Summary
従来の光血栓性脳卒中(PTS)モデルは、主に組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)溶解性治療に対して高い耐性の高密度血小板凝集体を誘導します。ここでは、光活性化のためにトロンビンと感光性色素を同時注入することにより、修正されたマウスPTSモデルが導入されています。トロンビン増強PTSモデルは、血小板:フィブリン血栓を混合し、tPA血栓溶解に対して非常に敏感です。
Abstract
理想的な血栓塞栓性脳卒中モデルには、死亡率の低い比較的単純な外科的処置、一貫した梗塞のサイズと位置、患者と同様の血小板:フィブリン混合血栓の沈殿、線溶治療に対する適切な感受性など、特定の特性が必要です。ローズベンガル(RB)色素ベースの光血栓性脳卒中モデルは、最初の2つの要件を満たしていますが、おそらく血小板に富むがフィブリンに乏しい血栓組成のために、tPAを介した溶解性治療に非常に抵抗性があります。RB色素(50 mg / kg)と血栓下用量のトロンビン(80 U / kg)の組み合わせは、中大脳動脈(MCA)の近位枝を対象とした光活性化のために、フィブリンが豊富でtPA感受性の血栓を生成する可能性があると推論します。実際、トロンビンとRB(T+RB)を組み合わせた光血栓症モデルは、免疫染色と免疫ブロットによって示されるように、血小板:フィブリン混合血栓を引き起こし、一貫した梗塞のサイズと位置を維持し、死亡率を低くしました。さらに、光活性化後2時間以内にtPA(アルテプラーゼ、10mg / kg)を静脈内注射すると、T + RB光血栓症の梗塞サイズが有意に減少しました。したがって、トロンビン増強光血栓性脳卒中モデルは、新規の血栓溶解療法を試験するための有用な実験モデルとなり得る。
Introduction
血管内血栓摘出術とtPA媒介性血栓溶解療法は、米国で年間~70万人の患者を苦しめている急性虚血性脳卒中に対して、米国食品医薬品局(FDA)が承認した唯一の治療法です1。血栓摘出術の適用は大血管閉塞症(LVO)に限定されていますが、tPA血栓溶解療法は小血管閉塞を緩和する可能性があるため、どちらも急性虚血性脳卒中の貴重な治療法です2。さらに、両方の治療法の組み合わせ(例:脳卒中発症から4.5時間以内にtPA血栓溶解療法を開始し、その後血栓摘出術を行う)により、再灌流と機能的転帰が改善されます3。このように、血栓溶解の最適化は、血栓摘出術の時代になっても、脳卒中研究にとって重要な目標であり続けています。
血栓塞栓症モデルは、血栓溶解療法の改善を目的とした前臨床脳卒中研究に不可欠なツールです。これは、機械的血管閉塞モデル(例:管腔内縫合MCA閉塞)が血栓を作らず、機械的閉塞除去後の脳血流の迅速な回復が過度に理想化されているためです4,5。現在までに、主要な血栓塞栓症モデルには、光血栓症6,7,8、局所塩化第二鉄(FeCl3)アプリケーション9、MCA枝へのトロンビンのマイクロインジェクション10,11、MCAまたは総頸動脈(CCA)へのex vivo(マイクロ)塞栓の注入12,13,14、および一過性低酸素虚血(tHI)15,16が含まれます。17,18。これらの脳卒中モデルは、その後の血栓の組織学的組成とtPAを介した溶解療法に対する感受性が異なります(表1)。それらはまた、開頭術の外科的要件(in situトロンビン注射およびFeCl3の局所適用に必要)、梗塞のサイズと位置の一貫性(例、微小塞栓のCCA注入は非常に異なる結果をもたらす)、および心血管系への全体的な影響(例:tHIは心拍数と心拍出量を増加させ、低酸素誘発性末梢血管拡張を補う)にもさまざまである。
RB色素ベースの光血栓性脳卒中(PTS)モデルには、開頭術を使わない簡単な外科的処置、低い死亡率(通常<5%)、梗塞のサイズと位置の予測可能(MCA供給領域内)など、多くの魅力的な特徴がありますが、2つの大きな制限があります。8 最初の注意点は、tPAを介した血栓溶解治療に対する反応が弱いかゼロであることであり、これもFeCl3モデル7,19,20の欠点です。PTSおよびFeCl3脳卒中モデルの2番目の注意点は、その後の血栓が少量のフィブリンを含む高密度の血小板凝集体で構成されており、tPA溶解療法に対する回復力につながるだけでなく、急性虚血性脳卒中患者における血小板:フィブリン血栓の混合パターンからも逸脱していることです21,22。対照的に、in situトロンビン−マイクロインジェクションモデルは、主に重合フィブリンと不確実な血小板の含有量を含む10。
上記の推論を考えると、RBと血栓下用量のトロンビンの混合は、薄くなった頭蓋骨を介したMCA標的光活性化のために、結果として生じる血栓のフィブリン成分を増加させ、tPAを介した溶解治療に対する感受性を高める可能性があると仮定しました。我々はこの仮説を確認し23 、ここでは修正(T+RB)光血栓性脳卒中モデルの詳細な手順を説明する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
