Summary
Os modelos tradicionais de AVC fototrombótico (STP) induzem principalmente agregados plaquetários densos de alta resistência ao tratamento lítico com ativador do plasminogênio tecidual (tPA). Aqui um modelo de PTS murino modificado é introduzido pela co-injeção de trombina e corante fotossensível para fotoativação. O modelo de PTS com trombina produz coágulos mistos plaquetas:fibrina e é altamente sensível à trombólise tPA.
Abstract
Um modelo ideal de AVC tromboembólico requer certas propriedades, incluindo procedimentos cirúrgicos relativamente simples com baixa mortalidade, tamanho e localização consistentes do infarto, precipitação de coágulos sanguíneos mistos plaquetas:fibrina semelhantes aos dos pacientes e sensibilidade adequada ao tratamento fibrinolítico. O modelo de AVC fototrombótico baseado em corante rosa bengala (RB) atende aos dois primeiros requisitos, mas é altamente refratário ao tratamento lítico mediado por tPA, presumivelmente devido à sua composição de coágulo rica em plaquetas, mas pobre em fibrina. Argumentamos que a combinação de corante RB (50 mg/kg) e uma dose subtrombótica de trombina (80 U/kg) para fotoativação visando o ramo proximal da artéria cerebral média (ACM) pode produzir coágulos enriquecidos com fibrina e sensíveis a tPA. De fato, o modelo de fototrombose combinada com trombina e RB (T+RB) desencadeou coágulos sanguíneos mistos plaquetas:fibrina, como demonstrado por imunomarcação e imunomanchas, e manteve tamanhos e locais de infarto consistentes, além de baixa mortalidade. Além disso, a injeção intravenosa de tPA (Alteplase, 10 mg/kg) dentro de 2 h após a fotoativação diminuiu significativamente o tamanho do infarto na fototrombose T+RB. Assim, o modelo de AVC fototrombótico com trombina pode ser um modelo experimental útil para testar novas terapias trombolíticas.
Introduction
A trombectomia endovascular e a trombólise mediada por tPA são as duas únicas terapias aprovadas pela Food and Drug Administration (FDA) dos EUA para acidente vascular cerebral isquêmico agudo, que acomete ~700.000 pacientes anualmente nos Estados Unidos1. Como a aplicação da trombectomia é limitada à oclusão de grandes vasos (LVO), enquanto a trombólise tPA pode aliviar as oclusões de pequenos vasos, ambas são terapias valiosas do acidente vascular cerebral isquêmico agudo2. Além disso, a combinação de ambas as terapias (por exemplo, início de trombólise tPA-dentro de 4,5 horas do início do AVC, seguido de trombectomia) melhora a reperfusão e os resultados funcionais3. Assim, otimizar a trombólise continua sendo um objetivo importante para a pesquisa do AVC, mesmo na era da trombectomia.
Os modelos tromboembólicos são uma ferramenta essencial para a pesquisa pré-clínica de AVC com o objetivo de melhorar as terapias trombolíticas. Isso ocorre porque os modelos de oclusão vascular mecânica (por exemplo, oclusão da ACM por sutura intraluminal) não produzem coágulos sanguíneos, e sua rápida recuperação do fluxo sanguíneo cerebral após a remoção da oclusão mecânica é excessivamente idealizada 4,5. Até o momento, os principais modelos tromboembólicos incluem fototrombose6,7,8, aplicação tópica de cloreto férrico (FeCl3)9, microinjeção de trombina no ramo da ACM 10,11, injeção ex vivo de (micro)êmbolos na ACM ou artéria carótida comum (ACC)12,13,14 e hipóxia-isquemia transitória (tHI)15,16, 17,18. Esses modelos de AVC diferem na composição histológica dos coágulos subsequentes e na sensibilidade às terapias líticas mediadas por tPA (Tabela 1). Eles também variam na necessidade cirúrgica de craniotomia (necessária para injeção in situ de trombina e aplicação tópica de FeCl3), na consistência do tamanho e localização do infarto (por exemplo, a infusão de microêmbolos com CCA produz resultados muito variáveis) e nos efeitos globais sobre o sistema cardiovascular (por exemplo, o tHI aumenta a frequência cardíaca e o débito cardíaco para compensar a vasodilatação periférica induzida por hipóxia).
