischemische beroerte2. Bovendien verbetert de combinatie van beide therapieën (bijv. start van tPA-trombolyse binnen 4,5 uur na het begin van de beroerte, gevolgd door trombectomie) de reperfusie en defunctionele uitkomsten. Het optimaliseren van trombolyse blijft dus een belangrijk doel voor onderzoek naar beroertes, zelfs in het tijdperk van trombectomie.
Trombo-embolische modellen zijn een essentieel hulpmiddel voor preklinisch onderzoek naar beroertes dat gericht is op het verbeteren van trombolytische therapieën. Dit komt omdat mechanische vasculaire occlusiemodellen (bijv. intraluminale hechting MCA-occlusie) geen bloedstolsels produceren en het snelle herstel van de cerebrale bloedstroom na het verwijderen van mechanische occlusie overdreven geïdealiseerd is 4,5. Tot op heden omvatten de belangrijkste trombo-embolische modellen fototrombose 6,7,8, topisch ijzerchloride (FeCl3) toepassing9, micro-injectie van trombine in de MCA-tak 10,11, injectie van ex vivo (micro)embolie in de MCA of gemeenschappelijke halsslagader (CCA)12,13,14 en voorbijgaande hypoxie-ischemie (tHI)15,16, 17,18. Deze beroertemodellen verschillen in de histologische samenstelling van de resulterende stolsels en de gevoeligheid voor tPA-gemedieerde lytische therapieën (tabel 1). Ze variëren ook in de chirurgische vereiste van craniotomie (nodig voor in situ trombine-injectie en plaatselijke toepassing van FeCl3), de consistentie van de grootte en locatie van het infarct (bijv. CCA-infusie van micro-embolieën levert zeer variabele uitkomsten op) en globale effecten op het cardiovasculaire systeem (bijv. tHI verhoogt de hartslag en het hartminuutvolume om hypoxie-geïnduceerde perifere vasodilatatie te compenseren).
Het op RB-kleurstof gebaseerde fototrombotische beroerte (PTS)-model heeft veel aantrekkelijke kenmerken, waaronder eenvoudige craniotomievrije chirurgische ingrepen, lage mortaliteit (meestal < 5%) en een voorspelbare grootte en locatie van het infarct (in het MCA-leverende gebied), maar het heeft twee belangrijke beperkingen. 8 Het eerste voorbehoud is een zwakke tot nihil-respons op tPA-gemedieerde trombolytische behandeling, wat ook een nadeel is van het FeCl3-model 7,19,20. Het tweede voorbehoud van PTS- en FeCl3-beroertemodellen is dat de daaruit voortvloeiende trombi bestaan uit dicht opeengepakte bloedplaatjesaggregaten met een kleine hoeveelheid fibrine, wat niet alleen leidt tot de veerkracht tegen tPA-lytische therapie, maar ook afwijkt van het patroon van gemengde bloedplaatjes:fibrinetrombi bij patiënten met een acute ischemische beroerte21,22. Het in situ trombine-micro-injectiemodel daarentegen bestaat voornamelijk uit gepolymeriseerd fibrine en een onzeker gehalte aan bloedplaatjes10.
Gezien de bovenstaande redenering veronderstelden we dat vermenging van RB en een subtrombotische dosis trombine voor MCA-gerichte fotoactivering door verdunde schedel de fibrinecomponent in de resulterende trombi kan verhogen en de gevoeligheid voor tPA-gemedieerde lytische behandeling kan verhogen. We hebben deze hypothese bevestigd,23 en hierin beschrijven we gedetailleerde procedures van het gemodificeerde (T+RB) fototrombotische beroertemodel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol is goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Virginia en volgt de National Institutes of Health Guideline for Care and Use of Laboratory Animals. Figuur 1A schetst de volgorde van chirurgische ingrepen van dit protocol.
1. Operatie instellen
- Plaats ten minste 15 minuten voor de operatie een verwarmingskussen met een temperatuur van 37 °C op de adapter voor kleine dieren. Bereid een neusklemrol voor adapter voor waarmee de kop van het dier kan draaien. Bereid de anesthetica voor Ketamine (60 mg/kg)/ Xylazine (10 mg/kg).
- Steriliseer de chirurgische instrumenten, waaronder scharen, tangen, micronaaldhouders, hemostaten, wattenstaafjes en hechtingen met autoclaaf (121 °C bij 15 psi gedurende 60 minuten). Bereid weefsellijm en oogzalf voor. Bereid de 532 nm laserbeschermingsbril voor chirurgen voor.
OPMERKING: Dit protocol beschrijft een belangrijke overlevingsoperatie en moet worden uitgevoerd met behulp van aseptische technieken. - Stel het verlichtingssysteem in met een laserbron van 532 nm. Bereid een tandartsboor voor.
- Bereid de Bengaalse rozenoplossing in zoutoplossing (10 mg/ml). Plaats een aliquoot boviene trombine (0,1 E/μL) op een ijsemmer.
- Injecteer Ketoprofen (4,0 mg/kg) subcutaan in de muis als analgesie 30 minuten voor de operatie of gebruik het pijnstillende regime dat wordt aanbevolen door de lokale institutionele richtlijnen.
