Summary
Традиционные модели фототромботического инсульта (ПТС) в основном индуцируют плотные агрегаты тромбоцитов с высокой резистентностью к тканевой терапии активатором плазминогена (tPA)-литическим лечением. Здесь модифицированная мышиная модель ПТС вводится путем совместного введения тромбина и фоточувствительного красителя для фотоактивации. Модель ПТС, усиленная тромбином, производит смешанные тромбоцитарно-фибриновые сгустки и обладает высокой чувствительностью к tPA-тромболизису.
Abstract
Идеальная модель тромбоэмболического инсульта требует определенных свойств, в том числе относительно простых хирургических процедур с низкой смертностью, постоянного размера и локализации инфаркта, осаждения тромбоцитов и сгустков крови с примесью тромбоцитов и фибрина, аналогичных таковым у пациентов, и адекватной чувствительности к фибринолитическому лечению. Модель фототромботического инсульта на основе красителя бенгальской розы (RB) отвечает первым двум требованиям, но обладает высокой рефрактерностью к tPA-опосредованному литической терапии, предположительно из-за богатого тромбоцитами, но бедного фибрином состава сгустков. Мы полагаем, что комбинация RB-красителя (50 мг/кг) и субтромботической дозы тромбина (80 ЕД/кг) для фотоактивации, направленной на проксимальную ветвь средней мозговой артерии (МЦА), может приводить к образованию обогащенных фибрином и tPA-чувствительных тромбов. Действительно, модель комбинированного фототромбоза с тромбином и RB (T+RB) вызывала смешанные тромбоцитарно-фибриновые тромбы, как показали иммуноокрашивание и иммуноблоты, и поддерживала постоянные размеры и локализацию инфаркта плюс низкую смертность. Кроме того, внутривенное введение tPA (Alteplase, 10 мг/кг) в течение 2 ч после фотоактивации значительно уменьшало размер инфаркта при фототромбозе T+RB. Таким образом, модель фототромботического инсульта, усиленная тромбином, может быть полезной экспериментальной моделью для тестирования новых методов тромболитической терапии.
Introduction
Эндоваскулярная тромбэктомия и tPA-опосредованный тромболизис являются единственными двумя одобренными Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) методами лечения острого ишемического инсульта, которым ежегоднов Соединенных Штатах страдают ~700 000 пациентов. Поскольку применение тромбэктомии ограничено окклюзией крупных сосудов (LVO), в то время как tPA-тромболизис может облегчить окклюзию мелких сосудов, оба метода лечения острого ишемического инсульта2 являются ценными. Кроме того, комбинация обоих методов лечения (например, начало tPA-тромболизиса в течение 4,5 часов после начала инсульта с последующей тромбэктомией) улучшает реперфузию и функциональные исходы3. Таким образом, оптимизация тромболизиса остается важной целью для исследований инсульта, даже в эпоху тромбэктомии.
Тромбоэмболические модели являются важным инструментом для доклинических исследований инсульта, направленных на улучшение тромболитической терапии. Это связано с тем, что модели механической окклюзии сосудов (например, внутрипросветная окклюзия MCA) не приводят к образованию тромбов, а быстрое восстановление мозгового кровотока после удаления механической окклюзии чрезмерно идеализировано 4,5. На сегодняшний день основные модели тромбоэмболии включают фототромбоз 6,7,8, местное применение хлорида железа (FeCl3)9, микроинъекцию тромбина в ветвь MCA 10,11, инъекцию ex vivo (микро)эмболии в MCA или общую сонную артерию (CCA)12,13,14 и транзиторную гипоксию-ишемию (tHI)15,16, 17,18. Эти модели инсульта различаются по гистологическому составу последующих тромбов и чувствительности к tPA-опосредованной литической терапии (табл. 1). Они также различаются по хирургическому требованию трепанации черепа (необходимой для инъекции тромбина in situ и местного применения FeCl3), постоянству размера и расположения инфаркта (например, CCA-инфузия микроэмболов дает очень разные результаты) и глобальному воздействию на сердечно-сосудистую систему (например, tHI увеличивает частоту сердечных сокращений и сердечный выброс, чтобы компенсировать вызванную гипоксией периферическую вазодилатацию).
Модель фототромботического инсульта (ПТС) на основе красителя RB имеет много привлекательных особенностей, включая простые хирургические процедуры без трепанации черепа, низкую смертность (обычно < 5%) и предсказуемый размер и расположение инфаркта (на территории, поставляющей MCA), но у нее есть два основных ограничения. 8 Первое предостережение – слабый или нулевой ответ на tPA-опосредованную тромболитическую терапию, что также является недостатком модели FeCl3 7,19,20. Второе предостережение моделей инсульта PTS и FeCl3 заключается в том, что последующие тромбы состоят из плотно упакованных агрегатов тромбоцитов с небольшим количеством фибрина, что не только приводит к их устойчивости к tPA-литической терапии, но и отклоняется от картины смешанных тромбоцитов:фибриновых тромбов у пациентов с острым ишемическим инсультом21,22. В отличие от этого, модель микроинъекций тромбина in situ в основном включает полимеризованный фибрин и неопределенное содержание тромбоцитов10.
