Summary
En høy plattform kan fikse rotter uten begrensning og helt avsløre akupunktene på ryggen under akupunkturmanipulasjon. Denne artikkelen beskriver metoder for fabrikasjon av den høye plattformen, etablerer en rottemodell av astma og måler endringer i åndedrettsfunksjonen ved hjelp av et ikke-invasivt og sanntids plethysmografisystem (WBP).
Abstract
En høy plattform kan fikse rotter uten begrensning og helt avsløre akupunktene på ryggen under akupunkturmanipulasjon. Denne artikkelen beskriver metoder for fabrikasjon av den høye plattformen, etablerer en rottemodell av astma og måler endringer i åndedrettsfunksjonen ved hjelp av et ikke-invasivt og sanntids plethysmografisystem (WBP).
Introduction
Astma er en kronisk sykdom preget av bronkokonstriksjon og luftveis hyperrespons1. Omtrent 339,4 millioner mennesker over hele verden er diagnostisert med astma2. Utbredelsen av astma øker globalt, med 100 millioner nye tilfeller forventet i løpet av det neste tiåret3. Inhalerte kortikosteroider og langtidsvirkende β2-agonisterkontrollerer ikke effektivt symptomene til alle pasienter4. Derfor har bruk av alternative terapier som akupunktur for å behandle astma fått økt oppmerksomhet5. En effektiv metode for behandling av astma er å nåle GV14 (Dazhui), bilateral BL12 (Fengmen) og bilateral BL13 (Feishu)6. Akupunktur reduserer nivåene av sekretorisk immunoglobulin A (SIgA) betydelig i spytt og nesesekretjoner av pasienter med allergisk astma og reduserer perifere blodeosinofiler med en total effektiv hastighet på 85%6. Akupunktur ved BL13 og ST36 (Zusanli) hos mus med kronisk astma reduserer nivået av IL-17 med 40% og reduserer den glatte muskeltykkelsen med 33% sammenlignet med ovalbumingruppen (OVA), og lindrer dermed betennelsessymptomer7,8. Imidlertid er mekanismen for akupunkturbehandling for astma ikke helt klar.
Dyremodeller er et viktig verktøy for astmaforskning9 fordi dyremodellen kan brukes til kontinuerlig måling av åndedrettsfunksjon for å vurdere effektiviteten av astmabehandlingen10. I mellomtiden krever studier av patofysiologien til astma testprøver, inkludert prøver fra luftrøret, lunge og bronkoalveolar lavage for å verifisere endringer i nivåene av nøkkelfaktorer11. Rottemodeller av astma brukes ofte til å vurdere astma patofysiologi fordi de produserer langvarige luftveisresponser og viser umiddelbare og senfase luftveisresponser12. På grunn av gjentatt eksperimentell stimulering blir rottene imidlertid ofte irritabel. Derfor er det nødvendig med en passende metode for å fikse rotter. Vanlige metoder for rottefiksering inkluderer anestesi og binding13. Selv om anestesimetoden gir bedre eksponering av akupunktene, kan det påvirke nerveledning og til slutt påvirke de eksperimentelle resultatene14. Bindingsmetoden induserer ikke de samme fysiologiske effektene som anestesi, men begrensede rotter vil oppleve skjelettmuskulaturspenning. Nålen kan heller ikke lett nå den angitte posisjonen15. Her introduserer vi en høy plattform som kan brukes til å fikse rotter uten å begrense dem og fullt ut eksponere akupunktene på baksiden. Rottene kan plasseres på den høye plattformen under administrering av akupunktur. Den høye plattformen er i stand til å imøtekomme rotten bare mens den står, og da den er plassert en viss avstand fra bakken, vil rottene ikke bevege seg på grunn av frykt for høyder16.
Denne artikkelen beskriver i detalj fabrikasjonen av den høye plattformen, etableringen av en rottemodell av astma, driften av å trenge en rotte på den høye plattformen og måling av åndedrettsfunksjon ved hjelp av et helkropps plethysmografi (WBP) system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble gjennomgått og godkjent av Komiteen for etikk for dyreforsøk ved Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (Etisk klareringsnummer PZSHUTCM190308020).
1. Fabrikasjon av den høye plattformen
- Sett lengden og bredden på støtteenheten til 86 cm x 17 cm (Figur 1).
