Summary
Les modèles traditionnels d’AVC photothrombotique (PTS) induisent principalement des agrégats plaquettaires denses d’une haute résistance au traitement lytique par activateur tissulaire du plasminogène (tPA). Ici, un modèle PTS murin modifié est introduit en co-injectant de la thrombine et un colorant photosensible pour la photoactivation. Le modèle PTS amélioré par la thrombine produit des caillots mixtes plaquettaire/fibrine et est très sensible à la thrombolyse tPA.
Abstract
Un modèle idéal d’AVC thromboembolique nécessite certaines propriétés, notamment des procédures chirurgicales relativement simples avec une faible mortalité, une taille et une localisation d’infarctus constantes, une précipitation de caillots sanguins mélangés plaquettaire/fibrine similaires à ceux des patients, et une sensibilité adéquate au traitement fibrinolytique. Le modèle d’AVC photothrombotique à base de colorant rose bengale (RB) répond aux deux premières exigences, mais est hautement réfractaire au traitement lytique médié par le tPA, probablement en raison de sa composition en caillots riche en plaquettes, mais pauvre en fibrine. Nous pensons que la combinaison d’un colorant RB (50 mg/kg) et d’une dose sub-thrombotique de thrombine (80 U/kg) pour la photoactivation visant la branche proximale de l’artère cérébrale moyenne (MCA) peut produire des caillots enrichis en fibrine et sensibles au tPA. En effet, le modèle de photothrombose combinée à la thrombine et à la RB (T+RB) a déclenché des caillots sanguins mixtes plaquette/fibrine, comme le montrent l’immunomarquage et les immunoblots, et a maintenu des tailles et des emplacements d’infarctus constants ainsi qu’une faible mortalité. De plus, l’injection intraveineuse de tPA (Alteplase, 10 mg/kg) dans les 2 heures suivant la photoactivation a significativement diminué la taille de l’infarctus dans la photothrombose T+RB. Ainsi, le modèle d’AVC photothrombotique amélioré par la thrombine peut être un modèle expérimental utile pour tester de nouvelles thérapies thrombolytiques.
Introduction
La thrombectomie endovasculaire et la thrombolyse médiée par tPA sont les deux seules thérapies approuvées par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis pour l’AVC ischémique aigu, qui touche ~700 000 patients chaque année aux États-Unis1. Étant donné que l’application de la thrombectomie est limitée à l’occlusion des gros vaisseaux (LVO), alors que la thrombolyse tPA peut soulager les occlusions des petits vaisseaux, les deux sont des thérapies précieuses de l’AVC ischémique aigu2. De plus, la combinaison des deux thérapies (p. ex., l’initiation de la thrombolyse tPA dans les 4,5 heures suivant le début de l’AVC, suivie d’une thrombectomie) améliore la reperfusion et les résultats fonctionnels3. Ainsi, l’optimisation de la thrombolyse reste un objectif important pour la recherche sur l’AVC, même à l’ère de la thrombectomie.
Les modèles thromboemboliques sont un outil essentiel pour la recherche préclinique sur l’AVC visant à améliorer les thérapies thrombolytiques. Cela est dû au fait que les modèles d’occlusion vasculaire mécanique (par exemple, l’occlusion MCA de suture intraluminale) ne produisent pas de caillots sanguins et que la récupération rapide du flux sanguin cérébral après l’ablation de l’occlusion mécanique est trop idéalisée 4,5. À ce jour, les principaux modèles thromboemboliques comprennent la photothrombose 6,7,8, l’application topique de chlorure ferrique (FeCl3)9, la micro-injection de thrombine dans la branche MCA 10,11, l’injection ex vivo de (micro)emboles dans le MCA ou l’artère carotide commune (ACC)12,13,14 et l’hypoxie-ischémie transitoire (tHI)15,16, Chapitre 17 et 18. Ces modèles d’AVC diffèrent par la composition histologique des caillots qui en résultent et la sensibilité aux thérapies lytiques médiées par le tPA (tableau 1). Ils varient également en ce qui concerne l’exigence chirurgicale de la craniotomie (nécessaire pour l’injection in situ de thrombine et l’application topique de FeCl3), la constance de la taille et de la localisation de l’infarctus (par exemple, la perfusion d’ACC de microemboles donne des résultats très variables) et les effets globaux sur le système cardiovasculaire (par exemple, l’IHI augmente la fréquence cardiaque et le débit cardiaque pour compenser la vasodilatation périphérique induite par l’hypoxie).
Le modèle d’AVC photothrombotique (PTS) basé sur le colorant RB présente de nombreuses caractéristiques intéressantes, notamment des procédures chirurgicales simples sans craniotomie, une faible mortalité (généralement < 5 %) et une taille et une localisation prévisibles de l’infarctus (dans le territoire fournissant l’ACM), mais il présente deux limites majeures. 8 La première mise en garde est la réponse faible à nulle au traitement thrombolytique médié par le tPA, ce qui est également un inconvénient du modèle FeCl3 7,19,20. La deuxième mise en garde des modèles d’AVC PTS et FeCl3 est que les thrombus qui en résultent sont constitués d’agrégats plaquettaires densément emballés avec une petite quantité de fibrine, ce qui non seulement conduit à sa résilience au traitement tPA-lytique, mais s’écarte également du modèle de thrombus plaquettaire/fibrine mélangés chez les patients ayant subi un AVC ischémique aigu21,22. En revanche, le modèle de thrombine-microinjection in situ comprend principalement de la fibrine polymérisée et une teneur incertaine en plaquettes10.