Учитывая вышеизложенное, мы предположили, что примесь RB и субтромботической дозы тромбина для MCA-направленной фотоактивации через истонченный череп может увеличить фибриновый компонент в образующихся тромбах и повысить чувствительность к tPA-опосредованному литическому лечению. Мы подтвердили эту гипотезу,23 и в данной статье подробно описываем процедуры модифицированной (Т+РБ) модели фототромботического инсульта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол одобрен Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) при Университете Вирджинии и соответствует Руководству Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. На рисунке 1А показана последовательность хирургических процедур этого протокола.
1. Подготовка к операции
- Положите грелку с температурой 37 °C на адаптер для мелких животных не менее чем за 15 минут до операции. Подготовьте ролик с зажимом для носа для адаптера, который позволяет поворачивать голову животного. Приготовьте анестетики Кетамин (60 мг/кг)/Ксилазин (10 мг/кг).
- Стерилизовать хирургические инструменты, включая ножницы, щипцы, микроиглодержатели, гемостаты, ватные палочки и швы, в автоклаве (121 °C при давлении 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 60 минут). Приготовьте тканевый клей и глазную мазь. Подготовьте для хирургов защитные очки с длиной волны лазера 532 нм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает основную хирургическую процедуру выживания и должен проводиться с использованием асептических методов. - Настройте систему подсветки с помощью лазерного источника с длиной волны 532 нм. Подготовьте бормашину.
- Приготовьте раствор бенгальской розы в физиологическом растворе (10 мг/мл). Поместите аликвотный бычий тромбин (0,1 Ед/мкл) на ведро со льдом.
- Вводите мышам кетопрофен (4,0 мг/кг) подкожно в качестве обезболивающего средства за 30 мин до операции или используйте схему обезболивания, рекомендованную местными рекомендациями.
2. Перевязка ипсилатеральной общей сонной артерии
- Обезболивайте 10-14-недельных самцов мышей C57BL/6NCrl массой от 22 до 30 г путем внутримышечного введения кетамина (60 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг).
ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается, что вся хирургическая процедура, включающая перевязку ипсилатеральной общей сонной артерии посредством мониторинга мозгового кровотока, займет ~120 минут. Режим анестезии, как правило, эффективен в течение всего этого времени, но глубину анестезии следует пересматривать не реже чем каждые 15 минут. При изучении этих процедур может потребоваться повторная доза анестезии. - Защипните пальцы ног, чтобы убедиться, что животное полностью обезболино. Удалите волосы на левой шее для перевязки CCA и голову для истончения черепа с помощью крема для удаления волос.
- Поместите мышь на адаптер для мелких животных в положении лежа на спине. Стерилизуйте операционную область, протирая кожу тремя чередующимися движениями повидон-йода и 70% этанола.
- Закрепите головку мыши с помощью ушных планок. Под препарирующим микроскопом сделайте разрез левой шейки матки диаметром 0,5 см с помощью микроножниц и прямых щипцов на расстоянии около 0,2 см латеральнее средней линии.
- Используйте пару тонких зубчатых щипцов, чтобы раздвинуть мягкие ткани и фасции, чтобы обнажить левую общую сонную артерию (LCCA). Осторожно отделите левую КЦА от блуждающего нерва с помощью пары тонких гладких щипцов.
- Наложите постоянный шов с двойным узлом вокруг LCCA с помощью шелкового шовного материала 5-0, разрезанного на сегменты по 20 мм, а затем закройте рану стерильными раневыми зажимами.
3. Истончение черепа над ветвью MCA и фотоактивация
- Переверните мышь в положение лежа на адаптере для мелких животных. Поверните ролик с зажимом для носа на 15°. Стерилизуйте операционную область, протирая кожу тремя чередующимися движениями бетадина и 70% этанола.
- Сделайте разрез 0,8 см на волосистой части головы с помощью микроножниц и прямых щипцов вдоль левого глаза и уха, чтобы обнажить височную мышцу, которая расположена между глазом и ухом (рисунок 1B).
- Под препарирующим микроскопом делают разрез 0,5 см по краю височной мышцы на левой теменной кости парой тонких зубчатых щипцов. Сделайте второй вертикальный разрез 0,3 см на височной мышце микроножницами. Втяните височную мышцу, чтобы обнажить край теменной кости и чешуйчатую кость. Обязательно визуализируйте ориентир венечного шва между лобной и теменной костями (рис. 1B, C).
- Увлажните череп, нанеся стерильный физиологический раствор, чтобы обнажить левую MCA. Отметьте маркером проксимальную ветвь MCA на чешуйчатой кости. Осторожно нарисуйте круг диаметром около 1 мм, окружающий отмеченную область, с помощью пневматической бормашины (скорость заусенцев установлена на 50% от регулятора скорости), а затем утончите череп примерно на 0,2 мм в глубину, не касаясь нижней твердой мозговой оболочки. Прекратите сверление до тех пор, пока не останется очень тонкий слой кости.
- Смешайте раствор тромбина (T, 0,1 Ед/мкл, 80 Ед/кг) и Rose bengal (RB, 10 мг/мл, 50 мг/кг) в расчете на массу тела мыши. Например, для мыши массой тела 25 г смешайте 20 мкл тромбина (0,1 Ед/мкл) и 125 мкл RB (10 мг/мл).
