Summary
Los modelos tradicionales de ictus fototrombótico (SPT) inducen principalmente agregados plaquetarios densos de alta resistencia al tratamiento lítico con activadores tisulares del plasminógeno (tPA). Aquí se introduce un modelo de PTS murino modificado mediante la coinyección de trombina y colorante fotosensible para la fotoactivación. El modelo de SPT potenciado con trombina produce coágulos mixtos de plaquetas:fibrina y es muy sensible a la trombólisis tPA.
Abstract
Un modelo ideal de accidente cerebrovascular tromboembólico requiere ciertas propiedades, incluidos procedimientos quirúrgicos relativamente simples con baja mortalidad, un tamaño y ubicación del infarto consistentes, precipitación de coágulos sanguíneos entremezclados plaquetas:fibrina similares a los de los pacientes y una sensibilidad adecuada al tratamiento fibrinolítico. El modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico basado en colorante de rosa de bengala (RB) cumple con los dos primeros requisitos, pero es altamente refractario al tratamiento lítico mediado por tPA, presumiblemente debido a su composición de coágulos rica en plaquetas, pero pobre en fibrina. Razonamos que la combinación de colorante RB (50 mg/kg) y una dosis subtrombótica de trombina (80 U/kg) para la fotoactivación dirigida a la rama proximal de la arteria cerebral media (ACM) puede producir coágulos enriquecidos en fibrina y sensibles al tPA. De hecho, el modelo de fototrombosis combinada de trombina y RB (T+RB) desencadenó coágulos sanguíneos mixtos de plaquetas:fibrina, como lo demuestran las inmunotinciones y las inmunomanchas, y mantuvo tamaños y ubicaciones de infarto consistentes, además de una baja mortalidad. Además, la inyección intravenosa de tPA (alteplasa, 10 mg/kg) dentro de las 2 h posteriores a la fotoactivación disminuyó significativamente el tamaño del infarto en la fototrombosis T+RB. Por lo tanto, el modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico mejorado con trombina puede ser un modelo experimental útil para probar nuevas terapias trombolíticas.
Introduction
La trombectomía endovascular y la trombólisis mediada por tPA son las únicas dos terapias aprobadas por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) para el accidente cerebrovascular isquémico agudo, que afecta a ~ 700,000 pacientes anualmente enlos Estados Unidos. Debido a que la aplicación de la trombectomía se limita a la oclusión de vasos grandes (LVO), mientras que la trombólisis tPA puede aliviar las oclusiones de vasos pequeños, ambas son terapias valiosas para el accidente cerebrovascular isquémico agudo2. Además, la combinación de ambas terapias (p. ej., inicio de la tPA-trombólisis dentro de las 4,5 horas posteriores al inicio del ictus, seguida de trombectomía) mejora la reperfusión y los resultados funcionales3. Por lo tanto, la optimización de la trombólisis sigue siendo un objetivo importante para la investigación del ictus, incluso en la era de la trombectomía.
Los modelos tromboembólicos son una herramienta esencial para la investigación preclínica del ictus con el objetivo de mejorar las terapias trombolíticas. Esto se debe a que los modelos de oclusión vascular mecánica (p. ej., oclusión de ACM con sutura intraluminal) no producen coágulos sanguíneos, y su rápida recuperación del flujo sanguíneo cerebral después de la eliminación de la oclusión mecánica está excesivamente idealizada 4,5. Hasta la fecha, los principales modelos tromboembólicos incluyen fototrombosis 6,7,8, aplicación tópica de cloruro férrico (FeCl3)9, microinyección de trombina en la rama MCA 10,11, inyección de (micro)émbolos ex vivo en la ACM o arteria carótida común (CCA)12,13,14 e hipoxia-isquemia transitoria (tHI)15,16, 17,18. Estos modelos de accidente cerebrovascular difieren en la composición histológica de los coágulos subsiguientes y en la sensibilidad a las terapias líticas mediadas por tPA (Tabla 1). También varían en el requerimiento quirúrgico de la craneotomía (necesaria para la inyección de trombina in situ y la aplicación tópica de FeCl3), la consistencia del tamaño y la ubicación del infarto (p. ej., la infusión de microémbolos con CCA produce resultados muy variables) y los efectos globales sobre el sistema cardiovascular (p. ej., la tHI aumenta la frecuencia cardíaca y el gasto cardíaco para compensar la vasodilatación periférica inducida por hipoxia).
El modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico (PTS) basado en colorante RB tiene muchas características atractivas, incluidos procedimientos quirúrgicos simples sin craneotomía, baja mortalidad (generalmente < 5%) y un tamaño y ubicación predecibles del infarto (en el territorio proveedor de MCA), pero tiene dos limitaciones principales. 8 La primera advertencia es la respuesta débil o nula al tratamiento trombolítico mediado por tPA, que también es un inconveniente del modelo FeCl3 7,19,20. La segunda advertencia de los modelos de accidente cerebrovascular PTS y FeCl3 es que los trombos resultantes consisten en agregados plaquetarios densamente empaquetados con una pequeña cantidad de fibrina, lo que no solo conduce a su resistencia a la terapia tPA-lítica, sino que también se desvía del patrón de trombos de plaquetas:fibrina entremezclados en pacientes con accidente cerebrovascular isquémico agudo21,22. Por el contrario, el modelo de microinyección de trombina in situ comprende principalmente fibrina polimerizada y un contenido incierto de plaquetas10.
Teniendo en cuenta el razonamiento anterior, planteamos la hipótesis de que la mezcla de RB y una dosis subtrombótica de trombina para la fotoactivación dirigida a MCA a través del cráneo adelgazado puede aumentar el componente de fibrina en los trombos resultantes y aumentar la sensibilidad al tratamiento lítico mediado por tPA. Hemos confirmado esta hipótesis23 y en este trabajo describimos en detalle los procedimientos del modelo de ictus fototrombótico modificado (T+RB).
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Protocol
Este protocolo está aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus siglas en inglés) de la Universidad de Virginia y sigue las Pautas de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. En la Figura 1A se describe la secuencia de procedimientos quirúrgicos de este protocolo.
1. Configuración de la cirugía
- Coloque una almohadilla térmica con temperatura a 37 °C en el adaptador para animales pequeños al menos 15 minutos antes de la cirugía. Prepare un rollo de pinza nasal para el adaptador que permita la rotación de la cabeza del animal. Preparar los anestésicos Ketamina (60 mg/kg)/ Xilacina (10 mg/kg).
- Esterilice las herramientas quirúrgicas, incluidas las tijeras, las pinzas, los portamicroagujas, los hemostáticos, los bastoncillos de algodón y las suturas con autoclave (121 °C a 15 psi durante 60 min). Prepara pegamento para pañuelos y ungüento para los ojos. Prepare las gafas de protección láser de 532 nm para cirujanos.
NOTA: Este protocolo describe un procedimiento de cirugía mayor de supervivencia y debe realizarse mediante técnicas asépticas. - Configure el sistema de iluminación con una fuente láser de 532 nm. Prepara un taladro dental.
- Preparar la solución de Rosa de Bengala en solución salina (10 mg/mL). Coloque una trombina bovina alícuota (0,1 U/μL) en una cubeta de hielo.
- Inyectar ketoprofeno (4,0 mg/kg) por vía subcutánea al ratón como analgesia 30 min antes de la cirugía o utilizar el régimen analgésico recomendado por las guías institucionales locales.
2. Ligadura de la arteria carótida común ipsilateral
- Anestesiar ratones machos C57BL/6NCrl de 10-14 semanas de edad con un peso de 22 a 30 g mediante inyección intramuscular de ketamina (60 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg).
NOTA: Se espera que todo el procedimiento quirúrgico, que abarca la ligadura de la arteria carótida común ipsilateral a través de la monitorización del flujo sanguíneo cerebral, dure ~120 min. El régimen anestésico suele ser eficaz durante toda esta duración, pero la profundidad anestésica debe reevaluarse al menos cada 15 minutos. Mientras se aprenden estos procedimientos, puede ser necesario volver a dosificar la anestesia. - Realice un pellizco en los dedos de los pies para asegurarse de que el animal esté completamente anestesiado. Retire el vello del cuello izquierdo para la ligadura CCA y la cabeza para el adelgazamiento del cráneo con la crema depilatoria.
- Coloque el ratón en el adaptador para animales pequeños en posición supina. Esterilice el área quirúrgica limpiando la piel con tres pasadas alternas de povidona yodada y etanol al 70%.
- Asegure la cabeza del mouse con barras para los oídos. Bajo un microscopio de disección, haga una incisión de 0,5 cm en el cuello uterino izquierdo con un par de microtijeras y pinzas rectas a unos 0,2 cm laterales a la línea media.
- Use un par de pinzas dentadas finas para separar el tejido blando y la fascia para exponer la arteria carótida común izquierda (LCCA, por sus siglas en inglés). Separe cuidadosamente el CCA izquierdo del nervio vago con un par de pinzas finas y lisas.
- Coloque una sutura permanente de doble nudo alrededor del LCCA con una sutura de seda 5-0 cortada en segmentos de 20 mm y luego cierre la herida con clips estériles.
3. Adelgazamiento del cráneo por encima de la rama MCA y fotoactivación
- Coloque el ratón en posición prona en el adaptador para animales pequeños. Gire el rodillo de pinza nasal 15°. Esterilice el área quirúrgica limpiando la piel con tres pasadas alternas de betadine y etanol al 70%.
