Summary
Her beskriver, sammenligner og kontrasterer vi to forskjellige teknikker for nøyaktig follikkeltelling av fast musovarisk vev.
Abstract
Seksuelt reproduserende kvinnelige pattedyr er født med hele livet tilførsel av oocytter. Umodne, quiescent oocytter finnes i primordiale follikler, lagringsenheten til den kvinnelige bakterien. De er ikke-fornybare, og dermed deres antall ved fødselen og påfølgende tapsrate dikterer i stor grad den kvinnelige fruktbare levetiden. Nøyaktig kvantifisering av opprinnelige follikkeltall hos kvinner og dyr er avgjørende for å bestemme virkningen av medisiner og toksiske stoffer på eggstokkreservatet. Det er også nødvendig for å evaluere behovet for, og suksess av, eksisterende og fremvoksende fruktbarhet bevaring teknikker. For tiden finnes det ingen metoder for å nøyaktig måle antall primordiale follikler som består av eggstokkreservatet hos kvinner. Videre er det ofte ikke mulig å skaffe eggstokkvev fra store dyr eller truede arter for eksperimentering. Dermed har mus blitt en viktig modell for slike studier, og evnen til å evaluere opprinnelige follikkeltall i hele museovaries er et kritisk verktøy. Rapporter om absolutte follikkeltall i museovaries i litteraturen er imidlertid svært variable, noe som gjør det vanskelig å sammenligne og / eller replikere data. Dette skyldes en rekke faktorer, inkludert belastning, alder, behandlingsgrupper, samt tekniske forskjeller i metodene for telling ansatt. I denne artikkelen gir vi en trinnvis instruksjonsveiledning for å forberede histologiske seksjoner og telle primordiale follikler i museovaries ved hjelp av to forskjellige metoder: [1] stereologi, som er avhengig av fraksjonator / optisk dissektorteknikk; og [2] den direkte telleteknikken. Noen av de viktigste fordelene og ulempene ved hver metode vil bli fremhevet slik at reproduserbarhet kan forbedres på feltet og for å gjøre det mulig for forskere å velge den mest hensiktsmessige metoden for studiene.
Introduction
De umodne, meiotisk arresterte oocyttene som er lagret i primordiale follikler i eggstokken, er lagringsenheten for den kvinnelige bakterien og utgjør en persons livstids eggstokkreservat. Primordial follikkel tall avtar naturlig med alder1, eller alternativt, kan være for tidlig utarmet etter eksponering for eksogene kjemikalier, inkludert noen legemidler og miljøgifter i luft, mat og vann2. Gitt at det opprinnelige follikkelnummeret er begrenset, bestemmer mengden og kvaliteten på follikler som er tilstede i eggstokken i stor grad kvinnelig fruktbarhet og avkom helse. Dermed er nøyaktig kvantifisering av primordial follikkeltall hos kvinner avgjørende for å evaluere off-target virkningene av eksogene fornærmelser på eggstokkreservatet.
Hos kvinner er analyse av hele eggstokken generelt ikke mulig, og dermed må ikke-invasive surrogatmål av eggstokkreservatet brukes i en klinisk setting. Anti-Mϋllerian hormon (AMH) er den mest brukte surrogat biomarkør klinisk3. Serum AMH nivåer måles ofte hos kvinner i avansert mors alder, eller før og etter kreft behandling, for eksempel kjemoterapi. AMH produseres imidlertid av voksende follikler og ikke av primordiale follikler, og dermed informerer serumnivåer ikke om absolutt primordial follikkelnummer.
Med fravær av metoder for å nøyaktig bestemme primordial follikkel nummer hos kvinner in situ, teller ovarie follikler i små dyremodeller, som gnagere, er fortsatt et viktig forskningsverktøy for å vurdere i hvilken grad eksogene fornærmelser påvirker primordiale follikler og dermed fruktbarhet. Dessverre er rapporter gjennom hele litteraturen av primordiale follikkeltall i gnagermodeller svært variable4. En viktig årsak til dette er mye rapporterte tekniske forskjeller i tellemetoden som benyttes. Overveiende er det to forskjellige teknikker beskrevet i litteraturen for opplisting av primordiale follikler hos mus. Disse inkluderer stereologi, som benytter fraksjonator optisk dissektormetode, og direkte follikkel teller.
Stereologi er allment ansett gullstandarden som den bruker systematisk ensartet tilfeldig prøvetaking5, noe som gjør den til den mest nøyaktige metoden for å kvantifisere primordial follikkel nummer i hel mus, eller rotte eggstokkene4,6,7. Stereologi er objektiv, da den står for den tredimensjonale strukturen til objektet av interesse8. Ved hjelp av en optisk dissektor/fraksjonatormetode påføres tre nivåer av prøvetaking for å kvantifisere primordiale follikler ved hjelp av tykke vevsseksjoner (f.eks. 20 μm) innenfor en kjent brøkdel av den totale museovalogen. For det første velges prøvetakingsintervallet (f.eks. hver3. seksjon) ved en tilfeldig start (prøvetakingsfraksjon 1, f1)4. Seksjoner prøves deretter på en systematisk, ensartet måte fra dette punktet gjennom hele eggstokken. Deretter legges en objektiv telleramme over eggstokkdelen og flyttes gradvis langs et definert, randomisert tellerutenett (prøvetakingsbrøk 2, f2)8. Til slutt blir en kjent brøkdel av seksjonstykkelsen optisk samplet (f.eks. 10 μm) og follikler innenfor dette området telles (prøvetakingsfraksjon 3, f3)4. Råfosikknummeret multipliseres med det motsatte av disse prøvetakingsfraksjonene for å oppnå den endelige verdien. Denne metoden krever ekspertopplæring og utstyr, inkludert et mikroskop med et motorisert stadium drevet av stereologisk programvare. Vev bør bevares i en spesialisert Bouins fixative, og innebygd i glykolmethacrylate harpiks for å tillate tykke vevsseksjoner å bli kuttet ved hjelp av en glykolmethacrylate harpiksmikrotom med en glasskniv. Denne metoden er designet for å ta hensyn til vevskrymping og deformasjon, for best å bevare den tredimensjonale morfologiske strukturen til eggstokken og folliklene9.