- Медленно вводят раствор Т+РБ (145 мкл на 25 г массы тела) в ретроорбитальный синус инсулиновым шприцем (иглой #31G).
ПРИМЕЧАНИЕ: В пилотных экспериментах исследовали смертность от возрастающих доз тромбина, смешанных со стандартной дозой RB-красителя (50 мг/кг) для фотоактивации. Смертность составила 0% для тромбина 80 ЕД/кг (n=13), 43% для тромбина 120 ЕД/кг (n=7) и 100% для тромбина 160 ЕД/кг (n=5) и 200 ЕД/кг тромбина (n=5). Поэтому для этой модели была выбрана доза 80 ЕД/кг тромбина. Для исключения возможности безудержного свертывания крови вблизи полости глазницы после ретроорбитальной синусовой инъекции Т+RB (дополнительный рисунок 1) также использовалась лазерная спекл-контрактная визуализация, а также распространенное отложение фибрина в контралатеральном полушарии, не подвергавшемся лазерному излучению (дополнительный рисунок 2). - Нанесите глазную мазь на оба глаза, чтобы предотвратить сухость.
- Нанесите осветитель лазерным лучом с длиной волны 532 нм (с энергией 0,5 мВт) на просверленный участок с расстоянием 2 дюйма в течение 20 минут. Визуализируйте освещение на проксимальной ветви MCA через лазерный защитный очки (рис. 1C,D).
ПРИМЕЧАНИЕ: MCA с подсветкой 532 нм показывает красную флуоресценцию под очками. Дистальная MCA исчезает через 10 минут освещения. Исключите животное, если дистальный поток MCA все еще присутствует после 20-минутного освещения. - Прекратите лазерную подсветку через 20 мин. Закройте рану стерильными зажимами.
4. Прижизненная визуализация (опционально)
ПРИМЕЧАНИЕ: Для характеристики тромбообразования in vivo используют внутривирусную визуализацию с помощью спин-диска конфокального с фотоактивационной системой23.
- Сделайте краниальное окно диаметром ~3 мм на теменной кости черепа.
- Поместите защитное стекло на краниальное окно и найдите дистальную MCA (~50 мкм в диаметре) под объективом для погружения в воду с 20-кратным увеличением.
- Маркируйте циркулирующий тромбоцит путем инъекции в хвостовую вену конъюгированного антитела DyLight488 против GPIbβ (0,1 мг/кг) за 5 мин до визуализации.
- Вводят раствор смеси тромбина (80 ЕД/кг) и бенгальской розы (50 мг/кг) ретроорбитальным путем за 5 мин до визуализации.
- Фотоактивируйте MCA с помощью лазерной системы 561 нм с лазерным лучом диаметром 10 мкм и записывайте изображение до образования тромба.
5. Администрирование tPA
- Поместите животное под наркозом на теплую подушку с температурой 37 °C. В выбранный момент времени после фотоактивации смочите марлю теплой водой с температурой ~45 °C и укутайте ее на хвосте на 1 минуту.
- Вводят рекомбинантный человеческий tPA (10 мг/кг) через хвостовую вену с 50% болюсом и 50% в течение 30 мин с помощью инфузионной помпы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя клиническая доза рекомбинантного человеческого tPA для лечения острого ишемического инсульта составляет 0,9 мг/кг, более высокая доза (10 мг/кг) обычно используется у грызунов для компенсации снижения межвидовой реактивности tPA. Мы также следовали стандартному протоколу введения tPA в доклинических моделях инсульта, используя 50% в качестве болюса и 50% через хвостовую вену в течение 30 минут.24
6. Монитор мозгового кровотока (ЦБК)
ПРИМЕЧАНИЕ: Для подтверждения восстановления КБВ после лечения ТПА используют двухмерную лазерную систему спекл-контрастной визуализации15 и записывают сразу после фототромбоза (шаг 3.9) или через 24 ч после лечения ТПА.
- Поместите животное под наркозом в положение лежа на животе и сделайте разрез по средней линии на волосистой части головы, обнажив череп.
- Увлажните череп стерильным физиологическим раствором и аккуратно нанесите ультразвуковой гель на череп. Избегайте волос и пузырьков в геле, которые будут мешать сигналу CBF.
- Контролируйте КБФ в обоих полушариях головного мозга под лазерным спекл-контрастным тепловизором в течение 10 мин.
- После записи изображения КБФ закройте кожу головы тканевым клеем и верните животное в клетку.
- Анализ НБВ в выбранных регионах и расчет процента извлечения НБВ по сравнению с контралатеральной областью.
- Затем поместите животное обратно в теплую клетку для восстановления. Наблюдайте за мышами в течение 5-10 минут, пока они не оправятся от анестезии. Поместите смоченный корм в клетку и верните ее в учреждение по уходу за животными.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте послеоперационное обезболивание в соответствии с рекомендациями местных учреждений.