- Realice una incisión de 0,8 cm en el cuero cabelludo con un par de microtijeras y pinzas rectas a lo largo del ojo y la oreja izquierdos para exponer el músculo temporal, que se encuentra entre el ojo y la oreja (Figura 1B).
- Bajo el microscopio de disección, haga una incisión de 0,5 cm a lo largo del borde del músculo temporal en el hueso parietal izquierdo con un par de pinzas dentadas finas. Realice una segunda incisión vertical de 0,3 cm en el músculo temporal con unas microtijeras. Retraiga el músculo temporal para exponer el borde del hueso parietal y el hueso escamoso. Asegúrese de visualizar el punto de referencia de la sutura coronal entre los huesos frontal y parietal (Figura 1B,C).
- Humedece el cráneo aplicando solución salina estéril para revelar el MCA izquierdo. Marque la rama proximal de MCA en el hueso escamoso con un rotulador. Dibuje suavemente un círculo de aproximadamente 1 mm de diámetro alrededor del área marcada con el taladro dental neumático (ajuste de la velocidad de la fresa al 50% del controlador de velocidad) y luego adelgace el cráneo aproximadamente 0,2 mm de profundidad sin tocar la duramadre inferior. Detenga la perforación hasta que quede una capa muy delgada de hueso.
- Mezclar la solución de trombina (T, 0,1 U/μL, 80 U/kg) y Rosa de bengala (RB, 10 mg/ml, 50 mg/kg) en función del peso corporal del ratón. Por ejemplo, para un ratón de 25 g de peso corporal, mezcle 20 μL de trombina (0,1 U/μL) y 125 μL de RB (10 mg/mL).
- Inyecte lentamente la solución de T+RB (145 μl por 25 g de peso corporal) en el seno retroorbitario con una jeringa de insulina (aguja #31G).
NOTA: En experimentos piloto, se examinó la tasa de mortalidad de dosis crecientes de trombina mezcladas con la dosis estándar de colorante RB (50 mg/kg) para la fotoactivación. La mortalidad fue del 0% para la trombina de 80 U/kg (n=13), del 43% para la trombina de 120 U/kg (n=7) y del 100% para la trombina de 160 U/kg (n=5) y de 200 U/kg (n=5). Por lo tanto, se eligió una dosis de 80 U/kg de trombina para este modelo. También se utilizaron imágenes de contracción de moteado láser para excluir la posibilidad de coagulación sanguínea desenfrenada cerca de la cavidad orbitaria después de la inyección en el seno retroorbitario de T+RB (Figura suplementaria 1), así como la deposición generalizada de fibrina en el hemisferio contralateral que no se sometió a iluminación láser (Figura suplementaria 2). - Aplique ungüento para los ojos en ambos ojos para prevenir la sequedad.
- Aplique el iluminador con una luz láser de 532 nm (con una energía de 0,5 mW) en el sitio perforado con una distancia de 2 pulgadas durante 20 minutos. Visualice la iluminación en la rama proximal de MCA a través de unas gafas de protección láser (Figura 1C,D).
NOTA: El MCA con iluminación de 532 nm muestra fluorescencia roja debajo de las gafas. El ACM distal desaparecerá después de 10 minutos de iluminación. Excluir al animal si el flujo distal de ACM sigue presente después de 20 minutos de iluminación. - Detenga la iluminación láser después de 20 minutos. Cierre la herida con pinzas estériles.
4. Imágenes intravitales (opcional)
NOTA: Para caracterizar la formación de trombos in vivo, se deben utilizar imágenes intravirales mediante un confocal de disco de espín con sistema de fotoactivación23.
- Haga una ventana craneal de ~3 mm de diámetro en el hueso parietal del cráneo.
- Coloque un cubreobjetos en la ventana craneal y ubique el ACM distal (~50 μm de diámetro) debajo de un objetivo de inmersión en agua de 20x.
- Etiquete la plaqueta circulante por la inyección en la vena de cola del anticuerpo anti-GPIbβ conjugado con DyLight488 (0,1 mg/kg) a los 5 minutos antes de la toma de imágenes.
- Inyectar la solución de mezcla de trombina (80 U/kg) y Rosa de bengala (50 mg/kg) por retroorbitario a los 5 min antes de la toma de imágenes.
- Fotoactivar el ACM mediante un sistema láser de 561 nm con rayo láser de 10 μm de diámetro y grabar la imagen hasta la formación del trombo.
5. Administración de tPA
- Coloque al animal anestesiado sobre una almohadilla tibia a 37 °C. En el momento seleccionado después de la fotoactivación, humedezca una gasa con agua tibia a ~45 °C y envuélvala en la cola durante 1 min.
- Inyectar tPA humano recombinante (10 mg/kg) a través de la vena de la cola con un bolo al 50% y al 50% durante 30 min mediante bomba de infusión.