2. Ligatie van de ipsilaterale gemeenschappelijke halsslagader
- Verdoof mannelijke C57BL/6NCrl-muizen van 10-14 weken oud met een gewicht van 22 tot 30 g door intramusculaire injectie van ketamine (60 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg).
OPMERKING: De hele chirurgische ingreep, die de ligatie van de ipsilaterale gemeenschappelijke halsslagader omvat door middel van het bewaken van de cerebrale bloedstroom, zal naar verwachting ~120 minuten duren. Het anesthesieregime zal doorgaans gedurende deze hele duur effectief zijn, maar de anesthesiediepte moet ten minste elke 15 minuten opnieuw worden beoordeeld. Tijdens het leren van deze procedures kan het nodig zijn om de anesthesie opnieuw te doseren. - Knijp in de tenen om ervoor te zorgen dat het dier volledig verdoofd is. Verwijder het haar in de linker nek voor CCA-ligatie en het hoofd voor het dunner worden van de schedel met de ontharingscrème.
- Plaats de muis op de adapter voor kleine dieren in rugligging. Steriliseer het operatiegebied door de huid af te vegen met drie afwisselende vegen povidonjodium en 70% ethanol.
- Zet de muiskop vast met behulp van oorbalken. Maak onder een ontleedmicroscoop een incisie van 0,5 cm in de linker cervicale hoek met behulp van een microschaar en een rechte pincet op ongeveer 0,2 cm lateraal van de middellijn.
- Gebruik een fijne gekartelde pincet om het zachte weefsel en de fascia uit elkaar te trekken om de linker gemeenschappelijke halsslagader (LCCA) bloot te leggen. Scheid voorzichtig de linker CCA van de nervus vagus met behulp van een fijne, gladde pincet.
- Plaats een permanente dubbele knoophechting rond de LCCA met behulp van 5-0 zijdehechting die in segmenten van 20 mm is gesneden, en sluit vervolgens de wond met steriele wondclips.
3. Schedel dunner worden boven de MCA-tak en fotoactivering
- Draai de muis in buikligging op de adapter voor kleine dieren. Draai de neusklemrol 15°. Steriliseer het operatiegebied door de huid af te vegen met drie afwisselende vegen betadine en 70% ethanol.
- Maak een incisie van 0,8 cm in de hoofdhuid met behulp van een microschaar en een rechte pincet langs het linkeroog en -oor om de temporalis-spier, die zich tussen het oog en het oor bevindt, bloot te leggen (Figuur 1B).
- Maak onder de ontleedmicroscoop een incisie van 0,5 cm langs de rand van de temporalis-spier op het linker pariëtale bot met een fijne gekartelde pincet. Maak een tweede verticale incisie van 0,3 cm op de temporalis-spier met een microschaar. Trek de temporale spier terug om de rand van het pariëtale bot en het squamosale bot bloot te leggen. Zorg ervoor dat u het herkenningspunt van de coronale hechting tussen de frontale en de pariëtale botten visualiseert (Figuur 1B,C).
- Bevochtig de schedel door steriele zoutoplossing aan te brengen om de linker MCA te onthullen. Markeer de proximale MCA-tak op het squamosale bot met een markeerstift. Teken voorzichtig een cirkel met een diameter van ongeveer 1 mm rond het gemarkeerde gebied met de pneumatische tandartsboor (braamsnelheid ingesteld op 50% van de snelheidsregelaar) en verdun vervolgens de schedel ongeveer 0.2 mm diep zonder de onderliggende dura aan te raken. Stop met boren totdat er een heel dun laagje bot overblijft.
- Meng de trombine (T, 0,1 E/μL, 80 E/kg) en Rose bengal (RB, 10 mg/ml, 50 mg/kg) oplossing op basis van het lichaamsgewicht van de muis. Meng bijvoorbeeld voor een muis met een lichaamsgewicht van 25 g 20 μL trombine (0,1 E/μL) en 125 μL RB (10 mg/ml).
- Injecteer langzaam T+RB-oplossing (145 μl per 25 g lichaamsgewicht) in de retroorbitale sinus met een insulinespuit (#31G naald).
OPMERKING: In pilotexperimenten werd het sterftecijfer van toenemende doses trombine vermengd met de standaarddosis RB-kleurstof (50 mg/kg) onderzocht op fotoactivering. De mortaliteit was 0% voor 80 E/kg trombine (n=13), 43% voor 120 E/kg trombine (n=7) en 100% voor zowel 160 E/kg (n=5) als 200 E/kg trombine (n=5). Voor dit model is daarom gekozen voor een dosis van 80 E/kg trombine. Beeldvorming met laserspikkelcontract werd ook gebruikt om de mogelijkheid van ongebreidelde bloedstolling in de buurt van de orbitale holte uit te sluiten na retro-orbitale sinusinjectie van T+RB (aanvullende figuur 1), evenals wijdverspreide fibrineafzetting in de contralaterale hemisfeer die niet werd onderworpen aan laserverlichting (aanvullende figuur 2). - Breng oogzalf aan op beide ogen om uitdroging te voorkomen.
- Breng de verlichting aan met een laserlicht van 532 nm (met een energie van 0.5 mW) op de geboorde locatie met een afstand van 2 inch gedurende 20 minuten. Visualiseer de verlichting op de proximale tak van MCA door middel van een laserbeschermingsbril (Figuur 1C,D).
