Summary
Une plate-forme haute peut fixer les rats sans restriction et exposer complètement les acupoints sur le dos pendant la manipulation d’acupuncture. Cet article décrit les méthodes de fabrication de la plate-forme haute, établit un modèle de rat de l’asthme et mesure les changements dans la fonction respiratoire à l’aide d’un système non invasif et en temps réel de pléthysmographie du corps entier (WBP).
Abstract
Une plate-forme haute peut fixer les rats sans restriction et exposer complètement les acupoints sur le dos pendant la manipulation d’acupuncture. Cet article décrit les méthodes de fabrication de la plate-forme haute, établit un modèle de rat de l’asthme et mesure les changements dans la fonction respiratoire à l’aide d’un système non invasif et en temps réel de pléthysmographie du corps entier (WBP).
Introduction
L’asthme est une maladie chronique caractérisée par la bronchoconstriction et l’hyperréactivité des voiesrespiratoires 1. Environ 339,4 millions de personnes dans le monde reçoivent un diagnosticd’asthme 2. La prévalence de l’asthme augmente à l’échelle mondiale, avec 100 millions de nouveaux cas attendus au cours de laprochaine décennie 3. Les corticostéroïdes inhalés et les β à action β2-agonistes ne contrôlent pas efficacement les symptômes de tous les patients4. Par conséquent, l’utilisation de thérapies alternatives telles que l’acupuncture pour traiter l’asthme a reçu une attentionaccrue 5. Une méthode efficace pour traiter l’asthme est d’aiguiller GV14 (Dazhui), bilatérale BL12 (Fengmen) et bilatérale BL13 (Feishu)6. L’acupuncture réduit considérablement les niveaux d’immunoglobuline sécrétoire A (SIgA) dans la salive et les sécrétions nasales des patients souffrant d’asthme allergique et réduit le nombre d’éosinophiles sanguins périphériques avec un taux effectif total de 85%6. L’acupuncture à BL13 et ST36 (Zusanli) chez les souris souffrant d’asthme chronique diminue le niveau d’IL-17 de 40% et diminue l’épaisseur musculaire lisse de 33% par rapport à celle du groupe ovalbumin (OVA), et soulageant ainsi les symptômes d’inflammation7,8. Cependant, le mécanisme du traitement d’acupuncture pour l’asthme n’est pas complètement clair.
Les modèles animaux sont un outil important pour la recherche surl’asthme 9 parce que le modèle animal peut être utilisé pour la mesure continue de la fonction respiratoire afin d’évaluer l’efficacité du traitement del’asthme 10. Pendant ce temps, les études de la pathophysiologie de l’asthme nécessitent des échantillons d’essai, y compris des échantillons de la trachée, poumon et bronchoalveolar lavage pour vérifier les changements dans les niveaux des facteursclés 11. Les modèles de rat de l’asthme sont couramment utilisés pour évaluer la pathophysiologie de l’asthme parce qu’ils produisent des réponses durables des voies respiratoires et montrent des réponses immédiates et tardives des voiesrespiratoires 12. Cependant, en raison de la stimulation expérimentale répétée, les rats deviennent souvent irritables. Par conséquent, une méthode appropriée pour fixer les rats est nécessaire. Les méthodes couramment utilisées pour la fixation des rats comprennent l’anesthésie et lafixation 13. Bien que la méthode d’anesthésie offre une meilleure exposition des acupoints, elle peut affecter la conduction nerveuse et finalement affecter les résultats expérimentaux14. La méthode de liaison n’induit pas les mêmes effets physiologiques que l’anesthésie, mais les rats retenus éprouveront une tension musculaire squelettique. En outre, l’aiguille ne peut pas facilement atteindre la positiondésignée 15. Ici, nous introduisons une plate-forme haute qui peut être utilisé pour fixer les rats sans les restreindre et exposer pleinement les acupoints sur le dos. Les rats peuvent être placés sur la plate-forme élevée pendant l’administration de l’acupuncture. La plate-forme haute est capable d’accueillir le rat seulement pendant qu’il est debout, et comme il est placé à une certaine distance du sol, les rats ne se déplaceront pas en raison d’une peur deshauteurs 16.