O modelo de AVC fototrombótico (PTS) baseado em corante RB tem muitas características atraentes, incluindo procedimentos cirúrgicos simples sem craniotomia, baixa mortalidade (tipicamente < 5%) e um tamanho e localização previsíveis do infarto (no território fornecedor de MCA), mas tem duas limitações principais. 8 A primeira ressalva é a resposta fraca a nula ao tratamento trombolítico mediado por tPA, o que também é uma desvantagem do modelo FeCl3 7,19,20. A segunda ressalva dos modelos de PTS e FeCl3 stroke é que os trombos subsequentes consistem em agregados plaquetários densamente embalados com uma pequena quantidade de fibrina, o que não apenas leva à sua resiliência à terapia lítica tPA, mas também se desvia do padrão de trombos mistos de plaquetas:fibrina em pacientes com AVC isquêmicoagudo 21,22. Em contraste, o modelo de microinjeção de trombina-microinjeção in situ compreende principalmente fibrina polimerizada e conteúdo incerto de plaquetas10.
Dado o raciocínio acima, levantamos a hipótese de que a mistura de RB e uma dose subtrombótica de trombina para fotoativação direcionada à MCA através do crânio afinado pode aumentar o componente de fibrina nos trombos resultantes e aumentar a sensibilidade ao tratamento lítico mediado por tPA. Confirmamos essa hipótese23 e descrevemos detalhadamente os procedimentos do modelo fototrombótico de AVC modificado (T+RB).
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Protocol
Este protocolo é aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Virgínia e segue a Diretriz do National Institutes of Health para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório. A Figura 1A descreve a sequência de procedimentos cirúrgicos desse protocolo.
1. Configuração da cirurgia
- Colocar uma almofada de aquecimento com temperatura regulada a 37 °C no adaptador de pequenos animais pelo menos 15 minutos antes da cirurgia. Prepare um rolo de clipe nasal para adaptador que permita a rotação da cabeça do animal. Preparar os anestésicos Ketamina (60 mg/kg)/ Xilazina (10 mg/kg).
- Esterilizar as ferramentas cirúrgicas incluindo tesouras, pinças, porta-microagulhas, hemostáticos, cotonetes e suturas com autoclave (121 °C a 15 psi por 60 min). Prepare cola de tecido e pomada para os olhos. Prepare o óculos de proteção a laser de 532 nm para cirurgiões.
NOTA: Este protocolo descreve um procedimento cirúrgico de sobrevida importante e deve ser conduzido usando técnicas assépticas. - Configure o sistema de iluminação com uma fonte laser de 532 nm. Prepare uma broca odontológica.
- Preparar a solução de Rosa Bengala em solução salina (10 mg/mL). Coloque uma alíquota de trombina bovina (0,1 U/μL) no balde de gelo.
- Injetar cetoprofeno (4,0 mg/kg) por via subcutânea no camundongo como analgesia 30 min antes da cirurgia ou utilizar o esquema analgésico recomendado pelas diretrizes institucionais locais.
2. Ligadura da artéria carótida comum ipsilateral
- Anestesiar camundongos machos C57BL/6NCrl de 10-14 semanas de idade, pesando 22 a 30 g, por injeção intramuscular de Ketamina (60 mg/kg) e Xilazina (10 mg/kg).
NOTA: Todo o procedimento cirúrgico, englobando a ligadura da artéria carótida comum ipsilateral através da monitorização do fluxo sanguíneo cerebral, deverá levar ~120 min. O regime anestésico será tipicamente eficaz durante toda essa duração, mas a profundidade anestésica deve ser reavaliada pelo menos a cada 15 min. Ao aprender esses procedimentos, pode ser necessário redosar a anestesia. - Realize uma pinça dos dedos dos pés para garantir que o animal esteja totalmente anestesiado. Remova os pelos do pescoço esquerdo para a ligadura CCA e a cabeça para o afinamento do crânio com o creme de depilação.
- Coloque o rato sobre o adaptador de pequenos animais na posição supina. Esterilizar a área cirúrgica limpando a pele com três toques alternados de iodopovidona e etanol 70%.
- Fixe a cabeça do mouse usando barras auriculares. Sob um microscópio dissecante, fazer uma incisão cervical-esquerda de 0,5 cm usando uma microtesoura e pinça reta a cerca de 0,2 cm lateral à linha média.
- Use um par de pinças finas serrilhadas para afastar o tecido mole e a fáscia para expor a artéria carótida comum esquerda (ACCE). Separe cuidadosamente a ACC esquerda do nervo vago usando um par de pinças finas e lisas.
- Coloque uma sutura permanente de duplo nó ao redor da ACE com fio de seda 5-0 cortado em segmentos de 20 mm e, em seguida, feche a ferida com clipes estéreis da ferida.
3. Afinamento do crânio acima do ramo da ACM e fotoativação
- Vire o mouse para a posição prona no adaptador de animais pequenos. Gire o rolo do clipe nasal por 15°. Esterilizar a área cirúrgica limpando a pele com três toques alternados de betadina e etanol 70%.