このプロトコルは、バージニア大学の動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されており、実験動物のケアと使用に関する国立衛生研究所のガイドラインに従っています。 図1A は、このプロトコルの外科的処置のシーケンスを概説しています。
1. 手術のセットアップ
- 手術の少なくとも15分前に、小動物用アダプターに温度設定37°Cの加温パッドを置きます。動物の頭を回転させるアダプター用のノーズクリップロールを用意します。麻酔薬ケタミン(60 mg / kg)/キシラジン(10 mg / kg)を準備します。
- ハサミ、鉗子、マイクロニードルホルダー、止血剤、綿棒、縫合糸などの手術器具をオートクレーブで滅菌します(121°C、15psi、60分間)。ティッシュグルーと眼軟膏を準備します。外科医用の532nmレーザー保護ゴーグルを準備します。
注:このプロトコルは、主要な生存手術手順を説明しており、無菌技術を使用して実施する必要があります。 - 532nmのレーザー光源で照明システムをセットアップします。歯科用ドリルを準備します。
- Rose Bengal溶液を生理食塩水(10 mg/mL)で調製します。分注したウシトロンビン(0.1 U/μL)をアイスバケットに置きます。
- 手術の30分前に鎮痛剤としてケトプロフェン(4.0 mg / kg)をマウスに皮下注射するか、地域の施設ガイドラインで推奨されている鎮痛レジメンを使用します。.
2.同側総頸動脈の結紮術
- 体重22〜30gの10〜14週齢の雄C57BL / 6NCrlマウスに、ケタミン(60 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)の筋肉内注射で麻酔します。
注:脳血流のモニタリングによる同側総頸動脈の結紮を含む外科的処置全体は、~120分かかると予想されます。麻酔薬レジメンは通常、この期間全体にわたって有効ですが、麻酔薬の深さは少なくとも15分ごとに再評価する必要があります。これらの手順を学習している間に、麻酔を再投与する必要がある場合があります。 - つま先をつまんで、動物が完全に麻酔されていることを確認します。CCA結紮のために左首の毛を取り除き、頭蓋骨を薄くするために頭部を脱毛クリームで除去します。
- マウスを小動物用アダプターの上に仰臥位で置きます。ポビドンヨードと70%エタノールを交互に3回スワイプして皮膚を拭いて、手術部位を滅菌します。
- イヤーバーを使用してマウスヘッドを固定します。解剖顕微鏡下で、正中線から外側約0.2cmのところにマイクロハサミとまっすぐな鉗子を使用して、0.5cmの左頸部切開を行います。
- 一対の細い鋸歯状の鉗子を使用して軟部組織と筋膜を引き離し、左総頸動脈(LCCA)を露出させます。一対の細かく滑らかな鉗子を使用して、左CCAを迷走神経から慎重に分離します。
- 20mmセグメントにカットされた5-0シルク縫合糸を使用してLCCAの周囲に恒久的なダブルノット縫合糸を配置し、滅菌創傷クリップを使用して創傷を閉じます。
3. MCA枝の上の頭蓋骨の薄化と光活性化
- マウスをひっくり返して、小動物用アダプターの腹臥位にします。ノーズクリップロールを15°回転させます。ベタジンと70%エタノールを交互に3回スワイプして皮膚を拭いて、手術部位を滅菌します。
- 左目と耳に沿ってマイクロハサミとまっすぐな鉗子を使用して頭皮を0.8cm切開し、目と耳の間にある側頭筋を露出させます(図1B)。
- 解剖顕微鏡の下で、一対の細かい鋸歯状の鉗子によって、左頭頂骨の側頭筋の端に沿って0.5cmの切開を行います。マイクロハサミで側頭筋を0.3cmの垂直切開します。側頭筋を引っ込めて、頭頂骨と扁平上皮骨の端を露出させます。前頭骨と頭頂骨の間の冠状縫合のランドマークを必ず視覚化してください(図1B、C)。
- 滅菌生理食塩水を塗布して頭蓋骨を湿らせ、左MCAを明らかにします。扁平上皮骨の近位MCA枝にマーカーペンで印を付けます。空気圧式歯科用ドリル(スピードコントローラーの50%でバリ速度設定)でマークした部分を囲む直径約1mmの円をそっと描き、下の硬膜に触れずに頭蓋骨を深さ約0.2mm薄くします。骨の非常に薄い層が残るまで穴あけを停止します。
- トロンビン(T、0.1 U/μL、80 U/kg)とローズベンガル(RB、10 mg/mL、50 mg/kg)溶液をマウスの体重に基づいて混合します。例えば、体重25 gのマウスの場合、20 μLのトロンビン(0.1 U/μL)と125 μLのRB(10 mg/mL)を混合します。
- インスリン注射器(#31G 針)を使用して、T + RB溶液(体重25gあたり145μL)を眼窩後洞にゆっくりと注入します。
