Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Точное перечисление фолликула в яичниках взрослых мышей

Published: October 16, 2020 doi: 10.3791/61782
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Development and Stem Cells Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, and Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University

Summary

Здесь мы описываем, сравниваем и противопоставляем два различных метода точного подсчета фолликулов фиксированных тканей яичников мыши.

Abstract

Сексуально размножающиеся самки млекопитающих рождаются с их пожизненным запасом яйцеклеток. Незрелые, тихие яйцеклетки находятся в изначальных фолликулах, единице хранения женской зародышевой линии. Они не являются возобновляемыми, поэтому их число при рождении и последующие темпы потерь в значительной степени диктует женскую плодородную продолжительность жизни. Точная количественная оценка количества изначальных фолликулов у женщин и животных имеет важное значение для определения воздействия лекарственных средств и токсикантов на резерв яичников. Необходимо также оценить необходимость и успех существующих и новых методов сохранения фертильности. В настоящее время не существует методов точного измерения количества изначальных фолликулов, включающих резерв яичников у женщин. Кроме того, получение ткани яичников от крупных животных или исчезающих видов для экспериментов часто не представляется возможным. Таким образом, мыши стали важной моделью для таких исследований, и способность оценивать изначальные числа фолликулов в целых яичниках мыши является критическим инструментом. Тем не менее, сообщения об абсолютных числах фолликулов в яичниках мыши в литературе весьма изменчивы, что затрудняет сравнение и/или репликацию данных. Это связано с рядом факторов, включая напряжение, возраст, группы лечения, а также технические различия в методах подсчета занятых. В этой статье мы предоставляем пошаговое учебное руководство по подготовке гистологических разделов и подсчету изначальных фолликулов в яичниках мыши с использованием двух различных методов: стереологии, которая опирается на метод фракционной/оптической препаратора; и метод прямого подсчета. Некоторые из ключевых преимуществ и недостатков каждого метода будут выделены таким образом, чтобы можно было улучшить воспроизводимость в полевых условиях и дать исследователям возможность выбрать наиболее подходящий метод для своих исследований.

Introduction

Незрелые, меиотически арестованных яйцеклеток, хранящихся в изначальных фолликулов в яичнике являются единицей хранения для женской зародышевой линии и составляют пожизненный резерв яичников человека. Изначальные номера фолликулов снижаются естественным образомс возрастом 1, или же, может быть преждевременно истощены после воздействия экзогенных химических веществ, в том числе некоторые фармацевтические препараты и экологические токсиканты в воздухе, пище и воде2. Учитывая, что изначальное число фолликулов является конечным, количество и качество фолликулов, присутствующих в яичнике в значительной степени определить женскую плодовитости и здоровья потомства. Таким образом, точная количестве изначальных фолликулов у женщин имеет важное значение для оценки внецелевых воздействий экзогенных оскорблений на резерв яичников.

У женщин анализ всего яичника, как правило, не возможно, поэтому неинвазивные суррогатные меры резерва яичников должны быть использованы в клинических условиях. Анти-Mϋllerian гормона (AMH) является наиболее широко используемым суррогатным биомаркером клинически3. Уровни АМГ сыворотки часто измеряются у женщин преклонного материнского возраста или до и после лечения рака, например, химиотерапии. Тем не менее, AMH производится растущими фолликулами, а не изначальными фолликулами, и, таким образом, уровни сыворотки не сообщают об абсолютном количестве изначальных фолликулов.

При отсутствии методов точного определения количества изначальных фолликулов у женщин на месте, подсчет фолликуловяичников в мелких животных моделях, таких как грызуны, остается важным инструментом исследования для оценки степени, с помощью которой экзогенные оскорбления влияют на изначальные фолликулы и, следовательно, плодовитости. К сожалению, хотя, доклады по всей литературе изначальных фолликулов номера в моделях грызунов являются весьмапеременной 4. Одной из основных причин этого являются широко используемые технические различия в методе подсчета голосов. Преимущественно, Есть два различных методов, описанных в литературе для перечисления изначальных фолликулов у мышей. К ним относятся стереология, которая использует метод оптического препаратора фракциотора, и прямые отсчеты фолликулов.

Стереология широко рассматривается золотой стандарт, как он использует систематические равномернойслучайной выборки 5, что делает его наиболее точным методом количественной изначальной числа фолликула в целом мыши, или крысыяичников 4,6,7. Стереология непредвзята, так как она объясняет трехмерную структуру объекта интереса8. Используя метод оптического рассечения/фракционного метода, три уровня выборки применяются для количественной оценки изначальных фолликулов с использованием толстых секций тканей (например, 20 мкм) в пределах известной доли от общего яичника мыши. Во-первых, выбран интервал отбора проб (например, каждый 3-й раздел) при случайном запуске (выборка фракции 1, f1)4. Разделы затем пробы в систематической, равномерной манере с этого момента через весь яичник. Затем, непредвзятый подсчет кадра накладывается на секцию яичников и постепенно перемещается по определенной, рандомизированной сетке подсчета (выборка фракция 2, f2)8. Наконец, известная доля толщины секции оптически пробы (например, 10 мкм) и фолликулы в этой области учитываются (выборка фракции 3, f3)4. Количество необработанных фолликулов умножается на обратные эти фракции выборки для получения конечного значения. Этот метод требует экспертной подготовки и оборудования, в том числе микроскопа с моторизованной стадией, управляемой стереологическим программным обеспечением. Ткани должны быть сохранены в специализированной фиксатор Буин, и встроенные в гликольметакрилат смолы, чтобы для толстых секций ткани, которые будут сокращены с помощью микротома гликольметакрилат смолы со стеклянным ножом. Этот метод предназначен для учета усадки тканей и деформации, чтобы наилучшим образом сохранить трехмерную морфологическую структуру яичников ифолликулов 9.