Compte tenu du raisonnement ci-dessus, nous avons émis l’hypothèse que l’association de RB et d’une dose sous-thrombotique de thrombine pour la photoactivation ciblée par l’ACM à travers un crâne aminci peut augmenter la composante fibrine dans les thrombus résultants et augmenter la sensibilité au traitement lytique médié par tPA. Nous avons confirmé cette hypothèse23 et nous décrivons ici en détail les procédures du modèle d’AVC photothrombotique modifié (T+RB).
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Protocol
Ce protocole est approuvé par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Virginie et suit les lignes directrices des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. La figure 1A décrit la séquence des interventions chirurgicales de ce protocole.
1. Configuration de la chirurgie
- Placez un coussin chauffant avec une température réglée à 37 °C sur l’adaptateur pour petit animal au moins 15 minutes avant l’opération. Préparez un rouleau de pince-nez pour l’adaptateur qui permet la rotation de la tête de l’animal. Préparer les anesthésiques Kétamine (60 mg/kg)/Xylazine (10 mg/kg).
- Stériliser les outils chirurgicaux, y compris les ciseaux, les pinces, les porte-micro-aiguilles, les hémostatiques, les cotons-tiges et les sutures avec un autoclave (121 °C à 15 psi pendant 60 min). Préparez de la colle pour tissus et de la pommade pour les yeux. Préparez les lunettes de protection laser 532 nm pour les chirurgiens.
REMARQUE : Ce protocole décrit une intervention chirurgicale de survie majeure et doit être effectué à l’aide de techniques aseptiques. - Installez le système d’éclairage avec une source laser de 532 nm. Préparez une perceuse dentaire.
- Préparez la solution de Rose Bengal dans une solution saline (10 mg/mL). Placer une aliquote de thrombine bovine (0,1 U/μL) dans un seau à glace.
- Injecter du kétoprofène (4,0 mg/kg) par voie sous-cutanée à la souris comme analgésie 30 min avant la chirurgie ou utiliser le schéma analgésique recommandé par les directives institutionnelles locales.
2. Ligature de l’artère carotide commune ipsilatérale
- Anesthésier des souris mâles C57BL/6NCrl âgées de 10 à 14 semaines pesant de 22 à 30 g par injection intramusculaire de kétamine (60 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg).
REMARQUE : L’ensemble de l’intervention chirurgicale, englobant la ligature de l’artère carotide commune ipsilatérale par la surveillance du flux sanguin cérébral, devrait prendre ~ 120 min. Le régime anesthésique sera généralement efficace pendant toute cette durée, mais la profondeur de l’anesthésie doit être réévaluée au moins toutes les 15 minutes. Lors de l’apprentissage de ces procédures, il peut être nécessaire de redoser l’anesthésie. - Effectuez un pincement des orteils pour vous assurer que l’animal est complètement anesthésié. Enlevez les poils du cou gauche pour la ligature de l’ACC et de la tête pour l’amincissement du crâne avec la crème dépilatoire.
- Placez la souris sur l’adaptateur pour petit animal en position couchée sur le dos. Stérilisez la zone chirurgicale en essuyant la peau avec trois pulvérisations alternées de povidone iodée et d’éthanol à 70 %.
- Fixez la tête de la souris à l’aide de barres d’oreille. À l’aide d’un microscope à dissection, faites une incision cervicale gauche de 0,5 cm à l’aide d’une paire de micro-ciseaux et d’une pince droite à environ 0,2 cm latéralement de la ligne médiane.
- Utilisez une paire de pinces finement dentelées pour séparer les tissus mous et le fascia afin d’exposer l’artère carotide commune gauche (LCCA). Séparez soigneusement l’ACC gauche du nerf vagal à l’aide d’une paire de pinces fines et lisses.
- Placez une suture permanente à double nœud autour du LCCA à l’aide d’une suture en soie 5-0 coupée en segments de 20 mm, puis fermez la plaie à l’aide de pinces stériles.
3. Amincissement du crâne au-dessus de la branche MCA et photoactivation
- Retournez la souris en position couchée sur l’adaptateur pour petits animaux. Faites pivoter le rouleau du pince-nez de 15°. Stérilisez la zone chirurgicale en essuyant la peau avec trois pulvérisations alternées de bétadine et d’éthanol à 70 %.
- Faites une incision de 0,8 cm dans le cuir chevelu à l’aide d’une paire de micro-ciseaux et d’une pince droite le long de l’œil gauche et de l’oreille pour exposer le muscle temporal, qui est situé entre l’œil et l’oreille (Figure 1B).
- Sous le microscope à dissection, faites une incision de 0,5 cm le long du bord du muscle temporal sur l’os pariétal gauche à l’aide d’une paire de pinces finement dentelées. Faites une deuxième incision verticale de 0,3 cm sur le muscle temporal à l’aide d’un micro ciseaux. Rétractez le muscle temporal pour exposer le bord de l’os pariétal et de l’os squamosal. Assurez-vous de visualiser le point de repère de la suture coronale entre les os frontaux et pariétaux (Figure 1B,C).
- Humidifiez le crâne en appliquant une solution saline stérile pour révéler le MCA gauche. Marquez la branche proximale de l’ACM sur l’os squamosal à l’aide d’un marqueur. Tracez doucement un cercle d’environ 1 mm de diamètre autour de la zone marquée avec la perceuse dentaire pneumatique (réglage de la vitesse de la bavure à 50 % du contrôleur de vitesse), puis amincissez le crâne d’environ 0,2 mm de profondeur sans toucher la dure-mère inférieure. Arrêtez le forage jusqu’à ce qu’il ne reste plus qu’une très fine couche d’os.