Direkte follikkeltelling er den mest brukte metoden for å telle follikler10. Mer vanlige fikseringer (dvs. formalin) kan brukes, etterfulgt av parafinvoksinnbygging og uttømmende seriell seksjonering ved hjelp av en standard mikrotom med en tykkelse på mellom 4-6 μm. Follikler telles systematisk i hele vevsdelen med et definert intervall, og multipliseres deretter med det motsatte av prøvetakingsintervallet for å oppnå det totale follikkelestimatet. Denne metoden er rask, enkel, kan utføres ved hjelp av arkivert vev, og fremstilles ved hjelp av standard histologiske teknikker. Det krever bare et lett mikroskop med standard bildebehandlingsfunksjoner. Til tross for disse fordelene mangler imidlertid direkte follikkeltelling nøyaktigheten og strenge telleparametere for stereologi, noe som gjør den mer utsatt for undersøkerbias. I tillegg kan vev gjennomgå krymping og deformasjon under behandling, forstyrre integriteten og morfologien til eggstokken og dermed gjøre follikkelklassifisering og kvantifisering vanskelig.
Målet med denne artikkelen er å beskrive to ofte brukte metoder for kvantitativt å vurdere primordial follikkelnummer i museovaries: stereologi og direkte follikkeltelling. Vi vil gi detaljerte protokoller for disse to metodene og fremheve noen av deres styrker og svakheter, for å forbedre reproduserbarheten på vårt felt og la forskere ta en informert beslutning om den mest hensiktsmessige tellemetoden for studiene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eggstokkene ble samlet inn fra kvinnelige C57BL6J-mus. Alle dyreprosedyrer og eksperimenter ble utført i samsvar med NHMRC Australian Code of Practice for Care and Use of Animals og godkjent av Monash Animal Research Platform Animal Ethics Committee.
MERK: Et kjemoterapimiddel vist å tømme primordiale follikkel oocytter, som bestemt ved hjelp av stereologi11 og direkte teller12,13 ble brukt i denne rapporten for å sammenligne de to tellemetodene i samme dyr. Kvinnelige, 8 uker gamle (unge voksne) mus ble veid før en enkelt intraperitoneal injeksjon på 75 mg/kg/kroppsvekt av cyklofosfamid, eller saltvannsbilkontroll (n = 5 / gruppe). Denne dosen har vist seg å forårsake omtrent 50% uttømming av primordiale follikler, men ikke rapportert å forårsake sykelighet eller dødelighet hos mus14. Eggstokkene ble høstet 48 timer etter behandling. En eggstokk fra hvert dyr ble løst i 10% (v / v) nøytral bufret formalinløsning i 24 timer, og den andre festet i Bouins løsning i 24 timer. Vev ble deretter innebygd i enten glykolmethacrylate harpiks og serielt seksjonert på 20 μm, eller i parafin og serielt seksjonert på 5 μm. Alle vev ble farget med periodisk syre Schiff og hematoksylin.
1. Histologisk forberedelse: fiksering, bearbeiding, innebygging og seksjonering av museovaries
- Disseker museovaries ved å trimme ovidukten og alt omkringliggende fett, uten å skade eller kutte eggstokken selv. Bruk om nødvendig et dissekeringsmikroskop og et fint blad til dette trinnet (Figur 1A).
- Fest vev umiddelbart ved å plassere i et lite merket rør som inneholder enten Bouins fixative (stereology), eller formalin fixative (direkte tellinger) i 24 timer (Figur 1B), før du overfører vev til 70% etanol.
MERK: Follikkelmorfologien er best bevart i Bouins faste eggstokkvev, innebygd i glykolmetakrylatharpiks (figur 2). - Behandle hele faste eggstokkene og legg deretter inn i glykolmethacrylateharpiks for stereologi (Supplementary File 1), eller parafinvoks for direkte tellinger ved hjelp av en standard histologisk protokoll.
FORSIKTIG: Harpiks er giftig, så sørg for at alle vevsbehandlingstrinn utføres i en avtrekkshette og hansker brukes til enhver tid. - Bruk en spesialisert harpiksmetakrylatmikrotomi (figur 1C) utstyrt med en glasskniv (figur 1D) for å kutte tykke glykolmettakrylatharpiksseksjoner (f.eks. 20 μm). Samle seksjonene med jevne mellomrom (f.eks. hver3. seksjon) på glassmikroskopsklier for stereologi.