Прямой подсчет фолликулов является наиболее часто используемым методом подсчета фолликулов10. Можно использовать более распространенные фиксаторы (т.е. формалин), за которыми следует встраивание парафинового воска и исчерпывающее последовательное сечение с использованием стандартного микротома толщиной от 4 до 6 мкм. Фолликулы систематически подсчитываются во всей секции тканей через определенный интервал, а затем умножаются на обратный интервал выборки для получения общей оценки фолликула. Этот метод быстрый, простой, может быть выполнен с использованием архивных тканей, и подготовлен с использованием стандартных гистологических методов. Для этого требуется только световой микроскоп со стандартными возможностями визуализации. Однако, несмотря на эти преимущества, прямой подсчет фолликулов не хватает точности и строгих параметров подсчета стереологии, что делает его более склонным к следователю предвзятости. Кроме того, ткани могут подвергаться усадки и деформации во время обработки, нарушая целостность и морфологию яичников и тем самым делая классификацию фолликулов и количественной оценки трудно.

Цель этой статьи состоит в том, чтобы описать два широко используемых метода количественной оценки числа изначальных фолликулов в яичниках мыши: стереология и прямой подсчет фолликулов. Мы предоставим подробные протоколы для этих двух методов и подчеркем некоторые из их сильных и слабых сторон, с тем чтобы повысить воспроизводимость в нашей области и позволить исследователям принять обоснованное решение о наиболее подходящем методе подсчета для своих исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Яичники были собраны у самок мышей C57BL6J. Все процедуры и эксперименты на животных были проведены в соответствии с Австралийским кодексом практики NHMRC по уходу и использованию животных и одобрены Комитетом по этике животных исследовательской платформы Monash Animal.

ПРИМЕЧАНИЕ: Химиотерапевтического агента показано, истощают изначальные фолликулоциты, как это определено спомощью стереологии 11 и прямых кол-во 12,13 был использован в этом докладе для сравнения двух методов подсчета в том же животном. Самки, 8-недельные (молодые взрослые) мыши взвешивались до одной внутриперитонеальной инъекции 75 мг/кг/массы тела циклофосфамида, или солевого управления транспортным средством (n'5/group). Эта доза, как было показано, вызывают приблизительное 50% истощение изначальных фолликулов, но не сообщается, вызывают заболеваемость или смертность умышей 14. Яичники были собраны через 48 часов после лечения. Один яичник от каждого животного был зафиксирован в 10% (v/v) нейтральном буферном растворе формалина в течение 24 часов, а другой зафиксирован в растворе Буина в течение 24 часов. Ткань затем была встроена либо в гликольметакрилат смолы и последовательно раздели на 20 мкм, или в парафин и последовательно раздели на 5 мкм. Все ткани были окрашены периодической кислотой Шифф и гематоксилин.

1. Гистологическая подготовка: фиксация, обработка, встраивание и разделка яичников мыши

  1. Рассекаете яичники мыши путем обрезки яйцеклетки и всего окружающего жира, не повреждая и не разрезая сам яичник. При необходимости используйте рассечение микроскопа и тонкого лезвия для этого шага(рисунок 1A).
  2. Исправить ткани немедленно, поместив в небольшой помечены трубки, содержащие либо фиксативной Буин (стереология), или формалин фиксатор (прямые подсчеты) в течение 24 часов(рисунок 1B), прежде чем передавать ткани в 70% этанола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фолликул морфология сохраняется лучше всего в фиксированной ткани яичников Буина, встроенные в глицольметакрилат смолы (Рисунок 2).
  3. Процесс целом фиксированных яичников, а затем вставлять в гликольметакрилат смолы длястереологии( Дополнительный файл 1 ), или парафин воск для прямого подсчета с помощью стандартного гистологического протокола.
    ВНИМАНИЕ: Смола является токсичным, поэтому убедитесь, что все шаги обработки тканей выполняются в дым капот и перчатки носят во все времена.
  4. Используйте специализированный микротом из метакрилата смолы(рисунок 1C),оснащенный стекляннымножом (рисунок 1D),чтобы исчерпывающе сократить толстые секции смолы гликольметакрилата (например, 20 мкм). Собирайте секции через регулярный интервал (например, каждый 3-йраздел) на стеклянные слайды микроскопа для стереологии.
  5. Используйте стандартный микротом для разреза тонких секций парафина (например, 4-6 мкм). Регулярно собирайте секции тканей (например, каждый9-й раздел) на слайде стеклянного микроскопа для прямого подсчета фолликулов.
  6. Пятно слайды с периодической кислоты Шифф и гематоксилин( Дополнительный файл 2).
  7. Coverslip со стандартным DPX для парафиновых секций, или толстый DPX для глицольметакрилатных секций смолы(рисунок 1E).
    ВНИМАНИЕ: Гликольметакрилат смолы DPX является опасным, так что выполните этот шаг в дым капот.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гликольметакрилат смолы DPX является чрезвычайно вязким. Стеклянная обложка должна быть твердо прилипает, нажав его вниз с помощью шпателя, чтобы обеспечить DPX равномерно и тонко рассеяны, и Есть нет пузырьков воздуха присутствует под крышкой (Рисунок 1F).