NOTA: Aunque la dosis clínica de tPA humano recombinante para el tratamiento del accidente cerebrovascular isquémico agudo es de 0,9 mg/kg, se suele utilizar una dosis más alta (10 mg/kg) en roedores para compensar la reducción de la reactividad al tPA entre especies. También se siguió el protocolo estándar de administración de tPA en modelos preclínicos de ictus, utilizando el 50% en bolo y el 50% en infusión a través de la vena de la cola durante 30 min.24
6. Monitor del flujo sanguíneo cerebral (CBF)
NOTA: Para confirmar la recuperación del CBF después del tratamiento con tPA, utilice un sistema de imágenes bidimensionales de contraste de manchasláser 15 y registre inmediatamente después de la fototrombosis (paso 3.9) o a las 24 h después del tratamiento con tPA.
- Coloque al animal anestesiado en posición prona y haga una incisión en la línea media del cuero cabelludo con el cráneo expuesto.
- Hidratar el cráneo con solución salina estéril y aplicar suavemente el gel de ultrasonido sobre el cráneo. Evite el pelo y las burbujas en el gel, que interferirán con la señal CBF.
- Monitoree el CBF en ambos hemisferios cerebrales bajo un generador de imágenes de contraste de manchas láser durante 10 minutos.
- Después de grabar la imagen de CBF, cierre el cuero cabelludo con pegamento de tejido y devuelva al animal a la jaula.
- Analice el CBF en las regiones seleccionadas y calcule el porcentaje de recuperación del CBF en comparación con la región contralateral.
- Luego, vuelva a colocar al animal en una jaula cálida para su recuperación. Monitoree a los ratones durante 5-10 minutos hasta que se recuperen de la anestesia. Coloque la comida mojada en la jaula y devuélvala al centro de cuidado de animales.
NOTA: Proporcione analgesia postoperatoria según lo recomendado por las pautas institucionales locales.
7. Medición del volumen del infarto mediante tinción con cloruro de trifenil tetrazolio (TTC)
- Veinticuatro horas después de la fototrombosis, anestesiar profundamente al animal según las pautas institucionales locales para la cirugía de no supervivencia.
NOTA: Administramos tribromoetanol (avertina) 250 mg/kg mediante inyección intraperitoneal (IP). - Realizar perfusión transcárdica con PBS, recolectar cerebro fresco e incrustar en gel de agar al 3%.
- Cortar el trozo de cerebro con 1 mm de espesor mediante vibrátomo e incubar en una solución de TTC al 2% durante 10 min.
- Cuantifique el volumen total del infarto de 6 cortes de cerebro como el volumen absoluto con el software ImageJ.
NOTA: El edema cerebral no se utilizó como medida de resultado por dos razones. En primer lugar, la tinción TTC mide la viabilidad del tejido (a través de la actividad de reducción mitocondrial), que es una consecuencia más grave que el edema. En segundo lugar, a medida que avanza el infarto, se produce tanto el edema vasogénico como el citotóxico y no se pueden distinguir fácilmente mediante los métodos estándar de medición del edema cerebral. Sin embargo, hemos utilizado el marcaje con antiinmunoglobina (IgG) para evaluar la integridad de la barrera hematoencefálica (BBB) y hemos encontrado una extravasación de IgG comparable a las 6 h después de la fotoactivación en los modelos de ictus RB y T+RB (Figura suplementaria 3).
8. Medición de la formación de trombos
NOTA: Para medir la formación de trombos, recoja el cerebro 1 h y 2 h después de la fototrombosis para la medición del trombo en la ACM por inmunoquímica (IHQ) y para la medición de la fibrina en el hemisferio cerebral por inmunotransferencia, respectivamente.
- Realizar la IHQ para la caracterización de la composición del coágulo. Fije el cerebro con paraformaldehído al 4% durante la noche y luego deshidrate el cerebro con sacarosa al 30% para la inclusión de OCT.
- Seccionar el cerebro con orientación sagital en 20 μm de espesor, y realizar la IHQ con anticuerpos específicos contra fibrinógeno, plaquetas (glicoproteína IIb), glóbulos rojos (TER119) y vasos sanguíneos (isolectina GS-IB4).
- Realizar la medición de fibrina en el hemisferio cerebral mediante inmunotransferencia con un anticuerpo contra fibrinógeno.