- Mélanger la solution de thrombine (T, 0,1 U/μL, 80 U/kg) et de Rose bengal (RB, 10 mg/mL, 50 mg/kg) en fonction du poids corporel de la souris. Par exemple, pour une souris de 25 g de poids corporel, mélangez 20 μL de thrombine (0,1 U/μL) et 125 μL de RB (10 mg/mL).
- Injecter lentement la solution T+RB (145 μL par 25 g de poids corporel) dans le sinus rétro-orbitaire à l’aide d’une seringue à insuline (aiguille #31G).
NOTA : Dans les expériences pilotes, le taux de mortalité des doses croissantes de thrombine mélangées à la dose standard de colorant RB (50 mg / kg) a été examiné pour la photoactivation. La mortalité était de 0 % pour la thrombine à 80 U/kg (n = 13), de 43 % pour la thrombine à 120 U/kg (n = 7) et de 100 % pour la thrombine à 160 U/kg (n = 5) et à 200 U/kg (n = 5). Une dose de 80 U/kg de thrombine a donc été choisie pour ce modèle. L’imagerie par gabarit laser a également été utilisée pour exclure la possibilité d’une coagulation sanguine rampante près de la cavité orbitaire après l’injection de T+RB dans les sinus rétro-orbitaires (figure supplémentaire 1), ainsi que d’un dépôt généralisé de fibrine dans l’hémisphère controlatéral qui n’a pas été soumis à un éclairage laser (figure supplémentaire 2). - Appliquez une pommade pour les yeux sur les deux yeux pour prévenir la sécheresse.
- Appliquez l’illuminateur avec une lumière laser de 532 nm (avec une énergie de 0,5 mW) sur le site foré à une distance de 2 pouces pendant 20 minutes. Visualisez l’éclairage sur la branche proximale de l’ACM à l’aide d’un masque de protection laser (Figure 1, C, D).
REMARQUE : Le MCA avec un éclairage de 532 nm montre une fluorescence rouge sous les lunettes. L’ACM distale disparaîtra après 10 min d’éclairage. Exclure l’animal si le flux distal de MCA est toujours présent après 20 min d’éclairage. - Arrêtez l’éclairage laser après 20 min. Fermez la plaie avec des pinces stériles.
4. Imagerie intravitale (facultatif)
NOTE : Pour caractériser la formation du thrombus in vivo, utiliser l’imagerie intravirale par un disque de spin confocal avec système de photoactivation23.
- Faites une fenêtre crânienne de ~3 mm de diamètre sur l’os pariétal du crâne.
- Placez une vitre de protection sur la fenêtre crânienne et localisez le MCA distal (~50 μm de diamètre) sous un objectif d’immersion dans l’eau 20x.
- Étiqueter la plaquette circulante par injection dans la veine caudale d’anticorps anti-GPIbβ conjugué DyLight488 (0,1 mg/kg) à 5 min avant l’imagerie.
- Injecter la solution de mélange de thrombine (80 U/kg) et de Rose bengal (50 mg/kg) par rétro-orbitale à 5 min avant l’imagerie.
- Photoactivez le MCA à l’aide d’un système laser de 561 nm avec un faisceau laser de 10 μm de diamètre et enregistrez l’image jusqu’à la formation du thrombus.
5. Administration du tPA
- Placez l’animal anesthésié sur un tampon chaud à 37 °C. Au moment choisi après la photoactivation, mouillez une gaze avec de l’eau tiède ~45 °C et enroulez-la sur la queue pendant 1 min.
- Injecter du tPA humain recombinant (10 mg/kg) par la veine caudale avec un bolus de 50 % et 50 % pendant 30 min par pompe à perfusion.
REMARQUE : Bien que la dose clinique de tPA humain recombinant pour le traitement de l’AVC ischémique aigu soit de 0,9 mg/kg, une dose plus élevée (10 mg/kg) est couramment utilisée chez les rongeurs pour compenser la réduction de la réactivité du tPA entre espèces. Nous avons également suivi le protocole standard d’administration de tPA dans des modèles précliniques d’AVC, en utilisant 50 % comme bolus et 50 % perfusés par la veine caudale pendant 30 minutes.
6. Surveiller le débit sanguin cérébral (CBF)
REMARQUE : Pour confirmer la récupération du CBF après le traitement par tPA, utilisez un système d’imagerie bidimensionnel par contraste de chatoiementau laser 15 et enregistrez immédiatement après la photothrombose (étape 3.9) ou 24 h après le traitement par tPA.
- Placez l’animal anesthésié en position couchée et faites une incision médiane sur le cuir chevelu avec le crâne exposé.
- Hydratez le crâne avec une solution saline stérile et appliquez délicatement le gel à ultrasons sur le crâne. Évitez les cheveux et les bulles dans le gel, qui interféreront avec le signal CBF.
- Surveillez le CBF dans les deux hémisphères cérébraux à l’aide d’un imageur de contraste laser à taches pendant 10 minutes.
- Après avoir enregistré l’image CBF, fermez le cuir chevelu avec de la colle tissulaire et remettez l’animal dans la cage.
- Analysez le CBF dans les régions sélectionnées et calculez le pourcentage de récupération du CBF par rapport à la région controlatérale.
- Ensuite, replacez l’animal dans une cage chaude pour le récupérer. Surveillez les souris pendant 5 à 10 minutes jusqu’à ce qu’elles se remettent de l’anesthésie. Placez les aliments mouillés dans la cage et rapportez-les à l’établissement de soins aux animaux.