- Realizar incisão de 0,8 cm no couro cabeludo com uma microtesoura e pinça reta ao longo do olho esquerdo e orelha para expor o músculo temporal, que está localizado entre o olho e a orelha (Figura 1B).
- Sob o microscópio dissecante, fazer uma incisão de 0,5 cm ao longo da borda do músculo temporal no osso parietal esquerdo por um par de pinças finas serrilhadas. Fazer uma segunda incisão vertical de 0,3 cm no músculo temporal por uma microtesoura. Retrair o músculo temporal para expor a borda do osso parietal e do osso escamoso. Certifique-se de visualizar o ponto de sutura coronal entre os ossos frontal e parietal (Figura 1B,C).
- Umedecer o crânio aplicando soro fisiológico estéril para revelar a ACM esquerda. Marque o ramo proximal da ACM no osso escamoso com caneta marcadora. Desenhe suavemente um círculo de cerca de 1 mm de diâmetro ao redor da área marcada com a broca dentária pneumática (ajuste de velocidade da rebarba a 50% do controlador de velocidade) e, em seguida, afione o crânio com cerca de 0,2 mm de profundidade sem tocar na dura-máter inferior. Pare a perfuração até que uma camada muito fina de osso seja deixada.
- Misturar a solução de trombina (T, 0,1 U/μL, 80 U/kg) e Rosa bengala (RB, 10 mg/mL, 50 mg/kg) com base no peso corporal do rato. Por exemplo, para um camundongo de 25 g de peso corporal, misture 20 μL de trombina (0,1 U/μL) e 125 μL de RB (10 mg/mL).
- Injetar lentamente solução de T+RB (145 μL por 25 g de peso corporal) no seio retro-orbital com uma seringa de insulina (agulha #31G).
NOTA: Em experimentos piloto, a taxa de mortalidade de doses crescentes de trombina misturada com a dose padrão de corante RB (50 mg/kg) foi examinada para fotoativação. A mortalidade foi de 0% para 80 U/kg de trombina (n=13), 43% para 120 U/kg de trombina (n=7) e 100% para 160 U/kg (n=5) e 200 U/kg de trombina (n=5). Optou-se, portanto, pela dose de 80 U/kg de trombina. A imagem por contracção speckle laser também foi utilizada para excluir a possibilidade de coagulação sanguínea desenfreada próxima à cavidade orbitária após injeção de T+RB no seio retro-orbital (Figura 1 Suplementar), bem como deposição disseminada de fibrina no hemisfério contralateral que não foi submetida à iluminação a laser (Figura 2 Suplementar). - Aplique pomada ocular em ambos os olhos para evitar o ressecamento.
- Aplique o iluminador com uma luz laser de 532 nm (com energia de 0,5 mW) no local perfurado com distância de 2 polegadas por 20 min. Visualize a iluminação no ramo proximal da ACM através de um óculos de proteção a laser (Figura 1C,D).
NOTA: O MCA com iluminação de 532 nm mostra fluorescência vermelha sob o óculos. A ACM distal desaparecerá após 10 min de iluminação. Excluir o animal se o fluxo distal da ACM ainda estiver presente após 20 min de iluminação. - Pare a iluminação a laser após 20 min. Feche a ferida com clipes estéreis da ferida.
4. Imagem intravital (opcional)
OBS: Para caracterizar a formação de trombo in vivo, utilizar imagem intraviral por spin-disk confocal com sistema de fotoativação23.
- Faça uma janela craniana de ~3 mm de diâmetro no osso parietal do crânio.
- Coloque uma tampa na janela craniana e localize a ACM distal (~50 μm de diâmetro) sob uma objetiva de imersão em água de 20x.
- Rotular a plaqueta circulante por injeção na veia caudal do anticorpo anti-GPIbβ conjugado com DyLight488 (0,1 mg/kg) 5 minutos antes da aquisição de imagens.
- Injetar a solução da mistura de trombina (80 U/kg) e Rosa bengala (50 mg/kg) por via retro-orbital 5 minutos antes da aquisição de imagens.
- Fotoative a ACM utilizando um sistema de laser de 561 nm com feixe de laser de 10 μm de diâmetro e registre a imagem até a formação do trombo.
5. Administração de tPA
- Coloque o animal anestesiado em uma almofada quente a 37 °C. No ponto de tempo pós-fotoativação selecionado, molhe uma gaze com ~45 °C de água morna e envolva-a na cauda por 1 min.
- Injetar tPA humano recombinante (10 mg/kg) através da veia caudal com um bolus de 50% e 50% durante 30 minutos por bomba de infusão.