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Representative Results
En primer lugar, comparamos el contenido de fibrina en RB frente a los coágulos sanguíneos inducidos por fototrombosis T+RB. Los ratones fueron sacrificados por perfusión transcardial de fijadores a las 2 h después de la fotoactivación, y los cerebros fueron extraídos para la tinción por inmunofluorescencia de la rama MCA en planos longitudinales y transversales. En la fototrombosis RB, la rama de la ACM estaba densamente repleta de plaquetas CD41+ y poca fibrina (Figura 2A,C). Por el contrario, la rama MCA en la fototrombosis T+RB fue ocluida por coágulos de plaquetas:fibrina mezclados aleatoriamente (Figura 2B,D, n>3 para cada uno). También se utilizaron inmunotransferencias para comparar el nivel de fibrina (ógeno) en la corteza cerebral entre los dos modelos, después de la perfusión transcardíaca con suero fisiológico a las 2 h después de la fotoactivación. Este análisis mostró > aumento del doble de la deposición de fibrina en el hemisferio ipsilateral en T+RB que en la fototrombosis RB (Figura 2E, p=0,027 por t-test no apareado; n=3 para cada grupo). En nuestro informe original, también utilizamos la fotoactivación de un solo vaso basada en microscopio confocal y la obtención de imágenes intravitales para comparar los comportamientos de las plaquetas marcadas con anti-GP1bβ conjugadas con FITC. 23 Estos experimentos demostraron que la inyección intravenosa de 80 U/kg de trombina no logró inducir agregados plaquetarios incluso bajo iluminación láser (Figura 3A), y que las plaquetas forman coágulos homogéneos en el modelo de fototrombosis RB (Figura 3B), pero agregados desiguales con múltiples regiones débiles en la fototrombosis T+RB (Figura 3C). Estos resultados sugieren que la fototrombosis T+RB aumenta el contenido de fibrina en los trombos subsiguientes.
A continuación, comparamos los efectos del tratamiento con tPA intravenoso agudo (10 mg/kg de alteplasa, 30 min después de la fotoactivación) sobre la recuperación del flujo sanguíneo cerebral (CBF) entre los dos modelos. El CBF del mismo ratón antes y 24 h después del tratamiento con tPA frente al vehículo se midió mediante imágenes de contraste de moteado láser y se normalizó al hemisferio contralateral (Figura 4A, B). En la fototrombosis RB, el tratamiento con tPA condujo a una tendencia de recuperación de CBF, particularmente en el área del borde isquémico, en comparación con los ratones tratados con vehículo (Figura 4C, vehículo 51 ± 9% vs tPA 65 ± 7%, p=0,3 por prueba t no apareada, n=4 para cada uno). En la fototrombosis T+RB, la recuperación de CBF en ratones tratados con tPA fue más prominente, y las ramas proximales de MCA a menudo se hicieron visibles a las 24 h (Figura 4D, vehículo 55 ± 3% vs tPA 81 ± 7%, p=0,02 por prueba t no apareada, n=6 para cada grupo). Estos resultados sugieren una mayor sensibilidad a la terapia tPA-lítica por T+RB que a la fototrombosis RB.
Por último, utilizamos la tinción TTC para cuantificar los efectos del tratamiento con tPA sobre el tamaño del infarto en los modelos de ictus fototrombótico RB y T+RB. En la fototrombosis RB, se detectó un tamaño de infarto similar en ratones tratados con vehículo (18 ± 2,80mm3, n=6) y tratados con tPA (18 ± 1,95mm3, n=10; se inyectaron 10 mg/kg de tPA a los 30 min post-fotoactivación) (Figura 5A). Por el contrario, el tratamiento con tPA redujo significativamente el infarto cuando se inyectó tPA a las 0,5 h (7 ± 2,1mm3, n = 9), 1 h (4,6 ± 1 mm 3, n = 10) o 2 h (6,4 ± 1,5 mm 3, n = 8 ), pero no a las 6 h posteriores a la fotoactivación (15,2 ± 3,1 mm 3, n = 7), en comparación con los ratones tratados con vehículo (14,8 ± 2 mm 3, n=19) (Figura 5B, el valor p determinado por la prueba t no apareada). Estos resultados indican que el modelo de ictus fototrombótico T+RB tiene sensibilidad al tratamiento con tPA-lítico en el.