- Bruk en standard mikrotom til å kutte tynne parafinseksjoner (f.eks. 4-6 μm). Samle vevsseksjoner med jevne mellomrom (f.eks. hver9. seksjon) på et glassmikroskopsklie for direkte follikkeltellinger.
- Flekk lysbildene med periodisk syre Schiff og hematoksylin (Supplementary File 2).
- Deksler med standard DPX for parafinseksjoner, eller tykk DPX for glykolmethacrylatharpiksseksjoner (figur 1E).
FORSIKTIG: Glykolmethacrylate harpiks DPX er farlig, så utfør dette trinnet for å avtrekke hetten.
MERK: Glykolmethacrylate harpiks DPX er ekstremt viskøs. Glassdekslene må festes godt ved å trykke den ned med en slikkepott for å sikre at DPXen er jevnt og tynt dispergert, og det er ingen luftbobler til stede under dekslene (Figur 1F).
2. Stereologisk estimering av primordial follikkelnummer ved hjelp av den optiske fraksjonatoren
- Slå på datamaskinen, multikontrollenheten, kameraet og lyskilden i stereologioppsettet og sett mikroskopmålet til en lav forstørrelse (f.eks. 10x).
- Åpne stereologiprogramvaren.
- Sett det første lysbildet sikkert på mikroskopstadiet.
- Juster lyseksponeringen ved å kontrollere Automatisk under Eksponering i kamerainnstillingspanelet (Tilleggsfigur 1A). Du kan også justere lyseksponeringen manuelt.
- Bruk styrespaken til å finne den første vevsprøven og sette prøven i fokus.
- Juster hvitbalansen, enten ved å klikke flere innstillinger (nederst til høyre i Kamerainnstillinger-panelet), og klikk deretter Hvitbalanse og klikk på Automatisk (Tilleggsfigur 1B). Du kan også klikke Hvitbalanse -knappen ved siden av Flere innstillinger -knappen (eller Velg område i Flere innstillinger) for å angi hvitbalansen manuelt ved å velge et hvitt område i delen.
- Gå til rullegardinmenyen Probes og klikk på Arbeidsflyt for optisk brøkator. Klikk deretter Start nytt prosjekt, og klikk OK.
- Hvis en eksisterende prøvekonfigurasjon er lagret, klikker du Ja under Prøveparametere | ... og velg ønsket prøvetakingskonfigurasjon.
- Hvis ikke, klikker du Nei og angir informasjonen om den serielle delen manuelt (Tilleggsfigur 1C) og definerer sondekonfigurasjonen i trinn 2.13.
- Klikk Neste, sett mikroskopet til Lav forstørrelse og velg 10x forstørrelse fra rullegardinmenyen.
- Klikk Neste, og spor deretter rundt hele eggstokkdelen – begynn med å venstreklikke rundt delen, og på slutten høyreklikker du og velger Lukk kontur.
- Klikk Neste, sett mikroskopet til Høy forstørrelse og velg 100x oljeforstørrelse fra rullegardinmenyen.
- Legg en dråpe olje på vevsdelen på lysbildet og flytt mikroskopmålet til 100x forstørrelse.
- Juster lyseksponeringen (som i trinn 2.4), og klikk Neste.
- Definer prøvetakingsparameterne for å definere sondekonfigurasjonen. Her ble tellerammen satt til 47,5 μm x 47,5 μm (2 256,25 μm2) og trinnlengden ble satt til 100 μm x 100 μm (10 000 μm2) (Tilleggs figur 2). Når prøveparameterne er opprettet, lagrer du malen og åpner den på nytt under påfølgende analyseøkter i trinn 2.7.
- Klikk på Starttelling (Tilleggstall 1D). Fokuser til toppen av eksemplet, klikk OK og begynn å telle.
- Bruk fokuseringsknappen til å bevege deg gjennom prøvetakingsdybden på 10 μm og telle eventuelle primordiale follikler hvis oocyttkjerne kommer i fokus. Klikk Neste for å gå til neste område.
- Klikuler follikler som en primordial hvis oocytten er omgitt av squamous (flatede) granulosa celler, men ingen cuboidal granulosa celler (Figur 2A).
MERK: Primordial follikler er forskjellige fra mellomliggende / overgangssekkene, som består av en kombinasjon av cuboidal og squamous granulosa celler (Figur 2B), og primære follikler, som hovedsakelig er omgitt av cuboidal granulosa celler (Figur 2C). Disse follikkelklassene bør kvantifiseres separat. - Bare telle follikler der oocyttkjernen er synlig. Oocyttkjernen må vises innenfor tellerammen eller berøre de grønne inkluderingslinjene i tellerammen (Tilleggsfigur 1E,F).
- Hvis oocyttkjernen faller utenfor tellerammen (Tilleggsfigur 1G) eller berører de røde eksklusjonslinjene i tellerammen, må du ikke telle denne follikkelen.
- Ved vurdering av primordial follikkelnedbrytning som svar på et eksogent kjemikalie (f.eks. kjemoterapi), må du sørge for at alle follikler som telles er sunne og dermed har normal morfologi (figur 2). Tell eventuelle unormale eller atretiske follikler separat. Ofte er follikkeldød indusert av fornærmelser som kjemoterapi, og kvantifisering av atretiske follikler bør oppnås separat for å skille mellom sunne og atretiske follikler, da bare sunne follikler utgjør eggstokkreservatet15.