NOTA: Embora a dose clínica de tPA humano recombinante para o tratamento de AVC isquêmico agudo seja de 0,9 mg/kg, uma dose mais alta (10 mg/kg) é comumente usada em roedores para compensar a redução da reatividade de tPA entre espécies. Também seguimos o protocolo padrão de administração de tPA em modelos pré-clínicos de AVC, utilizando 50% como bolus e 50% infundidos através da veia caudal ao longo de 30 min.24
6. Monitor do fluxo sanguíneo cerebral (FSC)
NOTA: Para confirmar a recuperação do FSC após o tratamento com tPA, use um sistema de imagem bidimensional com contraste specklea laser 15 e registre imediatamente após a fototrombose (passo 3.9) ou 24 h após o tratamento com tPA.
- Coloque o animal anestesiado em decúbito ventral e faça uma incisão mediana no couro cabeludo com o crânio exposto.
- Hidrate o crânio com soro fisiológico estéril e aplique suavemente o gel de ultrassom no crânio. Evite pelos e bolhas no gel, que vão interferir no sinal da CBF.
- Monitorar o FSC em ambos os hemisférios cerebrais sob imageador de contraste speckle laser por 10 min.
- Após o registro da imagem da FBC, feche o couro cabeludo com cola de tecido e devolva o animal à gaiola.
- Analisar a FBC nas regiões selecionadas e calcular o percentual de recuperação da FBC em relação à região contralateral.
- Em seguida, coloque o animal de volta em uma gaiola quente para recuperação. Monitore os camundongos por 5-10 minutos até que eles se recuperem da anestesia. Coloque o alimento molhado na gaiola e devolva-o ao centro de cuidados com os animais.
OBS: Proporcionar analgesia pós-operatória conforme preconizado pelas diretrizes institucionais locais.
7. Medida do volume de infarto pela coloração com cloreto de trifenil tetrazólio (TTC)
- Vinte e quatro horas após a fototrombose, anestesiar profundamente o animal de acordo com as diretrizes institucionais locais para cirurgia de não sobrevivência.
NOTA: Administramos tribromoetanol (avertin) 250 mg/kg por injeção intraperitoneal (IP). - Realizar perfusão transcárdica com PBS, coletar cérebro fresco e embutir em gel de ágar 3%.
- Seccionar o corte cerebral com 1 mm de espessura por vibratomo e incubar em solução TTC a 2% por 10 min.
- Quantifique o volume total de infarto de 6 fatias cerebrais como volume absoluto pelo software ImageJ.
OBS: O edema cerebral não foi utilizado como medida de desfecho por dois motivos. Primeiro, a coloração TTC mede a viabilidade tecidual (via atividade redutora mitocondrial), que é uma consequência mais grave do que o edema. Em segundo lugar, à medida que o infarto prossegue, tanto o edema vasogênico quanto o citotóxico ocorrem e não podem ser facilmente distinguidos pelos métodos padrão de medição do edema cerebral. No entanto, usamos a marcação antiimunoglobina (IgG) para avaliar a integridade da barreira hematoencefálica (BHE) e encontramos extravasamento de IgG comparável 6 h após a fotoativação em ambos os modelos de AVC RB e T+RB (Figura 3 suplementar).
8. Medição da formação do trombo
OBS: Para medir a formação do trombo, coletar o cérebro em 1 h e 2 h após a fototrombose para a medida do trombo na ACM por imunoquímica (IHQ) e para a dosagem de fibrina no hemisfério cerebral por imunoblot, respectivamente.
- Realizar o IHQ para a caracterização da composição do coágulo. Fixe o cérebro com paraformaldeído a 4% durante a noite e, em seguida, desidrate o cérebro com 30% de sacarose para a incorporação da OCT.
- Seccionar o cérebro com orientação sagital em 20 μm de espessura e realizar a IHQ com anticorpos específicos contra fibrinogênio, plaquetas (glicoproteína IIb), hemácias (TER119) e vasos sanguíneos (isomectina GS-IB4).
- Realizar a medição de fibrina no hemisfério cerebral por immunoblot com um anticorpo contra fibrinogênio.