OPMERKING: De MCA met 532 nm verlichting toont rode fluorescentie onder de bril. De distale MCA verdwijnt na 10 minuten verlichting. Sluit het dier uit als de distale MCA-stroom na 20 minuten verlichting nog steeds aanwezig is. - Stop de laserverlichting na 20 min. Sluit de wond af met steriele wondclips.
4. Intravitale beeldvorming (optioneel)
OPMERKING: Om de trombusvorming in vivo te karakteriseren, gebruikt u intravirale beeldvorming door een spin-schijf confocaal met fotoactiveringssysteem23.
- Maak een schedelvenster met een diameter van ~ 3 mm op het pariëtale bot van de schedel.
- Plaats een dekglas op het schedelraam en plaats de distale MCA (~50 μm in diameter) onder een 20x water-onderdompelingsobjectief.
- Label de circulerende bloedplaatjes door middel van staartaderinjectie van DyLight488-geconjugeerd anti-GPIbβ-antilichaam (0,1 mg/kg) 5 minuten vóór beeldvorming.
- Injecteer de mengseloplossing van trombine (80 E/kg) en Bengaalse roos (50 mg/kg) via retro-orbitaal 5 minuten voor de beeldvorming.
- Fotoactiveer de MCA met behulp van een 561 nm lasersysteem met een laserstraal met een diameter van 10 μm en neem het beeld op tot de trombusvorming.
5. tPA-toediening
- Leg het verdoofde dier op een warm kussen van 37 °C. Maak op het geselecteerde tijdstip na de fotoactivering een gaasje nat met ~45 °C warm water en wikkel het gedurende 1 minuut om de staart.
- Injecteer recombinant humaan tPA (10 mg/kg) via de staartader met een bolus van 50% en 50% gedurende 30 minuten met een infuuspomp.
OPMERKING: Hoewel de klinische dosis recombinant humaan tPA voor de behandeling van acute ischemische beroerte 0,9 mg/kg is, wordt bij knaagdieren vaak een hogere dosis (10 mg/kg) gebruikt om de verminderde tPA-reactiviteit tussen soorten te compenseren. We volgden ook het standaardprotocol van tPA-toediening in preklinische beroertemodellen, waarbij 50% als bolus werd gebruikt en 50% via de staartader werd toegediend gedurende 30 minuten.24
6. Controle van de cerebrale bloedstroom (CBF)
OPMERKING: Om CBF-herstel na tPA-behandeling te bevestigen, gebruikt u een tweedimensionaal laserspikkelcontrastbeeldvormingssysteem15 en registreert u onmiddellijk na fototrombose (stap 3.9) of 24 uur na tPA-behandeling.
- Plaats het verdoofde dier in buikligging en maak een incisie in de middellijn op de hoofdhuid met de schedel bloot.
- Bevochtig de schedel met steriele zoutoplossing en breng de ultrasone gel voorzichtig aan op de schedel. Vermijd haren en luchtbellen in de gel, die het CBF-signaal verstoren.
- Bewaak CBF in beide hersenhelften onder laserspikkelcontrastbeeldcamera gedurende 10 minuten.
- Sluit na het opnemen van het CBF-beeld de hoofdhuid met weefsellijm en breng het dier terug naar de kooi.
- Analyseer CBF in de geselecteerde regio's en bereken het CBF-herstelpercentage in vergelijking met de contralaterale regio.
- Plaats het dier vervolgens terug in een warme kooi om te herstellen. Houd de muizen 5-10 minuten in de gaten totdat ze herstellen van de anesthesie. Plaats nat voer in de kooi en breng het terug naar de dierenopvang.
OPMERKING: Zorg voor postoperatieve analgesie zoals aanbevolen door de lokale institutionele richtlijnen.
7. Meting van het infarctvolume door trifenyltetrazoliumchloride (TTC)-kleuring
- Vierentwintig uur na fototrombose, het dier diep verdoven volgens de lokale institutionele richtlijnen voor niet-overlevingschirurgie.
OPMERKING: We dienen tribroomethanol (avertin) 250 mg/kg toe via intraperitoneale (IP) injectie. - Voer transcardiale perfusie uit met PBS, verzamel verse hersenen en sluit ze in 3% agar-gel in.
- Snijd de hersenplak met een dikte van 1 mm in delen door middel van vibratoom en incubeer gedurende 10 minuten in 2% TTC-oplossing.
- Kwantificeer het totale infarctvolume van 6 hersenplakjes als het absolute volume door ImageJ-software.
OPMERKING: Hersenoedeem werd om twee redenen niet gebruikt als uitkomstmaat. Ten eerste meet de TTC-kleuring de levensvatbaarheid van het weefsel (via de mitochondriale reductieactiviteit), wat een ernstiger gevolg is dan oedeem. Ten tweede, naarmate het infarct vordert, treden zowel vasogeen als cytotoxisch oedeem op en kunnen ze niet gemakkelijk worden onderscheiden door de standaard meetmethoden voor hersenoedeem. We hebben echter anti-immunoglobine (IgG)-etikettering gebruikt om de integriteit van de bloed-hersenbarrière (BBB) te beoordelen, en vonden vergelijkbare IgG-extravasatie 6 uur na fotoactivering in zowel RB- als T+RB-beroertemodellen (aanvullende figuur 3).