- Klikuler follikler som en primordial hvis oocytten er omgitt av squamous (flatede) granulosa celler, men ingen cuboidal granulosa celler (Figur 2A).
- Når tellingen er fullført på den delen, gjør du ett av følgende:
- Klikk Legg til ny inndeling, og gå deretter tilbake til trinn 2.3 for å konfigurere neste del for opptelling.
- Klikk Jeg er ferdig med å telle for å avslutte økten. Returner målet til 10x, avslutt stereology-programvaren og slå av lyskilden, kameraet, multikontrollenheten og datamaskinen.
- Få summen rå follikkel nummer (Q) fra hver vevsseksjon samplet fra hele eggstokken, og bruk deretter ligningen nedenfor for å få den endelige verdien fra hvert replikere dyr (N)4.
hvor:
N = Totalt estimert antall follikler i eggstokken.
Q = Rå primordial follikkelantall.
f1 = Prøveintervall. Hver 3rd seksjon ble samplet slik
.
f2 = Forholdet mellom tellerammen (prøveområdet) og stepperen, beregnet som
. Siden prøveområdet var 2256 μm2 (47,5 μm x 47,5 μm) og stepperområdet var 10000 μm2 (100 μm x 100 μm), 
.
f3 = Brøkdel av ovarian seksjon samplet. Siden 10 μm av 20 μm delen ble samplet,
.
Derfor
, .
MERK: Denne protokollen beskriver hvordan du bruker disse prinsippene for stereologiske analyser ved hjelp av en mye sitert stereologiprogramvare (Tabell over materialer); Imidlertid er annen stereologisk programvare tilgjengelig. Prinsippene som brukes under stereologiske analyser av eggstokksekkene er de samme, uavhengig av programvaren som brukes til å sette opp parametrene. Stereologi er mest nøyaktig når 100 eller flere objekter telles i en voksen mus eggstokk4, da dette gir en feilkoeffisient for estimatet under 10%16. Prøvetakingsparametrene som er skissert her, er optimalisert for å sikre at minst 100 objekter (dvs. primordiale, overgangs- og primærsekkene) kan telles i kontroll voksen villtype C57BL6J eggstokkene. En pilotstudie kan gjennomføres med en liten prøvestørrelse for å etablere de optimale prøvetakingsparametrene, for eksempel intervall og antall seksjoner som skal analyseres og antall optiske dissektorer innenfor de samplede seksjonene17.
hvor:
.
. Siden prøveområdet var 2256 μm2 (47,5 μm x 47,5 μm) og stepperområdet var 10000 μm2 (100 μm x 100 μm), 
.
.
, .3. Estimering av primordial follikkelnummer ved direkte ovarial follikkeltall
- Plasser mikroskopet sikkert under et standard lysmikroskop og utfør direkte tellinger for å oppnå rå primordial follikkelnummer.
- Klikuler follikler som en primordial hvis oocytten er tydelig synlig og er omgitt av squamous (flatede) granulosaceller, men ingen cuboidal granulosa celler (Figur 2D).
MERK: Primordial follikler skiller seg fra mellomliggende/ overgangssekkene, som består av en kombinasjon av cuboidale og squamous granulosa celler (Figur 2E), og primære follikler, som hovedsakelig er omgitt av cuboidal granulosa celler (Figur 2F). Disse follikkelklassene bør kvantifiseres separat. - Sørg for at alle follikler som telles er sunne og dermed har normal morfologi (figur 2). Tell eventuelle unormale eller atretiske follikler separat, da bare sunne follikler utgjør eggstokkreservatet.
- Klikuler follikler som en primordial hvis oocytten er tydelig synlig og er omgitt av squamous (flatede) granulosaceller, men ingen cuboidal granulosa celler (Figur 2D).
- Alternativt kan du ta flere eller sydde høyeffekts (f.eks. 20x) fotomikrografer av hele eggstokkvevsdelen for å utføre tellinger ved å åpne bildefilen(e). Dette kan gjøres manuelt, eller ved hjelp av en automatisk lysbildeskanner.
- Få summen rå follikkel nummer (Q) fra hver vevsseksjon samplet fra hele eggstokken ved forhåndsbestemt intervall. Multipliser dette tallet med den inverse av prøvetakingsfraksjonen for å oppnå den endelige verdien for hvert replikeringsdyr (N), ved hjelp av ligningen nedenfor.
hvor:
N = Totalt estimert antall follikler i eggstokken.
Q = Rå follikkelantall (av hver enkelt type, beregnet separat).
f1 = Prøveintervall. Hver9. seksjon ble samplet slik
.
Derfor
, .
hvor:
.
, .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En godt karakterisert modell av follikkeluttømming ble brukt, hvorved unge voksne kvinnelige mus ble administrert en enkelt dose cyklofosfamid kjemoterapi, eller saltvannsbilkontroll (n = 5 / gruppe) og begge eggstokkene ble høstet fra hvert dyr etter 48 timer. En eggstokk per dyr ble utarbeidet som beskrevet i trinn 1 for hver av de to metodene: stereologi eller direkte teller. Venstre og høyre eggstokk fra hvert dyr ble tilfeldig tildelt hver gruppe. Disse dataene viser at ved bruk av stereologi kan en betydelig uttømming av mus primordial follikler oppdages etter kjemoterapibehandling (387 ± 11 follikler), versus kontroll (1043 ± 149; p = 0,0024) (figur 3). Derimot, ved hjelp av de kontralaterale eggstokkene fra de samme dyrene, klarte ikke direkte follikkeltall å oppdage en betydelig reduksjon av eggstokkreservatet etter kjemoterapi (490 ± 40), sammenlignet med kontroll (752 ± 139; p = 0,1063) (Figur 3). Vær oppmerksom på at primordial follikkelnummer hos unge voksne villtype dyr er variabelt, siden fordelingen av saltvannsbehandlede dyr er bredere, sammenlignet med cyklofosfamidgruppene, selv når tellinger ble utført ved hjelp av stereologi (figur 3).