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Representative Results
Primeiro, comparamos o conteúdo de fibrina em coágulos sanguíneos induzidos por fototrombose RB versus T+RB. Camundongos foram sacrificados por perfusão transcárdica de fixadores 2 h após a fotoativação, e cérebros foram removidos para coloração por imunofluorescência do ramo da ACM nos planos longitudinal e transversal. Na fototrombose RB, o ramo da ACM estava densamente preenchido com plaquetas CD41+ e pouca fibrina (Figura 2A,C). Em contraste, o ramo da ACM na fototrombose T+RB foi ocluído por coágulos aleatoriamente mistos plaquetas:fibrina (Figura 2B,D, n>3 para cada um). Também usamos immunoblots para comparar o nível de fibrina (ogen) no córtex cerebral entre os dois modelos, após perfusão transcárdica com solução salina 2 h após a fotoativação. Essa análise mostrou > duas vezes maior da deposição de fibrina no hemisfério ipsilateral em T+RB do que na fototrombose RB (Figura 2E, p=0,027 pelo teste t não pareado; n=3 para cada grupo). Em nosso relato original, também usamos fotoativação de vaso único baseada em microscópio confocal e imagens intravitais para comparar o comportamento de plaquetas marcadas com anti-GP1bβ conjugadas com FITC. 23 Esses experimentos mostraram que a injeção intravenosa de 80 U/kg de trombina não induziu agregados plaquetários mesmo sob iluminação a laser (Figura 3A), e que as plaquetas formam coágulos homogêneos no modelo de fototrombose RB (Figura 3B), mas agregados desiguais com múltiplas regiões tênues na fototrombose T+RB (Figura 3C). Esses resultados sugerem que a fototrombose T+RB aumenta o conteúdo de fibrina nos trombos subsequentes.
Em seguida, comparamos os efeitos do tratamento com tPA intravenoso agudo (10 mg/kg de Alteplase, 30 min após a fotoativação) na recuperação do fluxo sanguíneo cerebral (FSC) entre os dois modelos. O FSC do mesmo camundongo no pré e 24 h pós-tPA-versus-veículo foi medido por meio de contraste speckle laser e normalizado para o hemisfério contralateral (Figura 4A,B). Na fototrombose RB, o tratamento com tPA levou a uma tendência de recuperação do FSC, particularmente na área de borda isquêmica, quando comparado aos camundongos tratados com veículo (Figura 4C, veículo 51 ± 9% vs tPA 65 ± 7%, p=0,3 pelo teste t não pareado, n=4 para cada). Na fototrombose T+RB, a recuperação do FSC em camundongos tratados com tPA foi mais proeminente, e os ramos proximais da ACM frequentemente tornaram-se visíveis em 24 h (Figura 4D, veículo 55 ± 3% vs tPA 81 ± 7%, p=0,02 pelo teste t não pareado, n=6 para cada grupo). Esses resultados sugerem maior sensibilidade à terapia lítica tPA+RB do que à fototrombose RB.
Finalmente, utilizamos a coloração TTC para quantificar os efeitos do tratamento com tPA sobre o tamanho do infarto nos modelos de AVC fototrombótico RB e T+RB. Na fototrombose RB, um tamanho de infarto semelhante foi detectado em camundongos tratados com veículo (18 ± 2,80 mm 3, n=6) e tratados com tPA (18 ± 1,95 mm3, n=10; 10 mg/kg tPA foi injetado 30 min após a fotoativação) (Figura 5A). Em contraste, o tratamento tPA-lítico reduziu significativamente o infarto quando o tPA foi injetado em 0,5 h (7 ± 2,1 mm 3, n=9), 1 h (4,6 ± 1 mm 3, n=10) ou 2 h (6,4 ± 1,5 mm 3, n=8 ), mas não em 6 h pós-fotoativação (15,2 ± 3,1 mm 3, n=7), em comparação com camundongos tratados com veículo (14,8 ± 2 mm 3, n=19) (Figura 5B, valor de p determinado pelo teste t não pareado). Esses resultados indicam que o modelo de AVC fototrombótico T+RB tem sensibilidade ao tratamento tPA-lítico no país.