7. Измерение объема инфаркта методом окрашивания трифенилтетразолия хлоридом (ТТС)
- Через 24 часа после фототромбоза глубоко обезболивайте животное в соответствии с местными рекомендациями по хирургическому вмешательству, не связанному с выживанием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы вводим трибромэтанол (авертин) в дозе 250 мг/кг внутрибрюшинно (ВП). - Проводят транскардиальную перфузию с PBS, берут свежий мозг и встраивают в 3% агаровый гель.
- Срез мозга толщиной 1 мм разрезать вибратомом и инкубировать в 2% растворе ТТС в течение 10 мин.
- Количественно определите общий объем инфаркта из 6 срезов мозга как абсолютный объем с помощью программного обеспечения ImageJ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отек мозга не использовался в качестве показателя исхода по двум причинам. Во-первых, окрашивание TTC измеряет жизнеспособность тканей (через митохондриальную восстановительную активность), что является более серьезным последствием, чем отек. Во-вторых, по мере развития инфаркта возникают как вазогенные, так и цитотоксические отеки, которые не могут быть легко различимы стандартными методами измерения отека мозга. Тем не менее, мы использовали мечение антииммуноглобином (IgG) для оценки целостности гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и обнаружили сопоставимую экстравазацию IgG через 6 ч после фотоактивации как в RB, так и в T+RB (дополнительный рисунок 3).
8. Измерение тромбообразования
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы измерить образование тромба, соберите данные головного мозга через 1 ч и 2 ч после фототромбоза для измерения тромба в MCA с помощью иммунохимии (IHC) и для измерения фибрина в полушарии мозга с помощью иммуноблоттинга, соответственно.
- Выполняют ВПХ для характеристики состава тромба. Зафиксируйте мозг 4% параформальдегидом на ночь, а затем обезвоживайте мозг 30% сахарозой для встраивания ОКТ.
- Срез головного мозга с сагиттальной ориентацией толщиной 20 мкм и выполнение ВПХ специфическими антителами против фибриногена, тромбоцитов (гликопротеина IIb), эритроцитов (TER119) и кровеносных сосудов (изолектин GS-IB4).
- Проводят измерение фибрина в полушарии головного мозга методом иммуноблоттинга с антителом против фибриногена.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Во-первых, мы сравнили содержание фибрина в RB и T+RB, индуцированных фототромбозом. Мышей приносили в жертву транскардиальной перфузией фиксаторов через 2 ч после фотоактивации, а мозг удаляли для иммунофлуоресцентного окрашивания ветви MCA в продольной и поперечной плоскостях. При фототромбозе РБ ветвь MCA была плотно упакована CD41+ тромбоцитами и небольшим количеством фибрина (рис. 2, A,C). Напротив, ветвь MCA при фототромбозе Т+RB была окклюзирована случайно смешанными тромбоцитарно-фибриновыми сгустками (рис. 2B,D, n>3 для каждого). Мы также использовали иммуноблоттинг для сравнения уровня фибрина (огена) в коре головного мозга между двумя моделями после транскардиальной перфузии физиологическим раствором через 2 ч после фотоактивации. Этот анализ показал >двукратное увеличение отложения фибрина в ипсилатеральном полушарии при Т+РБ по сравнению с фототромбозом РБ (рис. 2Е, р=0,027 по непарному t-критерию; n=3 для каждой группы). В нашем первоначальном отчете мы также использовали фотоактивацию одного сосуда на основе конфокального микроскопа и прижизненную визуализацию для сравнения поведения FITC-конъюгированных тромбоцитов, меченных анти-GP1bβ. 23 Эти эксперименты показали, что внутривенное введение 80 ЕД/кг тромбина не привело к индуцированию тромбоцитарных агрегатов даже при лазерном освещении (рис. 3А), и что тромбоциты образуют гомогенные сгустки в модели РБ-фототромбоза (рис. 3В), но неравномерные агрегаты с множественными слабыми областями при Т+РБ фототромбозе (рис. 3В). Эти результаты свидетельствуют о том, что фототромбоз Т+RB увеличивает содержание фибрина в последующих тромбах.
Затем мы сравнили влияние острой внутривенной терапии ТПА (10 мг/кг алтеплазы, через 30 мин после фотоактивации) на восстановление мозгового кровотока (КБФ) между двумя моделями. КБФ одной и той же мыши до и через 24 ч после лечения tPA-versus vehicle измеряли с помощью лазерной спекл-контрастной визуализации и нормировали к контралатеральному полушарию (рис. 4A,B). При фототромбозе РБ лечение ТПА приводило к тенденции к восстановлению КБФ, особенно в области ишемической границы, по сравнению с мышами, получавшими лечение транспортными средствами (рис. 4C, транспортное средство 51 ± 9% против tPA 65 ± 7%, p=0,3 по непарному t-критерию, n=4 для каждого). При фототромбозе Т+RB восстановление КБФ у мышей, получавших tPA, было более выраженным, и проксимальные ветви MCA часто становились видимыми через 24 ч (рис. 4D, носитель 55 ± 3% против tPA 81 ± 7%, p=0,02 по непарному t-критерию, n=6 для каждой группы). Эти результаты свидетельствуют о большей чувствительности к tPA-литической терапии Т+RB, чем к RB-фототромбозу.