REMARQUE : Fournir une analgésie postopératoire comme recommandé par les directives de l’établissement local.
7. Mesure du volume de l’infarctus par coloration au chlorure de triphényltétrazolium (TTC)
- Vingt-quatre heures après la photothrombose, anesthésiez profondément l’animal conformément aux directives institutionnelles locales pour la chirurgie de non-survie.
REMARQUE : Nous administrons du tribromoéthanol (avertin) 250 mg / kg par injection intrapéritonéale (IP). - Effectuez une perfusion transcardique avec PBS, collectez du cerveau frais et incorporez-le dans du gel d’agar à 3 %.
- Sectionner la tranche de cerveau de 1 mm d’épaisseur par vibratome et incuber dans une solution à 2% TTC pendant 10 min.
- Quantifier le volume total de l’infarctus à partir de 6 tranches de cerveau en tant que volume absolu par le logiciel ImageJ.
REMARQUE : L’œdème cérébral n’a pas été utilisé comme mesure des résultats pour deux raisons. Tout d’abord, la coloration TTC mesure la viabilité tissulaire (via l’activité de réduction mitochondriale) qui est une conséquence plus sévère que l’œdème. Deuxièmement, au fur et à mesure que l’infarctus se déroule, un œdème vasogénique et cytotoxique se produit et ne peut pas être facilement distingué par les méthodes standard de mesure de l’œdème cérébral. Cependant, nous avons utilisé le marquage anti-immunoglobine (IgG) pour évaluer l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BHE), et nous avons trouvé une extravasation d’IgG comparable à 6 h après la photoactivation dans les modèles d’AVC RB et T+RB (Figure 3 supplémentaire).
8. Mesure de la formation de thrombus
REMARQUE : Pour mesurer la formation du thrombus, prélever le cerveau 1 h et 2 h après la photothrombose pour la mesure du thrombus dans l’ACM par immunochimie (IHC) et pour la mesure de la fibrine dans l’hémisphère cérébral par immunoblot, respectivement.
- Effectuer l’IHC pour la caractérisation de la composition du caillot. Fixez le cerveau avec 4 % de paraformaldéhyde pendant la nuit, puis déshydratez le cerveau avec 30 % de saccharose pour l’intégration de l’OCT.
- Sectionnez le cerveau avec une orientation sagittale de 20 μm d’épaisseur et effectuez l’IHC avec des anticorps spécifiques contre le fibrinogène, les plaquettes (glycoprotéine IIb), les globules rouges (TER119) et les vaisseaux sanguins (isolectine GS-IB4).
- Effectuer la mesure de la fibrine dans l’hémisphère cérébral par immunoblot avec un anticorps contre le fibrinogène.
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Representative Results
Tout d’abord, nous avons comparé la teneur en fibrine dans les caillots sanguins induits par la photothrombose RB par rapport à T+RB. Des souris ont été sacrifiées par perfusion transcardique de fixateurs 2 h après la photoactivation, et des cerveaux ont été prélevés pour la coloration par immunofluorescence de la branche MCA dans les plans longitudinaux et transversaux. Dans la photothrombose RB, la branche MCA était densément remplie de plaquettes CD41+ et de peu de fibrine (Figure 2A,C). En revanche, la branche MCA de la photothrombose T+RB a été occluse par des caillots plaquettaires/fibrine mélangés au hasard (Figure 2B,D, n>3 pour chacun). Nous avons également utilisé des immunoblots pour comparer le taux de fibrine (ogène) dans le cortex cérébral entre les deux modèles, après perfusion transcardique avec une solution saline à 2 h après la photoactivation. Cette analyse a montré > multiplication par deux du dépôt de fibrine dans l’hémisphère ipsilatéral en T+RB par rapport à la photothrombose RB (Figure 2E, p = 0,027 par test t non apparié ; n = 3 pour chaque groupe). Dans notre rapport original, nous avons également utilisé la photoactivation d’un seul vaisseau au microscope confocal et l’imagerie intravitale pour comparer les comportements des plaquettes conjuguées anti-GP1bβ marquées au FITC. 23 Ces expériences ont montré que l’injection intraveineuse de 80 U/kg de thrombine n’a pas réussi à induire d’agrégats plaquettaires même sous éclairage laser (Figure 3A), et que les plaquettes forment des caillots homogènes dans le modèle de photothrombose RB (Figure 3B), mais des agrégats inégaux avec de multiples régions faibles dans la photothrombose T+RB (Figure 3C). Ces résultats suggèrent que la photothrombose T+RB augmente la teneur en fibrine dans les thrombus qui en résultent.
Ensuite, nous avons comparé les effets d’un traitement aigu par tPA par voie intraveineuse (10 mg/kg d’Alteplase, 30 min après la photoactivation) sur la récupération du débit sanguin cérébral (CBF) entre les deux modèles. Le CBF de la même souris avant et 24 h après le traitement par tPA par rapport au véhicule a été mesuré par imagerie par contraste laser et normalisé à l’hémisphère controlatéral (Figure 4A, B). Dans la photothrombose RB, le traitement par tPA a conduit à une tendance à la récupération du CBF, en particulier dans la zone de bordure ischémique, par rapport aux souris traitées par véhicule (Figure 4C, véhicule 51 ± 9 % vs tPA 65 ± 7 %, p = 0,3 par test t non apparié, n = 4 pour chacun). Dans la photothrombose T+RB, la récupération du CBF chez les souris traitées par tPA était plus importante, et les branches proximales de l’ACM devenaient souvent visibles à 24 h (Figure 4D, véhicule 55 ± 3 % vs tPA 81 ± 7 %, p = 0,02 par test t non apparié, n = 6 pour chaque groupe). Ces résultats suggèrent une plus grande sensibilité au traitement tPA-lytique par T+RB qu’à la photothrombose RB.