Figura 1: Esquema dos procedimentos. (A) Fluxograma dos principais procedimentos cirúrgicos no modelo fototrombótico T+RB. A ligadura da artéria carótida comum (ACC) ipsilateral é opcional, mas achamos que torna o tamanho do infarto mais consistente, presumivelmente devido à diminuição da circulação colateral. (B) Vista superior e lateral do cérebro de camundongos em relação ao crânio. Também são indicados os olhos, a orelha, o músculo temporal, a artéria cerebral média (ACM) e ramos, a sutura coronal e o local de iluminação a laser. (C) Visualização do ramo alvo da ACM sob o crânio afinado (C1) e durante a iluminação a laser (C2), e cessação do fluxo sanguíneo após fotoativação (C3). Notar a relação do ramo da ACM com a sutura coronal. (D) A configuração de um mouse durante a iluminação a laser no ramo MCA esquerdo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Diferentes conteúdos de fibrina nos coágulos sanguíneos. (A-D) Marcação por imunofluorescência dos trombos induzidos por fototrombose RB e T+RB no ramo distal da ACM em plano longitudinal (A, B) ou transversal (C, D) usando marcadores antifibrina (verde), anti-CD41/plaqueta (vermelho) e isolado B4/células endoteliais (azul). Notar o aumento acentuado dos imunosinais antifibrina nos coágulos sanguíneos induzidos por fototrombose T+RB (B, D, n=3 para cada grupo). (E) O immunoblotting indicou maior deposição de fibrina no córtex cerebral ipsilateral em T+RB do que a fototrombose RB 2 h pós-fotoativação (n=3 para cada). UN: camundongos não lesionados; Cont: córtex contralateral; Ipsi: córtex ipsilateral. Barra de escala: 50 μm. Este valor é modificado com permissão de [23]. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagem intravital das respostas plaquetárias. Imagem intravital baseada em microscópio confocal de plaquetas marcadas com FITC-conjugadas anti-GP1bβ sob iluminação a laser de vaso único (no local indicado por setas brancas). Os grupos experimentais são: (A) trombina isolada, (B) Rosa Bengala isolada e (C) trombina mais Rosa Bengala. Os tempos após a iluminação a laser são rotulados. Veja o vídeo no site da JoVE para este manuscrito. Barra de escala: 50 μm. Este valor é modificado com permissão de [23]. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Efeitos do tratamento com tPA na recuperação do FSC. O tPA humano recombinante (Alteplase, 10 mg/kg) ou veículo foi administrado via veia caudal em camundongos com fototrombose RB e T+RB desafiados por fototrombose em 30 min após a iluminação do laser, e o fluxo sanguíneo cerebral (FSC) no pré e 24 h pós-tratamento no mesmo camundongo foi comparado com imagens de contraste speckle a laser. O FSC em uma área de 3 x 4,8 mm em ambos os hemisférios foi medido. Os grupos experimentais são: (A, C) fototrombose RB; (B, D) Fototrombose T+RB. Destaca-se a recuperação significativa do FSC pelo tratamento com tPA no grupo fototrombose T+RB (p=0,02 pelo teste t não pareado, n=4 para o veículo e n=6 para o tratamento com tPA) e a visualização frequente do ramo proximal da ACM. Na fototrombose RB, o tratamento tPA levou a uma tendência de melhor FSC, predominantemente na área isquêmica periférica (p=0,3 pelo teste t não pareado, n=4 para veículo e n=5 para tPA). As setas brancas indicam o local de fotoativação da ACM. Este valor é modificado com permissão de [23]. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Efeitos do tratamento com tPA sobre o tamanho do infarto. (A) O tratamento intravenoso com tPA (Alteplase, 10 mg/kg) 30 minutos após a fototrombose RB não reduziu o tamanho do infarto (n=6 em camundongos tratados com veículo e n=10 em camundongos tratados com tPA). (B) Em contraste, na fototrombose T+RB, o tratamento com Alteplase 10 mg/kg por via venosa em 0,5, 1 ou 2 h, mas não em 6 h após a fotoativação, levou a uma redução significativa do tamanho do infarto. O valor de p foi determinado por ANOVA one-way com teste de comparações múltiplas de Tukey. Este valor é modificado com permissão de [23]. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Modelo | Procedimento Cirúrgico | Coágulos sanguíneos | Plaquetas | Fibrina | tPA-reatividade | Principais características/utilidade | Principais referências |
| Sutura intraluminal MCAO | Oclusão da ACM endovascular | Não | N/A | N/A | Não | Reperfusão rápida; Estudo da neuropreção; Lesão BBB induzida por tPA | 1989 (Ref #5) |
| Fototrombose | Afinamento craniano e fotoativação | Sim | Fraco | Alta reprodutibilidade; baixa mortalidade | 1985 (Ref #6) | ||
| Trombina-Fototrombose | UCCAO, Afinamento craniano e fotoativação | Sim | Sim | Alta reprodutibilidade; baixa mortalidade | 2020 (Ref #23) | ||
| FeCl3 (no MCA) | Afinamento do crânio e ativação química | Sim | Não | Alta reprodutibilidade; baixa mortalidade | 2011 (Ref #69) | ||
| injeção in situ de trombina | Craniotomia e microinjeção de MCA | Sim | Sim | Alta reprodutibilidade; baixa mortalidade; tPA-tratamento lítico | 2007 (Ref #10) | ||
| Êmbolos-MCAO | Oclusão da ACM endovascular | Sim | Sim | tratamento lítico com tPA; Dureza variável do coágulo | 1997 (Ref #13) | ||
| Hipóxia-isquemia transitória (tHI) | UCCAO mais hipóxia | Sim | Sim | Infarto > área de ACM; Efeitos CV sistêmicos | 2014 (Ref #15) |
Tabela 1: Comparação dos modelos pré-clínicos selecionados de AVC. Caixas cheias indicam positividade (presença de coágulos sanguíneos, plaquetas e fibrina) ou reatividade significativa de tPA.