8. Meting van trombusvorming
OPMERKING: Om de trombusvorming te meten, verzamelt u de hersenen 1 uur en 2 uur na fototrombose voor trombusmeting in MCA door immunochemie (IHC) en voor fibrinemeting in hersenhelft door immunoblot, respectievelijk.
- Voer de IHC uit voor de karakterisering van de samenstelling van stolsels. Fixeer de hersenen 's nachts met 4% paraformaldehyde en dehydrateer de hersenen vervolgens met 30% sucrose voor de OCT-inbedding.
- Doorsnijd de hersenen met sagittale oriëntatie in 20 μm dikte en voer de IHC uit met specifieke antilichamen tegen fibrinogeen, bloedplaatjes (glycoproteïne IIb), rode bloedcellen (TER119) en bloedvaten (isolectine GS-IB4).
- Voer de meting van fibrine in de hersenhelft uit door middel van een immunoblot met een antilichaam tegen fibrinogeen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eerst vergeleken we het fibrinegehalte in RB versus T+RB fototrombose-geïnduceerde bloedstolsels. Muizen werden opgeofferd door transcardiale perfusie van fixeermiddelen 2 uur na fotoactivering, en hersenen werden verwijderd voor immunofluorescentiekleuring van de MCA-tak in longitudinale en transversale vlakken. Bij RB-fototrombose was de MCA-tak dicht opeengepakt met CD41+-bloedplaatjes en weinig fibrine (Figuur 2A,C). Daarentegen werd de MCA-tak bij T+RB-fototrombose afgesloten door willekeurig gemengde bloedplaatjes:fibrinestolsels (Figuur 2B,D, n>3 voor elk). We gebruikten ook immunoblots om het fibrine(ogen)-niveau in de hersenschors tussen de twee modellen te vergelijken, na transcardiale perfusie met zoutoplossing 2 uur na fotoactivering. Deze analyse toonde > tweevoudige toename van fibrine-afzetting in de ipsilaterale hemisfeer in T+RB dan RB-fototrombose (Figuur 2E, p=0,027 door ongepaarde t-toets; n=3 voor elke groep). In ons oorspronkelijke rapport gebruikten we ook confocale microscoopgebaseerde fotoactivering van één vat en intravitale beeldvorming om het gedrag van FITC-geconjugeerde anti-GP1bβ-gelabelde bloedplaatjes te vergelijken. 23 Uit deze experimenten bleek dat intraveneuze injectie van 80 E/kg trombine zelfs bij laserverlichting geen bloedplaatjesaggregaten induceerde (figuur 3A) en dat bloedplaatjes homogene stolsels vormen in het RB-fototrombosemodel (figuur 3B), maar ongelijke aggregaten met meerdere zwakke gebieden bij T+RB-fototrombose (figuur 3C). Deze resultaten suggereren dat T+RB fototrombose het fibrinegehalte in de daaropvolgende trombi verhoogt.
Vervolgens vergeleken we de effecten van acute intraveneuze tPA-behandeling (10 mg/kg Alteplase, 30 min na fotoactivering) op het herstel van de cerebrale bloedstroom (CBF) tussen de twee modellen. De CBF van dezelfde muis bij pre- en 24 uur na tPA-versus-vehiculumbehandeling werd gemeten door middel van laserbeeldvorming met spikkelcontrast en genormaliseerd naar de contralaterale hemisfeer (Figuur 4A,B). Bij RB-fototrombose leidde de tPA-behandeling tot een trend van CBF-herstel, met name in het ischemische grensgebied, in vergelijking met met vehiculum behandelde muizen (Figuur 4C, vehiculum 51 ± 9% vs. tPA 65 ± 7%, p=0,3 bij ongepaarde t-toets, n=4 voor elk). Bij T+RB-fototrombose was het herstel van CBF in met tPA behandelde muizen prominenter en werden de proximale MCA-takken vaak zichtbaar na 24 uur (Figuur 4D, vehiculum 55 ± 3% versus tPA 81 ± 7%, p=0,02 bij ongepaarde t-test, n=6 voor elke groep). Deze resultaten suggereren een grotere gevoeligheid voor tPA-lytische therapie door T+RB dan voor RB-fototrombose.
Ten slotte gebruikten we TTC-kleuring om de effecten van tPA-behandeling op de infarctgrootte te kwantificeren in de RB- en T+RB-modellen voor fototrombotische beroertes. Bij RB-fototrombose werd een vergelijkbare infarctgrootte gedetecteerd bij met medium behandelde muizen (18 ± 2,80mm3, n=6) en met tPA behandelde muizen (18 ± 1,95mm3, n=10; 10 mg/kg tPA werd 30 minuten na fotoactivatie geïnjecteerd) (Figuur 5A). Daarentegen verminderde de tPA-lytische behandeling het infarct significant wanneer tPA werd geïnjecteerd op 0,5 uur (7 ± 2,1 mm 3, n=9), 1 uur (4,6 ± 1 mm 3, n=10) of 2 uur (6,4 ± 1,5 mm 3, n=8 ), maar niet 6 uur na fotoactivering (15,2 ± 3,1 mm 3, n=7), vergeleken met met vehiculum behandelde muizen (14,8 ± 2 mm 3, n=19) (Figuur 5B, de p-waarde bepaald door de ongepaarde t-toets). Deze resultaten geven aan dat het T+RB fototrombotische beroertemodel gevoelig is voor tPA-lytische behandeling in de.