Enfin, nous avons utilisé la coloration TTC pour quantifier les effets du traitement tPA sur la taille de l’infarctus dans les modèles d’AVC photothrombotique RB et T+RB. Dans la photothrombose RB, une taille d’infarctus similaire a été détectée chez des souris traitées par véhicule (18 ± 2,80 mm 3, n = 6) et traitées par tPA (18 ± 1,95 mm3, n = 10 ; 10 mg/kg de tPA ont été injectés 30 min après la photoactivation) (Figure 5A). En revanche, le traitement tPA-lytique a significativement réduit l’infarctus lorsque le tPA a été injecté à 0,5 h (7 ± 2,1 mm 3, n = 9), 1 h (4,6 ± 1 mm 3, n = 10) ou 2 h (6,4 ± 1,5 mm 3, n = 8 ), mais pas à 6 h après la photoactivation (15,2 ± 3,1 mm 3, n = 7), par rapport aux souris traitées par véhicule (14,8 ± 2 mm 3, n = 19) (Figure 5B, valeur de p déterminée par un test t non apparié). Ces résultats indiquent que le modèle d’AVC photothrombotique T+RB a une sensibilité au traitement tPA-lytique dans le.
Figure 1 : Aperçu des procédures. (A) L’organigramme des principales interventions chirurgicales dans le modèle d’AVC photothrombotique T+RB. La ligature de l’artère carotide commune ipsilatérale (ACC) est facultative, mais nous avons constaté qu’elle rend la taille de l’infarctus plus constante, probablement en raison d’une diminution de la circulation collatérale. (B) Vue de dessus et de côté du cerveau de la souris en relation avec le crâne. Les yeux, l’oreille, le muscle temporal, l’artère cérébrale moyenne (ACM) et les branches, la suture coronaire et le site d’éclairage laser sont également indiqués. (C) Visualisation de la branche MCA ciblée sous le crâne aminci (C1) et pendant l’éclairage laser (C2), et arrêt du flux sanguin après photoactivation (C3). Notez la relation entre la branche MCA et la suture coronale. (D) La mise en place d’une souris pendant l’éclairage laser sur la branche gauche de l’ACM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Différentes teneurs en fibrine dans les caillots sanguins. (A-D) Marquage par immunofluorescence des thrombus induits par la photothrombose RB et T+RB dans la branche distale de l’ACM dans un plan longitudinal (A, B) ou transversal (C, D) à l’aide de marqueurs anti-fibrine (vert), anti-CD41/plaquette (rouge) et isolectine B4/cellule endothéliale (bleu). A noter l’augmentation marquée des immunosignaux anti-fibrine dans les caillots sanguins induits par la photothrombose T+RB (B, D, n=3 pour chaque groupe). (E) L’immunotransfert a indiqué un dépôt de fibrine plus important dans le cortex cérébral ipsilatéral en T+RB que dans la photothrombose RB 2 h après la photoactivation (n = 3 pour chacun). ONU : souris indemnes ; Cont : cortex controlatéral ; Ipsi : cortex ipsilatéral. Barre d’échelle : 50 μm. Ce chiffre est modifié avec l’autorisation de [23]. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Imagerie intravitale des réponses plaquettaires. Imagerie intravitale confocale au microscope de plaquettes conjuguées marquées à l’anti-GP1bβ par FITC sous un éclairage laser à vaisseau unique (à l’endroit indiqué par des flèches blanches). Les groupes expérimentaux sont : (A) la thrombine seule, (B) la rose Bengale seule, et (C) la thrombine plus la rose du Bengale. Les temps après l’illumination laser sont étiquetés. Voir la vidéo sur le site de JoVE pour ce manuscrit. Barre d’échelle : 50 μm. Ce chiffre est modifié avec l’autorisation de [23]. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Effets du traitement par tPA sur la récupération du CBF. Le tPA humain recombinant (Alteplase, 10 mg/kg) ou le véhicule a été administré par voie caudale à des souris présentant un problème de photothrombose RB et T+RB à 30 min après l’illumination laser, et le flux sanguin cérébral (CBF) avant et 24 h après le traitement chez la même souris a été comparé à l’imagerie par contraste de chatoiement au laser. Le CBF dans une zone de 3 x 4,8 mm sur les deux hémisphères a été mesuré. Les groupes expérimentaux sont : (A, C) photothrombose RB ; (B, D) Photothrombose T+RB. On notera la récupération significative du CBF par le traitement tPA dans le groupe photothrombose T+RB (p=0,02 par test t non apparié, n= 4 pour le véhicule et n=6 pour le traitement tPA) et la visualisation fréquente de la branche proximale de l’ACM. Dans la photothrombose RB, le traitement par tPA a conduit à une tendance à l’amélioration du CBF, principalement au niveau de la zone ischémique périphérique (p = 0,3 par test t non apparié, n = 4 pour le véhicule et n = 5 pour le traitement par tPA). Les flèches blanches indiquent le site de photoactivation de l’ACM. Ce chiffre est modifié avec l’autorisation de [23]. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Effets du traitement tPA sur la taille de l’infarctus. (A) Le traitement par tPA par voie intraveineuse (Alteplase, 10 mg/kg) 30 min après l’échec de la photothrombose RB à réduire la taille de l’infarctus (n = 6 chez les souris traitées par véhicule et n = 10 chez les souris traitées par tPA). (B) En revanche, dans la photothrombose T+RB, un traitement intraveineux à 10 mg/kg d’altéplase à 0,5, 1 ou 2 h, mais pas 6 h après la photoactivation, a conduit à une réduction significative de la taille de l’infarctus. La valeur de p a été déterminée par ANOVA à un facteur avec le test de comparaisons multiples de Tukey. Ce chiffre est modifié avec l’autorisation de [23]. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Modèle | Intervention chirurgicale | Caillots sanguins | Plaquettes | Fibrine | Réactivité tPA | Caractéristiques principales/utilitaire | Références clés |