Figura 1: Esquema de procedimientos. (A) El diagrama de flujo de los principales procedimientos quirúrgicos en el modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico T+RB. La ligadura de la arteria carótida común (ACC) ipsilateral es opcional, pero encontramos que hace que el tamaño del infarto sea más consistente, presumiblemente debido a la disminución de la circulación colateral. (B) Vista superior y lateral del cerebro del ratón en relación con el cráneo. También están indicados los ojos, el oído, el músculo temporal, la arteria cerebral media (ACM) y las ramas, la sutura coronal y el sitio de iluminación del láser. (C) Visualización de la rama MCA objetivo debajo del cráneo adelgazado (C1) y durante la iluminación láser (C2), y el cese del flujo sanguíneo después de la fotoactivación (C3). Obsérvese la relación de la rama MCA con la sutura coronal. (D) La configuración de un mouse durante la iluminación láser en la rama izquierda de MCA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diferentes contenidos de fibrina en los coágulos sanguíneos. (A-D) Marcaje por inmunofluorescencia de los trombos inducidos por fototrombosis RB y T+RB en la rama distal de la ACM en un plano longitudinal (A, B) o transversal (C, D) utilizando marcadores antifibrina (verde), anti-CD41/plaquetas (rojo) e isolectina B4/células endoteliales (azul). Obsérvese el marcado aumento de las inmunoseñales antifibrina en los coágulos sanguíneos inducidos por fototrombosis T+RB (B, D, n=3 para cada grupo). (E) La inmunotransferencia indicó una mayor deposición de fibrina en la corteza cerebral ipsilateral en T+RB que en la fototrombosis RB a las 2 h después de la fotoactivación (n = 3 para cada uno). ONU: ratones ilesos; Cont: corteza contralateral; Ipsi: corteza ipsilateral. Barra de escala: 50 μm. Esta cifra se ha modificado con permiso de [23]. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imagen intravital de las respuestas plaquetarias. Obtención de imágenes intravitales basadas en microscopio confocal de plaquetas marcadas con anti-GP1bβ conjugadas con FITC bajo iluminación láser de un solo vaso (en el sitio indicado por flechas blancas). Los grupos experimentales son: (A) trombina sola, (B) Rosa de Bengala sola, y (C) trombina más Rosa de Bengala. Los tiempos después de la iluminación láser están etiquetados. Vea el video en el sitio web de JoVE para este manuscrito. Barra de escala: 50 μm. Esta cifra se ha modificado con permiso de [23]. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Efectos del tratamiento con tPA en la recuperación del CBF. Se administró tPA humano recombinante (alteplasa, 10 mg/kg) o vehículo a través de la vena de la cola a ratones con problemas de fototrombosis RB y T+RB a los 30 minutos después de la iluminación con láser, y se comparó el flujo sanguíneo cerebral (CBF) antes y 24 h después del tratamiento en el mismo ratón con imágenes de contraste de manchas láser. Se midió el CBF en un área de 3 x 4,8 mm en ambos hemisferios. Los grupos experimentales son: (A, C) fototrombosis RB; (B, D) Fototrombosis T+RB. Obsérvese la recuperación significativa de CBF por el tratamiento con tPA en el grupo de fototrombosis T+RB (p=0,02 por la prueba t no apareada, n= 4 para el vehículo y n=6 para el tratamiento con tPA) y la visualización frecuente de la rama proximal de la ACM. En la fototrombosis RB, el tratamiento con tPA condujo a una tendencia de mejor CBF, predominantemente en el área isquémica periférica (p = 0,3 por la prueba t no apareada, n = 4 para el vehículo y n = 5 para el tratamiento con tPA). Las flechas blancas indican el sitio de fotoactivación de MCA. Esta cifra se ha modificado con permiso de [23]. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Efectos del tratamiento con tPA sobre el tamaño del infarto. (A) El tratamiento intravenoso con tPA (alteplasa, 10 mg/kg) a los 30 min después de la fototrombosis RB no logró reducir el tamaño del infarto (n = 6 en ratones tratados con vehículo y n = 10 en ratones tratados con tPA). (B) Por el contrario, en la fototrombosis T+RB, el tratamiento intravenoso con 10 mg/kg de alteplasa a las 0,5, 1 o 2 h, pero no a las 6 h después de la fotoactivación, condujo a una reducción significativa del tamaño del infarto. El valor p se determinó mediante ANOVA de un factor con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Esta cifra se ha modificado con permiso de [23]. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Modelo | Procedimiento quirúrgico | Coágulos de sangre | Plaquetas | Fibrina | Reactividad de tPA | Características principales/utilidad | Referencias clave |
| Sutura intraluminal MCAO | Oclusión endovascular de ACM | No | N/A | N/A | No | Reperfusión rápida; Estudio de neuroprección; Lesión de la BHE inducida por tPA | Longa et al. 1989 (Ref #5) |
| Fototrombosis | Adelgazamiento y fotoactivación del cráneo | Sí | Débil | Alta reproducibilidad; Baja mortalidad | Watson et al. 1985 (Ref #6) | ||
| Trombina-Fototrombosis | UCCAO, Adelgazamiento y fotoactivación del cráneo | Sí | Sí | Alta reproducibilidad; Baja mortalidad | Sun et al. 2020 (Ref #23) | ||
| FeCl3 (en el MCA) | Adelgazamiento del cráneo y activación química | Sí | No | Alta reproducibilidad; Baja mortalidad | Karatas et al. 2011 (Ref #69) | ||
| Inyección de trombina in situ | Craneotomía y microinyección de ACM | Sí | Sí | Alta reproducibilidad; baja mortalidad; Tratamiento tPA-lítico | Orset et al. 2007 (Ref #10) | ||
| Émbolos-MCAO | Oclusión endovascular de ACM | Sí | Sí | tratamiento tPA-lítico; Dureza variable del coágulo | Busch et al. 1997 (Ref #13) | ||
| Hipoxia-isquemia transitoria (tHI) | UCCAO más hipoxia | Sí | Sí | Infarto > el área de MCA; Efectos CV sistémicos | Sun et al. 2014 (Ref #15) |
Tabla 1: Comparación de modelos preclínicos de ictus seleccionados. Las casillas llenas indican positividad (la presencia de coágulos sanguíneos, plaquetas y fibrina) o una reactividad significativa del tPA.