注:パイロット実験では、標準用量のRB色素(50 mg / kg)と混合されたトロンビンの用量を増やした場合の死亡率を調べて、光活性化を調べました。.死亡率は、80 U / kgトロンビン(n = 13)で0%、120 U / kgトロンビン(n = 7)で43%、160 U / kg(n = 5)と200 U / kgトロンビン(n = 5)の両方で100%でした。.したがって、このモデルには80 U / kgトロンビンの用量が選択されました。また、T+RBの眼窩後洞注射後の眼窩腔付近での血液凝固の横行(補足図1)や、レーザー照射を受けなかった対側半球への広範囲のフィブリン沈着(補足図2)を排除するために、レーザースペックル収縮イメージングも使用しました。 - 乾燥を防ぐために両目に軟膏を塗ります。
- 532nmのレーザー光(0.5mWのエネルギー)を2インチの距離で掘削した場所に20分間照射します。レーザー保護ゴーグルを通してMCAの近位枝の照明を視覚化します(図1C、D)。
注:532nmの照明を備えたMCAは、ゴーグルの下で赤色蛍光を示します。遠位MCAは10分間の照明後に消えます。遠位MCAの流れが20分間の照明後もまだ存在する場合は、動物を除外します。 - 20分後にレーザー照射を停止します。滅菌創傷クリップで創傷を閉じます。
4.生体内イメージング(オプション)
注:生体内での血栓形成を特徴付けるには、光活性化システム23を備えたスピンディスク共焦点によるウイルス内イメージングを使用します。
- 頭蓋骨の頭頂骨に直径~3mmの頭蓋窓を作ります。
- 頭蓋窓にカバーガラスを置き、遠位MCA(直径~50μm)を20倍の水浸対物レンズの下に配置します。
- イメージングの 5 分前に DyLight488 標識抗 GPIbβ 抗体 (0.1 mg/kg) を尾静脈注射して循環血小板を標識します。
- トロンビン(80 U/kg)とローズベンガル(50 mg/kg)の混合溶液を5分前に眼窩後注入する。
- 直径10μmのレーザービームを持つ561nmレーザーシステムを使用してMCAを光活性化し、血栓形成までの画像を記録します。
5. tPA投与
- 麻酔をかけた動物を37°Cの温かいパッドの上に置きます。選択した光活性化後の時点で、ガーゼを~45°Cの温水で濡らし、テールに1分間包みます。
- 組換えヒトtPA(10 mg / kg)を尾静脈から50%ボーラスで注入し、輸液ポンプで30分かけて50%注入します。
注:急性虚血性脳卒中治療のための組換えヒトtPAの臨床用量は0.9 mg / kgですが、種間tPA反応性の低下を補うために、げっ歯類ではより高い用量(10 mg / kg)が一般的に使用されます。.また、前臨床脳卒中モデルにおけるtPA投与の標準プロトコルに従い、50%をボーラスとして使用し、50%を尾静脈から30分かけて注入しました24。
6.脳血流(CBF)のモニター
注:tPA処理後のCBF回復を確認するために、2次元レーザースペックルコントラストイメージングシステム15 を使用し、光血栓症の直後(ステップ3.9)またはtPA処理の24時間後に記録する。
- 麻酔をかけた動物を腹臥位に置き、頭蓋骨を露出させて頭皮を正中線で切開します。
- 滅菌生理食塩水で頭蓋骨に潤いを与え、超音波ジェルを頭蓋骨にやさしく塗ります。CBF信号を妨害するジェル内の髪の毛や気泡を避けてください。
- 両大脳半球のCBFをレーザースペックルコントラストイメージャーで10分間モニターします。
- CBF画像を記録した後、ティッシュグルーで頭皮を閉じ、動物をケージに戻します。
- 選択した領域の CBF を分析し、反対側の領域と比較した CBF 回収率を計算します。
- その後、動物を温かいケージに戻して回復させます。マウスが麻酔から回復するまで5〜10分間監視します。湿らせた餌をケージに入れ、動物飼育施設に戻します。
注:地域の施設ガイドラインで推奨されているように、術後の鎮痛剤を提供してください。
7. 塩化トリフェニルテトラゾリウム(TTC)染色による梗塞体積測定
- 光血栓症の24時間後に、非生存手術に関する地域の施設ガイドラインに従って動物に深く麻酔をかけます。
注:トリブロモエタノール(アベルチン)250 mg / kgを腹腔内(IP)注射で投与します。 - PBSによる経心灌流を行い、新鮮な脳を採取し、3%寒天ゲルに埋め込みます。
- 脳スライスをビブラトームで厚さ1mmに切片化し、2%TTC溶液中で10分間インキュベートします。
- 6つの脳スライスからの梗塞の総体積をImageJソフトウェアによって絶対体積として定量化します。
注:脳浮腫は、2つの理由でアウトカム測定として使用されませんでした。まず、TTC染色は、浮腫よりも重篤な結果である組織の生存率を(ミトコンドリアの減少活性を介して)測定します。第二に、梗塞が進行すると、血管原性浮腫と細胞傷害性浮腫の両方が発生し、標準的な脳浮腫測定方法では簡単に区別できません。しかし、抗免疫グロビン(IgG)標識を用いて血液脳関門(BBB)の完全性を評価したところ、RB脳卒中モデルとT+RB脳卒中モデルの両方で、光活性化後6時間で同等のIgG血管外漏出が認められました(補足図3)。
8.血栓形成測定
注:血栓形成を測定するには、光血栓症の1時間後と2時間後に脳を採取し、免疫化学(IHC)によるMCAの血栓測定と、イムノブロットによる脳半球のフィブリン測定をそれぞれ行います。