Figuur 1: Overzicht van de procedures. (A) Het stroomschema van de belangrijkste chirurgische ingrepen in het T+RB fototrombotische beroertemodel. Ligatie van de ipsilaterale gemeenschappelijke halsslagader (CCA) is optioneel, maar we ontdekten dat het de grootte van het infarct consistenter maakt, vermoedelijk als gevolg van verminderde collaterale circulatie. (B) Boven- en zijaanzicht van de muizenhersenen in relatie tot de schedel. Ook aangegeven zijn de ogen, het oor, de temporalis-spier, de middelste hersenslagader (MCA) en takken, coronale hechting en de laserverlichtingsplaats. (C) Visualisatie van de beoogde MCA-tak onder de verdunde schedel (C1) en tijdens laserverlichting (C2), en stopzetting van de bloedstroom na fotoactivering (C3). Let op de relatie van de MCA-tak met de coronale hechting. (D) De opstelling van een muis tijdens laserverlichting op de linker MCA-tak. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Verschillende fibrinegehaltes in de bloedstolsels. (A-D) Immunofluorescentie-etikettering van de RB- en T+RB-fototrombose-geïnduceerde trombi in de distale MCA-tak in een longitudinaal (A, B) of transversaal vlak (C, D) met behulp van anti-fibrine (groen), anti-CD41/bloedplaatjes (rood) en isolectine B4/endotheelcel (blauw) markers. Let op de duidelijke toename van anti-fibrine-immunosignalen in de T+RB fototrombose-geïnduceerde bloedstolsels (B, D, n=3 voor elke groep). (E) Immunoblotting duidde op een grotere fibrineafzetting in de ipsilaterale hersenschors in T+RB dan RB-fototrombose 2 uur na fotoactivering (n=3 voor elk). VN: ongedeerde muizen; Vervolg: contralaterale cortex; Ipsi: ipsilaterale cortex. Schaalbalk: 50 μm. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van [23]. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Intravitale beeldvorming van de bloedplaatjesresponsen. Confocale microscoopgebaseerde intravitale beeldvorming van FITC-geconjugeerde anti-GP1bβ-gelabelde bloedplaatjes onder laserverlichting met één vat (op de plaats aangegeven met witte pijlen). De experimentele groepen zijn: (A) trombine alleen, (B) Rose Bengal alleen, en (C) trombine plus Rose Bengal. De tijden na laserverlichting worden gelabeld. Zie de video op de JoVE-website voor dit manuscript. Schaalbalk: 50 μm. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van [23]. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Effecten van tPA-behandeling op CBF-herstel. Recombinant humaan tPA (Alteplase, 10 mg/kg) of vehiculum werd toegediend via de staartader aan RB- en T+RB-muizen met fototrombose-uitdaging 30 minuten na laserverlichting, en cerebrale bloedstroom (CBF) voor en 24 uur na de behandeling in dezelfde muis werd vergeleken met beeldvorming met laserspikkelcontrast. De CBF in een gebied van 3 x 4,8 mm op beide halfronden werd gemeten. De experimentele groepen zijn: (A, C) RB fototrombose; (B, D) T+RB fototrombose. Let op het significante herstel van CBF door tPA-behandeling in de T+RB-fototrombosegroep (p=0,02 door ongepaarde t-test, n= 4 voor vehiculum en n=6 voor tPA-behandeling) en frequente visualisatie van de proximale MCA-tak. Bij RB-fototrombose leidde de tPA-behandeling tot een trend van betere CBF, voornamelijk in het perifere ischemische gebied (p=0,3 bij ongepaarde t-toets, n=4 voor vehiculum en n=5 voor tPA-behandeling). Witte pijlen geven de plaats van MCA-fotoactivatie aan. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van [23]. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Effecten van tPA-behandeling op de grootte van het infarct. (A) Intraveneuze tPA-behandeling (Alteplase, 10 mg/kg) 30 minuten na RB-fototrombose slaagde er niet in de infarctgrootte te verminderen (n=6 bij met vehiculum behandelde muizen en n=10 bij met tPA behandelde muizen). (B) Bij T+RB-fototrombose daarentegen leidde intraveneuze behandeling met 10 mg/kg Alteplase 0,5, 1 of 2 uur, maar niet 6 uur na fotoactivering tot een significante vermindering van de infarctgrootte. De p-waarde werd bepaald door eenrichtings-ANOVA met Tukey's meervoudige vergelijkingstest. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van [23]. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Model | Chirurgische ingreep | Bloedstolsels | Bloedplaatjes | Fibrine | tPA-reactiviteit | Belangrijkste kenmerken/hulpprogramma's | Belangrijkste referenties |
| Intraluminale hechting MCAO | Endovasculaire MCA-occlusie | Nee | N.V.T | N.V.T | Nee | Snelle reperfusie; Neuroprectie onderzoek; tPA-geïnduceerd BBB-letsel | Longa et al. 1989 (Ref #5) |
| Fototrombose | Schedel dunner worden en foto-activatie | Ja | Zwak | Hoge reproduceerbaarheid; Lage sterfte | Watson et al. 1985 (Ref #6) | ||
| Trombine-fototrombose | UCCAO, Schedel dunner worden en fotoactivatie | Ja | Ja | Hoge reproduceerbaarheid; Lage sterfte | Zon et al. 2020 (Ref #23) | ||
| FeCl3 (op de MCA) | Schedel dunner worden en chemische activering | Ja | Nee | Hoge reproduceerbaarheid; Lage sterfte | Karatas et al. 2011 (Ref #69) | ||
| In situ trombine-injectie | Craniotomie en MCA-micro-injectie | Ja | Ja | Hoge reproduceerbaarheid; lage mortaliteit; tPA-lytische behandeling | Orset et al. 2007 (Ref #10) | ||
| Emboli-MCAO | Endovasculaire MCA-occlusie | Ja | Ja | tPA-lytische behandeling; Variabele stolselhardheid | Busch et al. 1997 (Ref #13) | ||
| Voorbijgaande hypoxie-ischemie (tHI) | UCCAO plus hypoxie | Ja | Ja | Infarct > het MCA-gebied; Systemische CV effecten | Sun et al. 2014 (Ref #15) |
Tabel 1: Vergelijking van geselecteerde preklinische beroertemodellen. Gevulde dozen duiden op positiviteit (de aanwezigheid van bloedstolsels, bloedplaatjes en fibrine) of significante tPA-reactiviteit.