- Fest tilkoblingsenheten vertikalt til støtteenheten. Tilkoblingsenheten skal være ca. 30 cm lang for å forhindre at rotten løper til den øverste overflaten av den høye plattformen og har en bredde på 14 cm.
- Fest den horisontale pedalen (5 cm x 5 cm) til tilkoblingsenheten. Den hengende høyden på bunnen av den horisontale pedalen skal være større enn eller lik 50 cm.
MERK: Avhengig av antall eksperimentelle rotter, kan flere horisontale pedaler brukes, med en rotte plassert på hver pedal.
2. Etablering av en rottemodell av astma
- Sensibilisere rotter med OVA
- Forbered sensibiliseringsløsningen på dag 0. Forbered hver 1 ml sensibiliseringsløsning med 1 mg OVA og 10 mg aluminiumhydroksid, med normal saltvann som løsningsmiddel.
- Injiser hver rotte intraperitonealt med 1 ml sensibiliseringsløsning på dag 0. Tegn sensibiliseringsløsningen med en passende sprøyte for senere bruk.
- Ta tak i halen og løft opp rotten, legg den på en grov overflate, og trekk forsiktig halen tilbake. Ta tak i huden på både ørene og nakken med venstre tommel og pekefinger mens du holder bakhuden tett med de resterende tre fingrene og håndflatene (vær forsiktig med å avstå fra å bruke overflødig kraft som vil kvele rotten).
- Med høyre hånd, utfør en intraperitoneal injeksjon i rotten med den tilberedte sprøyten med 1 ml sensibiliseringsoppløsning.
- Utfordrende rotter med OVA
- Velg en boks med lokk (lengden, bredden og høyden er 39 cm x 28 cm x 23 cm), og bor et lite hull i siden. Koble til den forseglede esken, forstøverbegeret og kompresjonsstøveren med et gummirør (Supplerende figur 1).
MERK: Den forstøpte partikkelstørrelsen til den komprimerte forstøveren er 1 - 5 μm, forstøverhastigheten er større enn 0,2 ml / min, og det ultimate trykket er 205 kPa. - dagen etter sensibilisering åpner du lokket på den hjemmelagde forseglede boksen og legger rotten i esken (boksen har plass til 5 rotter), og legg deretter den forseglede boksen i et biosikkerhetsskap.
- Forbered utfordringsløsningen. Bland grundig 300 mg OVA med 30 ml normal saltvann.
- Slå på ultralyd nebulisatoren og legg til 30 ml av utfordringsløsningen i forstøverbegeret. Juster doseringen av utfordringsløsning og antall rotter i henhold til volumet av den hjemmelagde forseglede boksen.
- Gjenta forstøvning flere ganger (en gang om dagen) eller juster prosedyren i henhold til alvorlighetsgraden av astma symptomer.
- Velg en boks med lokk (lengden, bredden og høyden er 39 cm x 28 cm x 23 cm), og bor et lite hull i siden. Koble til den forseglede esken, forstøverbegeret og kompresjonsstøveren med et gummirør (Supplerende figur 1).
3. Akupunkturbehandling
- Velg akupunkter, inkludert GV14, bilaterale BL12 og bilaterale BL13, i henhold til teorien om tradisjonell kinesisk medisin for behandling av astma (Supplerende figur 2). Administrer manuell akupunktur på dag 2 og utfør én gang annenhver dag i totalt 7 økter (figur 2).
- Akupunktur GV14 ligger mellom den syvende cervical vertebra og den første thorax vertebra (hulen av scapula), på midtlinjen på ryggen (Figur 3).
- Akupunktur BL13 ligger under den tredje thorax vertebra, på begge sider av intercostal mellomrom (nedre kant av scapula).
- Akupunktur BL12 ligger under den andre thorax vertebra, på begge sider av intercostal mellomrom (under scapula, posisjon identifisert i henhold til BL13).
- Ta tak i rotter og plasser dem på den høye plattformen.
- Hold engangs nålen i rustfritt stål (0,3 mm x 13,0 mm, tilleggsfigur 3) med tommelen og pekefingeren på høyre hånd, og trykk baksiden av rotten med håndflaten på høyre hånd.
MERK: Engangsnåler må kun brukes én gang. Fordi gjentatt bruk vil stumpe nålen, noe som fører til økt smerte hos rotter. - Berør depresjonen midt på den øvre kanten (GV14) eller den nedre kanten av scapulaen (BL12 og BL13), og stikk deretter forsiktig huden på rotten med nålespissen for å finne akupunktene.