| Suture intraluminale MCAO | Occlusion endovasculaire de l’ACM | Non | N/A | N/A | Non | Reperfusion rapide ; Étude de neuropréction ; Lésion de la BHE induite par le tPA | Longa et al., 1989 (Réf #5) |
| Photothrombose | Amincissement et photoactivation du crâne | Oui | Faible | Haute reproductibilité ; Faible mortalité | Watson et al., 1985 (Réf. #6) | ||
| Thrombine-photothrombose | UCCAO, Amincissement et photoactivation du crâne | Oui | Oui | Haute reproductibilité ; Faible mortalité | Sun et al. 2020 (Réf #23) | ||
| FeCl3 (sur le MCA) | Amincissement du crâne et activation chimique | Oui | Non | Haute reproductibilité ; Faible mortalité | Karatas et al. 2011 (Réf #69) | ||
| Injection in situ de thrombine | Craniotomie et micro-injection d’ACM | Oui | Oui | Haute reproductibilité ; faible mortalité ; Traitement tPA-lytique | Orset et al. 2007 (Réf #10) | ||
| Emboli-MCAO | Occlusion endovasculaire de l’ACM | Oui | Oui | traitement tPA-lytique ; Dureté variable du caillot | Busch et al. 1997 (Réf #13) | ||
| Hypoxie-ischémie transitoire (tHI) | UCCAO plus hypoxie | Oui | Oui | Infarctus > la zone MCA ; Effets systémiques sur les maladies cardiovasculaires | Sun et al., 2014 (Réf #15) |
Tableau 1 : Comparaison de modèles précliniques d’AVC sélectionnés. Les cases remplies indiquent la positivité (présence de caillots sanguins, de plaquettes et de fibrine) ou une réactivité significative du tPA.
Figure 1 supplémentaire : Moniteur CBF après injection rétro-orbitale de thrombine. (A) Les photos représentatives du sinus rétro-orbitaire (panneau supérieur) et du flux sanguin par imagerie laser par contraste de chatoiement (panneau inférieur). Les trois sites vasculaires (1 ~ 3 comme marqué) ont été surveillés après injection de thrombine (80 U / kg) dans le sinus rétro-orbitaire. (B) Le graphique représentatif du débit sanguin pendant 15 min après l’injection de thrombine (flèche). (C) La quantification par laser par spectrométrie n’a montré aucune réduction du flux sanguin près du sinus rétro-orbitaire dans les 15 minutes suivant l’injection de thrombine (n = 4, valeur p déterminée par un test t non apparié). Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.
Figure supplémentaire 2 : Absence de dépôt de fibrine dans l’hémisphère controlatéral 6 heures après la photoactivation. L’immunomarquage de l’anti-fibrinogène (vert) a montré un dépôt de fibrine dans le cortex ipsilatéral 6 h après la photothrombose RB et T+RB. En revanche, il n’y a pas eu de dépôt de fibrine discerable dans le cortex controlatéral après une photothrombose renforcée par la thrombine. N = 4 pour chaque groupe. Barre d’échelle : 50 μm. Fluorescence bleue comme coloration du noyau DAPI. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.
Figure 3 : Absence d’extravasation d’immunoglobulines (IgG) après photothrombose. À 6 h après la photoactivation unilatérale ciblée par l’ACM, l’immunomarquage a montré une extravasation des IgG dans l’hémisphère ipsilatéral, mais pas dans l’hémisphère controlatéral, suggérant une lésion limitée de la BHE après une photothrombose améliorée par la thrombine. N = 4 pour chacun. Barre d’échelle : 50 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.
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Discussion
L’AVC photothrombotique RB traditionnel, introduit en 1985, est un modèle attrayant d’ischémie cérébrale focale pour les interventions chirurgicales simples, la faible mortalité et la reproductibilité élevée de l’infarctus cérébral. 5 Dans ce modèle, le colorant photodynamique RB active rapidement les plaquettes lors de l’excitation lumineuse, conduisant à des agrégats denses qui occlus le vaisseau sanguin 5,8,23. Cependant, la faible quantité de fibrine dans les caillots sanguins induits par RB (Figure 2) s’écarte du schéma dominant de thrombus intermélangés plaquettes/fibrine prélevés de manière aiguë chez les patients ayant subi un AVC ischémique21,22. La faible teneur en fibrine des thrombus induits par RB contribue probablement aussi à sa résilience au traitement tPA-lytique 7,8,19. Bien que l’irradiation au laser ultraviolet induise une recanalisation vasculaire dans la photothrombose RB, il est peu probable que cette thérapie expérimentale soit utilisée cliniquement7. Ainsi, l’AVC photothrombotique RB traditionnel a été principalement utilisé comme modèle d’occlusion permanente, moins adapté à la recherche sur la thrombolyse et la neuroprotection (cette dernière utilise souvent un modèle de suture intraluminale MCAO qui se caractérise par une reperfusion vasculaire rapide lors de l’ablation de l’occlusion mécanique).