Aanvullende figuur 1: CBF-monitor na retro-orbitale injectie van trombine. (A) De representatieve foto's van retro-orbitale sinus (bovenste paneel) en bloedstroom door middel van laserspikkelcontrastbeeldvorming (onderste paneel). De drie vasculaire plaatsen (1~3 zoals gelabeld) werden gecontroleerd na trombine-injectie (80 E/kg) in de retro-orbitale sinus. (B) De representatieve traceergrafiek van de bloedstroom gedurende 15 minuten na trombine-injectie (pijl). (C) De op laserspikkels gebaseerde kwantificering toonde geen vermindering van de bloedstroom in de buurt van de retro-orbitale sinus binnen 15 minuten na trombine-injectie (n=4, p-waarde bepaald door ongepaarde t-toets). Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Gebrek aan fibrineafzetting in contralaterale hemisfeer 6 uur na fotoactivering. Immunokleuring van het anti-fibrinogeen (groen) toonde fibrineafzetting in de ipsilaterale cortex 6 uur na RB en T+RB fototrombose. Daarentegen was er geen disceribele fibrineafzetting in de contralaterale cortex na trombine-versterkte fototrombose. N=4 voor elke groep. Schaalbalk: 50 μm. Blauwe fluorescentie als de DAPI-nucleuskleuring. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Gebrek aan immunoglobuline (IgG) extravasatie na fototrombose. 6 uur na unilaterale MCA-gerichte fotoactivatie toonde immunokleuring extravasatie van IgG in de ipsilaterale hemisfeer, maar niet in de contralaterale hemisfeer, wat wijst op beperkte BBB-schade na trombine-versterkte fototrombose. N=4 voor elk. Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De traditionele RB fototrombotische beroerte, geïntroduceerd in 1985, is een aantrekkelijk model van focale cerebrale ischemie voor eenvoudige chirurgische ingrepen, lage mortaliteit en hoge reproduceerbaarheid van herseninfarct. 5 In dit model activeert de fotodynamische kleurstof RB snel bloedplaatjes bij lichtexcitatie, wat leidt tot dichte aggregaten die het bloedvat afsluiten 5,8,23. De kleine hoeveelheid fibrine in RB-geïnduceerde bloedstolsels (figuur 2) wijkt echter af van het dominante bloedplaatjes:fibrine gemengd patroon van trombi dat acuut werd opgehaald bij patiënten met een ischemische beroerte21,22. Het lage fibrinegehalte in RB-geïnduceerde trombi draagt waarschijnlijk ook bij aan de veerkracht tegen tPA-lytische behandeling 7,8,19. Hoewel ultraviolette laserbestraling vasculaire rekanalisatie induceert bij RB-fototrombose, is het onwaarschijnlijk dat deze experimentele therapie klinisch wordt gebruikt7. De traditionele RB fototrombotische beroerte is dus voornamelijk gebruikt als een permanent occlusiemodel, minder geschikt voor trombolyse- en neuroprotectieonderzoek (dit laatste maakt vaak gebruik van een intraluminaal hechtdraad MCAO-model met snelle vasculaire reperfusie na verwijdering van de mechanische occlusie).