Наконец, мы использовали окрашивание TTC для количественной оценки влияния лечения tPA на размер инфаркта в моделях RB и T+RB фототромботического инсульта. При фототромбозе РБ аналогичный размер инфаркта был выявлен у мышей, получавших лечение транспортным средством (18 ± 2,80 мм3, n=6) и мышей, получавших ТПА (18 ± 1,95мм3, n=10; 10 мг/кг тПА вводили через 30 мин после фотоактивации) (рис. 5А). В отличие от этого, лечение tPA-литиком значительно снижало частоту инфаркта при введении tPA через 0,5 ч (7 ± 2,1мм3, n=9), 1 ч (4,6 ± 1 мм3, n=10) или 2 ч (6,4 ± 1,5 мм3, n=8 ), но не через 6 ч после фотоактивации (15,2 ± 3,1 мм3, n=7), по сравнению с мышами, получавшими транспортную терапию (14,8 ± 2 мм3, n=19) (рис. 5B, p-значение, определяемое непарным t-критерием). Эти результаты свидетельствуют о том, что модель фототромботического инсульта T+RB обладает чувствительностью к tPA-литической терапии в организме.
Рисунок 1: Схема процедур. (А) Блок-схема основных хирургических вмешательств в модели фототромботического инсульта Т+RB. Перевязка ипсилатеральной общей сонной артерии (КЦА) не является обязательной, но мы обнаружили, что она делает размер инфаркта более стабильным, предположительно из-за снижения коллатерального кровообращения. (Б) Вид мозга мыши сверху и сбоку по отношению к черепу. Также показаны глаза, ухо, височная мышца, средняя мозговая артерия (МЦА) и ее ветви, венечный шов, место лазерной иллюминации. (C) Визуализация целевой ветви MCA под истонченным черепом (С1) и во время лазерного излучения (С2), а также прекращение кровотока после фотоактивации (С3). Обратите внимание на связь ветви MCA с коронарным швом. (D) Настройка мыши во время лазерной подсветки на левой ветви MCA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Различное содержание фибрина в сгустках крови. (А-Д) Иммунофлуоресцентное мечение тромбозов, индуцированных РБ и Т+РБ фототромбозом в дистальной ветви МКА в продольной (A, B) или поперечной плоскости (C, D) с использованием маркеров антифибрина (зеленый), анти-CD41/тромбоцитов (красный) и изолектина B4/эндотелиальных клеток (синий). Отмечено выраженное увеличение антифибриновых иммуносигналов в Т+RB фототромбоз-индуцированных сгустках крови (B, D, n=3 для каждой группы). (E) Иммуноблоттинг показал большее отложение фибрина в ипсилатеральной коре головного мозга при Т+RB, чем фототромбоз RB через 2 ч после фотоактивации (n=3 для каждого). ООН: невредимые мыши; Продолжение: контралатеральная кора; Ипси: ипсилатеральная кора. Масштабная линейка: 50 мкм. Эта цифра изменена с разрешения [23]. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Прижизненная визуализация тромбоцитарных реакций. Прижизненная визуализация с помощью конфокального микроскопа FITC-конъюгированных анти-GP1bβ-меченых тромбоцитов при однососудистом лазерном освещении (в месте, обозначенном белыми стрелками). Экспериментальные группы: (А) только тромбин, (Б) только бенгальская роза и (В) тромбин плюс бенгальская роза. Время после лазерной подсветки помечено. Смотрите видео на веб-сайте JoVE для этой рукописи. Масштабная линейка: 50 мкм. Эта цифра изменена с разрешения [23]. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Влияние tPA-обработки на извлечение НБВ. Рекомбинантный человеческий tPA (Alteplase, 10 мг/кг) или носитель вводили через хвостовую вену мышам с RB и T+RB с фототромбозом через 30 минут после лазерного освещения, а церебральный кровоток (CBF) до и через 24 ч после лечения у той же мыши сравнивали с лазерной спекл-контрастной визуализацией. Измеряли КБВ в области 3 х 4,8 мм в обоих полушариях. Экспериментальными группами являются: (А, С) фототромбоз РБ; (Б, Г) Фототромбоз Т+РБ. Отмечают достоверное восстановление КБФ при лечении тПА в группе Т+РБ фототромбоза (p=0,02 по непарному t-критерию, n= 4 для носителя и n=6 для tPA-лечения) и частая визуализация проксимальной ветви МКА. При РБ-фототромбозе лечение ТПА приводило к тенденции к улучшению КБФ, преимущественно в периферической ишемизированной области (p=0,3 по непарному t-критерию, n= 4 для носителя и n=5 для лечения tPA). Белыми стрелками обозначено место MCA-фотоактивации. Эта цифра изменена с разрешения [23]. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Влияние tPA-лечения на размер инфаркта. (A) Внутривенное лечение tPA (Alteplase, 10 мг/кг) через 30 мин после фототромбоза RB не привело к уменьшению размера инфаркта (n=6 у мышей, получавших транспортное средство, и n=10 у мышей, получавших tPA). (B) Напротив, при фототромбозе Т+RB внутривенное введение альтеплазы в дозе 10 мг/кг через 0,5, 1 или 2 ч, но не через 6 ч после фотоактивации приводило к значительному уменьшению размера инфаркта. p-значение определяли с помощью одностороннего ANOVA с помощью критерия множественных сравнений Тьюки. Эта цифра изменена с разрешения [23]. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Модель | Хирургическое вмешательство | Тромбы | Тромбоцитов | Фибрин | tPA-реакционная способность | Основные возможности/полезность | Основные референции |