- 血栓組成の特性評価のためにIHCを実施します。4%パラホルムアルデヒドで脳を一晩固定し、OCT包埋用に30%スクロースで脳を脱水します。
- 矢状配向で脳を20μmの厚さで切片化し、フィブリノーゲン、血小板(糖タンパク質IIb)、赤血球(TER119)、血管(イソレクチンGS-IB4)に対する特異的抗体でIHCを行います。
- フィブリノーゲンに対する抗体を用いたイムノブロットにより、脳半球のフィブリンを測定します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
まず、RBとT+RB光血栓誘発血栓のフィブリン含有量を比較しました。マウスは、光活性化後2時間で固定剤の経心灌流によって犠牲にされ、縦方向および横方向の平面におけるMCA枝の免疫蛍光染色のために脳を除去した。RB光血栓症では、MCA枝はCD41+血小板と少量のフィブリンで密集していました(図2A、C)。対照的に、T+RB光血栓症のMCA枝は、ランダムに混合された血小板:フィブリン血栓によって閉塞されました(図2B、D、n>3)。また、イムノブロットを用いて、光活性化後2時間で生理食塩水による経心灌流後の大脳皮質のフィブリン(原体)レベルを2つのモデル間で比較した。この解析では>RB光血栓症よりもT+RBの同側半球におけるフィブリン沈着量が2倍増加することが示されました(図2E、対応のないt検定によるp = 0.027、各グループでn = 3)。最初のレポートでは、共焦点顕微鏡ベースの単一血管光活性化と生体内イメージングを使用して、FITC標識抗GP1bβ標識血小板の挙動を比較しました。23 これらの実験では、80 U/kgのトロンビンを静脈内注射してもレーザー照射下でも血小板凝集体を誘導できず(図3A)、RB光血栓症モデルでは血小板が均一な血栓を形成するが(図3B)、T+RB光血栓症では複数のかすかな領域を持つ不均一な凝集体が形成されることが示された(図3C)。これらの結果は、T+RB光血栓症がその後の血栓のフィブリン含量を増加させることを示唆しています。
次に、急性tPA静脈内投与(10mg/kgアルテプラーゼ、光活性化30分後)が脳血流(CBF)回復に及ぼす影響を2モデル間で比較した。tPA対ビヒクル治療前および24時間後の同じマウスのCBFをレーザースペックルコントラストイメージングで測定し、対側半球に正規化しました(図4A、B)。RB光血栓症では、tPA処理は、ビヒクルで治療したマウスと比較して、特に虚血性境界領域においてCBF回復の傾向を示しました(図4C、ビヒクル51±9%対tPA65±7%、対応のないt検定によるp=0.3、それぞれn=4)。T+RB光血栓症では、tPA処理マウスのCBFの回復がより顕著であり、近位MCA枝が24時間で見えることがしばしばありました(図4D、ビヒクル55±3%対tPA81±7%、対応のない t検定によるp=0.02、各群のn=6)。これらの結果は、RB光血栓症よりもT+RBによるtPA溶解療法に対する感受性が高いことを示唆しています。
最後に、TTC染色を用いて、RBおよびT+RB光血栓性脳卒中モデルにおける梗塞サイズに対するtPA治療の効果を定量化しました。RB光血栓症では、ビヒクル処理マウス(18 ± 2.80 mm 3、n = 6)およびtPA処理マウス(18 ± 1.95 mm3、n = 10;光活性化後30分で10 mg / kgのtPAを注射)で同様の梗塞サイズが検出されました(図5A)。対照的に、tPA溶解処理は、vPAを0.5時間(7±2.1mm3、n=9)、1時間(4.6±1mm3、n=10)、または2時間(6.4±1.5mm3、n=8)に注入した場合、梗塞を有意に減少させたが、光活性化後6時間(15.2±3.1mm3、n=7)では、ビヒクル処理マウス(14.8±2mm3、n=7、 n=19) (図5B、対応のないt検定によって決定されたp値)。これらの結果は、T+RB光血栓性脳卒中モデルがtPA溶解性治療に対する感受性を有することを示している。
図1:手順の概要 (A)T+RB光血栓性脳卒中モデルにおける主な手術手順のフローチャート。同側総頸動脈(CCA)の結紮術は任意であるが、側副循環の減少により、梗塞の大きさがより安定することがわかった。(B)頭蓋骨との関係におけるマウスの脳の上面図と側面図。また、目、耳、側頭筋、中大脳動脈(MCA)と枝、冠状縫合糸、レーザー照射部位も示されます。(C)薄くなった頭蓋骨の下(C1)およびレーザー照射中(C2)、および光活性化後の血流の停止(C3)の標的MCA枝の視覚化。MCA枝と冠状縫合糸の関係に注意してください。(D)左MCAブランチのレーザー照射中のマウスのセットアップ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:血栓中の異なるフィブリン含有量。 (A-D)抗フィブリン(緑)、抗CD41/血小板(赤)、およびイソレクチンB4/内皮細胞(青)マーカーを使用した、縦方向(A、B)または横方向(C、D)の遠位MCA枝におけるRBおよびT + RB光血栓誘発性血栓の免疫蛍光標識。