We veronderstelden dat het gebruik van bijmenging van RB en een subtrombotische dosis trombine voor fotoactivering het fibrinegehalte in de daaropvolgende trombi kan verhogen en de respons op tPA-trombolyse, de echte beroertetherapie, kan verbeteren. Deze hypothese wordt ondersteund door de resultaten die hier en in ons oorspronkelijke rapport worden gepresenteerd. 23 Het trombine-versterkte fototrombotische beroertemodel behoudt ook de voordelen van een lage mortaliteit, eenvoudige chirurgische ingrepen en een hoge consistentie in de grootte en locatie van het infarct, zoals in het traditionele RB-fototrombosemodel. Daarom zijn wij van mening dat trombine-versterkte fototrombose een waardevolle aanvulling is op het repertoire van trombo-embolische beroertemodellen (tabel 1). Twee procedurele details van het trombine-versterkte fototrombosemodel verdienen bespreking. Ten eerste kan een overdosis intraveneuze trombine acute pulmonale trombo-embolie en diersterfte veroorzaken25. We onderzochten een reeks trombinedoses voor combinatie met RB-fototrombose, en de gekozen dosis van 80 E/kg heeft tot nu toe geen mortaliteit veroorzaakt bij >100 geëxperimenteerde volwassen mannelijke C57Bl/6-muizen. Het is waarschijnlijk dat de trombinedosis moet worden aangepast voor muizen met hyperstollingstoestanden26. Ten tweede hebben we routinematig de ipsilaterale CCA geligeerd naast MCA-gerichte fototrombose in onze procedures. We ontdekten dat ligatie van de ipsilaterale CCA de consistentie in infarctgrootte verder verhoogt, wat te wijten kan zijn aan een verminderde collaterale circulatie tussen MCA en de voorste plus achterste hersenslagaders.
Met zijn unieke eigenschappen kan het trombine-versterkte fototrombotische beroertemodel bijzonder nuttig zijn voor ten minste drie onderzoeksonderwerpen. Ten eerste is dit nieuwe model bij uitstek geschikt voor een rechtstreekse vergelijking van tPA en andere fibrinolytische middelen zoals Tenecteplase (TNKase)27. TNKase is een gemanipuleerde tPA-mutante variant met verhoogde fibrine-specificiteit en een lager risico op iatrogene bloeding in ex vivo experimenten. Toch is de superioriteit ervan ten opzichte van tPA alleen getest in een micro-embolisch beroertemodel en met behulp van een binaire neurologische uitkomstanalyse14. Gezien de hoge reproduceerbaarheid en kwantitatieve analyse van de infarctgrootte, kan het trombine-versterkte fototrombotische beroertemodel worden gebruikt om de voordelen en nadelige effecten van tPA-versus-TNKase in meerdere aspecten te vergelijken (bijv. dosisresponsen, therapeutisch venster, comorbiditeitseffecten en mogelijke bijwerkingen bij vertraagde behandeling). Ten tweede kan het trombine-versterkte fototrombosemodel nuttig zijn voor het onderzoeken van de effecten van gecombineerde tPA- en plaatjesaggregatieremmers bij acute ischemische beroerte28. Recente ontwikkelingen van endovasculaire procedures bij ischemische beroerte hebben onderzoekers in staat gesteld de histologische samenstelling van acute trombi te analyseren en een dominant, gemengd bloedplaatjes:fibrinepatroon21,22 te identificeren. Dienovereenkomstig kan de combinatie van een fibrinolyticum (tPA) en plaatjesaggregatieremmers de algehele werkzaamheid van trombolyse verhogen, maar een beroertemodel dat de klinische bloedplaatjes:fibrinesamenstelling van trombus simuleert, is cruciaal voor dergelijk onderzoek. Samen met de tHI- en embli-MCAO-modellen voldoet trombine-fototrombose aan deze eis en onderscheidt het zich door zijn lage mortaliteit, eenvoudige chirurgische ingrepen en het ontbreken van systemische cardiovasculaire effecten (tabel 1).
Last but not least kan trombine-versterkte fototrombose bijzonder nuttig zijn voor het onderzoeken van door een beroerte geïnduceerde collaterale circulatie, gezien de voorspelbare locatie rond het peri-infarct in het MCA-leverende gebied. Door de halfschaduw in stand te houden om de groei van het infarct te compenseren, wordt collaterale circulatie steeds meer erkend als een belangrijke voorspeller van de uitkomsten van ischemische beroertes, omdat acute vasculaire obstructie de bloedstroom over het collaterale netwerk bevordert, gevolgd door remodellering en angiogenese om neo-collaterale vaten te vormen29,30. De resultaten suggereren dat tPA niet alleen de rekanalisatie van de proximale MCA bevordert, maar ook de collaterale circulatie in de periferie van het MCA-leverende gebied verhoogt (Figuur 4). Een beter begrip van de mechanismen die de plasticiteit van collaterale circulatie reguleren, kan nieuwe therapieën suggereren. Aangezien het trombine-versterkte fototrombotische beroertemodel het voordeel biedt van een voorspelbaar peri-infarctgebied en gevoeligheid voor lytische behandeling, zal het het onderzoek naar de collaterale circulatie na een beroerte ondersteunen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de NIH-subsidies (NS108763, NS100419, NS095064 en HD080429 aan C.Y.K.; en NS106592 aan Y.Y.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | infarct |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 543nm laser beam | Melles Griot | 25-LGP-193-249 | photothrombosis |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~14 weeks old (22~30 g) |
| Anesthesia bar for mouse adaptor | machine shop, UVA | surgical setup | |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Dental drill | Dentamerica | Rotex 782 | surgical setup |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | brain imaging |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| infusion pump | KD Scientific | 200 | thrombolytic treatment |
| Insulin syringe with 31G needle | BD | 328291 | photothrombosis |
| Ketamine | CCM, UVA | anesthesia | |
| Laser protective google 532nm | Thorlabs | LG3 | photothrombosis |
| Ketoprofen | CCM, UVA | NSAID analgesia | |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mouse adaptor | RWD | 68014 | surgical setup |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| Retractor tips | Kent Scientific | Surgi-5014-2 | surgical setup |
| Rose Bengal | Sigma | 198250 | photothrombosis |
| Thrombin | Sigma | T7513 | photothrombosis |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| tPA | Genetech | Cathflo activase 2mg | thrombolytic treatment |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | TTC infacrt |
| Xylazine | CCM, UVA | anesthesia |
References
- Lyden, P. D. Thrombolytic Therapy for Acute Stroke. 3/e. , Springer. (2015).