Cet article décrit en détail la fabrication de la plate-forme haute, la mise en place d’un modèle de rat de l’asthme, le fonctionnement d’un rat sur la plate-forme haute et la mesure de la fonction respiratoire à l’aide d’un système de pléthysmographie du corps entier (WBP).
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été examinées et approuvées par le Comité sur l’éthique des expériences animales de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Shanghai (numéro de dédouanement éthique PZSHUTCM190308020).
1. Fabrication de la plate-forme haute
- Réglez la longueur et la largeur du dispositif de soutien à 86 cm x 17 cm (figure 1).
- Fixez l’appareil de connexion verticalement à l’appareil de soutien. Le dispositif de raccordement doit avoir une longueur d’environ 30 cm pour empêcher le rat de courir jusqu’à la surface supérieure de la plate-forme haute et avoir une largeur de 14 cm.
- Fixez la pédale horizontale (5 cm x 5 cm) à l’appareil de raccordement. La hauteur suspendue au bas de la pédale horizontale doit être supérieure ou égale à 50 cm.
REMARQUE : Selon le nombre de rats expérimentaux, plusieurs pédales horizontales peuvent être utilisées, avec un rat placé sur chaque pédale.
2. Établissement d’un modèle de rat de l’asthme
- Sensibilisation des rats avec OVA
- Préparez la solution de sensibilisation le jour 0. Préparer chaque 1 mL de la solution de sensibilisation avec 1 mg d’OVA et 10 mg d’hydroxyde d’aluminium, avec la solution saline normale comme solvant.
- Injectez intraperitoneally chaque rat avec 1 mL de la solution de sensibilisation le jour 0. Dessinez la solution de sensibilisation avec une seringue appropriée pour une utilisation ultérieure.
- Prenez la queue et soulevez le rat, placez-le sur une surface rugueuse, et tirez doucement la queue en arrière. Saisissez la peau des oreilles et du cou avec le pouce gauche et l’index tout en retenant étroitement la peau arrière avec les trois doigts et paumes restants (veillez à vous abstenir d’appliquer une force excessive qui étouffera le rat).
- Avec la main droite, effectuer une injection intraperitoneal dans le rat avec la seringue préparée avec 1 mL de la solution de sensibilisation.
- Rats provocants avec OVA
- Sélectionnez une boîte avec un couvercle (la longueur, la largeur et la hauteur sont de 39 cm x 28 cm x 23 cm), et percez un petit trou sur le côté. Connectez la boîte scellée, la tasse nébulisante et le nébuliseur de compression avec un tube en caoutchouc( Figure supplémentaire 1).
REMARQUE : La taille nébulisée des particules du nébuliseur comprimé est de 1 à 5 μm, le taux de nébulisation est supérieur à 0,2 mL/min, et la pression ultime est de 205 kPa. - Le 14ème jour après la sensibilisation, ouvrez le couvercle de la boîte scellée maison et placez le rat dans la boîte (la boîte peut accueillir 5 rats), puis mettez la boîte scellée dans une armoire de biosécurité.
- Préparez la solution de défi. Bien mélanger 300 mg d’OVA avec 30 mL de solution saline normale.
- Allumez le nébuliseur ultrasonique et ajoutez 30 mL de la solution de défi dans la tasse nébulisante. Ajuster la posologie de la solution défi et le nombre de rats en fonction du volume de la boîte scellée maison.
- Répétez la nébulisation plusieurs fois (une fois par jour) ou ajustez la procédure en fonction de la gravité des symptômes d’asthme.
- Sélectionnez une boîte avec un couvercle (la longueur, la largeur et la hauteur sont de 39 cm x 28 cm x 23 cm), et percez un petit trou sur le côté. Connectez la boîte scellée, la tasse nébulisante et le nébuliseur de compression avec un tube en caoutchouc( Figure supplémentaire 1).