Figura complementaria 1: Monitor de CBF después de la inyección retroorbitaria de trombina. (A) Las fotos representativas del seno retroorbitario (panel superior) y el flujo sanguíneo mediante imágenes de contraste de moteado láser (panel inferior). Los tres sitios vasculares (1 ~ 3 como se indica) se monitorearon después de la inyección de trombina (80 U / kg) en el seno retroorbitario. (B) El gráfico de trazado representativo del flujo sanguíneo durante 15 minutos después de la inyección de trombina (flecha). (C) La cuantificación basada en el moteado láser no mostró ninguna reducción del flujo sanguíneo cerca del seno retroorbitario dentro de los 15 minutos posteriores a la inyección de trombina (n = 4, valor p determinado por la prueba t no apareada). Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura complementaria 2: Ausencia de depósito de fibrina en el hemisferio contralateral a las 6 horas de la fotoactivación. La inmunotinción del antifibrinógeno (verde) mostró depósito de fibrina en la corteza ipsilateral a las 6 h después de la fototrombosis RB y T+RB. Por el contrario, no hubo depósito de fibrina discerible en la corteza contralateral después de la fototrombosis potenciada con trombina. N=4 para cada grupo. Barra de escala: 50 μm. Fluorescencia azul como tinción del núcleo DAPI. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura complementaria 3: Falta de extravasación de inmunoglobulina (IgG) después de la fototrombosis. A las 6 h después de la fotoactivación unilateral dirigida a MCA, la inmunotinción mostró extravasación de IgG en el hemisferio ipsilateral, pero no en el hemisferio contralateral, lo que sugiere un daño restringido de la BHE después de la fototrombosis con trombina. N=4 para cada uno. Barra de escala: 50 μm. Haga clic aquí para descargar esta figura.
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Discussion
El accidente cerebrovascular fototrombótico RB tradicional, introducido en 1985, es un modelo atractivo de isquemia cerebral focal para procedimientos quirúrgicos simples, baja mortalidad y alta reproducibilidad del infarto cerebral. 5 En este modelo, el colorante fotodinámico RB activa rápidamente las plaquetas al excitarse con la luz, lo que da lugar a agregados densos que ocluyen el vaso sanguíneo 5,8,23. Sin embargo, la pequeña cantidad de fibrina en los coágulos sanguíneos inducidos por RB (Figura 2) se desvía del patrón dominante de plaquetas:fibrina entremezclados de trombos recuperados de forma aguda en pacientes con ictus isquémico21,22. Es probable que el bajo contenido de fibrina en los trombos inducidos por RB también contribuya a su resistencia al tratamiento con tPA 7,8,19. Aunque la irradiación láser ultravioleta induce la recanalización vascular en la fototrombosis RB, es poco probable que esta terapia experimental se utilice clínicamente7. Así, el ictus fototrombótico tradicional RB se ha utilizado principalmente como modelo de oclusión permanente, menos adecuado para la investigación en trombólisis y neuroprotección (este último suele utilizar el modelo MCAO de sutura intraluminal que presenta una rápida reperfusión vascular tras la eliminación de la oclusión mecánica).
Planteamos la hipótesis de que el uso de una mezcla de RB y una dosis subtrombótica de trombina para la fotoactivación puede aumentar el contenido de fibrina en los trombos subsiguientes y mejorar las respuestas a la trombólisis de tPA, la terapia del ictus en el mundo real. Esta hipótesis está respaldada por los resultados presentados aquí y en nuestro informe original. 23 El modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico potenciado con trombina también mantiene las ventajas de una baja mortalidad, procedimientos quirúrgicos sencillos y una alta consistencia en el tamaño y la localización del infarto, como en el modelo tradicional de fototrombosis RB. Por lo tanto, creemos que la fototrombosis potenciada con trombina es una valiosa adición al repertorio de modelos de ictus tromboembólicos (Tabla 1). Dos detalles del procedimiento del modelo de fototrombosis mejorada con trombina justifican la discusión. En primer lugar, la sobredosis de trombina intravenosa puede provocar tromboembolismo pulmonar agudo y mortalidad animal25. Examinamos un rango de dosis de trombina para su combinación con fototrombosis RB, y la dosis elegida de 80 U/kg no ha inducido mortalidad en >100 ratones machos adultos C57Bl/6 experimentales hasta el momento. Es probable que la dosis de trombina necesite un ajuste para ratones con estados de hipercoagulación26. En segundo lugar, ligamos rutinariamente el CCA ipsilateral además de la fototrombosis dirigida a MCA en nuestros procedimientos. Encontramos que la ligadura de la ACC ipsilateral aumenta aún más la consistencia en el tamaño del infarto, lo que puede deberse a la disminución de la circulación colateral entre la ACM y las arterias cerebrales anterior y posterior.