Figur 1: Histologisk fremstilling av Bouins faste, glykolmethacrylateharpiksin innebygde eggstokkene for stereologisk analyse. A) En voksen mus eggstokk (sirkel, pil) ble nært trimmet av alt fett og ovidukten fra musen eggstokk ved hjelp av et fjærblad. B) Kontralaterale museovaries (sirkel, pil) fra samme kvinnelige voksen ble dissekert, trimmet, deretter enten festet i Bouins fixative (venstre) for stereologi, eller formalin for direkte tellinger (høyre). C) En spesialisert harpiksmetakrylatmikrotom D) utstyrt med en glasskniv (pil) ble brukt til å uttømmende kutte glykolmetlakrylatharpiksblokker i 20 μm seksjoner, samlet på glassmikroskop lysbilder. E) Periodisk syre Schiff-farget eggstokkvev seksjoner på glassmikroskop lysbilder (piler) ble dyppet i fersk histolen (grønn beholder) i en avtrekk hette, deretter en glass coverlip ble lagt på toppen av dråper av GMA DPX. En spatel ble brukt til å fjerne overflødig DPX og luftbobler. Sklier ble lufttørket i avtrekkshetten over natten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Primordial follikkelklassifisering. Representative bilder av primordiale, overgangs- og primærsekkene i glykolmethacrylate harpiks-innebygd (A-C) og parafin-innebygd (D-F) eggstokk seksjoner. A: Primordial follikkel omgitt av squamous granulosa celler (pil). Bar = 10 μm. B: Overgangssekk omgitt av både squamous (pil) og cuboidal (pilspiss) granulosa celler. Bar = 10 μm. C: Primær follikkel omgitt av cuboidal (pilspiss) granulosa celler. Bar = 25 μm. D: Primordial follicle omgitt av squamous granulosa celler (pil). Bar = 10 μm. E: Overgangssekk omgitt av både squamous (pil) og cuboidal (pilspiss) granulosa celler. Bar = 10 μm. F: Primær follikkel omgitt av cuboidal (pilspiss) granulosa celler. Bar = 25 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Sammenligning av den optiske fraksjonatoren og direkte tellemetoder for å evaluere musprimordiale follikler. En veletablert modell av follikkelnedbrytning ble brukt som modell, hvor 8 uker gamle kvinnelige C57BL6J-mus ble behandlet intraperitonealt med saltvann, eller en 75 mg / kg / kroppsvektdose av kjemoterapeutisk, cyklofosfamid (n = 6 / gruppe). Dette gjorde det mulig å sammenligne de to follikkeltellingsmetodene for å oppdage endringer i eggstokkreservatet. I samme kohort av dyr klarte ikke totale follikkelestimater å oppdage betydelig follikkeluttømming, i motsetning til stereologi som oppdaget en større og betydelig uttømming av eggstokkreservatet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Styrker | Svakheter | |
| STEREOLOGI | Mest nøyaktige måte å estimere follikler på | Tidkrevende og kostbart |
| Bruker flere utvalgsparametere, noe som gjør den statistisk robust | Krever ekspertutstyr og programvare | |
| Svært følsom, kan oppdage mindre endringer i opprinnelige follikkeltall | Prøver må utarbeides ved hjelp av spesifikke, spesialiserte histologiske teknikker | |
| Follikkelstruktur er bedre bevart under vevsbehandling | ||
| Enhetlige regler som kan brukes av forskjellige etterforskere, og dermed redusere skjevheter | ||
| DIREKTE ANTALL | Tids- og kostnadseffektivitet | Mindre nøyaktig og sensitiv enn stereologi |
| Krever standard laboratorieutstyr, f.eks. | Bare én prøveparameter som brukes, noe som gjør den mindre effektiv til å oppdage små endringer i follikkeltall | |
| Oppbevaring av eggstokkseksjoner som kan brukes til immunhiistokjemiske eller andre analyser | Vev er mer utsatt for endringer i volum og follikkelstruktur under behandling | |
| Ingen ensartede regler som kan brukes, og dermed mer utsatt for skjevheter fra undersøkeren |
Tabell 1: Sammenligning av styrker og svakheter ved follikkeltellingsmetoder: stereologi vs. direkte tellinger.