3. Traitement d’acupuncture
- Choisissez des acupoints, y compris GV14, BL12 bilatérale et bilatérale BL13, selon la théorie de la médecine traditionnelle chinoise pour le traitement de l’asthme (Figure supplémentaire 2). Administrer l’acupuncture manuelle le jour 2 et effectuer une fois tous les deux jours pour un total de 7 séances( Figure 2) .
- Acupuncture du GV14 situé entre la septième vertèbre cervicale et la première vertèbre thoracique (le creux de l’omoplate), sur la ligne médiane du dos (figure 3).
- Acupuncture du BL13 situé sous la troisième vertèbre thoracique, des deux côtés des espaces intercostals (bord inférieur de l’omoplate).
- Acupuncture du BL12 situé sous la deuxième vertèbre thoracique, des deux côtés des espaces intercostals (au-dessous de l’omoplate, position identifiée selon BL13).
- Saisissez les rats et placez-les sur la plate-forme haute.
- Tenez l’aiguille en acier inoxydable jetable (0,3 mm x 13,0 mm, figure supplémentaire 3)avec le pouce et l’index de la main droite, et appuyez sur l’arrière du rat avec la paume de la main droite.
REMARQUE : Les aiguilles jetables ne doivent être utilisées qu’une seule fois. Parce que l’utilisation répétée va émousser l’aiguille, ce qui conduit à une douleur accrue chez les rats. - Touchez la dépression au milieu du bord supérieur (GV14) ou le bord inférieur de l’omoplate (BL12 et BL13), puis piquez doucement la peau du rat avec la pointe de l’aiguille pour localiser les acupoints.
- Insérez rapidement l’aiguille après avoir déterminé l’emplacement spécifique de l’acupoint et retirez rapidement la main droite.
- A tordu uniformément les aiguilles d’environ 360° à une vitesse de 60 fois/min pendant 10 à 20 s, manipulez-les toutes les 5 minutes, puis retirez-les après 20 à 30 min(figure supplémentaire 4).
4. La mesure Penh
- Préparer la méthacholine : Placer 100 mg de méthacholine dans un tube de centrifugeuse de 5 mL et ajouter le PBS à un volume de 2 mL (50 mg/mL de méthacholine). Ensuite, diluer la solution de méthacholine de 50 mg/mL à 25 mg/mL, 12,5 mg/mL, 6,25 mg/mL et 3,125 mg/mL.
- Inspection des instruments
- Allumez l’amplificateur de signal (le système de distribution des aérosols et le système d’alimentation par biais de rongeurs sont tous éteints, et le connecteur de nébulisation est fermé).
- Vérifiez les canaux : Cliquez sur Calibrate,retournez la ligne de base d’ajustement grossier à 0 et passez à la position de courant direct (DC). Affiner la ligne de base à 0 et injecter 5 mL de gaz avec une seringue. Ensuite, passez à la position de courant alternatif (AC).
- Après vérification des canaux, assurez-vous que la valeur d’erreur est inférieure à 0,5 %.
- Paramètres de réglage
- Allumez le système de distribution des aérosols et le système d’approvisionnement en flux de biais de rongeurs. Ajuster le débit à 4,5 mL en fonction du niveau de liquide sur la boule de mercure.
- Cliquez sur Créer des options d’étude et sélectionnez Dose Response Study, sélectionnez Rat d’espèces et cliquez sur Suivant.
- Sélectionnez Simple Dose List, réglez le nombre de doses à 6 et cliquez sur Suivant.
- Sélectionnez les paramètres Penh et Area : Réglez le temps d’adaptation des animaux à 5 min, le temps de nébulisation à 2 min, le temps de réponse à 3 min et le temps de récupération à 2 min.