| Внутрипросветный шов MCAO | Эндоваскулярная окклюзия MCA | Нет | Н/Д | Н/Д | Нет | Быстрая реперфузия; Нейропрекционное исследование; ГЭБ-индуцированное тПА повреждение | Longa et al., 1989 (Ref #5) |
| Фототромбоз | Истончение и фотоактивация черепа | Да | Слабый | Высокая воспроизводимость; низкая смертность, | Watson et al., 1985 (Ref #6) | ||
| Тромбин-фототромбоз | UCCAO, Истончение черепа и фотоактивация | Да | Да | Высокая воспроизводимость; низкая смертность, | Sun et al., 2020 (Ref #23) | ||
| FeCl3 (на MCA) | Истончение черепа и химическая активация | Да | Нет | Высокая воспроизводимость; низкая смертность, | Karatas et al., 2011 (Ref #69) | ||
| Инъекция тромбина in situ | Трепанация черепа и микроинъекции MCA | Да | Да | Высокая воспроизводимость; низкая смертность; tPA-литическая обработка | Orset et al., 2007 (Ref #10) | ||
| Эмболи-МЦАО | Эндоваскулярная окклюзия MCA | Да | Да | tPA-литическая обработка; Переменная твердость сгустка | Busch et al., 1997 (Ref #13) | ||
| Транзиторная гипоксия-ишемия (tHI) | УКЦАО плюс гипоксия | Да | Да | Инфаркт > области МКА; Системные эффекты сердечно-сосудистых заболеваний | Sun et al., 2014 (Ref #15) |
Таблица 1: Сравнение выбранных доклинических моделей инсульта. Заполненные квадраты указывают на положительную (наличие тромбов, тромбоцитов и фибрина) или значительную реактивность tPA.
Дополнительный рисунок 1: Монитор КБФ после ретроорбитальной инъекции тромбина. (A) Репрезентативные фотографии ретроорбитального синуса (верхняя панель) и кровотока с помощью лазерной спекл-контрастной визуализации (нижняя панель). Три сосудистых участка (1~3, как указано на этикетке) контролировали после инъекции тромбина (80 Ед/кг) в ретроорбитальный синус. (Б) Репрезентативный график кровотока в течение 15 мин после введения тромбина (стрелка). (C) Количественная оценка на основе лазерного спекла не показала снижения кровотока вблизи ретроорбитального синуса в течение 15 мин после введения тромбина (n=4, p-значение, определяемое по непарному t-критерию). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот рисунок.
Дополнительный рисунок 2: Отсутствие отложения фибрина в контралатеральном полушарии через 6 часов после фотоактивации. Иммуноокрашивание антифибриногена (зеленый) показало отложение фибрина в ипсилатеральной коре через 6 ч после РБ и Т+РБ фототромбоза. Напротив, не было обнаружено дискриминационного отложения фибрина в контралатеральной коре после фототромбоза, усиленного тромбином. N=4 для каждой группы. Масштабная линейка: 50 мкм. Синяя флуоресценция в качестве DAPI-ядерного окрашивания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот рисунок.
Дополнительный рисунок 3: Отсутствие экстравазации иммуноглобулинов (IgG) после фототромбоза. Через 6 ч после односторонней фотоактивации, направленной на MCA, иммуноокрашивание показало экстравазацию IgG в ипсилатеральном полушарии, но не в контралатеральном полушарии, что свидетельствует об ограниченном повреждении ГЭБ после фототромбоза, усиленного тромбином. N=4 для каждого. Масштабная линейка: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот рисунок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Традиционный RB-фототромботический инсульт, представленный в 1985 году, является привлекательной моделью фокальной ишемии головного мозга для простых хирургических процедур, низкой смертности и высокой воспроизводимости инфаркта головного мозга. 5 В этой модели фотодинамический краситель RB быстро активирует тромбоциты при возбуждении светом, что приводит к образованию плотных агрегатов, которые окклюзируют кровеносный сосуд 5,8,23. Однако небольшое количество фибрина в RB-индуцированных сгустках крови (рис. 2) отклоняется от доминирующей смешанной картины тромбоцитов: фибрина, выявленной остро у пациентов с ишемическим инсультом21,22. Низкое содержание фибрина в RB-индуцированных тромбах, вероятно, также способствует его устойчивости к tPA-литической терапии 7,8,19. Несмотря на то, что ультрафиолетовое лазерное облучение индуцирует реканализацию сосудов при фототромбозе РБ, эта экспериментальная терапия вряд ли будет использоваться клинически7. Таким образом, традиционный RB-фототромботический инсульт в основном используется в качестве модели постоянной окклюзии, менее подходящей для тромболизиса и нейропротекторных исследований (в последней часто используется модель MCAO с внутрипросветным швом, характеризующаяся быстрой реперфузией сосудов при удалении механической окклюзии).