- Linfante, I., Cipolla, M. J. Improving reperfusion therapies in the era of mechanical thrombectomy. Translational Stroke Research. 7 (4), 294-302 (2016).
- Campbell, B. C., et al. Endovascular Therapy for Ischemic stroke with perfusion-imaging selection. The New England Journal of Medicine. 372 (11), 1009-1018 (2015).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (7), 1310-1316 (2012).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
- Watson, B. D., Prado, R., Veloso, A., Brunschwig, J. P., Dietrich, W. D. Cerebral blood flow restoration and reperfusion injury after ultraviolet laser-facilitated middle cerebral artery recanalization in rat thrombotic stroke. Stroke. 33 (2), 428-434 (2002).
- Uzdensky, A. B. Photothrombotic stroke as a model of ischemic stroke. Translational Stroke Research. 9 (5), 437-451 (2018).
- Karatas, H., et al. Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (3), 1452-1460 (2011).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Orset, C., et al. Efficacy of Alteplase in a mouse model of acute ischemic stroke: A retrospective pooled analysis. Stroke. 47 (5), 1312-1318 (2016).
- Kudo, M., Aoyama, A., Ichimori, S., Fukunaga, N. An animal model of cerebral infarction. Homologous blood clot emboli in rats. Stroke. 13 (4), 505-508 (1982).
- Busch, E., Kruger, K., Hossmann, K. A. Improved model of thromboembolic stroke and rt-PA induced reperfusion in the rat. Brain Research. 778 (1), 16-24 (1997).
- Lapchak, P. A., Araujo, D. M., Zivin, J. A. Comparison of Tenecteplase with Alteplase on clinical rating scores following small clot embolic strokes in rabbits. Experimental Neurology. 185 (1), 154-159 (2004).
- Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-Edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9 (6), 98807 (2014).
- Sun, Y. Y., et al. Prophylactic Edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: Implications for perioperative neuroprotection. Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).
- Sun, Y. Y., et al. Sickle mice are sensitive to hypoxia/ischemia-induced stroke but respond to tissue-type plasminogen activator treatment. Stroke. 48 (12), 3347-3355 (2017).
- Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. A thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxia-ischemia. Journal of Visualized Experiments. (102), e52978 (2015).
- Pena-Martinez, C., et al. Pharmacological modulation of neutrophil extracellular traps reverses thrombotic stroke tPA (tissue-type plasminogen activator) resistance. Stroke. 50 (11), 3228-3237 (2019).
- Denorme, F., et al. ADAMTS13-mediated thrombolysis of t-PA-resistant occlusions in ischemic stroke in mice. Blood. 127 (19), 2337-2345 (2016).
- Marder, V. J., et al. Analysis of thrombi retrieved from cerebral arteries of patients with acute ischemic stroke. Stroke. 37 (8), 2086-2093 (2006).
- Bacigaluppi, M., Semerano, A., Gullotta, G. S., Strambo, D. Insights from thrombi retrieved in stroke due to large vessel occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (8), 1433-1451 (2019).
- Sun, Y. Y., et al. A murine photothrombotic stroke model with an increased fibrin content and improved responses to tPA-lytic treatment. Blood Advances. 4 (7), 1222-1231 (2020).
- Su, E. J., et al. Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke. Nature Medicine. 14 (7), 731-737 (2008).
- Gupta, A. K., et al. Protective effects of gelsolin in acute pulmonary thromboembolism and thrombosis in the carotid artery of mice. PLoS One. 14 (4), 0215717 (2019).
- Carroll, B. J., Piazza, G. Hypercoagulable states in arterial and venous thrombosis: When, how, and who to test. Vascular Medicine. 23 (4), 388-399 (2018).
- Coutts, S. B., Berge, E., Campbell, B. C., Muir, K. W., Parsons, M. W. Tenecteplase for the treatment of acute ischemic stroke: A review of completed and ongoing randomized controlled trials. International Journal of Stroke. 13 (9), 885-892 (2018).
- McFadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. Current and future antiplatelet therapies: emphasis on preserving haemostasis. Nature Reviews Cardiology. 15 (3), 181-191 (2018).
- Bang, O. Y., Goyal, M., Liebeskind, D. S. Collateral crculation in ischemic stroke: Assessment tools and therapeutic strategies. Stroke. 46 (11), 3302-3309 (2015).
- Faber, J. E., Chilian, W. M., Deindl, E., van Royen, N., Simons, M. A brief etymology of the collateral circulation. Arteriosclerosis, Thrombsis, Vascular Biology. 34 (9), 1854-1859 (2014).