- Sett raskt inn nålen etter å ha bestemt den spesifikke plasseringen av akupunktet og fjern raskt høyre hånd.
- Jevnt vridd nålene ca 360 ° med en hastighet på 60 ganger / min i 10 - 20 s, manipulere dem hver 5 min, og trekk dem deretter tilbake etter 20 - 30 min (Supplerende figur 4).
4. Penh-målingen
- Forbered methacholine: Legg 100 mg methacholine i et 5 ml sentrifugerør og tilsett PBS i et volum på 2 ml (50 mg/ml methakolin). Fortynn deretter 50 mg/ml methacholine-oppløsningen til 25 mg/ml, 12,5 mg/ml, 6,25 mg/ml og 3,125 mg/ml.
- Inspeksjon av instrumenter
- Slå på signalforsterkeren (aerosolfordelingssystemet og gnagerbiasstrømforsyningssystemet er alle slått av, og forstøvningskontakten er lukket).
- Kontroller kanalene: Klikk Kalibrer, returner grunnlinjen for grovjustering til 0 og bytt til likestrømsposisjon (DC). Finjuster grunnlinjen til 0 og injiser 5 ml gass med en sprøyte. Bytt deretter til vekselstrømposisjonen (AC).
- Når du har sjekket kanalene, må du kontrollere at feilverdien er mindre enn 0,5 %.
- Angi parametere
- Slå på aerosoldistribusjonssystemet og gnagerbiasstrømforsyningssystemet. Juster strømningshastigheten til 4,5 ml i henhold til væskenivået på kvikksølvkulen.
- Klikk Opprett studiealternativer , velg Doseresponsstudie, velg Rotte av arter og klikk Neste.
- Velg Enkel doseliste, sett antall doser til 6, og klikk Neste.
- Velg Penh- og Area-parametrene: Sett dyrets tilpasningstid til 5 min, forstøvingstiden til 2 min, responstiden til 3 min og gjenopprettingstiden til 2 min.
- Legg sekvensielt til følgende løsninger i forstøveren (200 μL per rotte): methacholine (0 mg/ml, 3,125 mg/ml, 6,25 mg/ml, 12,5 mg/ml, 25 mg/ml og 50 mg/ml). Endringer i penh i sanntid kan observeres (Figur 4).
- Når alle de 6 løsningene med forskjellige konsentrasjoner er reagert, klikker du på Fil og avslutt økt for å fullføre eksperimentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med akupunktur på GV14, bilaterale BL12 og bilaterale BL13-poeng opprettholder rotten en utsatt posisjon. Rotten kan bare vri hodet til utsiden og ikke innsiden fordi en retning er blokkert med et trebrett (figur 5).
Etter hvert som methacholinekonsentrasjonen økte, viser Penh en økende trend og vekstraten øker gradvis. Ved konsentrasjoner på 3,125 mg/ml, 6,25 mg/ml, 12,5 mg/ml, 25 mg/ml og 50 mg/ml økte Penh med 18,40 % ± 10,70 %, 27,55 % ± 26,30 %, 88,10 % ± 45,63 %, 427,60 % ± 172,92 % og 882,27 % ± henholdsvis 121,97 %, noe som viser en effekt som øker med økende dose (figur 6).