Мы предположили, что использование смеси RB и субтромботической дозы тромбина для фотоактивации может увеличить содержание фибрина в последующих тромбах и усилить реакцию на tPA-тромболизис, реальную терапию инсульта. Эта гипотеза подтверждается результатами, представленными здесь и в нашем первоначальном отчете. 23 Модель фототромботического инсульта, усиленная тромбином, также сохраняет такие преимущества, как низкая смертность, простые хирургические процедуры и высокая стабильность размера и локализации инфаркта, как и в традиционной модели фототромбоза RB. Таким образом, мы считаем, что усиленный тромбином фототромбоз является ценным дополнением к репертуару моделей тромбоэмболического инсульта (табл. 1). Две процедурные детали модели фототромбоза, усиленного тромбином, заслуживают обсуждения. Во-первых, передозировка внутривенного тромбина может спровоцировать острую тромбоэмболию легочной артерии и смертность животных25. Мы изучили диапазон доз тромбина для комбинации с фототромбозом RB, и выбранная доза 80 ЕД/кг до сих пор не индуцировала смертность у >100 опытных взрослых самцов мышей C57Bl/6. Вероятно, доза тромбина нуждается в корректировке для мышей с состояниями гиперкоагуляции26. Во-вторых, в наших процедурах мы регулярно перевязывали ипсилатеральный CCA, а также фототромбоз, направленный на MCA. Мы обнаружили, что перевязка ипсилатерального ССА еще больше увеличивает постоянство размеров инфаркта, что может быть связано с уменьшением коллатерального кровообращения между МСА и передними и задними артериями головного мозга.
Благодаря своим уникальным свойствам модель фототромботического инсульта, усиленная тромбином, может быть особенно полезной, по крайней мере, для трех исследовательских тем. Во-первых, эта новая модель идеально подходит для сравнения tPA и других фибринолитических агентов, таких как тенектеплаза (TNKase)27. TNKase представляет собой модифицированный tPA-мутантный вариант с повышенной фибрин-специфичностью и более низким риском ятрогенного кровоизлияния в экспериментах ex vivo. Тем не менее, его превосходство над tPA было проверено только на модели микроэмболического инсульта и с использованием бинарного неврологического анализа исходов14. Учитывая высокую воспроизводимость и количественный анализ размеров инфаркта, модель фототромботического инсульта, усиленная тромбином, может быть использована для сравнения преимуществ и побочных эффектов tPA-versus TNKase в нескольких аспектах (например, реакция на дозу, терапевтическое окно, влияние коморбидности и потенциальные побочные эффекты при отсроченном лечении). Во-вторых, модель фототромбоза, усиленного тромбином, может быть полезна для изучения эффектов комбинированного лечения tPA и антитромбоцитарной терапии при остром ишемическом инсульте28. Последние достижения в области эндоваскулярных процедур при ишемическом инсульте позволили исследователям проанализировать гистологический состав острых тромбов и идентифицировать доминантный, смешанный паттерн тромбоцитов и фибрина21,22. Соответственно, комбинация фибринолитического агента (tPA) и антитромбоцитарных агентов может повысить общую эффективность тромболизиса, но модель инсульта, которая имитирует клинический состав тромбоцитов/фибринов, имеет решающее значение для таких исследований. Наряду с моделями tHI и emboli-MCAO, тромбин-фототромбоз отвечает этому требованию и отличается низкой смертностью, простотой хирургических процедур и отсутствием системных сердечно-сосудистых эффектов (табл. 1).
И последнее, но не менее важное: фототромбоз, усиленный тромбином, может быть особенно полезен для исследования коллатерального кровообращения, вызванного инсультом, учитывая его предсказуемое расположение в периинфарктном периоде на территории, поставляющей MCA. Поддерживая полутень для компенсации роста инфаркта, коллатеральное кровообращение все чаще признается важным предиктором исходов ишемического инсульта, поскольку острая сосудистая обструкция способствует кровотоку через коллатеральную сеть с последующим ремоделированием и ангиогенезом с образованием неоколлатеральных сосудов29,30. Полученные результаты свидетельствуют о том, что тПА не только способствует реканализации проксимального отдела МКА, но и увеличивает коллатеральную циркуляцию в периферии области, снабжающей МКА (рис. 4). Лучшее понимание механизмов, регулирующих пластичность коллатеральной циркуляции, может предложить новые методы лечения. Поскольку модель фототромботического инсульта, усиленная тромбином, предлагает преимущество предсказуемой периинфарктной области и чувствительности к литическому лечению, она поможет в исследовании постинсультного коллатерального кровообращения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами NIH (NS108763, NS100419, NS095064 и HD080429 для C.Y.K.; и NS106592 для Y.Y.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | infarct |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 543nm laser beam | Melles Griot | 25-LGP-193-249 | photothrombosis |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~14 weeks old (22~30 g) |
| Anesthesia bar for mouse adaptor | machine shop, UVA | surgical setup | |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Dental drill | Dentamerica | Rotex 782 | surgical setup |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | brain imaging |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| infusion pump | KD Scientific | 200 | thrombolytic treatment |
| Insulin syringe with 31G needle | BD | 328291 | photothrombosis |
| Ketamine | CCM, UVA | anesthesia | |
| Laser protective google 532nm | Thorlabs | LG3 | photothrombosis |
| Ketoprofen | CCM, UVA | NSAID analgesia | |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mouse adaptor | RWD | 68014 | surgical setup |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| Retractor tips | Kent Scientific | Surgi-5014-2 | surgical setup |
| Rose Bengal | Sigma | 198250 | photothrombosis |
| Thrombin | Sigma | T7513 | photothrombosis |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| tPA | Genetech | Cathflo activase 2mg | thrombolytic treatment |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | TTC infacrt |
| Xylazine | CCM, UVA | anesthesia |
References
- Lyden, P. D. Thrombolytic Therapy for Acute Stroke. 3/e. , Springer. (2015).