Nous avons émis l’hypothèse que l’utilisation d’un mélange de RB et d’une dose sous-thrombotique de thrombine pour la photoactivation peut augmenter la teneur en fibrine dans les thrombus qui en résultent et améliorer les réponses à la thrombolyse tPA, le traitement réel de l’AVC. Cette hypothèse est étayée par les résultats présentés ici et dans notre rapport original. 23 Le modèle d’AVC photothrombotique amélioré par thrombine conserve également les avantages d’une faible mortalité, d’interventions chirurgicales simples et d’une grande cohérence dans la taille et l’emplacement de l’infarctus, comme dans le modèle traditionnel de photothrombose RB. Par conséquent, nous pensons que la photothrombose améliorée par la thrombine est un ajout précieux au répertoire des modèles d’AVC thromboembolique (Tableau 1). Deux détails procéduraux du modèle de photothrombose améliorée par la thrombine méritent d’être discutés. Premièrement, une surdose de thrombine par voie intraveineuse peut provoquer une thromboembolie pulmonaire aiguë et la mortalité animale25. Nous avons examiné une gamme de doses de thrombine en association avec la photothrombose RB, et la dose choisie de 80 U/kg n’a pas induit de mortalité chez > 100 souris mâles adultes C57Bl/6 expérimentées jusqu’à présent. Il est probable que la dose de thrombine doive être ajustée pour les souris présentant des états d’hypercoagulation26. Deuxièmement, nous avons ligaturé systématiquement l’ACC ipsilatéral en plus de la photothrombose ciblée par l’ACM dans nos procédures. Nous avons constaté que la ligature de l’ACC ipsilatérale augmente encore la cohérence de la taille de l’infarctus, ce qui peut être dû à une diminution de la circulation collatérale entre l’ACM et les artères cérébrales antérieures et postérieures.
Grâce à ses propriétés uniques, le modèle d’AVC photothrombotique amélioré par la thrombine peut être particulièrement utile pour au moins trois sujets de recherche. Tout d’abord, ce nouveau modèle est parfaitement adapté à la comparaison directe du tPA et d’autres agents fibrinolytiques tels que la ténectéplase (TNKase)27. TNKase est une variante modifiée du mutant tPA avec une spécificité accrue de la fibrine et un risque plus faible d’hémorragie iatrogène dans les expériences ex vivo. Pourtant, sa supériorité par rapport au tPA n’a été testée que dans un modèle d’AVC micro-embolique et à l’aide d’une analyse binaire des résultats neurologiques14. Compte tenu de sa grande reproductibilité et de l’analyse quantitative de la taille de l’infarctus, le modèle d’AVC photothrombotique amélioré par la thrombine peut être utilisé pour comparer les avantages et les effets indésirables de la tPA par rapport à la TNKase sous plusieurs aspects (p. ex., dose-réponse, fenêtre thérapeutique, effets de la comorbidité et effets indésirables potentiels en cas de traitement retardé). Deuxièmement, le modèle de photothrombose améliorée par la thrombine peut être utile pour étudier les effets du traitement combiné tPA et antiplaquettaire dans l’AVC ischémique aigu28. Les progrès récents des procédures endovasculaires dans l’AVC ischémique ont permis aux chercheurs d’analyser la composition histologique des thrombus aigus et d’identifier un profil plaquette/fibrine dominantet mélangé 21,22. Par conséquent, la combinaison d’un agent fibrinolytique (tPA) et d’agents antiplaquettaires peut augmenter l’efficacité globale de la thrombolyse, mais un modèle d’accident vasculaire cérébral simulant la composition clinique plaquettaire/fibrine du thrombus est crucial pour de telles recherches. Avec les modèles tHI et emboli-MCAO, la thrombine-photothrombose répond à cette exigence et se distingue par sa faible mortalité, la simplicité de ses interventions chirurgicales et l’absence d’effets cardiovasculaires systémiques (tableau 1).
Enfin, la photothrombose améliorée par la thrombine peut être particulièrement utile pour étudier la circulation collatérale induite par l’AVC, étant donné sa localisation péri-infarctus prévisible dans le territoire d’approvisionnement en MCA. En maintenant la pénombre pour compenser la croissance de l’infarctus, la circulation collatérale est de plus en plus reconnue comme un prédicteur important des résultats de l’AVC ischémique, car l’obstruction vasculaire aiguë favorise la circulation sanguine à travers le réseau collatéral, suivie d’un remodelage et d’une angiogenèse pour former des vaisseaux néo-collatéraux29,30. Les résultats suggèrent que le tPA favorise non seulement la recanalisation de l’ACM proximal, mais augmente également la circulation collatérale dans la périphérie de la zone d’alimentation en MCA (Figure 4). Une meilleure compréhension des mécanismes qui régulent la plasticité de la circulation collatérale pourrait suggérer de nouvelles thérapies. Comme le modèle d’AVC photothrombotique amélioré par thrombine offre l’avantage d’une région péri-infarctus prévisible et d’une sensibilité au traitement lytique, il facilitera la recherche sur la circulation collatérale post-AVC.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les subventions du NIH (NS108763, NS100419, NS095064 et HD080429 à C.Y.K. ; et NS106592 à Y.Y.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | infarct |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 543nm laser beam | Melles Griot | 25-LGP-193-249 | photothrombosis |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~14 weeks old (22~30 g) |
| Anesthesia bar for mouse adaptor | machine shop, UVA | surgical setup | |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Dental drill | Dentamerica | Rotex 782 | surgical setup |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | brain imaging |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| infusion pump | KD Scientific | 200 | thrombolytic treatment |
| Insulin syringe with 31G needle | BD | 328291 | photothrombosis |
| Ketamine | CCM, UVA | anesthesia | |
| Laser protective google 532nm | Thorlabs | LG3 | photothrombosis |
| Ketoprofen | CCM, UVA | NSAID analgesia | |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mouse adaptor | RWD | 68014 | surgical setup |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| Retractor tips | Kent Scientific | Surgi-5014-2 | surgical setup |
| Rose Bengal | Sigma | 198250 | photothrombosis |
| Thrombin | Sigma | T7513 | photothrombosis |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| tPA | Genetech | Cathflo activase 2mg | thrombolytic treatment |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | TTC infacrt |
| Xylazine | CCM, UVA | anesthesia |
References
- Lyden, P. D. Thrombolytic Therapy for Acute Stroke. 3/e. , Springer. (2015).