Figur 1. Fabrikasjon av den høye plattformen. Den høye plattformen består av en støtteenhet, tre tilkoblingsenheter og tre pedaler. Lengden og bredden på støtteanordningen er 86 cm x 17 cm, lengden og bredden på tilkoblingsenheten er 30 cm x 14 cm, lengden og bredden på pedalen er 5 cm x 5 cm. Hver tilkoblingsenhet er skilt med 20 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Protokoll for etablering av en rottemodell av astma. Sensibilisering utføres på dag 0, og akupunktur utføres annenhver dag på den høye plattformen fra dag 2 til 14. Etter utfordring måles endringen i Penh. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Anatomiske posisjoner for GV14 (Dazhui), BL12 (Fengmen)og BL13 (Feishu) på rottene. (A) Anatomisk disseksjon av baksiden av en rotte som viser scapula, første ribbe, andre ribbe, tredje ribbe og andre thorax vertebra (T2). (B) Det sagittale planet på ribbeina og thoraxvirvelen. (C) Tverrsnittet av scapulaen. (D) GV14: Ligger i hulen av scapulaen, midtlinjen på ryggen; BL13: Ligger i nedre kant av scapulaen; BL12: Ligger under scapulaen, plassert i henhold til BL13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Endringer i åndedrettsfunksjonen i sanntid. Den blå kurven viser endringer i sanntid i Penh. Den grønne kurven viser den totale endringen i tidevannsvolumet (TVb) over en viss periode. Den lilla kurven viser den totale endringen i Penh over en viss periode. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5. Akupunktur av GV14 (Dazhui), BL12 (Fengmen)og BL13 (Feishu) hos rotter på den høye plattformen. (A) Sett ovenfra for posisjonene til GV14, BL12 og BL13 hos rotter. (B) Lateral visning av en akupunktur rotte på en høy plattform. Rotten er plassert på plattformen og opprettholdt i utsatt posisjon under akupunktur. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6. Måling av Penh. WBP brukes til å måle Penh av den normale rotten. Etter hvert som konsentrasjonen av methacholine øker, øker Penh også gradvis. Dataene presenteres som gjennomsnittlig ± SEM (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1. Forstøverspesifikasjonene. Den forstøldte partikkelstørrelsen til den komprimerte forstøveren er 1 - 5 μm, forstøvningshastigheten er større enn 0,2 ml / min, og det ultimate trykket er 205 kPa. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 2. Skjematiske posisjoner for GV14 (Dazhui) ,BL12 (Fengmen)og BL13 (Feishu) i rotte.
Supplerende figur 3. Nålespesifikasjoner. Lengden på nålen er 13 mm og diameteren er 0,3 mm. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 4. Skjematisk akupunkturmanipulering. Etter å ha satt inn nålen, vridde du nålene jevnt ca. 360° i forskjellige retninger. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GV14, bilaterale BL12 og bilaterale BL13-akupunkter som brukes i denne studien ligger på baksiden, og dermed er den høye plattformen egnet for å fikse rotter. I andre studier bør en tilstrekkelig fikseringsmetode velges i henhold til posisjonen til akupunktene15. For akupunkter på magen kan rotten plasseres nedover i en svart kjegle (ligner en konditorpose som brukes av bakere)17. En kjede er festet til selvbeherskelseskjeglen for fiksering, og bakbenet på rotten er også festet. På denne måten er forsiden av dyrets kropp fast festet i kjeglen, mens magen og ryggen er utsatt. For akupunkter på beinet kan rotten plasseres vertikalt i en spesiell gjennomsiktig bøtte, og etterlater halen og bakbenene naturlig utenfor bøtte18. Den gjennomsiktige fatet dekker rottens kropp, men det er praktisk for akupunktur på benet.
Flere kritiske trinn bør vurderes når du utfører disse metodene. Før akupunkturbehandlingen bør rottene plasseres på den høye plattformen for trening i noen dager i forveien til rottene holder seg stille og puster jevnt på den høye plattformen. For akupunkturmanipulering presser den hardere håndflaten på høyre hånd rotten tilbake, jo lettere er det å sette inn nålen. For måling av åndedrettsfunksjoner måler WBP-systemet endringer i Penh som gjenspeiler endringer i lungemotstand av rotter på en ikke-invasiv måte og minimerer effekten av psykologisk stress19,20. Effekten av det ytre miljøet på rotter bør minimeres. Rotten skal plasseres i testrommet og deretter dekkes testrommet med en plastpose (med 1 cm x 1 cm hull på dorsalsiden for ventilasjon) for å redusere irritasjonen forårsaket av det ytre miljøet.
Begrensningen av dette eksperimentet er at nålen kan falle av hvis rotten svinger rundt under akupunkturen. Derfor må trengende manipuleres hvert 5. I tillegg er den høye plattformen egnet for rotter, men ikke for mindre dyr, som mus.