T+RB光血栓誘発血栓における抗フィブリン免疫シグナルの著しい増加に注目(各群のB、D、n=3)。(E)イムノブロッティングは、光活性化後2時間でRB光血栓症よりもT+RBの同側大脳皮質におけるフィブリン沈着量が多いことを示しました(それぞれn = 3)。国連:無傷のマウス。続き:対側皮質;イプシ:同側皮質。スケールバー:50μm。この図は [23] の許可を得て変更しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:血小板反応の生体内イメージング。 単一血管レーザー照射下でのFITC標識抗GP1bβ標識血小板の共焦点顕微鏡による生体内イメージング(白矢印で示した部位)。実験グループは、(A)トロンビン単独、(B)ローズベンガル単独、および(C)トロンビンとローズベンガルです。レーザー照射後の時間はラベル付けされています。この原稿については、JoVEのWebサイトのビデオを参照してください。スケールバー:50μm。この図は [23] の許可を得て変更しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:CBF回復に対するtPA処理の効果。 組換えヒトtPA(アルテプラーゼ、10 mg / kg)またはビヒクルを尾静脈を介してRBおよびT + RB光血栓症チャレンジドマウスにレーザー照射後30分で投与し、同じマウスの治療前および治療後24時間の脳血流(CBF)をレーザースペックルコントラストイメージングと比較しました。両半球の3 x 4.8 mm領域のCBFを測定しました。実験グループは、(A、C)RB光血栓症です。(B、D)T + RB光血栓症。T+RB光血栓症群におけるtPA処理によるCBFの有意な回復(対応のないt検定によるp=0.02、ビヒクルでn=4、tPA治療でn=6)と近位MCA枝の頻繁な可視化に注目してください。RB光血栓症では、tPA治療により、主に末梢虚血領域でCBFが良好になる傾向が見られました(対応のないt検定によるp=0.3、ビヒクルでn=4、tPA治療でn=5)。白矢印はMCA光活性化部位を示す。この図は [23] の許可を得て変更しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:梗塞の大きさに対するtPA治療の効果。 (A)RB光血栓症後30分後のtPA静脈内投与(アルテプラーゼ、10mg/kg)では、梗塞サイズの縮小は認められなかった(ビヒクル投与マウスではn=6、tPA投与マウスではn=10)。(B)対照的に、T + RB光血栓症では、光活性化後6時間ではなく、0.5時間、1時間、または2時間のいずれかで10 mg / kgアルテプラーゼを静脈内投与すると、梗塞サイズが大幅に縮小しました。.p値は、テューキーの多重比較検定による一元配置分散分析によって決定されました。この図は [23] の許可を得て変更しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| モデル | 手術 | 血栓 | 血小板 | フィブリン | tPA反応性 | 主な機能/ユーティリティ | 主な参考資料 |
| 管腔内縫合糸 MCAO | 血管内MCA閉塞 | いいえ | 該当なし | 該当なし | いいえ | 急速な再灌流;ニューロプレクション研究;tPA誘発性BBB損傷 | Longa et al. 1989 (参考文献 #5) |
| 光血栓症 | 頭蓋骨の薄化と光活性化 | はい | 弱い | 高い再現性;死亡率が低い | Watson et al. 1985 (参考文献 #6) | ||
| 血栓光血栓症 | UCCAO、頭蓋骨の薄化と光活性化 | はい | はい | 高い再現性;死亡率が低い | Sun et al. 2020 (参照 #23) | ||
| FeCl3 (MCA上) | 頭蓋骨の薄化と化学的活性化 | はい | いいえ | 高い再現性;死亡率が低い | Karatas et al. 2011 (参照 #69) | ||
| in situトロンビン注射 | 開頭術とMCAマイクロインジェクション | はい | はい | 高い再現性;死亡率が低いtPA溶解処理 | Orset et al. 2007 (参考文献 #10) | ||
| 塞栓-MCAO | 血管内MCA閉塞 | はい | はい | tPA溶解処理;可変血餅硬度 | Busch et al. 1997 (参照 #13) | ||
| 一過性低酸素虚血(tHI) | UCCAOと低酸素症 | はい | はい | MCA領域>梗塞;全身性CV効果 | Sun et al. 2014 (参考文献 #15) |
表1:選択された前臨床脳卒中モデルの比較。 塗りつぶされたボックスは、陽性(血栓、血小板、フィブリンの存在)または有意なtPA反応性を示します。