- Linfante, I., Cipolla, M. J. Improving reperfusion therapies in the era of mechanical thrombectomy. Translational Stroke Research. 7 (4), 294-302 (2016).
- Campbell, B. C., et al. Endovascular Therapy for Ischemic stroke with perfusion-imaging selection. The New England Journal of Medicine. 372 (11), 1009-1018 (2015).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (7), 1310-1316 (2012).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
- Watson, B. D., Prado, R., Veloso, A., Brunschwig, J. P., Dietrich, W. D. Cerebral blood flow restoration and reperfusion injury after ultraviolet laser-facilitated middle cerebral artery recanalization in rat thrombotic stroke. Stroke. 33 (2), 428-434 (2002).
- Uzdensky, A. B. Photothrombotic stroke as a model of ischemic stroke. Translational Stroke Research. 9 (5), 437-451 (2018).
- Karatas, H., et al. Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (3), 1452-1460 (2011).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Orset, C., et al. Efficacy of Alteplase in a mouse model of acute ischemic stroke: A retrospective pooled analysis. Stroke. 47 (5), 1312-1318 (2016).
- Kudo, M., Aoyama, A., Ichimori, S., Fukunaga, N. An animal model of cerebral infarction. Homologous blood clot emboli in rats. Stroke. 13 (4), 505-508 (1982).
- Busch, E., Kruger, K., Hossmann, K. A. Improved model of thromboembolic stroke and rt-PA induced reperfusion in the rat. Brain Research. 778 (1), 16-24 (1997).
- Lapchak, P. A., Araujo, D. M., Zivin, J. A. Comparison of Tenecteplase with Alteplase on clinical rating scores following small clot embolic strokes in rabbits. Experimental Neurology. 185 (1), 154-159 (2004).
- Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-Edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9 (6), 98807 (2014).
- Sun, Y. Y., et al. Prophylactic Edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: Implications for perioperative neuroprotection. Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).
- Sun, Y. Y., et al. Sickle mice are sensitive to hypoxia/ischemia-induced stroke but respond to tissue-type plasminogen activator treatment. Stroke. 48 (12), 3347-3355 (2017).
- Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. A thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxia-ischemia. Journal of Visualized Experiments. (102), e52978 (2015).
- Pena-Martinez, C., et al. Pharmacological modulation of neutrophil extracellular traps reverses thrombotic stroke tPA (tissue-type plasminogen activator) resistance. Stroke. 50 (11), 3228-3237 (2019).
- Denorme, F., et al. ADAMTS13-mediated thrombolysis of t-PA-resistant occlusions in ischemic stroke in mice. Blood. 127 (19), 2337-2345 (2016).
- Marder, V. J., et al. Analysis of thrombi retrieved from cerebral arteries of patients with acute ischemic stroke. Stroke. 37 (8), 2086-2093 (2006).
- Bacigaluppi, M., Semerano, A., Gullotta, G. S., Strambo, D. Insights from thrombi retrieved in stroke due to large vessel occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (8), 1433-1451 (2019).
- Sun, Y. Y., et al. A murine photothrombotic stroke model with an increased fibrin content and improved responses to tPA-lytic treatment. Blood Advances. 4 (7), 1222-1231 (2020).
- Su, E. J., et al. Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke. Nature Medicine. 14 (7), 731-737 (2008).
- Gupta, A. K., et al. Protective effects of gelsolin in acute pulmonary thromboembolism and thrombosis in the carotid artery of mice. PLoS One. 14 (4), 0215717 (2019).
- Carroll, B. J., Piazza, G. Hypercoagulable states in arterial and venous thrombosis: When, how, and who to test. Vascular Medicine. 23 (4), 388-399 (2018).
- Coutts, S. B., Berge, E., Campbell, B. C., Muir, K. W., Parsons, M. W. Tenecteplase for the treatment of acute ischemic stroke: A review of completed and ongoing randomized controlled trials. International Journal of Stroke. 13 (9), 885-892 (2018).
- McFadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. Current and future antiplatelet therapies: emphasis on preserving haemostasis. Nature Reviews Cardiology. 15 (3), 181-191 (2018).
- Bang, O. Y., Goyal, M., Liebeskind, D. S. Collateral crculation in ischemic stroke: Assessment tools and therapeutic strategies. Stroke. 46 (11), 3302-3309 (2015).
- Faber, J. E., Chilian, W. M., Deindl, E., van Royen, N., Simons, M. A brief etymology of the collateral circulation. Arteriosclerosis, Thrombsis, Vascular Biology. 34 (9), 1854-1859 (2014).