Supplerende figur 1: Skjermbilder av stereology-programvareprotokollen. A) Juster eksponeringen ved å merke av for Automatisk (rød boks) under Eksponering i Kamerainnstillinger-panelet (hvit boks). B) Angi hvitbalansen ved først å klikke ikonet Flere innstillinger under Annet i Kamerainnstillinger-panelet. Deretter velger du Hvitbalanse og klikker Automatisk (rød boks). C) Hvis en eksisterende prøvekonfigurasjon ikke er angitt, klikker du Nei (rød boks) og skriver inn informasjonen om den serielle delen (grønn boks). D) Hvis du vil begynne opptellingen, klikker du Start opptelling (hvit pil). E) Hvis kjernen i en primordial follikkel er synlig innenfor tellerammen, telles denne follikkelen (hvit prikket sirkel). F) Hvis kjernen i en primordial follikkel berører de grønne inkluderingslinjene i tellerammen, telles også denne follikkelen (hvit prikket sirkel). G) Hvis kjernen i en primordial follikkel ikke er synlig innenfor tellerammen eller berører de røde eksklusjonslinjene i tellerammen, telles ikke denne follikkelen (hvit prikket sirkel). Klikk her for å laste ned denne figuren.
Supplerende figur 2: Definere prøveparameterne. Følg sekvensielle trinn i panelet til venstre for å definere probekonfigurasjonen. A) Mål montert tykkelse. Kontroller at "Fokuser på nytt til toppen av delen på hvert rutenettområde" ikke er merket (rød boks). Merk av for 'Skriv inn gjennomsnittlig montert tykkelse manuelt' (grønn boks). Angi gjennomsnittlig montert tykkelse som 20,00 μm (blå boks). B) Definer opptellingsrammestørrelsen. Under Tellerammevisning merker du av for «Tving tellerammevisningen til å være firkantet» og «Midt på levende bilde» (rød boks). Under Tellerammestørrelse skriver du inn 47,5 μm for X og Y (grønn boks). C) Definer SRS-rutenettoppsett. Angi rutenettstørrelsen manuelt som 110 for X og Y (rød boks). D) Definer dissektoralternativer. For høyde på øverste vernesone angir du 1,00 μm (rød boks). For optisk dissektorhøyde skriver du inn 10 μm (grønn boks). Velg «Manuell fokusering» (blå boks) under Fokusmetode. E) Lagre prøveparametere. Hvis du vil lagre disse innstillingene, skriver du inn et navn og en kommentar, og deretter klikker du Lagre gjeldende innstillinger (hvit pil). F) Kontroller at innstillingene samsvarer med innstillingene som vises, under Gjeldende innstillinger for samplingsparametere. Klikk her for å laste ned denne figuren.
Tilleggsfil 1. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen inneholder en trinnvis protokoll for gullstandardteknikken for opplisting av musprimordiale follikler, stereologi og den mer brukte metoden for direkte follikkeltelling. Kjemoterapi behandling ble brukt til å sammenligne og kontrast resultatene oppnådd fra disse to forskjellige metoder innenfor venstre og høyre eggstokk fra samme dyr. Begge metodene avdekket høy variasjon mellom dyr i opprinnelige follikkeltall. En betydelig uttømming av ovariereservatet ble registrert ved hjelp av stereologi, men direkte telling klarte ikke å oppdage en betydelig reduksjon i primordial follikkelnummer etter kjemoterapiadministrasjon kontra kontroll.
Spesielt er det klart at selv i en innavlet stamme av mus, som C57BL6J, er eggstokkreservatet hos unge voksne villtype (kontroll) kvinner utbredt, som det er tilfelle hos mennesker. Faktorer som påvirker dette og bidrar til etableringen av eggstokkreservatet forblir under etterforskning18. Høy variasjon blant studier av mus ovarian funksjon utgjør mange utfordringer for feltet å sammenligne, eller replikere data og å fremme klinisk oversettelse av nye terapeutiske for å beskytte oocytt nummer og kvalitet4. Denne variasjonen skyldes sannsynligvis en rekke faktorer, inkludert ikke bare tellemetodene som brukes, men ytterligere faktorer som forskjeller mellom dyrestamme og alder; behandlingsregimer, som dose og timing. Disse faktorene må alle vurderes ved sammenligning av data fra ulike studier. Uansett fremhever follikkeluttømmingsmodellen som brukes i denne studien generelt den nøyaktige og sensitive karakteren av stereologiprotokollen, samtidig som den viser at den mye rapporterte direkte tellermetoden ikke klarer å oppdage en kjent betydelig primordial follikkeluttømming.
Det finnes styrker og begrensninger for hver tellemetode som er beskrevet i denne artikkelen (Tabell 1). Stereologi betraktes som gullstandardmetoden på grunn av nøyaktigheten når den brukes til å bestemme cellenummer i en rekke forskjellige organer5. Ulempene med denne teknikken inkluderer imidlertid tiden og kostnadene som er involvert, samt kravet til spesialisert utstyr og kompetanse. Sammen har dette begrenset bruken av denne prosedyren for å oppnå de mest sensitive dataene.
I motsetning til dette er metoden for direkte tellinger rask, enkel, kan gjøres ved hjelp av arkivert vev, og fremstilles ved hjelp av standard histologiske teknikker. Det krever bare et lett mikroskop med standard bildebehandlingsfunksjoner. Det tar imidlertid ikke hensyn til volumendringer forårsaket av histologisk behandling, noe som kan forstyrre eggstokkens tredimensjonale struktur. Følgelig er follikkelmorfologi ikke alltid tilstrekkelig bevart, noe som gjør identifikasjon og tellenøyaktighet utfordrende, spesielt for uerfarne etterforskere. Mens formalin var det fixativet som ble brukt til direkte tellinger i denne studien, kan Bouins faste vev bygges inn i parafin, og dette kan gi bedre morfologi og hjelpe forskere til lettere å identifisere primordiale follikler. I litteraturen varierer også prøvetakingsfraksjonene for metoden for direkte tellinger mye, alt fra hver 3.00 til hver 10. Gitt at parafinvoksseksjoner er så tynne, bidrar telling hver9.