2. Стереологическая оценка числа изначальных фолликулов с помощью оптического фракционер

  1. Включите компьютер, блок мультиуго контроля, камеру и источник света в рамках настройки стереологии и установите цель микроскопа до низкого увеличения (например, 10x).
  2. Откройте программное обеспечение для стереологии.
  3. Поместите первый слайд надежно на сцене микроскопа.
  4. Отрегулируйте экспозицию света, проверяя автоматическое воздействие в панели настроек камеры (Дополнительный рисунок 1A). Кроме того, вручную отрегулируйте воздействие света.
  5. Используйте джойстик, чтобы найти первый образец ткани и привести образец в фокусе.
  6. Отрегулируйте баланс белого, либо нажав на больше настроек (расположен в правом нижнем углу панели настроек камеры), а затем нажмите Белый баланс и нажмите на автоматический (Дополнительный рисунок 1B). Кроме того, нажмите кнопку «Белый баланс», прилегающую к кнопке «Больше настроек» (или выберите область в большемнаборе настроек), чтобы настроить баланс белого цвета вручную, выбрав белую область в разделе.
  7. Перейти к зондам падение вниз меню и нажмите на оптический fractionator рабочий процесс. Затем нажмите Кнопку «Начать новый проект» и нажмите OK.
    1. Если существующая конфигурация выборки сохранена, под параметрами выборки нажмите Да | ... и выберите нужную конфигурацию выборки.
    2. Если нет, нажмите Нет и вручную введите информацию о разделе(Дополнительный рисунок 1C)и определите конфигурацию зонда на этапе 2.13.
  8. Нажмите на Следующий, установите микроскоп для низкого увеличения и выбрать 10x увеличение из меню высадки.
  9. Нажмите на следующий, а затем проследить вокруг всего раздела яичников - начать с левой нажав вокруг раздела и в конце, право нажмите кнопку и выбрать закрыть контур.
  10. Нажмите на Следующий, установить микроскоп для высокого увеличения и выбрать 100x увеличение масла из меню высадки.
  11. Поместите каплю масла на секцию ткани на слайде и переместит цель микроскопа к 100-му увеличению.
  12. Отрегулируйте воздействие света (как в шаге 2.4) и нажмите Далее.
  13. Настройка параметров выборки для определения конфигурации зонда. Здесь счетная рамка была установлена на 47,5 мкм х 47,5 мкм (2256,25мкм 2),а длина шага была установлена на 100 мкм х 100 мкм (10 000мкм 2)( Дополнительныйрисунок 2). После того, как параметры выборки будут установлены, сохраните шаблон и вновь откройте его во время последующих сеансов анализа на этапе 2.7.
  14. Нажмите на начало подсчета (Дополнительный рисунок 1D). Сосредоточьтесь на верхней части выборки, нажмите OK и начните подсчет.
  15. Используйте фокусировку ручки, чтобы двигаться через глубину выборки 10 мкм и подсчитать любые изначальные фолликулы, ядро яйцеклетки которых попадает в фокус. Нажмите далее, чтобы перейти к следующей области.
    1. Классифицировать фолликулы как изначальные, если яйцеклетка окружена плоскоклеточными (уплощенными) гранулозами, но без кубоидных клеток гранулозы(рисунок 2A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные фолликулы отличаются от промежуточных/переходных фолликулов, которые состоят из сочетания кубоидных и плоскоклеточных гранулоз(рисунок 2B),и первичных фолликулов, которые окружены преимущественно кубоидными гранулозными клетками(рисунок 2C). Эти классы фолликулов должны быть количественно определены отдельно.
    2. Только подсчитайте фолликулы, в которых видно ядро яйцеклетки. Ядро яйцеклетки должно появиться в рамке подсчета или касаться зеленых линий включения счетной рамки(Дополнительный рисунок 1E,F).
    3. Если ядро яйцеклетки падает за пределы счетной рамки(дополнительный рисунок 1G)или касается красных линий исключения из графовой рамы, не посчитайте этот фолликул.
    4. При оценке истощения изначального фолликула в ответ на экзогенное химическое вещество (например, химиотерапию), убедитесь, что все подсчитанные фолликулы здоровы и, таким образом, имеют нормальнуюморфологию (рисунок 2). Подсчитайте любые ненормальные или атретические фолликулы отдельно. Часто смерть фолликула вызвана оскорблениями, такими как химиотерапия, и количественная оценка атретических фолликулов должна быть получена отдельно, чтобы различать здоровые и атретические фолликулы, так как только здоровые фолликулы составляют резерв яичников15.
  16. После завершения подсчета на этом разделе, сделать один из следующих:
    1. Нажмите Добавить новый раздел, а затем вернуться к шагу 2.3, чтобы настроить следующий раздел для подсчета голосов.
    2. Нажмите, что я закончил подсчет, чтобы закончить сеанс. Верните цель в 10 раз, выйти из стереологического программного обеспечения и выключить источник света, камеру, блок мульти-управления и компьютер.
  17. Получить сумму сырья фолликула номер (я) из каждой ткани раздел, отобранный из всего яичника, а затем с помощью электронной таблицы, использовать уравнение ниже, чтобы получить окончательное значение от каждого реплицировать животное (N)4.
    Equation 1где:
    N - Общее предполагаемое количество фолликулов в яичнике.
    Сырье из первобытного фолликула кол.
    f1 - Интервал выборки. Каждый3-й раздел был отобран таким образом Equation 2 .
    f2 - Связь между рамкой подсчета (область выборки) и степпером, рассчитанная как Equation 3 . Так как площадь выборки составила 2256мкм 2 (47,5 мкм х 47,5 мкм), а область степпера составила 10000мкм 2 (100 мкм х 100 мкм), Equation 4 .
    f3 - Часть образцов секции яичников. Так как 10 мкм из 20 мкм раздел был отобран, Equation 5 .
    Таким образом, Equation 6 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе описывается, как применять эти принципы стереологического анализа с использованием широко цитируемого стереологического программногообеспечения (Таблица материалов); однако, другое стереологическое программное обеспечение доступно. Принципы, применяемые при стереологическом анализе фолликулов яичников, одинаковы, независимо от программного обеспечения, используемого для настройки параметров. Стереология является наиболее точным, когда 100 или более объектов учитываются во взросломяичнике мыши 4, так как это дает коэффициент погрешности для оценки ниже 10%16. Параметры выборки, изложенные здесь, были оптимизированы для обеспечения того, чтобы как минимум около 100 объектов (т.е. первичных, переходных и первичных фолликулов) можно было засчитать в контроль взрослых яичников дикого типа C57BL6J. Экспериментальное исследование может быть проведено в том числе небольшой размер выборки для установления оптимальных параметров выборки, таких как интервал и количество разделов, которые будут проанализированы и количество оптических рассечений в отобранныхразделах 17.