補足図1:トロンビンの眼窩後注射後のCBFモニター。 (A)眼窩後洞(上段)とレーザースペックルコントラストイメージングによる血流(下段)の代表写真。3つの血管部位(標識は1~3)は、眼窩後洞へのトロンビン注射(80 U/kg)後にモニターされました。(B)トロンビン注射後15分間の血流の代表的なトレースグラフ(矢印)。(C)レーザースペックルによる定量では、トロンビン注射後15分以内に眼窩後洞付近の血流の減少は見られませんでした(n = 4、p値は不対t検定によって決定されました)。 この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:光活性化後6時間での対側半球へのフィブリン沈着の欠如。 抗フィブリノーゲン(緑)の免疫染色では、RBおよびT+RB光血栓症の6時間後に同側皮質にフィブリン沈着が見られました。対照的に、トロンビン増強光血栓症後の対側皮質にディスクリシブルフィブリン沈着はありませんでした。各グループに対して N=4 です。スケールバー:50μm。DAPI核染色としての青色蛍光。 この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図3:光血栓症後の免疫グロブリン(IgG)血管外漏出の欠如。 片側MCA標的光活性化の6時間後、免疫染色は同側半球ではIgGの血管外漏出を示しましたが、反対側半球では示されず、トロンビン増強光血栓症後のBBB損傷が制限されていることが示唆されました。それぞれ N=4 です。スケールバー:50μm。 この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1985年に導入された従来のRB光血栓性脳卒中は、脳梗塞の簡便な外科的処置、低死亡率、高い再現性のための魅力的な限局性脳虚血モデルです。5 このモデルでは、光力学的色素RBは光励起時に血小板を急速に活性化し、血管を閉塞する高密度の凝集体を引き起こします5,8,23。しかし、RB誘発性血栓中の少量のフィブリン(図2)は、虚血性脳卒中患者で急性に回収された血栓の優勢な血小板:フィブリン混合パターンから逸脱している21,22。RB誘発性血栓のフィブリン含有量が低いことも、tPA溶解療法に対する耐性に寄与している可能性があります7,8,19。紫外線レーザー照射はRB光血栓症の血管再開通を誘導するが、この実験的治療法が臨床的に使用される可能性は低い7。したがって、従来のRB光血栓性脳卒中は、主に永久閉塞モデルとして使用されてきましたが、血栓溶解および神経保護研究にはあまり適していません(後者は、機械的閉塞の除去時に迅速な血管再灌流を特徴とする管腔内縫合糸MCAOモデルを使用することがよくあります)。
RBと血栓下用量のトロンビンの混合物を使用して光活性化を行うと、その後の血栓のフィブリン含有量が増加し、実際の脳卒中治療であるtPA血栓溶解療法への反応が増強する可能性があるという仮説を立てました。この仮説は、ここで提示された結果と、私たちの元のレポートで示された結果によって裏付けられています。23 トロンビン増強光血栓性脳卒中モデルは、従来のRB光血栓症モデルと同様に、死亡率が低く、外科的処置が簡単で、梗塞のサイズと位置の一貫性が高いという利点も維持しています。したがって、トロンビン増強光血栓症は、血栓塞栓性脳卒中モデルのレパートリーへの貴重な追加であると考えています(表1)。トロンビン増強光血栓症モデルの2つの手順の詳細が議論に値する。第一に、静脈内トロンビンの過剰摂取は、急性肺血栓塞栓症および動物の死亡率を誘発する可能性がある25。RB光血栓症との併用について、さまざまなトロンビン用量を検討したところ、80 U/kgの用量を選択しても、これまでに実験された>100匹の成体雄C57Bl/6マウスで死亡率は誘発されていません。凝固亢進状態のマウスでは、トロンビンの用量を調整する必要がある可能性があります26。第二に、MCAを標的とした光血栓症に加えて、同側CCAを日常的にライゲーションしました。同側CCAの結紮は、MCAと前大脳動脈と後大脳動脈との間の側副循環の減少が原因である可能性がある、梗塞サイズの一貫性をさらに高めることがわかった。
トロンビン増強光血栓性脳卒中モデルは、そのユニークな特性により、少なくとも3つの研究トピックに特に有用である可能性があります。第一に、この新しいモデルは、tPAとテネクテプラーゼ(TNKase)などの他の線溶剤の直接比較に理想的です27。TNKaseは、ex vivo実験においてフィブリン特異性が高く、医原性出血のリスクが低い遺伝子操作されたtPA変異体です。しかし、tPAに対するその優位性は、微小塞栓性脳卒中モデルとバイナリ神経学的転帰分析を使用した場合にのみテストされています14。トロンビン増強光血栓性脳卒中モデルは、その高い再現性と定量的梗塞サイズ分析により、tPAとTNKaseの有益性と有害作用を複数の側面(例、用量反応、治療期間、併存疾患の影響、および治療の遅延による潜在的な副作用)で比較するために使用できます。第二に、トロンビン増強光血栓症モデルは、急性虚血性脳卒中におけるtPAと抗血小板治療の併用の効果を調査するのに役立つ可能性がある28。虚血性脳卒中における血管内処置の最近の進歩により、研究者は急性血栓の組織学的組成を分析することができ、優勢で混合された血小板:フィブリンパターンを特定しました21,22。したがって、線溶剤(tPA)と抗血小板剤の組み合わせは、血栓溶解の全体的な有効性を高める可能性がありますが、そのような研究には、血栓の臨床血小板:フィブリン組成をシミュレートする脳卒中モデルが重要です。tHIおよび塞栓MCAOモデルとともに、トロンビン光血栓症はこの要件を満たし、死亡率が低く、外科的処置が簡単で、全身性心血管への影響がないことで際立っています(表1)。