- Ajoutez séquentiellement les solutions suivantes au nébuliseur (200 μL par rat) : méthacholine (0 mg/mL, 3,125 mg/mL, 6,25 mg/mL, 12,5 mg/mL, 25 mg/mL et 50 mg/mL). Des changements en temps réel dans Penh peuvent être observés( Figure 4).
- Une fois que les 6 solutions avec différentes concentrations ont été réagies, cliquez sur Fichier et Session de fin pour compléter l’expérience.
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Representative Results
Avec l’acupuncture au GV14, le BL12 bilatéral et les points bilatéraux de BL13, le rat maintient une position encline. Le rat ne peut tordre sa tête qu’à l’extérieur et non à l’intérieur parce qu’une direction est bloquée par une planche de bois (figure 5).
À mesure que la concentration de méthacholine augmentait, Penh montre une tendance à la hausse et le taux de croissance augmente graduellement. À des concentrations de 3,125 mg/mL, 6,25 mg/mL, 12,5 mg/mL, 25 mg/mL et 50 mg/mL, Penh a augmenté de 18,40 % ± 10,70 %, 27,55% ± 26,30%, 88,10% ± 45,63%, 427,60% ± 172,92% et 882,27% ± 121,97%, respectivement, montrant un effet qui augmente avec une dose croissante(figure 6).
Figure 1. Fabrication de la plate-forme haute. La plate-forme haute se compose d’un dispositif de soutien, de trois dispositifs de connexion et de trois pédales. La longueur et la largeur du dispositif de soutien sont de 86 cm x 17 cm, la longueur et la largeur de l’appareil de raccordement sont de 30 cm x 14 cm, la longueur et la largeur de la pédale sont de 5 cm x 5 cm. Chaque appareil de connexion est séparé par 20 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. Protocole pour établir un modèle de rat de l’asthme. La sensibilisation est effectuée le jour 0, et l’acupuncture est effectuée tous les deux jours sur la plate-forme haute de jours 2 à 14. Après le défi, le changement de Penh est mesuré. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3. Positions anatomiques de GV14 (Dazhui), BL12 (Fengmen), et BL13 (Feishu) sur les rats. (A) Dissection anatomique du dos d’un rat montrant l’omoplate, la première côte, la deuxième côte, la troisième côte et la deuxième vertèbre thoracique (T2). (B) Le plan sagittal des côtes et de la vertèbre thoracique. (C) La section transversale de l’omoplate. (D) GV14: Situé dans le creux de l’omoplate, midline de l’arrière; BL13: Situé au bord inférieur de l’omoplate; BL12: Situé sous l’omoplate, positionné selon BL13. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4. Changements en temps réel de la fonction respiratoire. La courbe bleue montre les changements en temps réel dans Penh. La courbe verte montre l’évolution totale du volume des marées (TVb) sur une certaine période. La courbe violette montre le changement total de Penh sur une certaine période. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5. Acupuncture de GV14 (Dazhui), BL12 (Fengmen), et BL13 (Feishu) chez les rats sur la plate-forme haute. (A) Vue supérieure des positions de GV14, BL12 et BL13 chez les rats. (B) Vue latérale d’un rat acupuncture sur une plate-forme haute. Le rat est placé sur la plate-forme et maintenu en position couchée pendant l’acupuncture. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6. Mesure de Penh. WBP est utilisé pour mesurer le Penh du rat normal. Comme la concentration de méthacholine augmente, le Penh augmente également progressivement. Les données sont présentées comme la moyenne ± SEM (n = 3). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 1. Les spécifications du nébuliseur. La taille nébulisée des particules du nébuliseur comprimé est de 1 à 5 μm, le taux de nébulisation est supérieur à 0,2 mL/min, et la pression ultime est de 205 kPa. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2. Les positions schématiques de GV14 (Dazhui), BL12 (Fengmen), et BL13 (Feishu) en rat. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 3. Spécifications des aiguilles. La longueur de l’aiguille est de 13 mm et le diamètre est de 0,3 mm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 4. Le schéma de la manipulation de l’acupuncture. Après l’insertion de l’aiguille, torsader uniformément les aiguilles à environ 360° dans différentes directions. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Les acupoints GV14, bilatéraux BL12 et bilatéraux BL13 utilisés dans cette étude sont situés à l’arrière, et donc la plate-forme haute est appropriée pour fixer les rats. Dans d’autres études, une méthode de fixation adéquate doit être choisie en fonction de la position des acupoints15. Pour les acupoints sur l’abdomen, le rat peut être placé vers le bas dans un cône noir (semblable à un sac à pâtisserie utilisé par les boulangers)17. Une chaîne est fixée au cône de retenue pour la fixation, et la patte arrière du rat est également fixée. De cette façon, l’avant du corps de l’animal est fermement fixé dans le cône, tandis que l’abdomen et le dos sont exposés. Pour les acupoints sur la jambe, le rat peut être placé verticalement dans un seau transparent spécial, laissant la queue et les pattes postérieures naturellement à l’extérieur duseau 18. Le canon transparent couvre le corps du rat, mais il est pratique pour l’acupuncture sur la jambe.