3. Оценка числа изначальных фолликулов по прямым подсчетам фолликулов яичников

  1. Поместите слайд микроскопа надежно под стандартным световым микроскопом и выполните прямые подсчеты, чтобы получить сырое первобытное число фолликула.
    1. Классифицивные фолликулы как изначальные, если яйцеклетка хорошо видна и окружена плоскоклеточными (уплощенными) гранулоза, но без кубоидных гранулозных клеток(рисунок 2D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные фолликулы отличаются от промежуточных/переходных фолликулов, которые состоят из сочетания кубоидных и плоскоклеточных гранулоз(рисунок 2E),и первичных фолликулов, которые окружены преимущественно кубоидными гранулозными клетками(рисунок 2F). Эти классы фолликулов должны быть количественно определены отдельно.
    2. Убедитесь, что все подсчитанные фолликулы здоровы и, таким образом, имеют нормальную морфологию(рисунок 2). Подсчитайте любые ненормальные или атретические фолликулы отдельно, так как только здоровые фолликулы составляют резерв яичников.
  2. Кроме того, возьмите несколько, или сшитые высокой мощности (например, 20x) фотомикрографы всего раздела ткани яичников для выполнения рассчитывает, открыв файл изображения (ы). Это можно сделать вручную или с помощью автоматизированного сканера слайдов.
  3. Получить сумму сырья фолликула номер (я) из каждой части ткани пробы из всего яичника в заданный интервал. Умножьте это число на обратную часть выборки, чтобы получить окончательное значение для каждого реплицировать животное (N), используя уравнение ниже.
    Equation 7где:
    N - Общее предполагаемое количество фолликулов в яичнике.
    - Количество необработанных фолликулов (каждого отдельного типа, рассчитанного отдельно).
    f1 - Интервал выборки. Каждый9-й раздел был отобран таким Equation 8 образом.
    Таким образом, Equation 9 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Была использована хорошо охарактеризованная модель истощения фолликула, при которой молодым взрослым самшам вводили разовую дозу циклофосфамидной химиотерапии, или солевой контроль транспортного средства (n'5/group), и оба яичника были собраны с каждого животного после 48 часов. Один яичник на животное был подготовлен, как описано в шаге 1 для каждого из двух методов: стереология или прямое количество. Левый и правый яичники от каждого животного случайным образом присваивались каждой группе. Эти данные показывают, что при использовании стереологии, значительное истощение мыши изначальных фолликулов могут быть обнаружены после химиотерапии (387 ± 11 фолликулов), по сравнению с контролем (1043 ± 149; p'0.0024) (Рисунок 3). В отличие от этого, используя контралатеральные яичники от тех же животных, прямые фолликулы не смогли обнаружить значительное сокращение резерва яичников после химиотерапии (490 ± 40), по сравнению с контролем (752 ± 139; стр. 0,1063) (Рисунок 3). Следует отметить, что изначальное число фолликулов у молодых взрослых диких животных типа является переменной, так как распределение солевых обработанных животных шире, по сравнению с группами циклофосфамидов, даже когда подсчеты были выполнены с использованием стереологии (Рисунок 3).