大事なことを言い忘れましたが、トロンビン増強光血栓症は、MCA供給領域における予測可能な梗塞周囲の位置を考えると、脳卒中誘発性側副循環の調査に特に役立つ可能性があります。急性血管閉塞は側副ネットワーク全体の血流を促進し、その後、リモデリングと血管新生を促進して新側副血管を形成するため、側副循環は虚血性脳卒中転帰の重要な予測因子としてますます認識されています29,30。この結果から、tPAはMCA近位の再開通を促進するだけでなく、MCA供給領域の末梢における側副循環を増加させることが示唆されました(図4)。側副循環の可塑性を調節するメカニズムの理解が深まれば、新しい治療法が示唆される可能性がある。トロンビン増強光血栓性脳卒中モデルは、予測可能な梗塞周囲領域と溶解性治療に対する感受性の利点を提供するため、脳卒中後の側副循環の研究に役立ちます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
この研究は、NIHの助成金(NS108763、NS100419、NS095064、HD080429はC.Y.K.、NS106592はY.Y.S.)の支援を受けた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | infarct |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 543nm laser beam | Melles Griot | 25-LGP-193-249 | photothrombosis |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~14 weeks old (22~30 g) |
| Anesthesia bar for mouse adaptor | machine shop, UVA | surgical setup | |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Dental drill | Dentamerica | Rotex 782 | surgical setup |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | brain imaging |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| infusion pump | KD Scientific | 200 | thrombolytic treatment |
| Insulin syringe with 31G needle | BD | 328291 | photothrombosis |
| Ketamine | CCM, UVA | anesthesia | |
| Laser protective google 532nm | Thorlabs | LG3 | photothrombosis |
| Ketoprofen | CCM, UVA | NSAID analgesia | |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mouse adaptor | RWD | 68014 | surgical setup |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| Retractor tips | Kent Scientific | Surgi-5014-2 | surgical setup |
| Rose Bengal | Sigma | 198250 | photothrombosis |
| Thrombin | Sigma | T7513 | photothrombosis |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| tPA | Genetech | Cathflo activase 2mg | thrombolytic treatment |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | TTC infacrt |
| Xylazine | CCM, UVA | anesthesia |
References
- Lyden, P. D. Thrombolytic Therapy for Acute Stroke. 3/e. , Springer. (2015).