Con sus propiedades únicas, el modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico mejorado con trombina puede ser particularmente útil para al menos tres temas de investigación. En primer lugar, este nuevo modelo es ideal para la comparación directa de tPA y otros agentes fibrinolíticos como la tenecteplasa (TNKasa)27. TNKasa es una variante modificada con mutación en tPA con mayor especificidad de fibrina y un menor riesgo de hemorragia iatrogénica en experimentos ex vivo. Sin embargo, su superioridad sobre el tPA solo se ha probado en un modelo de accidente cerebrovascular microembólico y utilizando un análisis de resultados neurológicos binarios14. Dada su alta reproducibilidad y el análisis cuantitativo del tamaño del infarto, el modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico mejorado con trombina se puede utilizar para comparar los beneficios y los efectos adversos de la tPA-frente a la TNKasa en múltiples aspectos (p. ej., respuestas a la dosis, ventana terapéutica, impactos de comorbilidad y posibles efectos adversos en el tratamiento tardío). En segundo lugar, el modelo de fototrombosis potenciada con trombina puede ser útil para investigar los efectos del tratamiento combinado con tPA y antiagregante plaquetario en el ictus isquémico agudo28. Los avances recientes de los procedimientos endovasculares en el accidente cerebrovascular isquémico han permitido a los investigadores analizar la composición histológica de los trombos agudos e identificar un patrón dominante de plaquetas:fibrina entremezcladas21,22. En consecuencia, la combinación de un agente fibrinolítico (tPA) y agentes antiplaquetarios puede aumentar la eficacia general de la trombólisis, pero un modelo de accidente cerebrovascular que simule la composición clínica plaqueta:fibrina del trombo es crucial para dicha investigación. Junto con los modelos de tHI y émbolo-MCAO, la trombina-fototrombosis cumple con este requisito y destaca por su baja mortalidad, procedimientos quirúrgicos sencillos y ausencia de efectos cardiovasculares sistémicos (Tabla 1).
Por último, pero no menos importante, la fototrombosis potenciada por trombina puede ser particularmente útil para investigar la circulación colateral inducida por un accidente cerebrovascular, dada su ubicación predecible del periinfarto en el territorio de suministro de MCA. Al mantener la penumbra para compensar el crecimiento del infarto, la circulación colateral se reconoce cada vez más como un predictor importante de los resultados del accidente cerebrovascular isquémico, ya que la obstrucción vascular aguda promueve el flujo sanguíneo a través de la red colateral, seguida de la remodelación y la angiogénesis para formar vasos neocolaterales29,30. Los resultados sugieren que el tPA no solo promueve la recanalización de la ACM proximal, sino que también aumenta la circulación colateral en la periferia del área proveedora de ACM (Figura 4). Una mejor comprensión de los mecanismos que regulan la plasticidad de la circulación colateral puede sugerir nuevas terapias. Dado que el modelo de accidente cerebrovascular fototrombótico mejorado con trombina ofrece la ventaja de una región periinfarto predecible y sensibilidad al tratamiento lítico, ayudará a la investigación de la circulación colateral posterior al accidente cerebrovascular.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH (NS108763, NS100419, NS095064 y HD080429 a C.Y.K.; y NS106592 a Y.Y.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | infarct |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 543nm laser beam | Melles Griot | 25-LGP-193-249 | photothrombosis |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~14 weeks old (22~30 g) |
| Anesthesia bar for mouse adaptor | machine shop, UVA | surgical setup | |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Dental drill | Dentamerica | Rotex 782 | surgical setup |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | brain imaging |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| infusion pump | KD Scientific | 200 | thrombolytic treatment |
| Insulin syringe with 31G needle | BD | 328291 | photothrombosis |
| Ketamine | CCM, UVA | anesthesia | |
| Laser protective google 532nm | Thorlabs | LG3 | photothrombosis |
| Ketoprofen | CCM, UVA | NSAID analgesia | |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mouse adaptor | RWD | 68014 | surgical setup |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| Retractor tips | Kent Scientific | Surgi-5014-2 | surgical setup |
| Rose Bengal | Sigma | 198250 | photothrombosis |
| Thrombin | Sigma | T7513 | photothrombosis |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| tPA | Genetech | Cathflo activase 2mg | thrombolytic treatment |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | TTC infacrt |
| Xylazine | CCM, UVA | anesthesia |
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