Ytterligere metoder som ikke er skissert i denne guiden, men ofte rapportert i litteraturen, teller bare i en sentral seksjon fra hele eggstokken og vurderer dette å være representativt for hele eggstokken, eller follikkeltettheten. Denne første metoden er svært problematisk, siden primordiale follikler ikke er jevnt fordelt i eggstokken og finnes i klynger. Dette betyr at en enkelt, eller til og med noen få deler av eggstokken ikke er representative for hele orgelet, noe som gjør systematisk prøvetaking til en viktig komponent til enhver tellemetode. Follikkeltetthet innebærer å telle follikler i en eggstokkvevsprøve, og deretter uttrykke tellingene per vevsområde. Gitt begrensningene for å oppnå primært menneskelig vev, brukes follikkeltetthet ofte som surrogattiltak for absolutt follikkelnummer hos human eggstokk, selv om rapporter hos mus også er vanlige. Denne kvantifiseringsmetoden tar imidlertid ikke hensyn til ujevn fordeling av follikler gjennom eggstokken, eller svingninger i eggstokkvolum, som forekommer rutinemessig gjennom hele den eggstokk endokrine (luteal) syklusen. Dette er viktig fordi et nøyaktig mål på tetthet blant prøver er avhengig av konservert vevsområde. Videre prøver denne metoden ofte bare en liten biopsi eller brøkdel av eggstokken når man analyserer menneskelig vev, og er derfor ikke representativ for hele eggstokken. Follikkeltetthet mangler nøyaktigheten oppnåelig med stereologi. Selv ved hjelp av samme hele eggstokk, komparative mål på follikkel kvantifisering etter stereologisk analyse, med follikkeltetthet, bemerket ikke i museovaries20.
Selv om det er det mest brukte eksperimentelle dyret, er musen bare en modellart. Å skaffe eggstokkene fra større arter, inkludert husdyr eller ikke-menneskelige primater, er mulig, og dermed kan follikkeltall fra hele eggstokkprøver oppnås ved hjelp av en modifisert stereologisk protokoll21,22. Til slutt, mens evnen til å analysere follikkeltall i hele menneskelige eggstokkene faktisk er svært vanskelig, kan det likevel gjøres når prøver er tilgjengelige, ved hjelp av en modifisert stereologisk protokoll23,24,25.
Fremtidige retninger i feltet kan omfatte utvidelse og opptak av nye teknikker. For eksempel har en ny metodikk for automatisert deteksjon og telling for primordial follicle oocytter blitt beskrevet26. Denne metoden bruker konvolusjonelle nevrale nettverk drevet av merkede datasett og en glidende vindusalgoritme for å velge testdata. Imidlertid ble denne algoritmen bare testet over to eggstokkene, og utbredt opptak gjenstår å bestemme. Alternativt har nylige fremskritt innen optisk vevsrydding og lysarkmikroskopi tillatt omfattende analyse av intakt vev, og noen studier har undersøkt dette for follikkelopplisting i musovarary27,28.
Til slutt, mens direkte follikkeltelling er en enkel, rask og kostnadseffektiv metode for opplisting av primordiale follikler i eggstokken, kan denne teknikken mangle følsomhet, nøyaktighet og være utsatt for undersøkerbias. Derfor, til tross for sine ulemper, er stereologi fortsatt den beste tilgjengelige teknikken for nøyaktig og reprodusering av primordiale follikkeltall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble gjort mulig gjennom viktoriansk statlig operasjonell infrastrukturstøtte og den australske regjeringen NHMRC IRIISS og støttet av midler fra National Health and Medical Research Council (ALW #1120300) og Australian Research Council (KJH #FT190100265). Forfatterne ønsker å anerkjenne den tekniske støtten til Monash Animal Research Platform, Monash Histology Platform og Monash Micro Imaging-anlegget.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Butanol (HPLC) | Fisher Chemical | #A383-1 | |
| Acid alcohol | Amber Scientific | #ACDL | |
| Bouin’s fixative | Sigma-Aldrich | #HT10132 | Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v) |
| Cyclophosphamide | Sigma-Aldrich | #C0768-5G | |
| Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX) | Sigma-Aldrich | #06522 | |
| Ethanol | Amber Scientific | #ETH | Ethanol 100% |
| Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle | Designs for Vision | #FEA-745-SR | Feather blade for dissections (seen in Figure 1) |
| Formalin fixative | Australian Biostain | #ANBFC | |
| Glass coverslip | Thermo Scientific | #MENCS22501GP | 22 mm x 50 mm |
| Glycomethacrylate resin RM2165 microtome | Leica Microsystems | #RM2165 | |
| Glycolmethacrylate DPX | *made in house | *Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks | |
| Histolene | Trajan | #11031 | |
| Mayer’s haematoxylin | Amber Scientific | #MH | |
| Olympus BX50 microscope | Olympus | #BX50 | Brightfield microscope fitted with 10x dry & 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3) |
| Olympus immersion oil type-F | Olympus | #IMMOIL-F30CC | |
| Olympus TH4-200 light source | Olympus | #TH4-200 | |
| Paraffin wax | Sigma-Aldrich | #03987 | |
| Periodic acid | Trajan | #PERI1% | Periodic acid 1% |
| Rotary Microtome CUT 4060 | MicroTec | #4060R/F | Used to cut paraffin sections |
| Schiff’s reagent | Trajan | #SCHF | |
| Scott's tap water | Amber Scientific | #SCOT | Potassium carbonate, magnesium sulphate, water |
| StereoInvestigator Stereological System | MBF Bioscience | Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick | |
| Superfrost microscope slides | Thermo Scientific | #MENSF41296SP | 1 mm, 72 pcs |
| Technovit 7100 Plastic embedding system | Emgrid Australia | #64709003 | 500 mL/5 x 1 g/40 mL |
| Technovit 3040 yellow | Emgrid Australia | #64708805 | 100 g/80 mL |
References
- Stringer, J. M., Winship, A., Liew, S. H., Hutt, K. The capacity of oocytes for DNA repair. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2777-2792 (2018).
- Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing. Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).
- Broer, S. L., Broekmans, F. J., Laven, J. S., Fauser, B. C. Anti-Mullerian hormone: ovarian reserve testing and its potential clinical implications. Human Reproduction Update. 20 (5), 688-701 (2014).
- Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
- Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. Design-based stereology: introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number. Toxicologic Pathology. 38 (7), 1011-1025 (2010).
- Ristic, N., et al. Maternal dexamethasone treatment reduces ovarian follicle number in neonatal rat offspring. Journal of Microscopy. 232 (3), 549-557 (2008).
- Soleimani Mehranjani, M., Mansoori, T. Stereological study on the effect of vitamin C in preventing the adverse effects of bisphenol A on rat ovary. International Journal of Reproductive Biomedicine (Yazd). 14 (6), 403-410 (2016).
- Brown, D. L. Bias in image analysis and its solution: unbiased stereology. Journal of Toxicologic Pathology. 30 (3), 183-191 (2017).
- Hasselholt, S., Lykkesfeldt, J., Overgaard Larsen, J. Thick methacrylate sections devoid of lost caps simplify stereological quantifications based on the optical fractionator design. Anatomical Record (Hoboken). 298 (12), 2141-2150 (2015).
- Tilly, J. L. Ovarian follicle counts--not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
- Nguyen, Q. N., et al. Loss of PUMA protects the ovarian reserve during DNA-damaging chemotherapy and preserves fertility. Cell Death and Disease. 9 (6), 618 (2018).
- Meirow, D., Assad, G., Dor, J., Rabinovici, J. The GnRH antagonist cetrorelix reduces cyclophosphamide-induced ovarian follicular destruction in mice. Human Reproduction. 19 (6), 1294-1299 (2004).
- Winship, A. L., et al. The PARP inhibitor, olaparib, depletes the ovarian reserve in mice: implications for fertility preservation. Human Reproduction. , (2020).
- Meirow, D., Lewis, H., Nugent, D., Epstein, M. Subclinical depletion of primordial follicular reserve in mice treated with cyclophosphamide: clinical importance and proposed accurate investigative tool. Human Reproduction. 14 (7), 1903-1907 (1999).
- Nguyen, Q. N., et al. Cisplatin- and cyclophosphamide-induced primordial follicle depletion is caused by direct damage to oocytes. Molecular Human Reproduction. , (2019).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. Journal of Microscopy. 147, Pt 3 229-263 (1987).
- Olesen, M. V., Needham, E. K., Pakkenberg, B. The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy. Journal of Visualized Experiments. (125), e55737 (2017).
- Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. How Is the Number of Primordial Follicles in the Ovarian Reserve Established. Biology of Reproduction. 93 (5), 111 (2015).
- Omari, S., et al. Mcl-1 is a key regulator of the ovarian reserve. Cell Death and Disease. 6, 1755 (2015).
- Winship, A. L., Bakai, M., Sarma, U., Liew, S. H., Hutt, K. J. Dacarbazine depletes the ovarian reserve in mice and depletion is enhanced with age. Scientific Reports. 8 (1), 6516 (2018).
- Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. An accurate, simple method for unbiased determination of primordial follicle number in the primate ovary. Biology of Reproduction. 56 (4), 909-915 (1997).
- Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. Morphometric analysis of primordial follicle number in pigtailed monkey ovaries: symmetry and relationship with age. Biology of Reproduction. 61 (2), 553-556 (1999).
- Charleston, J. S., et al. Estimating human ovarian non-growing follicle number: the application of modern stereology techniques to an old problem. Human Reproduction. 22 (8), 2103-2110 (2007).
- Hansen, K. R., Craig, L. B., Zavy, M. T., Klein, N. A., Soules, M. R. Ovarian primordial and nongrowing follicle counts according to the Stages of Reproductive Aging Workshop (STRAW) staging system. Menopause. 19 (2), 164-171 (2012).
- Hansen, K. R., et al. A new model of reproductive aging: the decline in ovarian non-growing follicle number from birth to menopause. Human Reproduction. 23 (3), 699-708 (2008).
- Sonigo, C., et al. High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach. Scientific Reports. 8 (1), 13499 (2018).
- McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovarydagger. Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).
- Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).