Oppsummert gir vi en detaljert beskrivelse av metoden for fabrikasjon av en høy plattform for å fikse rotter uten begrensning under akupunktur. Den høye plattformen kan helt eksponere akupunktene på baksiden av rotten. Bruk av høy plattform og ikke-intravasive respiratoriske funksjonsmålinger kan lette analysen av akupunktur som behandling for astma. Å studere den terapeutiske mekanismen for akupunktur på ryggen kan gi nye behandlinger til luftveissykdommer som astma og kronisk obstruktiv lungesykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (nr. 81922076, 81973951, 81873373), Byggeprosjekt for samarbeidsinnovasjon av shanghai (Nei. ZYJKFW201811010, ZYJKFW201701005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mm x 13.0 mm acupuncture needle | China Suzhou Medical Device Factory | ||
| Al(OH)3 | American Thermo | 77161 | |
| Compression nebulizer | Jiangsu Lude Medical Electronics Co., Ltd. | NB-212C | |
| Fine Pointe V2.0 | American Buxco | ||
| Laboratory gas drying unit | American Drierite | 26800 | |
| Methacholine | American Sigma | MKCF6054 | |
| Ovalbumin | American Sigma | A5503-25G | |
| Phosphate Buffer solution (1x) | Gelifesciences | SH30256.01 | |
| Seal box | IRIS Corporation of Japan | ||
| Whole-body plethysmography respiratory function measurement system | American Buxco |
References
- Papi, A., Brightling, C., Pedersen, S. E., Reddel, H. K.
- Global Initiative for Asthma, 2019. Global strategy for asthma management and prevention. , Available from: https://ginasthma.org/gina-reports/ (2019).
- Enilari, O., Sinha, S. The Global Impact of Asthma in Adult Populations. Annals of Global Health. 85 (1), (2019).
- Global Initiative for Asthma, 2020. Global strategy for asthma management and prevention. , Available from: https://ginasthma.org/gina-reports/ (2020).
- Zhuang, Y., Xing, J. J., Li, J., Zeng, B. Y., Liang, F. R.
- Yang, Y. Q., et al. Considerations for use of acupuncture as supplemental therapy for patients with allergic asthma. Clinical Reviews in Allergy & Immunology. 44 (3), 254-261 (2013).
- Nurwati, I., et al. Reduction of interleukin-17 level by acupuncture at Feishu (BL13) is strengthened by acupuncture at Zusanli (ST36) in a mouse model of chronic asthma: An experimental study. Medical Acupuncture. 27 (4), 278-282 (2015).
- Nurwati, I., et al. Improvement in inflammation and airway remodelling after acupuncture at BL13 and ST36 in a mouse model of chronic asthma. Acupuncture in Medicine. 37 (4), 228-236 (2019).
- Reddy, A. T., Lakshmi, S. P., Reddy, R. C. Murine model of allergen induced asthma. Journal of Visualized Experiments. (63), e3771 (2012).
- Zhou, D. D., et al. Metallothionein-2 is associated with the amelioration of asthmatic pulmonary function by acupuncture through protein phosphorylation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 123, 109785 (2020).
- Yin, L. M., et al. Transgelin-2 as a therapeutic target for asthmatic pulmonary resistance. Science Translational Medicine. 10 (427), (2018).
- Shin, Y. S., Takeda, K., Gelfand, E. W. Understanding asthma using animal models. Allergy Asthma & Immunology Research. 1 (1), 10-18 (2009).
- Cui, K. M., et al. Electro-acupuncture relieves chronic visceral hyperalgesia in rats. Neuroscience Letters. 376 (1), 20-23 (2005).
- Tobin, J. R., Martin, L. D., Breslow, M. J., Traystman, R. J. Selective anesthetic inhibition of brain nitric oxide synthase. Anesthesiology. 81 (5), 1264-1269 (1994).
- Dimitrov, N., Sivrev, D., Atanasova, D. Method of rat immobilization during experimental acupuncture. Scripta Scientifica Medica. 45, 105-108 (2013).
- Aguilar, R., et al. emotional reactivity and fear of heights: a factor analytic map from a large F(2) intercross of Roman rat strains. Brain Research Bulletin. 57 (2), 17-26 (2002).
- Lai, X., et al. Proteomic response to acupuncture treatment in spontaneously hypertensive rats. PloS One. 7 (9), 44216 (2012).
- Niu, C., et al. A novel uni-acupoint electroacupuncture stimulation method for pain relief. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2011, 209879 (2011).
- McFadden, E. R., Luparello, T., Lyons, H. A., Bleecker, E. The mechanism of action of suggestion in the induction of acute asthma attacks. Psychosomatic Medicine. 31 (2), 134-143 (1969).
- Savov, J. D., et al. Ozone-induced acute pulmonary injury in inbred mouse strains. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 69-77 (2004).