Plusieurs étapes critiques doivent être prises en considération lors de l’exécution de ces méthodes. Avant le traitement d’acupuncture, les rats doivent être placés sur la plate-forme élevée pour la formation pendant quelques jours à l’avance jusqu’à ce que les rats se taire et respirer en douceur sur la plate-forme haute. Pour la manipulation de l’acupuncture, plus la paume de la main droite appuie sur le rat en arrière, plus il est facile d’insérer l’aiguille. Pour la mesure de la fonction respiratoire, le système WBP mesure les changements dans le Penh qui reflètent les changements dans la résistance pulmonaire des rats d’une manière non invasive et minimise les effets du stresspsychologique 19,20. L’effet de l’environnement externe sur les rats doit être minimisé. Le rat doit être placé dans la salle d’essai, puis recouvert la salle d’essai d’un sac en plastique (avec trou de 1 cm x 1 cm sur le côté dorsal pour la ventilation) afin de réduire l’irritation causée par l’environnement extérieur.
La limitation de cette expérience est que l’aiguille peut tomber si le rat se balance pendant l’acupuncture. Par conséquent, les besoins doivent être manipulés toutes les 5 minutes pour ajuster la profondeur. En outre, la plate-forme haute convient aux rats, mais pas aux petits animaux, tels que les souris.
En résumé, nous fournissons une description détaillée de la méthode pour la fabrication d’une plate-forme élevée pour fixer les rats sans restriction pendant l’acupuncture. La plate-forme haute peut complètement exposer les acupoints sur le dos du rat. L’utilisation de la plate-forme élevée et des mesures non invasives de la fonction respiratoire peut faciliter l’analyse de l’acupuncture comme traitement de l’asthme. L’étude du mécanisme thérapeutique de l’acupuncture sur le dos peut apporter de nouveaux traitements aux maladies respiratoires telles que l’asthme et la maladie pulmonaire obstructive chronique.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par la National Natural Science Foundation of China (no 81922076, 81973951, 81873373), projet de construction de l’innovation collaborative de Shanghai (No. ZYJKFW201811010, ZYJKFW201701005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mm x 13.0 mm acupuncture needle | China Suzhou Medical Device Factory | ||
| Al(OH)3 | American Thermo | 77161 | |
| Compression nebulizer | Jiangsu Lude Medical Electronics Co., Ltd. | NB-212C | |
| Fine Pointe V2.0 | American Buxco | ||
| Laboratory gas drying unit | American Drierite | 26800 | |
| Methacholine | American Sigma | MKCF6054 | |
| Ovalbumin | American Sigma | A5503-25G | |
| Phosphate Buffer solution (1x) | Gelifesciences | SH30256.01 | |
| Seal box | IRIS Corporation of Japan | ||
| Whole-body plethysmography respiratory function measurement system | American Buxco |
References
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