Summary
En hög plattform kan fixa råttor utan begränsning och helt exponera akupunkterna på baksidan under akupunkturmanipulation. Denna artikel beskriver metoder för tillverkning av den höga plattformen, upprättar en råtta modell av astma och mäter förändringar i andningsfunktionen med hjälp av en noninvasive och realtid hela kroppen plethysmography (WBP) system.
Abstract
En hög plattform kan fixa råttor utan begränsning och helt exponera akupunkterna på baksidan under akupunkturmanipulation. Denna artikel beskriver metoder för tillverkning av den höga plattformen, upprättar en råtta modell av astma och mäter förändringar i andningsfunktionen med hjälp av en noninvasive och realtid hela kroppen plethysmography (WBP) system.
Introduction
Astma är en kronisk sjukdom som kännetecknas av bronkkonstriction och luftvägarna hyperresponsivitet1. Cirka 339,4 miljoner människor över hela världen diagnostiseras med astma2. Prevalensen av astma ökar globalt, med 100 miljoner nya fall som förväntas under det kommande decenniet3. Inhalerade kortikosteroider och långverkande β2-agonisterkontrollerar inte effektivt symtomen hos alla patienter4. Därför har användningen av alternativa terapier som akupunktur för att behandla astma fått ökad uppmärksamhet5. En effektiv metod för behandling av astma är att nåla GV14 (Dazhui), bilaterala BL12 (Fengmen) och bilaterala BL13 (Feishu)6. Akupunktur minskar signifikant nivåerna av sekretoriskt immunglobulin A (SIgA) i saliv och nasala sekret hos patienter med allergisk astma och minskar antalet eosinofiler i perifert blod med en total effektiv hastighet på 85%6. Akupunktur vid BL13 och ST36 (Zusanli) hos möss med kronisk astma minskar nivån av IL-17 med 40% och minskar den släta muskeltjockleken med 33% jämfört med ovalbumingruppen (OVA) och därmed lindra inflammationssymtom7,8. Mekanismen för akupunkturbehandling för astma är dock inte helt klar.
Djurmodeller är ett viktigt verktyg förastmaforskning 9 eftersom djurmodellen kan användas för kontinuerlig mätning av andningsfunktionen för att bedöma astmabehandlingens effektivitet10. Under tiden kräver studier av astmans patofysiologi testprover, inklusive prover från luftstrupen, lung- och bronchoalveolär lavage för att verifiera förändringar i nivåerna avnyckelfaktorer 11. Råtta modeller av astma används ofta för att bedöma astma patofysiologi eftersom de producerar långvariga luftvägarna svar och visa omedelbara och sena fas luftvägarna svar12. Men på grund av upprepad experimentell stimulering blir råttorna ofta irriterade. Därför behövs en lämplig metod för att fixa råttor. Vanliga metoder för råttfixering inkluderar anestesi och bindning13. Även om anestesimetoden ger bättre exponering av akutpunkterna, kan det påverka nervledning och i slutändan påverka de experimentella resultaten14. Bindningsmetoden inducerar inte samma fysiologiska effekter som anestesi, men återhållna råttor kommer att uppleva skelettmuskelspänning. Nålen kan inte heller lätt nå det angivna läget15. Här introducerar vi en hög plattform som kan användas för att fixa råttor utan att begränsa dem och helt exponera akupunkterna på baksidan. Råttorna kan placeras på den höga plattformen under administrering av akupunktur. Den höga plattformen kan rymma råttan endast medan den står, och eftersom den placeras ett visst avstånd från marken kommer råttorna inte att röra sig på grund av rädsla för höjder16.
Denna artikel beskriver i detalj tillverkningen av den höga plattformen, upprättandet av en råtta modell av astma, driften av att behöva en råtta på den höga plattformen och mätning av andningsfunktionen med hjälp av en helkropp plethysmography (WBP) system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök granskades och godkändes av kommittén för etik för djurförsök vid Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (Etiskt godkännandenummer PZSHUTCM190308020).
1. Tillverkning av den höga plattformen
- Ställ in stödanordningens längd och bredd på 86 cm x 17 cm (bild 1).
- Fäst anslutningsenheten vertikalt på stödenheten. Anslutningsanordningen bör vara ca 30 cm lång för att förhindra att råttan går till den övre ytan av den höga plattformen och har en bredd på 14 cm.