Figura suplementar 1: Monitor de FSC após injeção retroorbitária de trombina. (A) As fotos representativas do seio retro-orbital (painel superior) e do fluxo sanguíneo por meio de contraste speckle laser (painel inferior). Os três sítios vasculares (1~3 como marcado) foram monitorados após a injeção de trombina (80 U/kg) no seio retro-orbital. (B) Gráfico representativo do traçado do fluxo sanguíneo durante 15 min após a injeção de trombina (seta). (C) A quantificação baseada em speckle a laser não mostrou redução do fluxo sanguíneo próximo ao seio retro-orbital dentro de 15 min após a injeção de trombina (n=4, valor de p determinado pelo teste t não pareado). Clique aqui para baixar esta figura.
Figura 2 suplementar: Ausência de deposição de fibrina no hemisfério contralateral 6 horas após a fotoativação. A imunomarcação do antifibrinogênio (verde) mostrou deposição de fibrina no córtex ipsilateral 6 h após fototrombose RB e T+RB. Em contraste, não houve deposição de fibrina discerível no córtex contralateral após fototrombose com trombina realçada. N=4 para cada grupo. Barra de escala: 50 μm. Fluorescência azul como coloração do núcleo DAPI. Clique aqui para baixar esta figura.
Figura Suplementar 3: Ausência de extravasamento de imunoglobulina (IgG) após fototrombose. Em 6 h após a fotoativação unilateral direcionada para MCA, a imunomarcação mostrou extravasamento de IgG no hemisfério ipsilateral, mas não no hemisfério contralateral, sugerindo dano restrito à BHE após fototrombose com trombina. N=4 para cada um. Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para baixar esta figura.
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Discussion
O tradicional acidente vascular cerebral fototrombótico RB, introduzido em 1985, é um modelo atraente de isquemia cerebral focal para procedimentos cirúrgicos simples, baixa mortalidade e alta reprodutibilidade do infarto cerebral. 5 Nesse modelo, o corante fotodinâmico RB ativa rapidamente as plaquetas à excitação luminosa, levando a agregados densos que ocluem o vaso sanguíneo 5,8,23. No entanto, a pequena quantidade de fibrina nos coágulos sanguíneos induzidos por RB (Figura 2) desvia-se do padrão dominante de trombos misturados plaquetas:fibrina recuperados agudamente em pacientes com AVC isquêmico21,22. O baixo conteúdo de fibrina nos trombos induzidos por RB provavelmente também contribui para sua resiliência ao tratamento tPA-lítico 7,8,19. Embora a irradiação com laser ultravioleta induza recanalização vascular na fototrombose do RB, é improvável que essa terapia experimental seja usada clinicamente7. Assim, o tradicional AVC fototrombótico RB tem sido usado principalmente como um modelo de oclusão permanente, menos adequado para pesquisas de trombólise e neuroproteção (este último frequentemente usa o modelo MCAO de sutura intraluminal que apresenta rápida reperfusão vascular após a remoção da oclusão mecânica).
Nós hipotetizamos que o uso de mistura de RB e uma dose subtrombótica de trombina para fotoativação pode aumentar o conteúdo de fibrina nos trombos subsequentes e aumentar as respostas à trombólise tPA, a terapia de AVC do mundo real. Essa hipótese é reforçada pelos resultados aqui apresentados e em nosso relato original. 23 O modelo de AVC fototrombótico com trombina também mantém as vantagens de baixa mortalidade, procedimentos cirúrgicos simples e alta consistência no tamanho e localização do infarto, como no modelo tradicional de fototrombose RB. Assim, acreditamos que a fototrombose com trombina seja um acréscimo valioso ao repertório de modelos de AVC tromboembólico (Tabela 1). Dois detalhes do procedimento do modelo de fototrombose com trombina merecem discussão. Primeiro, a superdosagem de trombina por via venosa pode provocar tromboembolismo pulmonar agudo e mortalidade animal25. Examinamos uma variedade de doses de trombina para combinação com fototrombose RB, e a dose escolhida de 80 U/kg não induziu mortalidade em >100 camundongos adultos C57Bl/6 machos experimentados até agora. É provável que a dose de trombina necessite de ajuste para camundongos com estados de hipercoagulação26. Em segundo lugar, ligamos rotineiramente a CCA ipsilateral além da fototrombose direcionada para ACM em nossos procedimentos. Observamos que a ligadura da ACC ipsilateral aumenta ainda mais a consistência do tamanho do infarto, o que pode ser devido à diminuição da circulação colateral entre a ACM e as artérias cerebrais anterior e posterior.