- Linfante, I., Cipolla, M. J. Improving reperfusion therapies in the era of mechanical thrombectomy. Translational Stroke Research. 7 (4), 294-302 (2016).
- Campbell, B. C., et al. Endovascular Therapy for Ischemic stroke with perfusion-imaging selection. The New England Journal of Medicine. 372 (11), 1009-1018 (2015).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (7), 1310-1316 (2012).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
- Watson, B. D., Prado, R., Veloso, A., Brunschwig, J. P., Dietrich, W. D. Cerebral blood flow restoration and reperfusion injury after ultraviolet laser-facilitated middle cerebral artery recanalization in rat thrombotic stroke. Stroke. 33 (2), 428-434 (2002).
- Uzdensky, A. B. Photothrombotic stroke as a model of ischemic stroke. Translational Stroke Research. 9 (5), 437-451 (2018).
- Karatas, H., et al. Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (3), 1452-1460 (2011).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Orset, C., et al. Efficacy of Alteplase in a mouse model of acute ischemic stroke: A retrospective pooled analysis. Stroke. 47 (5), 1312-1318 (2016).
- Kudo, M., Aoyama, A., Ichimori, S., Fukunaga, N. An animal model of cerebral infarction. Homologous blood clot emboli in rats. Stroke. 13 (4), 505-508 (1982).
- Busch, E., Kruger, K., Hossmann, K. A. Improved model of thromboembolic stroke and rt-PA induced reperfusion in the rat. Brain Research. 778 (1), 16-24 (1997).
- Lapchak, P. A., Araujo, D. M., Zivin, J. A. Comparison of Tenecteplase with Alteplase on clinical rating scores following small clot embolic strokes in rabbits. Experimental Neurology. 185 (1), 154-159 (2004).
- Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-Edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9 (6), 98807 (2014).
- Sun, Y. Y., et al. Prophylactic Edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: Implications for perioperative neuroprotection. Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).
- Sun, Y. Y., et al. Sickle mice are sensitive to hypoxia/ischemia-induced stroke but respond to tissue-type plasminogen activator treatment. Stroke. 48 (12), 3347-3355 (2017).
- Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. A thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxia-ischemia. Journal of Visualized Experiments. (102), e52978 (2015).
- Pena-Martinez, C., et al. Pharmacological modulation of neutrophil extracellular traps reverses thrombotic stroke tPA (tissue-type plasminogen activator) resistance. Stroke. 50 (11), 3228-3237 (2019).
- Denorme, F., et al. ADAMTS13-mediated thrombolysis of t-PA-resistant occlusions in ischemic stroke in mice. Blood. 127 (19), 2337-2345 (2016).
- Marder, V. J., et al. Analysis of thrombi retrieved from cerebral arteries of patients with acute ischemic stroke. Stroke. 37 (8), 2086-2093 (2006).
- Bacigaluppi, M., Semerano, A., Gullotta, G. S., Strambo, D. Insights from thrombi retrieved in stroke due to large vessel occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (8), 1433-1451 (2019).
- Sun, Y. Y., et al. A murine photothrombotic stroke model with an increased fibrin content and improved responses to tPA-lytic treatment. Blood Advances. 4 (7), 1222-1231 (2020).
- Su, E. J., et al. Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke. Nature Medicine. 14 (7), 731-737 (2008).
- Gupta, A. K., et al. Protective effects of gelsolin in acute pulmonary thromboembolism and thrombosis in the carotid artery of mice. PLoS One. 14 (4), 0215717 (2019).
- Carroll, B. J., Piazza, G. Hypercoagulable states in arterial and venous thrombosis: When, how, and who to test. Vascular Medicine. 23 (4), 388-399 (2018).
- Coutts, S. B., Berge, E., Campbell, B. C., Muir, K. W., Parsons, M. W. Tenecteplase for the treatment of acute ischemic stroke: A review of completed and ongoing randomized controlled trials. International Journal of Stroke. 13 (9), 885-892 (2018).
- McFadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. Current and future antiplatelet therapies: emphasis on preserving haemostasis. Nature Reviews Cardiology. 15 (3), 181-191 (2018).
- Bang, O. Y., Goyal, M., Liebeskind, D. S. Collateral crculation in ischemic stroke: Assessment tools and therapeutic strategies. Stroke. 46 (11), 3302-3309 (2015).
- Faber, J. E., Chilian, W. M., Deindl, E., van Royen, N., Simons, M. A brief etymology of the collateral circulation. Arteriosclerosis, Thrombsis, Vascular Biology. 34 (9), 1854-1859 (2014).