Figure 1
Рисунок 1: Гистологическая подготовка фиксированных, гликольметакрилат смолы встроенных яичников Буина для стереологического анализа. A) Взрослый яичник мыши (круг, стрелка) был близко обрезан всех сала и oviduct от зайца мыши используя лезвие пера. B) Контралатеральные яичники мыши (круг, стрелка) от той же взрослой женщины были рассечены, обрезаны, затем либо зафиксированы в фиксаторе Буина (слева) для стереологии, либо формалин для прямых подсчетов (справа). C) Специализированная смола метакрилат микротома D ), оснащенныйстеклянным ножом (стрелка) был использован для исчерпывающего разреза гликольметакрилата смолы блоков на 20 мкм разделов, собранных на стеклянный микроскоп слайды. E) Периодические кислоты Шифф окрашенных яичников ткани разделы на стеклянный микроскоп слайды (стрелки) были окунуты в свежий гистолен (зеленый контейнер) в дым капот, то стеклянная обложка была добавлена на вершине капель GMA DPX. Шпатель был использован для удаления избыточного DPX и пузырьков воздуха. Слайды были высушены воздухом в дымовой капот на ночь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Классификация изначальных фолликулов. Репрезентативные изображения первичных, переходных и первичных фолликулов в секциях яичников, встроенных вгликольметакрилатсмолы ( A-C) ипарафин-встроенных ( D-F). A: Изначальный фолликул, окруженный плоскоклеточными гранулозами (стрелка). Бар No 10 мкм. B: Переходный фолликул, окруженный как плоскоклеточными (стрелками), так и кубоидными (наконечниками стрел) гранулоза клетками. Бар No 10 мкм. C: Первичный фолликул, окруженный кубоидными (наконечниками стрел) гранулозными клетками. Бар No 25 мкм. D: Изначальный фолликул, окруженный плоскоклеточными гранулозами (стрелка). Бар No 10 мкм. Е: Переходный фолликул, окруженный как плоскоклеточным (стрелка), так и кубоидальными (наконечниками стрел) гранулоза. Бар No 10 мкм. F: Первичный фолликул, окруженный кубоидными (наконечниками стрел) гранулозными клетками. Бар No 25 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Сравнение оптического фракциотеля и методов прямого подсчета для оценки изначальных фолликулов мыши. В качестве модели была использована устоявшаяся модель истощения фолликула, в которой 8-недельные самки мышей C57BL6J лечились интраперитонически солевым раствором, или 75 мг/кг/массой тела, дозой химиотерапии, циклофосфамидом (n'6/group). Это позволило сравнить два метода подсчета фолликулов для обнаружения изменений в резерве яичников. В той же когорте животных, общие оценки фолликула не удалось обнаружить значительное истощение фолликула, в отличие от стереологии, которые обнаружили большее и значительное истощение яичников резерва. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

сильные стороны Слабые стороны
СТЕРЕОЛОГИЯ Наиболее точный способ оценки фолликулов Затраты времени и затраты
Использует несколько параметров выборки, что делает его статистически надежным Требуется экспертное оборудование и программное обеспечение
Высокочувствительный, может обнаружить меньшие изменения в числах изначальных фолликулов Образцы должны быть подготовлены с использованием конкретных, специализированных гистологических методов
Структура фолликула лучше сохраняется при обработке тканей
Единые правила, которые могут применяться различными следователями, тем самым уменьшая предвзятость
ПРЯМЫЕ ПОДСЧЕТЫ Время и рентабельные Менее точный и чувствительный, чем стереология
Требуется стандартное лабораторное оборудование, например легкий микроскоп Используется только один параметр выборки, что делает его менее эффективным при обнаружении небольших изменений в числах фолликулов
Сохранение секций яичников, которые могут быть использованы для иммуногистохимических или других анализов Ткань более восприимчива к изменениям объема и структуры фолликула во время обработки
Нет единого набора правил, которые могут быть применены, таким образом, более склонны к предвзятости со стороны следователя

Таблица 1: Сравнение сильных и слабых сторон методов подсчета фолликулов: стереология и прямые подсчеты.