- Fäst den horisontella pedalen (5 cm x 5 cm) på anslutningsanordningen. Den upphängda höjden längst ner på den horisontella pedalen bör vara större än eller lika med 50 cm.
OBS: Beroende på antalet experimentella råttor kan flera horisontella pedaler användas, med en råtta placerad på varje pedal.
2. Upprättande av en råttmodell av astma
- Sensibilisera råttorna med OVA
- Förbered sensibiliseringslösningen dag 0. Förbered varje 1 ml av sensibiliseringslösningen med 1 mg OVA och 10 mg aluminiumhydroxid, med normal saltlösning som lösningsmedel.
- Intraperitoneally injicera varje råtta med 1 ml av sensibiliseringslösningen dag 0. Dra den sensibiliserande lösningen med en lämplig spruta för senare användning.
- Ta tag i svansen och lyft upp råttan, placera den på en grov yta och dra försiktigt svansen tillbaka. Ta tag i huden på både öron och nacke med vänster tumme och pekfinger samtidigt som du håller fast rygghuden med de återstående tre fingrarna och handflatorna (var noga med att avstå från att applicera överflödig kraft som kväver råttan).
- Med höger hand, utför en intraperitoneal injektion i råttan med den beredda sprutan med 1 ml av sensibiliseringslösningen.
- Utmanande råttor med OVA
- Välj en låda med lock (längden, bredden och höjden är 39 cm x 28 cm x 23 cm) och borra ett litet hål i sidan. Anslut den förseglade lådan, nebuliserande koppen och kompressionsnebulatorn med ett gummirör (kompletterande figur 1).
OBS: Den nebuliserade partikelstorleken på den komprimerade nebulisatorn är 1 - 5 μm, nebuliseringshastigheten är större än 0,2 ml/min och det ultimata trycket är 205 kPa. - Den 14: e dagen efter sensibiliseringen öppnar du locket på den hemlagade förseglade lådan och placerar råttan i lådan (lådan rymmer 5 råttor) och lägger sedan den förseglade lådan i ett biosäkerhetsskåp.
- Förbered utmaningslösningen. Blanda noggrant 300 mg OVA med 30 ml normal saltlösning.
- Slå på ultraljud nebulisatorn och lägg till 30 ml av utmaningslösningen i nebulizing koppen. Justera dosen av utmaningslösningen och antalet råttor enligt volymen av den hemlagade förseglade lådan.
- Upprepa nebuliseringen flera gånger (en gång om dagen) eller justera proceduren beroende på svårighetsgraden av astmasymtom.
- Välj en låda med lock (längden, bredden och höjden är 39 cm x 28 cm x 23 cm) och borra ett litet hål i sidan. Anslut den förseglade lådan, nebuliserande koppen och kompressionsnebulatorn med ett gummirör (kompletterande figur 1).
3. Akupunkturbehandling
- Välj akupunkter, inklusive GV14, bilaterala BL12 och bilaterala BL13, enligt teorin om traditionell kinesisk medicin för behandling av astma (kompletterande figur 2). Administrera manuell akupunktur dag 2 och utför en gång varannan dag under totalt 7 session (figur 2).
- Akupunktur GV14 som ligger mellan den sjunde halskotan och den första bröstkotan (scapulans ihåliga) på ryggens mittlinje (figur 3).
- Akupunktur BL13 ligger under den tredje bröstkotan, på båda sidor av de interkostala utrymmena (scapulaens nedre kant).
- Akupunktur BL12 ligger under den andra bröstkotan, på båda sidor av de interkostala utrymmena (under scapula, position identifierad enligt BL13).
- Ta tag i råttorna och placera dem på den höga plattformen.
- Håll nål av rostfritt stål (0,3 mm x 13,0 mm, tilläggsfigur 3)med höger tumme och pekfinger och tryck på råttans baksida med handflatan på höger hand.
OBS: Engångsnålar får endast användas en gång. Eftersom upprepad användning kommer att trubba nålen, vilket leder till ökad smärta hos råttor. - Vidrör fördjupningen i mitten av överkanten (GV14) eller scapulans underkant (BL12 och BL13) och stick sedan försiktigt råttans hud med nålspetsen för att hitta akupunkterna.