- Linfante, I., Cipolla, M. J. Improving reperfusion therapies in the era of mechanical thrombectomy. Translational Stroke Research. 7 (4), 294-302 (2016).
- Campbell, B. C., et al. Endovascular Therapy for Ischemic stroke with perfusion-imaging selection. The New England Journal of Medicine. 372 (11), 1009-1018 (2015).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (7), 1310-1316 (2012).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
- Watson, B. D., Prado, R., Veloso, A., Brunschwig, J. P., Dietrich, W. D. Cerebral blood flow restoration and reperfusion injury after ultraviolet laser-facilitated middle cerebral artery recanalization in rat thrombotic stroke. Stroke. 33 (2), 428-434 (2002).
- Uzdensky, A. B. Photothrombotic stroke as a model of ischemic stroke. Translational Stroke Research. 9 (5), 437-451 (2018).
- Karatas, H., et al. Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (3), 1452-1460 (2011).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Orset, C., et al. Efficacy of Alteplase in a mouse model of acute ischemic stroke: A retrospective pooled analysis. Stroke. 47 (5), 1312-1318 (2016).
- Kudo, M., Aoyama, A., Ichimori, S., Fukunaga, N. An animal model of cerebral infarction. Homologous blood clot emboli in rats. Stroke. 13 (4), 505-508 (1982).
- Busch, E., Kruger, K., Hossmann, K. A. Improved model of thromboembolic stroke and rt-PA induced reperfusion in the rat. Brain Research. 778 (1), 16-24 (1997).
- Lapchak, P. A., Araujo, D. M., Zivin, J. A. Comparison of Tenecteplase with Alteplase on clinical rating scores following small clot embolic strokes in rabbits. Experimental Neurology. 185 (1), 154-159 (2004).
- Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-Edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9 (6), 98807 (2014).
- Sun, Y. Y., et al. Prophylactic Edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: Implications for perioperative neuroprotection. Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).
- Sun, Y. Y., et al. Sickle mice are sensitive to hypoxia/ischemia-induced stroke but respond to tissue-type plasminogen activator treatment. Stroke. 48 (12), 3347-3355 (2017).
- Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. A thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxia-ischemia. Journal of Visualized Experiments. (102), e52978 (2015).
- Pena-Martinez, C., et al. Pharmacological modulation of neutrophil extracellular traps reverses thrombotic stroke tPA (tissue-type plasminogen activator) resistance. Stroke. 50 (11), 3228-3237 (2019).
- Denorme, F., et al. ADAMTS13-mediated thrombolysis of t-PA-resistant occlusions in ischemic stroke in mice. Blood. 127 (19), 2337-2345 (2016).
- Marder, V. J., et al. Analysis of thrombi retrieved from cerebral arteries of patients with acute ischemic stroke. Stroke. 37 (8), 2086-2093 (2006).
- Bacigaluppi, M., Semerano, A., Gullotta, G. S., Strambo, D. Insights from thrombi retrieved in stroke due to large vessel occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (8), 1433-1451 (2019).
- Sun, Y. Y., et al. A murine photothrombotic stroke model with an increased fibrin content and improved responses to tPA-lytic treatment. Blood Advances. 4 (7), 1222-1231 (2020).
- Su, E. J., et al. Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke. Nature Medicine. 14 (7), 731-737 (2008).
- Gupta, A. K., et al. Protective effects of gelsolin in acute pulmonary thromboembolism and thrombosis in the carotid artery of mice. PLoS One. 14 (4), 0215717 (2019).
- Carroll, B. J., Piazza, G. Hypercoagulable states in arterial and venous thrombosis: When, how, and who to test. Vascular Medicine. 23 (4), 388-399 (2018).
- Coutts, S. B., Berge, E., Campbell, B. C., Muir, K. W., Parsons, M. W. Tenecteplase for the treatment of acute ischemic stroke: A review of completed and ongoing randomized controlled trials. International Journal of Stroke. 13 (9), 885-892 (2018).
- McFadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. Current and future antiplatelet therapies: emphasis on preserving haemostasis. Nature Reviews Cardiology. 15 (3), 181-191 (2018).
- Bang, O. Y., Goyal, M., Liebeskind, D. S. Collateral crculation in ischemic stroke: Assessment tools and therapeutic strategies. Stroke. 46 (11), 3302-3309 (2015).
- Faber, J. E., Chilian, W. M., Deindl, E., van Royen, N., Simons, M. A brief etymology of the collateral circulation. Arteriosclerosis, Thrombsis, Vascular Biology. 34 (9), 1854-1859 (2014).