Дополнительная цифра 1: Скриншоты протокола стереологического программного обеспечения. A) Отрегулируйте экспозицию, тикая Автоматическая (красная коробка) под экспозицией в панели настроек камеры (белая коробка). B) Установите баланс белого, сначала нажав на значок больше настроек под другим в панели настроек камеры. Затем выберите White Balance и нажмите Automatic (красная коробка). C)Если существующая конфигурация выборки не установлена, нажмите Нет (красная коробка) и введите информацию о последовательном разделе (зеленая коробка). D) Чтобы начать подсчет, нажмите нажмите Начало подсчета (белая стрелка). E) Если ядро первобытного фолликула видно в рамке подсчета, этот фолликул считается (белый пунктирный круг). F) Если ядро первобытного фолликула касается зеленых линий включения счетной рамы, этот фолликул также считается (белый пунктирный круг). G)Если ядро изначального фолликула не видно в рамке подсчета или касается красных линий исключения из подсчета кадра, этот фолликул не учитывается (белый пунктирный круг). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Дополнительная цифра 2: Настройка параметров выборки. Следуйте последовательным шагам в левой панели, чтобы определить конфигурацию зонда. A)Мера установлена толщина. Убедитесь, что "Переориентировать на верхней части раздела на каждом сайте сетки" является unticked (красная коробка). Тик 'Manually введите среднюю установленную толщину' (зеленая коробка). Введите среднюю установленную толщину как 20.00 мкм (синий ящик). B) Определите размер подсчета кадров. Под подсчетом frame Display, тик "Форсажить дисплей рамки подсчета, чтобы быть квадратным" и "Центр на живом изображении" (красная коробка). Под подсчетом размера кадра введите 47,5 мкм для X и Y (зеленая коробка). C) Определить макет сетки SRS. Вручную введите размер сетки как 110 для X и Y (красная коробка). D)Определите варианты препаратора. Для верхней высоты зоны охраны введите 1,00 мкм (красный ящик). Для оптической высоты препаратора введите 10 мкм (зеленая коробка). В соответствии с методом фокусировки выберите "Ручной фокус" (синий ящик). E)Сохранить параметры выборки. Чтобы сохранить эти настройки, введите имя и комментарий, а затем нажмите кнопку "Сохранить текущие настройки" (белая стрелка). F) В соответствии с текущими параметрами параметров выборки убедитесь, что ваши настройки соответствуют отображаемым настройкам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Дополнительный файл 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой статье приводится пошаговой протокол для техники золотого стандарта для перечисления мышей изначальных фолликулов, стереологии и более часто используемого метода прямого подсчета фолликулов. Химиотерапия была использована для сравнения и контраста результаты, полученные из этих двух различных методов в левой и правой яичников от одного и того же животного. Оба метода выявили высокую меж животных изменчивость в изначальных числах фолликулов. Значительное истощение резерва яичников было зарегистрировано с использованием стереологии, но прямой подсчет не удалось обнаружить значительное сокращение числа изначальных фолликулов после химиотерапии администрации против контроля.

Примечательно, что даже в инбредных штамм мышей, таких как C57BL6J, резерв яичников у молодых взрослых диких типов (контроль) женщин широко распространен, как и в случае с людьми. Факторы, которые влияют на это и способствуют созданию резерва яичников остаются под следствием18. Высокая изменчивость среди исследований функции яичников мыши создает многочисленные проблемы для области, чтобы сравнить, или воспроизвести данные и для продвижения клинического перевода новых терапевтических средств для защиты ооцитовчисло и качество 4. Эта изменчивость, вероятно, обусловлена рядом факторов, включая не только используемые методы подсчета, но и дополнительные факторы, такие, как различия между штаммом животных и возрастом; а также схемы лечения, такие как доза и сроки. Все эти факторы должны учитываться при сопоставлении данных различных исследований. Несмотря на это, модель истощения фолликулов, использованная в данном исследовании, в целом подчеркивает точный и чувствительный характер стереологического протокола, а также демонстрирует, что широко известный метод прямого подсчета не в состоянии обнаружить известное значительное истощение изначального фолликула.

Есть сильные и сильные стороны каждого метода подсчета подробно описаны в этой статье(таблица 1). Стереология рассматривается как золотой стандартный метод из-за его точности при использовании для определения числа клеток в различных органах5. Однако недостатки этого метода включают в себя время и связанные с этим расходы, а также потребность в специализированном оборудовании и экспертных знаниях. В совокупности это ограничило широкое использование этой процедуры для получения наиболее конфиденциальных данных.

В отличие от этого, метод прямого подсчета быстро, легко, может быть сделано с помощью архивных тканей, и подготовлены с использованием стандартных гистологических методов. Для этого требуется только световой микроскоп со стандартными возможностями визуализации. Однако в нем не учитываются изменения объема, вызванные гистологической обработкой, что может нарушить трехмерную структуру яичника. Следовательно, морфология фолликулов не всегда достаточно сохраняется, что делает идентификацию и точность подсчета сложными, особенно для неопытных исследователей. Хотя формалин был фиксатором, используемым для прямых подсчетов в этом исследовании, Bouin-фиксированные ткани могут быть встроены в парафин, и это может обеспечить лучшую морфологию и помочь исследователям легче определить изначальные фолликулы. Кроме того, в литературе, выборки фракций для метода прямого подсчета сильно различаются, начиная от каждого 3rd на каждые 10й 5 мкм парафинраздел 19, которые могут способствовать большим расхождениям в фолликула рассчитывает между исследованиями. Учитывая, что парафин воск разделы настолько тонкие, считая каждый9-й раздел помогает предотвратить переутомки и ненужного подсчета голосов.