- Sätt snabbt in nålen efter att ha fastställt akupunktpunktens specifika plats och ta snabbt bort höger hand.
- Jämnt vridna nålarna ca 360° med en hastighet av 60 gånger/min i 10-20 s, manipulera dem var 5: e minut och dra sedan tillbaka dem efter 20 - 30 min(kompletterande figur 4).
4. Penh-mätningen
- Bered methacholine: Placera 100 mg methacholine i ett 5 ml centrifugeringsrör och tillsätt PBS till en volym av 2 ml (50 mg/ml methakolin). Späd sedan ut 50 mg/ml methakolinlösning till 25 mg/ml, 12,5 mg/ml, 6,25 mg/ml och 3,125 mg/ml.
- Inspektion av instrument
- Slå på signalförstärkaren (aerosolfördelningssystemet och gnagarnas förspänningsflödessystem är alla avstängda och nebuliseringskontakten är stängd).
- Kontrollera kanalerna: Klicka på Kalibrera, återställ den grovjusteringsbaslinjen till 0 och växla till likströmsläget (DC). Finjustera baslinjen till 0 och injicera 5 ml gas med en spruta. Växla sedan till växelströmsläget (AC).
- När du har kontrollerat kanalerna kontrollerar du att felvärdet är mindre än 0,5 %.
- Ställa in parametrar
- Slå på aerosoldistributionssystemet och gnagarflödets flödessystem. Justera flödeshastigheten till 4,5 ml enligt vätskenivån på kvicksilverkulan.
- Klicka på Skapa studiealternativ och välj Dosresponsstudie, välj Råtta av arter och klicka på Nästa.
- Välj Enkel doslista , ställ in antalet doser till 6 och klicka på Nästa.
- Välj parametrarna Penna och Område: Ställ in djurens anpassningstid på 5 min, nebuliseringstiden till 2 min, svarstiden till 3 min och återhämtningstiden till 2 min.
- Tillsätt sekventiellt följande lösningar till nebulisatorn (200 μL per råtta): methacholine (0 mg/ml, 3,125 mg/ml, 6,25 mg/ml, 12,5 mg/ml, 25 mg/ml och 50 mg/ml). Realtidsförändringar i Penh kan observeras (figur 4).
- När alla 6 lösningar med olika koncentrationer har reagerats klickar du på Arkiv och Slutsession för att slutföra experimentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med akupunktur vid GV14, bilaterala BL12 och bilaterala BL13-punkter behåller råttan en benägen position. Råttan kan vrida huvudet endast till utsidan och inte insidan eftersom en riktning är blockerad med en träbräda (Figur 5).
I takt med att methakolinkoncentrationen ökade visar Penh en ökande trend och tillväxttakten ökar gradvis. Vid koncentrationer på 3,125 mg/ml, 6,25 mg/ml, 12,5 mg/ml, 25 mg/ml och 50 mg/ml ökade Penh med 18,40% ± 10,70%, 27,55% ± 26,30%, 88,10% ± 45,63%, 427,60% ± 172,92% respektive 882,27% ± 121,97%, vilket visar en effekt som ökar med ökande dos (Figur 6).