Com suas propriedades únicas, o modelo de AVC fototrombótico aprimorado com trombina pode ser particularmente útil para pelo menos três tópicos de pesquisa. Em primeiro lugar, esse novo modelo é ideal para comparação direta de tPA e outros agentes fibrinolíticos, como Tenecteplase (TNKase)27. A TNKase é uma variante modificada do mutante tPA com maior especificidade de fibrina e menor risco de hemorragia iatrogênica em experimentos ex vivo. No entanto, sua superioridade em relação ao tPA só foi testada em um modelo de AVC microembólico e usando uma análise binária de resultados neurológicos14. Dada sua alta reprodutibilidade e análise quantitativa do tamanho do infarto, o modelo de AVC fototrombótico com trombina pode ser usado para comparar os benefícios e efeitos adversos da tPA-versus-TNKase em múltiplos aspectos (por exemplo, respostas à dose, janela terapêutica, impactos na comorbidade e potenciais efeitos adversos no tratamento tardio). Em segundo lugar, o modelo de fototrombose com trombina pode ser útil para investigar os efeitos do tratamento combinado com tPA e antiplaquetários no acidente vascular cerebral isquêmico agudo28. Avanços recentes dos procedimentos endovasculares no acidente vascular cerebral isquêmico permitiram analisar a composição histológica dos trombos agudos e identificar um padrão predominante de mistura plaquetária:fibrina21,22. Assim, a combinação de um agente fibrinolítico (tPA) e agentes antiplaquetários pode aumentar a eficácia geral da trombólise, mas um modelo de AVC que simule a composição clínica plaqueta:fibrina do trombo é crucial para essa pesquisa. Juntamente com os modelos tHI e êmbolo-MCAO, a trombina-fototrombose preenche esse requisito e se destaca por sua baixa mortalidade, procedimentos cirúrgicos simples e ausência de efeitos cardiovasculares sistêmicos (Tabela 1).
Por último, mas não menos importante, a fototrombose com trombina pode ser particularmente útil para investigar a circulação colateral induzida por AVC, dada sua previsível localização peri-infarto no território fornecedor de ACM. Ao sustentar a penumbra para compensar o crescimento do infarto, a circulação colateral é cada vez mais reconhecida como um importante preditor de desfechos de AVC isquêmico, pois a obstrução vascular aguda promove fluxo sanguíneo através da rede colateral, seguida de remodelamento e angiogênese para formar vasos neocolaterais29,30. Os resultados sugerem que o tPA não só promove a recanalização da ACM proximal, mas também aumenta a circulação colateral na área periférica fornecedora de ACM (Figura 4). Compreender melhor os mecanismos que regulam a plasticidade da circulação colateral pode sugerir novas terapias. Como o modelo de AVC fototrombótico realçado com trombina oferece a vantagem da região peri-infarto previsível e da sensibilidade ao tratamento lítico, ele auxiliará a pesquisa da circulação colateral pós-AVC.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelos subsídios do NIH (NS108763, NS100419, NS095064 e HD080429 para C.Y. K.; e NS106592 para Y.Y.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | infarct |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 543nm laser beam | Melles Griot | 25-LGP-193-249 | photothrombosis |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~14 weeks old (22~30 g) |
| Anesthesia bar for mouse adaptor | machine shop, UVA | surgical setup | |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Dental drill | Dentamerica | Rotex 782 | surgical setup |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | brain imaging |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| infusion pump | KD Scientific | 200 | thrombolytic treatment |
| Insulin syringe with 31G needle | BD | 328291 | photothrombosis |
| Ketamine | CCM, UVA | anesthesia | |
| Laser protective google 532nm | Thorlabs | LG3 | photothrombosis |
| Ketoprofen | CCM, UVA | NSAID analgesia | |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mouse adaptor | RWD | 68014 | surgical setup |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| Retractor tips | Kent Scientific | Surgi-5014-2 | surgical setup |
| Rose Bengal | Sigma | 198250 | photothrombosis |
| Thrombin | Sigma | T7513 | photothrombosis |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| tPA | Genetech | Cathflo activase 2mg | thrombolytic treatment |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | TTC infacrt |
| Xylazine | CCM, UVA | anesthesia |
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