Дополнительные методы, не изложенные в этом руководстве, но обычно сообщается в литературе, подсчитываются только в одном центральном разделе из всего яичника и считая это репрезентативным для всего яичника, или плотность фолликула. Этот первый метод является весьма проблематичным, так как изначальные фолликулы не равномерно распределены в яичнике и могут быть найдены в кластерах. Это означает, что один или даже несколько секций яичника не являются репрезентативными для всего органа, что делает систематический отбор проб важным компонентом любого метода подсчета. Плотность фолликула включает в себя подсчет фолликулов в образце ткани яичников, а затем выразить количество на область ткани. Учитывая ограничения получения первичной ткани человека, плотность фолликула часто используется в качестве суррогатной меры для абсолютного числа фолликулов в яичнике человека, хотя сообщения у мышей также распространены. Однако этот метод количественной оценки не учитывает неравномерное распределение фолликулов по всему яичнику, или колебания объема яичников, которые происходят регулярно на протяжении всего эндокринного (лютеилового) цикла яичников. Это важно, потому что точная мера плотности среди образцов зависит от сохраненной области тканей. Кроме того, этот метод часто только образцы небольшой биопсии или доли яичников при анализе тканей человека, таким образом, не является репрезентативным для всего яичника. Плотность фолликула не хватает точности достижимой со стереологией. Даже используя тот же весь яичник, сравнительные показатели количественной оценки фолликула после стереологического анализа, с плотностью фолликула, не соответствовали в яичникахмыши 20.

Хотя это наиболее часто используемых экспериментальных животных, мышь является лишь одной модели видов. Получение яичников от крупных видов, в том числе домашних животных или не-человеческих приматов, возможно, таким образом, количество фолликулов из целых образцов яичников может быть достигнуто с помощью модифицированногостереологического протокола 21,22. Наконец, в то время как способность анализировать количество фолликулов в целых яичниках человека действительно очень трудно, тем не менее, это тем не менее может быть сделано, когда образцы доступны, используя модифицированныйстереологический протокол 23,24,25.

Будущие направления в этой области могут включать расширение и освоение новых методов. Например, была описана новая методология автоматизированного обнаружения и подсчета изначальных фолликуловяйцеклеток 26. Этот метод использует сколюционные нейронные сети, управляемые помеченными наборами данных, и алгоритм раздвижного окна для выбора тестовых данных. Тем не менее, этот алгоритм был протестирован только на двух яичниках и широкое поглощение еще предстоит определить. Кроме того, последние достижения в оптической очистки тканей и световой микроскопии листа позволили всеобъемлющий анализ нетронутых тканей и некоторые исследования исследовали это для перечисления фолликула вяичнике мыши 27,28.