Figur 1. Tillverkning av den höga plattformen. Den höga plattformen består av en stödanordning, tre anslutningsanordningar och tre pedaler. Stödanordningens längd och bredd är 86 cm x 17 cm, anslutningsanordningens längd och bredd är 30 cm x 14 cm, pedalens längd och bredd är 5 cm x 5 cm. Varje anslutningsenhet är separerad med 20 cm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2. Protokoll för upprättande av en råttmodell av astma. Sensibilisering utförs dag 0, och akupunktur utförs varannan dag på den höga plattformen från dag 2 till 14. Efter utmaning mäts förändringen i Penh. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3. Anatomiska positioner för GV14 (Dazhui),BL12 (Fengmen) ochBL13 (Feishu) på råttorna. A)Anatomisk dissekering av baksidan av en råtta som visar scapula, första revbenet, andra revbenet, tredje revbenet och andra bröstkotan (T2). B)Revbenens och bröstkotans sagittalplan. C)Scapulans tvärsnitt. D)GV14: Placerad i scapulans ihåliga, mittlinjen på baksidan; BL13: Beläget vid scapulaens nedre kant; BL12: Ligger under scapula, placerad enligt BL13. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4. Realtidsförändringar i andningsfunktionen. Den blå kurvan visar realtidsförändringar i Penh. Den gröna kurvan visar den totala förändringen i tidvattenvolymen (TVb) under en viss period. Den lila kurvan visar den totala förändringen i Penh under en viss period. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5. Akupunktur av GV14 (Dazhui), BL12 (Fengmen)och BL13 (Feishu) hos råttor på den höga plattformen. (A) Toppvy över positionerna GV14, BL12 och BL13 hos råttor. B)Sidovy av en akupunkterad råtta på en hög plattform. Råttan placeras på plattformen och underhålls i benägen position under akupunkturen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6. Mätning av Penh. WBP används för att mäta den normala råttans penna. När koncentrationen av methacholine ökar ökar penhen också gradvis. Uppgifterna presenteras som medelvärdet av ± SEM (n = 3). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande figur 1. Nebulisatorspecifikationerna. Den nebuliserade partikelstorleken på den komprimerade nebulisatorn är 1 - 5 μm, nebuliseringshastigheten är större än 0,2 ml/min och det ultimata trycket är 205 kPa. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2. De schematiska positionerna för GV14 (Dazhui), BL12 (Fengmen)och BL13 (Feishu) i råtta. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 3. Nålspecifikationer. Nålens längd är 13 mm och diametern är 0,3 mm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 4. Schemat för akupunkturmanipulation. Efter att ha fört in nålen, vridit nålarna jämnt ca 360° i olika riktningar. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GV14, bilaterala BL12 och bilaterala BL13 acupoints som används i denna studie ligger på baksidan, och därmed den höga plattformen är lämplig för fixering av råttor. I andra studier bör en adekvat fixeringsmetod väljas enligt positionen för akutpunkterna15. För akupunkter på buken kan råttan placeras nedåt i en svart kon (liknar en konpåse som används av bagare)17. En kedja är fäst vid fasthållningskonen för fixering, och råttans bakben är också fastsatt. På detta sätt är framsidan av djurets kropp fast fixerad i konen, medan buken och ryggen exponeras. För akupunkter på benet kan råttan placeras vertikalt i en speciell genomskinlig hink, vilket lämnar svansen och bakbenen naturligt utanförhinken 18. Den genomskinliga pipan täcker råttans kropp, men det är bekvämt för akupunktur på benet.
Flera kritiska steg bör övervägas när du utför dessa metoder. Före akupunkturbehandlingen bör råttorna placeras på den höga plattformen för träning i några dagar i förväg tills råttorna håller tyst och andas smidigt på den höga plattformen. För akupunkturmanipulation, ju hårdare handflatan på höger hand pressar råttan tillbaka, desto lättare är det att sätta in nålen. För mätning av andningsfunktionen mäter WBP-systemet förändringar i Penh som återspeglar förändringar i pulmonell resistens hos råttor på ett icke-invasivt sätt och minimerar effekterna av psykologisk stress19,20. Effekten av den yttre miljön på råttor bör minimeras. Råttan ska placeras i testrummet och sedan täckas över testrummet med en plastpåse (med 1 cm x 1 cm hål på dorsalsidan för ventilation) för att minska irritationen som orsakas av den yttre miljön.
Begränsningen av detta experiment är att nålen kan falla av om råttan svänger runt under akupunkturen. Därför måste behövande manipuleras var 5: e minut för att justera djupet. Dessutom är den höga plattformen lämplig för råttor, men inte för mindre djur, till exempel möss.
Sammanfattningsvis ger vi en detaljerad beskrivning av metoden för tillverkning av en hög plattform för att fixa råttor utan begränsning under akupunktur. Den höga plattformen kan helt exponera akupunkterna på baksidan av råttan. Användningen av hög plattform och icke-invasiva luftvägarna funktion mätningar kan underlätta analysen av akupunktur som en behandling för astma. Att studera akupunkturens terapeutiska mekanism på baksidan kan ge nya behandlingar till luftvägssjukdomar som astma och kronisk obstruktiv lungsjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (nr 81922076, 81973951, 81873373), Byggprojekt för samarbetsinnovation i Shanghai (Nr. ZYJKFW201811010, ZYJKFW201701005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mm x 13.0 mm acupuncture needle | China Suzhou Medical Device Factory | ||
| Al(OH)3 | American Thermo | 77161 | |
| Compression nebulizer | Jiangsu Lude Medical Electronics Co., Ltd. | NB-212C | |
| Fine Pointe V2.0 | American Buxco | ||
| Laboratory gas drying unit | American Drierite | 26800 | |
| Methacholine | American Sigma | MKCF6054 | |
| Ovalbumin | American Sigma | A5503-25G | |
| Phosphate Buffer solution (1x) | Gelifesciences | SH30256.01 | |
| Seal box | IRIS Corporation of Japan | ||
| Whole-body plethysmography respiratory function measurement system | American Buxco |
References
- Papi, A., Brightling, C., Pedersen, S. E., Reddel, H. K.
- Global Initiative for Asthma, 2019. Global strategy for asthma management and prevention. , Available from: https://ginasthma.org/gina-reports/ (2019).
- Enilari, O., Sinha, S. The Global Impact of Asthma in Adult Populations. Annals of Global Health. 85 (1), (2019).
- Global Initiative for Asthma, 2020. Global strategy for asthma management and prevention. , Available from: https://ginasthma.org/gina-reports/ (2020).
- Zhuang, Y., Xing, J. J., Li, J., Zeng, B. Y., Liang, F. R.
- Yang, Y. Q., et al. Considerations for use of acupuncture as supplemental therapy for patients with allergic asthma. Clinical Reviews in Allergy & Immunology. 44 (3), 254-261 (2013).
- Nurwati, I., et al. Reduction of interleukin-17 level by acupuncture at Feishu (BL13) is strengthened by acupuncture at Zusanli (ST36) in a mouse model of chronic asthma: An experimental study. Medical Acupuncture. 27 (4), 278-282 (2015).
- Nurwati, I., et al. Improvement in inflammation and airway remodelling after acupuncture at BL13 and ST36 in a mouse model of chronic asthma. Acupuncture in Medicine. 37 (4), 228-236 (2019).
- Reddy, A. T., Lakshmi, S. P., Reddy, R. C. Murine model of allergen induced asthma. Journal of Visualized Experiments. (63), e3771 (2012).
- Zhou, D. D., et al. Metallothionein-2 is associated with the amelioration of asthmatic pulmonary function by acupuncture through protein phosphorylation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 123, 109785 (2020).
- Yin, L. M., et al. Transgelin-2 as a therapeutic target for asthmatic pulmonary resistance. Science Translational Medicine. 10 (427), (2018).
- Shin, Y. S., Takeda, K., Gelfand, E. W. Understanding asthma using animal models. Allergy Asthma & Immunology Research. 1 (1), 10-18 (2009).
- Cui, K. M., et al. Electro-acupuncture relieves chronic visceral hyperalgesia in rats. Neuroscience Letters. 376 (1), 20-23 (2005).
- Tobin, J. R., Martin, L. D., Breslow, M. J., Traystman, R. J. Selective anesthetic inhibition of brain nitric oxide synthase. Anesthesiology. 81 (5), 1264-1269 (1994).
- Dimitrov, N., Sivrev, D., Atanasova, D. Method of rat immobilization during experimental acupuncture. Scripta Scientifica Medica. 45, 105-108 (2013).
- Aguilar, R., et al. emotional reactivity and fear of heights: a factor analytic map from a large F(2) intercross of Roman rat strains. Brain Research Bulletin. 57 (2), 17-26 (2002).
- Lai, X., et al. Proteomic response to acupuncture treatment in spontaneously hypertensive rats. PloS One. 7 (9), 44216 (2012).
- Niu, C., et al. A novel uni-acupoint electroacupuncture stimulation method for pain relief. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2011, 209879 (2011).
- McFadden, E. R., Luparello, T., Lyons, H. A., Bleecker, E. The mechanism of action of suggestion in the induction of acute asthma attacks. Psychosomatic Medicine. 31 (2), 134-143 (1969).
- Savov, J. D., et al. Ozone-induced acute pulmonary injury in inbred mouse strains. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 69-77 (2004).