В заключение, в то время как прямой подсчет фолликулов является простым, быстрым и экономически эффективным методом для перечисления изначальных фолликулов в яичнике, этот метод может не хватать чувствительности, точности и быть склонным к предвзятости следователя. Поэтому, несмотря на свои недостатки, стереология остается наилучшим доступным методом для точного и воспроизводимого определения изначальных чисел фолликулов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа стала возможной благодаря поддержке оперативной инфраструктуры правительства штата Виктория и австралийского правительства NHMRC IRIISS и при поддержке Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям (ALW #1120300) и Австралийского исследовательского совета (KJH #FT190100265). Авторы хотели бы отметить техническую поддержку исследовательской платформы Monash Animal Research Platform, платформы Гистологии Монаша и объекта микровизии Монаш.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Butanol (HPLC) Fisher Chemical #A383-1
Acid alcohol Amber Scientific #ACDL
Bouin’s fixative Sigma-Aldrich #HT10132 Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v)
Cyclophosphamide Sigma-Aldrich #C0768-5G
Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX) Sigma-Aldrich #06522
Ethanol Amber Scientific #ETH Ethanol 100%
Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle Designs for Vision #FEA-745-SR Feather blade for dissections (seen in Figure 1)
Formalin fixative Australian Biostain #ANBFC
Glass coverslip Thermo Scientific #MENCS22501GP 22 mm x 50 mm
Glycomethacrylate resin RM2165 microtome Leica Microsystems #RM2165
Glycolmethacrylate DPX *made in house *Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks
Histolene Trajan #11031
Mayer’s haematoxylin Amber Scientific #MH
Olympus BX50 microscope Olympus #BX50 Brightfield microscope fitted with 10x dry & 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3)
Olympus immersion oil type-F Olympus #IMMOIL-F30CC
Olympus TH4-200 light source Olympus #TH4-200
Paraffin wax Sigma-Aldrich #03987
Periodic acid Trajan #PERI1% Periodic acid 1%
Rotary Microtome CUT 4060 MicroTec #4060R/F Used to cut paraffin sections
Schiff’s reagent Trajan #SCHF
Scott's tap water Amber Scientific #SCOT Potassium carbonate, magnesium sulphate, water
StereoInvestigator Stereological System MBF Bioscience Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick
Superfrost microscope slides Thermo Scientific #MENSF41296SP 1 mm, 72 pcs
Technovit 7100 Plastic embedding system Emgrid Australia #64709003 500 mL/5 x 1 g/40 mL
Technovit 3040 yellow Emgrid Australia #64708805 100 g/80 mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stringer, J. M., Winship, A., Liew, S. H., Hutt, K. The capacity of oocytes for DNA repair. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2777-2792 (2018).
  2. Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing. Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).
  3. Broer, S. L., Broekmans, F. J., Laven, J. S., Fauser, B. C. Anti-Mullerian hormone: ovarian reserve testing and its potential clinical implications. Human Reproduction Update. 20 (5), 688-701 (2014).
  4. Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
  5. Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. Design-based stereology: introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number. Toxicologic Pathology. 38 (7), 1011-1025 (2010).
  6. Ristic, N., et al. Maternal dexamethasone treatment reduces ovarian follicle number in neonatal rat offspring. Journal of Microscopy. 232 (3), 549-557 (2008).
  7. Soleimani Mehranjani, M., Mansoori, T. Stereological study on the effect of vitamin C in preventing the adverse effects of bisphenol A on rat ovary. International Journal of Reproductive Biomedicine (Yazd). 14 (6), 403-410 (2016).
  8. Brown, D. L. Bias in image analysis and its solution: unbiased stereology. Journal of Toxicologic Pathology. 30 (3), 183-191 (2017).
  9. Hasselholt, S., Lykkesfeldt, J., Overgaard Larsen, J. Thick methacrylate sections devoid of lost caps simplify stereological quantifications based on the optical fractionator design. Anatomical Record (Hoboken). 298 (12), 2141-2150 (2015).
  10. Tilly, J. L. Ovarian follicle counts--not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
  11. Nguyen, Q. N., et al. Loss of PUMA protects the ovarian reserve during DNA-damaging chemotherapy and preserves fertility. Cell Death and Disease. 9 (6), 618 (2018).
  12. Meirow, D., Assad, G., Dor, J., Rabinovici, J. The GnRH antagonist cetrorelix reduces cyclophosphamide-induced ovarian follicular destruction in mice. Human Reproduction. 19 (6), 1294-1299 (2004).
  13. Winship, A. L., et al. The PARP inhibitor, olaparib, depletes the ovarian reserve in mice: implications for fertility preservation. Human Reproduction. , (2020).
  14. Meirow, D., Lewis, H., Nugent, D., Epstein, M. Subclinical depletion of primordial follicular reserve in mice treated with cyclophosphamide: clinical importance and proposed accurate investigative tool. Human Reproduction. 14 (7), 1903-1907 (1999).
  15. Nguyen, Q. N., et al. Cisplatin- and cyclophosphamide-induced primordial follicle depletion is caused by direct damage to oocytes. Molecular Human Reproduction. , (2019).
  16. Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. Journal of Microscopy. 147, Pt 3 229-263 (1987).
  17. Olesen, M. V., Needham, E. K., Pakkenberg, B. The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy. Journal of Visualized Experiments. (125), e55737 (2017).
  18. Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. How Is the Number of Primordial Follicles in the Ovarian Reserve Established. Biology of Reproduction. 93 (5), 111 (2015).
  19. Omari, S., et al. Mcl-1 is a key regulator of the ovarian reserve. Cell Death and Disease. 6, 1755 (2015).
  20. Winship, A. L., Bakai, M., Sarma, U., Liew, S. H., Hutt, K. J. Dacarbazine depletes the ovarian reserve in mice and depletion is enhanced with age. Scientific Reports. 8 (1), 6516 (2018).
  21. Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. An accurate, simple method for unbiased determination of primordial follicle number in the primate ovary. Biology of Reproduction. 56 (4), 909-915 (1997).
  22. Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. Morphometric analysis of primordial follicle number in pigtailed monkey ovaries: symmetry and relationship with age. Biology of Reproduction. 61 (2), 553-556 (1999).
  23. Charleston, J. S., et al. Estimating human ovarian non-growing follicle number: the application of modern stereology techniques to an old problem. Human Reproduction. 22 (8), 2103-2110 (2007).
  24. Hansen, K. R., Craig, L. B., Zavy, M. T., Klein, N. A., Soules, M. R. Ovarian primordial and nongrowing follicle counts according to the Stages of Reproductive Aging Workshop (STRAW) staging system. Menopause. 19 (2), 164-171 (2012).
  25. Hansen, K. R., et al. A new model of reproductive aging: the decline in ovarian non-growing follicle number from birth to menopause. Human Reproduction. 23 (3), 699-708 (2008).
  26. Sonigo, C., et al. High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach. Scientific Reports. 8 (1), 13499 (2018).
  27. McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovarydagger. Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).
  28. Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).

Tags

Биология развития Выпуск 164 Яичник яйцеклетка плодовитости изначальный фолликул стереология оценки фолликулов прямые подсчеты
Точное перечисление фолликула в яичниках взрослых мышей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Winship, A. L., Sarma, U. C., Alesi, … More

Winship, A. L., Sarma, U. C., Alesi, L. R., Hutt, K. J. Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries. J. Vis. Exp. (164), e61782, doi:10.3791/61782 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter