Summary
Este protocolo presenta un sistema nuevo, robusto, y reproducible de la cultura para generar y para crecer esferoides tridimensionales de las células de la adenocarcinoma de los dos puntos Caco2. Los resultados proporcionan la primera prueba de concepto de la idoneidad de este enfoque para estudiar la biología de las células madre cancerosas, incluida la respuesta a la quimioterapia.
Abstract
Los cánceres colorrectales son caracterizados por heterogeneidad y una organización jerárquica que comprende una población de las células madres del cáncer (CSCs) responsables del desarrollo, del mantenimiento, y de la resistencia del tumor a las drogas. Una mejor comprensión de las propiedades de CSC para su orientación específica es, por lo tanto, un requisito previo para la terapia efectiva. Sin embargo, hay una escasez de modelos preclínicos adecuados para investigaciones en profundidad. Aunque las variedades de células bidimensionales ines vitro (2D) del cáncer proporcionen penetraciones valiosas en biología del tumor, no replican la heterogeneidad fenotípica y genética del tumor. Por el contrario, los modelos tridimensionales (3D) abordan y reproducen la complejidad casi fisiológica del cáncer y la heterogeneidad celular. El objetivo de este trabajo fue diseñar un sistema de cultivo 3D robusto y reproducible para estudiar la biología csc. La presente metodología describe el desarrollo y optimización de condiciones para generar esferoides 3D, de tamaño homogéneo, a partir de células de adenocarcinoma de colon Caco2, un modelo que puede ser utilizado para el cultivo a largo plazo. Importantemente, dentro de los esferoides, las células que fueron organizadas alrededor lumen-como las estructuras, fueron caracterizadas por los patrones diferenciados de la proliferación de célula y por la presencia de CSCs que expresaban un panel de marcadores. Estos resultados proporcionan la primera prueba de concepto de la idoneidad de este enfoque 3D para estudiar la heterogeneidad celular y la biología csc, incluyendo la respuesta a la quimioterapia.
Introduction
El cáncer colorrectal (CCR) sigue siendo la segunda causa principal de muertes asociadas al cáncer en el mundo1. El desarrollo de la CCR es el resultado de una progresiva adquisición y acumulación de mutaciones genéticas y/o alteraciones epigenéticas2,3,incluyendo la activación de oncogenes e inactivación de genes supresores tumorales3,4. Además, los factores no genéticos (por ejemplo, el microambiente) pueden contribuir y promover la transformación oncogénica y, por lo tanto, participar en la evolución de los CCR5. Es importante destacar que los CRCs están compuestos por diferentes poblaciones celulares, incluyendo CSCs indiferenciados y células tumorales a granel que muestran algunos rasgos de diferenciación, que constituyen una estructura jerárquica que recuerda a la organización del epitelio en una cripta normal del colon6,7.
Se considera que las CSCs son responsables de la aparición del tumor8,su mantenimiento y crecimiento, capacidad metastásica y resistencia a las terapias convencionales6,7. Dentro de los tumores, las células cancerosas, incluidas las CSCs, muestran un alto nivel de heterogeneidad y complejidad en términos de sus distintos perfiles mutacionales y epigenéticos, diferencias morfológicas y fenotípicas, expresión génica, metabolismo, tasas de proliferación y potencial metastásico9. Por lo tanto, para comprender mejor la biología del cáncer, la progresión tumoral y la adquisición de resistencia a la terapia y su traducción en tratamientos efectivos, los modelos preclínicos humanos que capturan esta heterogeneidad y jerarquía del cáncer son importantes10,11.
Las variedades de células ines vitro del cáncer 2D se han utilizado durante mucho tiempo y proporcionan penetraciones valiosas en el desarrollo del tumor y los mecanismos que son la base de la eficacia de moléculas terapéuticas. Sin embargo, su limitación con respecto a la falta de heterogeneidad fenotípica y genética encontrada en los tumores originales es ahora ampliamente reconocida12. Por otra parte, los nutrientes, el oxígeno, los gradientes de pH y el microambiente tumoral no se reproducen, siendo el microambiente especialmente importante para el mantenimiento de diferentes tipos celulares, incluidas las CSCs11,12. Para superar estos principales inconvenientes, se han desarrollado varios modelos 3D para abordar y reproducir experimentalmente la complejidad y heterogeneidad de los cánceres. En efecto, estos modelos recapitulan la heterogeneidad celular tumoral, las interacciones célula-célula y la arquitectura espacial, similares a las observadas in vivo12,13,14. Los organoides tumorales primarios establecidos a partir de tumores frescos, así como los esferoides derivados de líneas celulares, se emplean en gran medida15,16.
Los esferoides se pueden cultivar de una manera libre de andamios o basada en andamios para forzar a las células a formarse y crecer en agregados celulares. Los métodos libres de andamios se basan en el cultivo de células en condiciones no adherentes (por ejemplo, el método de colgar y soltar o placas de fijación ultrabajos), mientras que los modelos basados en andamios se basan en biomateriales naturales, sintéticos o híbridos para cultivar células12,13,14. Los esferoides basados en andamios presentan diferentes desventajas, ya que la formación final del esferoide dependerá de la naturaleza y composición del (bio)material utilizado. Aunque los métodos de esferoides sin andamios disponibles hasta ahora no se basan en la naturaleza del sustrato, generan esferoides que varían en estructura y tamaño17,18.
Este trabajo tuvo como objetivo diseñar un sistema de cultivo 3D robusto y reproducible de esferoides, de tamaño homogéneo, compuesto por células de adenocarcinoma de colon Caco2 para estudiar la biología csc. Las células Caco2 son de particular interés debido a su capacidad para diferenciarse con el tiempo19,20,lo que sugiere fuertemente un potencial similar al tallo. Por consiguiente, la cultura de largo plazo de los esferoides reveló la presencia de diversas poblaciones del CSC con diversas respuestas a la quimioterapia.
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Protocol
NOTA: Los detalles de todos los reactivos y materiales se enumeran en la Tabla de materiales.
1. Formación de esferoides
- Medios de cultivo esferoide
- Prepare el medio básico que consiste en el medio modificado del águila de Dulbecco (DMEM) complementado con el dipéptido de la L-alanil-L-glutamina de 4 milímetros.
- Preparar el medio completo DMEM que contenga un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina-estreptomicina (Pen/Strep) en medio basal a partir del paso 1.1.1.
- Prepare el medio dmem/de la matriz de la membrana del sótano que contiene la matriz de la membrana del sótano del 2.5%, el 10% FBS, y la pluma/estreptococo del 1% en medio básico del paso 1.1.1.
- Preparación de placas para la formación de esferoides
- Medio de matriz basal y dmem/membrana basal caliente a temperatura ambiente (RT) durante aproximadamente 20 min.
- Pretrate los pozos de una placa de 24 pozos dedicada a la formación de esferoides mediante la adición de 500μL de solución de enjuague antia adherencia a cada pozo.
NOTA: En estas placas, cada pozo consta de 1.200 micropcillos. - Centrifugar la placa a 1.200 × g durante 5 min en un rotor de cubo oscilante con adaptadores para placas.
NOTA: Si sólo se utiliza una placa, prepare una placa estándar adicional llena de agua para contrarrestar el peso. - Enjuague cada pozo con 2 mL de medio basal caliente y aspire el medio de los pozos.
- Observe la placa bajo el microscopio para asegurarse de que las burbujas se han eliminado por completo de los micropcillos. Si las burbujas permanecen atrapadas, centrífuga de nuevo a 1.200 × g durante 5 min para eliminar las burbujas.
- Repetir los pasos de enjuague 1.2.4-1.2.5.
- Agregue 1 mL de dmem caliente /medio de matriz de membrana basal a cada pozo.
- Generación de esferoides
- Cultivar las células de Caco2 en una monocapa 2D en medio DMEM complementado con 10% de FBS y 1% de Pen/Strep a 37 °C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO2 (en lo sucesivo, 37 °C/5% deCO2).
Nota : el número máximo de pasajes de celda que se utilizará es 80. - Cuando se alcance el 80% de la confluencia, lavar las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x (5 mL para un plato de 10 cm), añadir el ácido tetraacético tripsina-etilendiamina (EDTA) (2 mL para un plato de 10 cm) e incubar durante 2-5 min a 37 °C/5% de CO2.
- Compruebe el desprendimiento de células bajo el microscopio y neutralice la tripsina agregando 4 mL de dmem medio completo por plato de 10 cm.
- Cuente las células usando un hemocytometer para determinar el número total de células.
- Centrifugar la suspensión celular a 1.200 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y resuspend el pellet en un volumen apropiado de DMEM /medio de matriz de membrana basal.
- Consulte la Tabla 1 para determinar el número de células necesarias por pozo para lograr el número deseado de células por micropcillo. Alternativamente, calcule el número de celdas utilizando la siguiente fórmula para una placa de 24 pozos, considerando que cada pozo contiene 1,200 micropcillos
Número requerido de células por pozo = Número deseado de células por micropcillo × 1.200 - Agregue el volumen requerido de la suspensión celular a cada pozo para lograr el número de celda deseado en un volumen final de 1 mL.
- Añadir 1 mL de DMEM/medio de matriz de membrana basal a cada pozo para alcanzar el volumen final de 2 mL por pozo (véase también el paso 1.2.7).
NOTA: Tenga cuidado de no introducir burbujas en los micropcillos. - Centrifugar la placa inmediatamente a 1.200 × g durante 5 min para capturar las células en los micropocillos. Si es necesario, contrapese la centrifugadora con una placa estándar llena de agua.
- Observe la placa bajo el microscopio para verificar que las células estén distribuidas uniformemente entre los micropcillos.
- Incubar la placa a 37 °C/5% de CO2 durante 48 h sin perturbar la placa.
NOTA: De acuerdo con el protocolo original21,aunque muchas líneas celulares pueden formar esferoides dentro de las 24 h, algunas requieren un tiempo de incubación más largo. En este protocolo, 48 h son suficientes para la formación de esferoides.
- Cultivar las células de Caco2 en una monocapa 2D en medio DMEM complementado con 10% de FBS y 1% de Pen/Strep a 37 °C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO2 (en lo sucesivo, 37 °C/5% deCO2).
- Cosecha de los esferoides de los micropocillos
- Caliente el medio basal y dmem/matriz de membrana basal /sótano en RT durante aproximadamente 20 min.
- Usando una pipeta serológica, retire la mitad del medio de cultivo (1 mL) de cada pozo.
- Agregue el medio de nuevo a la superficie del pozo para desalojar los esferoides de los micropocillos.
NOTA: No toque ni triturar los esferoides. - Coloque un colador reversible de 37 μm (o un colador estándar de 40 μm) en la parte superior de un tubo cónico de 15 mL para recoger los esferoides.
NOTA: Si utiliza un colador estándar de 40 μm, colómelo boca abajo. - Aspirar suavemente los esferoides desalojados (desde el paso 1.4.3), y pasar la suspensión esferoide a través del colador.
Nota: Los esferoides permanecerán en el filtro; las células individuales fluirán a través del medio. - Usando una pipeta serológica, dispense 1 mL del medio basal caliente a través de toda la superficie del pozo para desalojar cualquier esferoide restante y recuperarlos en el colador.
- Repetir este paso de lavado 1.4.6 dos veces.
- Observe la placa bajo el microscopio para asegurarse de que todos los esferoides se han eliminado de los micropocillos. Repetir el lavado si es necesario (pasos 1.4.6-1.4.7).
- Invierta el colador y colóquelo en un nuevo tubo cónico de 15 mL. Recoja los esferoides lavando el colador con dmem/medio de matriz de membrana basal.
NOTA: Los esferoides recogidos están listos para aplicaciones y análisis aguas abajo.
- Cultivo a largo plazo de esferoides
- Preparar solución de agarosa al 1,5% en medio basal, y esterilizarla por autoclave (ciclo estándar).
- Mientras que la solución de agarosa esté caliente y todavía líquida, cubra los pozos de platos o platos de cultivo estándar, como se describe en la Tabla 2.
NOTA: Calentar el plato/plato en el horno facilitará el paso de recubrimiento. Los platos/platos recubiertos se pueden dejar en RT durante un hasta 10 días en un ambiente estéril y protegidos de la luz. - Sembrar los esferoides cosechados (a partir del paso 1.4.9) en las placas recubiertas de agarosa, y añadir dmem/soporte de matriz de membrana basal para lograr el volumen final dependiendo del tamaño de la placa.
NOTA: Para evitar agregados esferoides, sembrarlos a la densidad óptima de 22 esferoides/cm2. Observe que el recubrimiento no es perfectamente plano, y se eleva hacia el borde, creando una concavidad ligera en el centro de la placa. Si el número de esferoides es demasiado alto, es más probable que se adhieran entre sí. - Incubar la placa a 37 °C/5% deCO2 hasta la recuperación de los esferoides para análisisespecíficos.
- Tratamiento de esferoides con fármacos quimioterapéuticos
- Platee los esferoides a partir del paso 1.5.4, y cultive durante 2 días. A partir del día 3 (D3), trátelos con FOLFIRI (5-Fluorouracilo, 50 μg/mL; Irinotecán, 100 μg/mL; Leucovorina, 25 μg/mL) o con FOLFOX (5-Fluorouracilo, 50 μg/mL; Oxaliplatino, 10 μg/mL; Leucovorina, 25 μg/mL) combinaciones de regímenes quimioterapéuticos utilizados rutinariamente para tratar a los pacientes con CCR22,23,24,25,o mantenerlos en condiciones (control) no tratadas (NT).
- Recoja los esferoides después de 3 días de tratamiento utilizando una pipeta con la punta cortada (punta de 1.000 μL), asegurándose de que cada condición esté representada por al menos tres réplicas. Centrifugarlos a 1.000 × g durante 3 min, y luego retire el sobrenadante.
- Fijar los pellets en paraformadehído al 2% (AP) para el análisis histológico (ver sección 3), o utilizar los pellets para la extracción de ARN (ver sección 4).
- Para analizar la muerte celular, incubar los esferoides a partir de la etapa 1.6.1 en placas de pozos de cultivo negro en dmem/medio de matriz de membrana basal durante 30 min con una tinción de ácido nucleico (dilución 1:5000) que no permea las células vivas, sino que penetra en las membranas comprometidas de las células muertas26. Mida la acumulación de fluorescencia con un lector de microplacas.
2. Monitoreo del crecimiento de esferoides
- Utilizando un microscopio invertido, adquirir imágenes representativas de esferoides mantenidos bajo diferentes condiciones a lo largo de los días en cultivo.
- Analice las imágenes midiendo tres diámetros representativos diferentes de cada esferoide utilizando el software apropiado.
- Utilice la siguiente fórmula para obtener el volumen estimado de la esfera.
Nota: Los términos, d1, d2 y d3, son los tres diámetros del esferoide.
3. Inmunofluorescencia (FI) y tinción histológica
- Fijación e incrustación de parafina
- Recoja los esferoides en los puntos de tiempo seleccionados usando una pipeta con la punta cortada como se describe en el paso 1.6.2, y fijarlos durante 30 minutos en RT en 2% PFA.
NOTA: Alternativamente, almacene las muestras en este paso a 4 °C hasta su uso posterior. - Para la incrustación de parafina, lave los esferoides 3x con PBS 1x y resuspón en etanol al 70%. Después de la inclusión de parafina y seccionamiento, realizar hematoxilina & eosina (H &E) tinción para el análisis histológico.
- Recoja los esferoides en los puntos de tiempo seleccionados usando una pipeta con la punta cortada como se describe en el paso 1.6.2, y fijarlos durante 30 minutos en RT en 2% PFA.
- Inmunoetiquetado de secciones de parafina
NOTA: Utilice secciones de 5 μm de espesor para la inmunotensación indirecta.- Incubar portaobjetos a 60 °C durante 2 h para fundir la cera y mejorar la desparafinación.
- Lave las guías dos veces durante 3 min en metilciclohexano.
- Lave los portaobjetos durante 3 min en 1:1 metilciclohexano: 100% etanol.
- Lave los portaobjetos dos veces durante 3 min en etanol al 100%.
NOTA: Realice todas las manipulaciones para los pasos 3.2.2 a 3.2.4 en una campana química. - Lave los portaobjetos durante 3 min en etanol al 90%.
- Lave los portaobjetos durante 3 min en etanol al 75%.
- Lavar los portaobjetos durante 3 min en etanol al 50%.
- Lave los portaobjetos bajo el agua del grifo.
- Rehidratar los portaobjetos en agua destilada durante 5 min.
- Preparar 700 mL de tampón de citrato de 0,01 M, pH 6,0, y añadirlo a un recipiente adecuado (ancho: 11,5 cm, largo: 17 cm, altura: 7 cm); sumergir las diapositivas en él. Calentar el recipiente en el microondas durante 9-10 min a 700 W, y cuando comience la ebullición, disminuir la potencia a 400-450 W. Incubar durante 10 min adicionales.
- Deje que las diapositivas se enfríen en el búfer a RT durante aproximadamente 30-40 min.
- Lave las guías dos veces en PBS durante 5 min.
- Dibuje un círculo alrededor de las secciones con un rotulador para crear una barrera para los líquidos aplicados a las secciones.
- Incubar cada sección con 50 μL de tampón bloqueador (10% de suero de cabra normal, 1% de albúmina sérica bovina (BSA) y 0,02% de Tritón X-100 en PBS) durante al menos 30 min a rt.
- Retire el tampón de bloqueo y agregue 50 μL de anticuerpos primarios diluido en el tampón de incubación (1% de suero de cabra normal, 0,1% de BSA y 0,02% de Tritón X-100 en PBS). Incubar durante 2 h a rt o durante la noche a 4 °C.
- Retire los anticuerpos primarios y lave los portaobjetos 3 veces en PBS durante 5 min.
- Incubar los portaobjetos con 50 μL de anticuerpos secundarios fluorescentes diluido en el tampón de incubación durante 1 h a RT.
- Retire los anticuerpos secundarios y lave los portaobjetos 3x en PBS durante 5 min.
- Agregue 50 μL de medio de montaje con 4′,6-diamidino-2-fenilindol a cada sección, y coloque una cubierta de vidrio sobre la sección.
4. Extracción de ARN, reacción en cadena de la transcripción-polimerasa inversa (RT-PCR) y RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR)
- Recoger esferoides en diferentes puntos de tiempo, cada punto representado por al menos tres réplicas. Centrifugarlos a 1.000 × g durante 3 min, y luego retire el sobrenadante.
NOTA: Los pellets pueden utilizarse directamente para la extracción de ARN o almacenarse a -20 °C hasta su posterior uso. - Aísle el ARN total usando un kit comercial de aislamiento de ARN, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Transcriba inversamente 500 ng de cada muestra de ARN en ADN complementario (ADNc) con un kit comercial de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Después de la transcripción inversa, realizar un análisis de PCR en 1 μL de ADNc para amplificar un gen de limpieza con cebadores ubicados en diferentes exones.
NOTA: Este paso permite la verificación de la ausencia de cualquier contaminación genómica de ADN en las preparaciones de ARN. Para este protocolo, las cartillas de la isomerasa B del peptidylprolyl(PPIB) fueron utilizadas. - Realizar la amplificación de qPCR en 4 μL de ADNc previamente diluido (1:10 en agua doble destilada libre de RNAse) mediante el uso de cebadores específicos para los genes de interés. En cada muestra, cuantifique la expresión específica de ARNm utilizando el método ΔΔCt y los valores normalizados contra los niveles de un gen de limpieza.
NOTA: Para este protocolo, se seleccionó β-actina(ACTB). Los cebadores utilizados en este protocolo se enumeran en la Tabla 3.
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Representative Results
Dado que la falta de homogeneidad en el tamaño de los esferoides es uno de los principales inconvenientes de los sistemas de cultivo de esferoides 3D actualmente disponibles13,el objetivo de este trabajo fue establecer un protocolo fiable y reproducible para obtener esferoides homogéneos. En primer lugar, para establecer las condiciones de trabajo ideales, se probaron diferentes números de células Caco2, que oscilaban entre 50 y 2.000 células por micropocillo/esferoide utilizando placas dedicadas(Tabla 1). En efecto, cada pocillo en estas placas contiene 1.200 micropocillos, lo que permite la formación del mismo número de esferoides por pocillo, y lo que es más importante, la formación de un esferoide por micropocillo21. Después de dos días de cultivo, los pozos que contenían 2.000 células por esferoide crecieron como monocapa, y 50 células por esferoide dieron lugar a esferoides pequeños y no homogéneos(Figura 1A). Por lo tanto, estas dos condiciones se excluyeron de otros análisis. Para establecer cultivos a largo plazo, los esferoides se cosecharon de los micropocillos y se sembraron en condiciones no adherentes en placas recubiertas de agarosa recién preparadas. El crecimiento del esferoide entonces fue supervisado a través del tiempo-curso experimental midiendo el cambio en volumen. Para tener en cuenta la forma no esférica, se midieron tres diámetros diferentes de cada esferoide, y se aplicó la fórmula de volumen27 (Figura 1B). Los esferoides generados a partir de 100 y 200 células mantuvieron su tamaño inicial durante todo el transcurso del experimento, mientras que los que contenían 1.000 células se desintegraron durante la cosecha debido a su gran tamaño y, en consecuencia, presentaron más variabilidad en su volumen. Por lo tanto, pues los esferoides que se presentaban de 500 células demostraron el aumento más homogéneo de tamaño durante el tiempo-curso experimental, este número de células fue utilizado para la formación del esferoide.
En segundo lugar, además de 500 células por esferoide, los números adicionales de la célula que se extendían a partir del 300 a 800 células fueron estudiados. Además, para mejorar las condiciones de no adhesión, el protocolo original se modificó pretratando los pozos dos veces en lugar de aplicar un solo lavado. Con estos cambios se observó una mejoría en la homogeneidad y compactación de los esferoides (Figura 2A). El tamaño de los esferoides en cada condición se midió en el momento de la cosecha (Figura 2B), y su crecimiento a largo plazo fue monitoreado a lo largo de los días en cultivo en platos recubiertos de agarosa (Figura 2C). De acuerdo con los resultados, 500 y 600 células/esferoide fueron confirmados como las condiciones óptimas que rinden buen crecimiento y variabilidad baja. Debido al perfil de crecimiento más homogéneo a lo largo del curso de tiempo experimental y las estructuras compactas formadas, se seleccionaron 600 células por esferoide como el número de células para experimentos posteriores. Finalmente, para mejorar aún más el protocolo, el medio completo DMEM se complementó con un 2,5% de la matriz de membrana basal, que contiene factores de crecimiento adicionales y un gran panel de proteínas de la matriz extracelular28. De hecho, la forma multilobular de los esferoides podría deberse a la falta de señales del microambiente que pudieran haber afectado a la polarización celular29,30. La adición de la matriz de membrana basal mejoró el crecimiento de los esferoides y mejoró su homogeneidad (Figura 2D). Un ejemplo de esta mejora se puede ver para 500 células por esferoide. En ausencia de la matriz de membrana basal(Figura 1B),el tamaño de los esferoides fue más heterogéneo, duplicándose de D3 a D7 y llegando luego a una meseta. Sin embargo, en presencia de la matriz de membrana basal(Figura 2C),el tamaño de los esferoides en cada punto de tiempo fue más homogéneo, aumentando proporcionalmente con el tiempo.
Para analizar las características de largo plazo de los esferoides, fueron recuperados en diversos tiempo-puntos después de cultura en los platos agarosa-revestidos para los análisis histológicos y si detallados en secciones de la parafina. La coloración de H&E mostró que las células dentro de los esferoides experimentaron cambios en su organización y forma en un plazo. De hecho, las células estaban densamente dispuestas en múltiples capas en D3, mientras que las células aplanadas dispuestas en monocapas eran claramente visibles en D10. Curiosamente, como lo indican las líneas punteadas negras en las imágenes, un lumen apareció dentro de los esferoides a partir de D5 (Figura 3). Paralelamente, la proliferación celular y la apoptosis fueron analizadas por IF utilizando el marcador de proliferación, antígeno nuclear celular proliferante (PCNA), y el marcador de muerte celular, activado caspasa 3. El etiquetado para pcna reveló que las células de la proliferación estaban a menudo presentes en la superficie externa de los esferoides, a veces en cripta-como o brote-como estructuras que recuerdan a culturas organoides15. Además, se observó un claro aumento de las células PCNA positivas en D5 y D7 que disminuyó en D10(Figura 4,paneles izquierdos). Sorprendentemente, la caspasa 3 activada se observó en muy pocas células en los esferoides tanto en D3 como en D5(Figura 4,paneles izquierdos) y durante períodos de tiempo más largos (datos no mostrados). El patrón de expresión de β-catenina también se evaluó en secciones de parafina. Curiosamente, se observaron altos niveles de expresión de β-catenina en cada punto de tiempo con tinción clara unida a la membrana y citoplasmática(Figura 4,paneles derechos). Vale la pena señalar que la membrana unida a la β-catenina participa en la adhesión célula-célula mediante la unión a E-cadherina31. Se observó un alto nivel de etiquetado de ß-catenina en grupos de células en todos los puntos de tiempo. En algunos casos, las células también mostraban una clara localización nuclear de ß-catenina(Figura 4,paneles derechos). Se sabe que las células caco2 se diferencian in vitro en 2D principalmente en enterocitos19,32. Sin embargo, la expresión de los marcadores de la diferenciación, tales como chromogranin A (células enteroendocrinas), lysozyme (células de Paneth) o mucina 2 (MUC 2, células de copa), era imperceptible en estos esferoides por SI (datos no mostrados). Sin embargo, se confirmó el potencial de diferenciación en enterocitos, dado que los esferoides expresaron ALPI (fosfatasa alcalina) y solutos de la familia de portadores 2, variante de transcripción 2(SLC2A5)/transportadorde glucosa 5(GLUT5)ARNm(Figura 5). Estos niveles del mRNA aumentaron en D5 y D7, pero la diferencia era no significativa (ALPI) o solamente marginal significativa (SLC2A5) comparada a los niveles en D3.
Con el objetivo final de definir si los esferoides generados y cultivados a partir de este nuevo método son una herramienta fiable para el estudio de las CSCs, se analizó la expresión de marcadores CSC mediante IF y qRT-PCR. CD133 y CD44 caracterizan a poblaciones de células cancerosas incluyendo CSCs7,33,34 y también se expresan por SCs en el intestino normal y loscolones 33,34,35. Los racimos de células CD133-positivas fueron localizados principalmente en la superficie externa de los esferoides en cada punto de tiempo(Figura 6A, paneles izquierdos). Las células CD44 positivas fueron menos frecuentes, pero siempre se asociaron con células CD133 positivas(Figura 6A, paneles derechos), lo que indica la existencia de una población de células CD133/CD44 doblemente positivas tipo CSC y una población que sólo expresa CD133. Olfactomedin 4 (OLFM4) y Musashi 1 (MSI1) fueron examinados como marcadores de SC/CSC; estos marcadores se expresan de manera muy limitada en las criptas de colon36,37 y también en distintas poblaciones celulares35,38. Sólo se observaron unas pocas células MSI1 positivas en cada punto de tiempo(Figura 7),mientras que OLFM4 permaneció indetectable (datos no mostrados). Sin embargo, según lo observado para CD44 y CD133, las células de MSI1-labeled fueron situadas en la superficie externa de los esferoides adentro cripta-como o brote-como estructuras. Los mismos marcadores también eran analizados en el nivel del mRNA en los mismos tiempo-puntos después de la cultura en platos agarosa-revestidos. La aldehído deshidrogenasa 1(ALDH1a1),un marcador bien caracterizado de CSCs39,40,también fue incluida en el estudio(Figura 8). El análisis de prominina-1 (codificaciónPROM1 para CD133) y ARNm CD44 confirmó la expresión de ambos marcadores en esferoides en todos los tiempos-puntos analizados. De la nota, sin embargo, mientras que los niveles de PROM1 mRNA eran absolutamente similares en un plazo en cultura, los niveles CD44 disminuyeron de D3 hacia adelante. La diferencia, sin embargo, era solamente marginal significativa al comparar los niveles del mRNA de D10 y de D3.
El análisis del ARNm MSI1 confirmó su expresión en esferoides en cada punto de tiempo, con niveles significativamente más altos en D3 y D5 en comparación con los de D7 o D10(Figura 8),mientras que el ARNm olfm4 no fue detectable (no se mostró). Finalmente, el ARNm alDH1a1 se expresó en esferoides en cada punto de tiempo y mostró un perfil de expresión que disminuyó en D10, siendo los niveles sólo marginalmente significativos en comparación con los de D3(Figura 8). Para validar la idoneidad del nuevo modelo para estudiar la biología celular cancerosa, se analizó la respuesta a la quimioterapia en esferoides tratados con FOLFOX o FOLFIRI, terapias combinadas administradas rutinariamente a pacientes con CCR22,23,24,25. En primer lugar, se examinó la eficacia de los tratamientos para inducir la muerte celular mediante la incubación de los esferoides con una tinción de ácido nucleico fluorescente que entra específicamente en las células muertas26. En comparación con la condición de control nt, el tratamiento con cada uno de los fármacos indujo una muerte celular significativa medida por la acumulación de fluorescencia (Figura 9A). Esta observación también fue confirmada a nivel morfológico mediante microscopía viva, lo que mostró que los tratamientos afectaron fuertemente el tamaño y la apariencia de los esferoides(Figura 9B). Finalmente, la expresión de los marcadores SC/CSC fue analizada por qRT-PCR en esferoides bajo las mismas condiciones (Figura 9C). Intrigantemente, una disminución significativa de los niveles de ARNm PROM1 bajo condiciones folfox y folfiri fue observada en comparación con los niveles para el control, mientras que los niveles msi1 no fueron afectados por los tratamientos. Además, mientras que FOLFOX no tuvo ningún efecto sobre la expresión de ARNm de ALDH1a1 en comparación con el control, el tratamiento con FOLFIRI aumentó significativamente sus niveles. Olfm4 mRNA no fue detectado, y los niveles de CD44 mRNA eran extremadamente bajos (los datos no mostrados).
Figura 1:Configuración de cultivos esferoides. (A)Formación de esferoides iniciada a partir de las concentraciones indicadas de células Caco2 per esferoide/micropocillo. El panel superior muestra una imagen representativa de toda una placa de cultivo después de dos días de cultura. El panel inferior muestra imágenes de micropcillos seleccionados por condición. Las imágenes se tomaron a un aumento de 4x (tamaño de micropcillo: 400 μm). Barras de escala: bajo aumento, 100 μm; alto aumento, 30 μm. (B)Características de crecimiento de los esferoides generados a partir de diferentes números de células por micropocillo y analizados en diferentes momentos. Tenga en cuenta que los días indicados incluyen los dos primeros días de cultivo en los micropocillos y el posterior cultivo de los esferoides cosechados en placas recubiertas de agarosa. Los histogramas muestran la media ± desviación estándar, n = 4–6. Los círculos negros muestran los valores de los esferoides individuales. La fórmula para el volumen estimado se muestra en la parte superior del panel, donde d1, d2 y d3 indican los tres diámetros medidos para cada esferoide. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2: Optimización de las condiciones para la formación y cultivo de esferoides. (A)Imágenes representativas de esferoides en D7 después de su recuperación de los micropocillos (2 días) y cultivo en platos recubiertos de agarosa (5 días), utilizando nuevas condiciones de preparación de pozos y medios de cultivo. Barra de escala: 30 μm. (B) Volumen estimado de los esferoides recién cosechados dos días después del inicio del cultivo celular en los micropocillos. Los histogramas muestran la desviación estándar media ± (DE), n = 4–6. Los círculos negros indican el tamaño de los esferoides individuales. (C)Volumen estimado de los esferoides en cultivo a largo plazo basado en las condiciones recién seleccionadas. Los gráficos muestran las características de crecimiento de los esferoides generados a partir de diferentes números de células por esferoide y analizados en diferentes puntos de tiempo después de su cosecha, como se indica. Los histogramas muestran la media ± DE, n = 6–10. Los círculos negros indican el tamaño de los esferoides individuales. (D)Imágenes representativas de las 600 células elegidas por condición esferoide durante el curso del tiempo experimental (paneles derechos) y dentro de los micropocillos (panel izquierdo). Las imágenes fueron tomadas a un aumento de 4x. Barras de escala: bajo aumento, 100 μm; alto aumento, 30 μm. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3: Caracterización histológica de los esferoides. Coloración histológica del hematoxylin y de la eosina (H&E) de las secciones de la parafina. Imágenes representativas de esferoides en los puntos de tiempo indicados después de la cosecha, como se indica. Las líneas punteadas negras en cada recuadro de alto aumento delimitan el lumen dentro de los esferoides. Barras de escala: bajo aumento, 30 μm; alto aumento, 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 4: Caracterización de esferoides de Caco2 por inmunoetiquetado. Inmunostaining de esferoides para el marcador de la proliferación, antígeno nuclear de la célula de la proliferación (PCNA, rojo), y marcador de la muerte celular, caspasa activada 3 (verde) (paneles izquierdos) y para β-catenina (rojo) (paneles derechos) en los tiempos indicados. Las imágenes muestran el etiquetado combinado de PCNA (rojo), caspasa activada 3 (verde) y núcleos (azul) o de β-catenina (rojo) y núcleos (azul). Las flechas blancas apuntan a celdas o grupos de células que expresan altos niveles de β-catenina. Las imágenes fueron tomadas con un objetivo de 20x. Barra de escala: 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 5: Análisis de marcadores de diferenciación de enterocitos mediante qRT-PCR. Análisis de alpi y SLC2A5 codificando proteínas alcalina fosfatasa y GLUT5, respectivamente. Los histogramas muestran la media ± desviación estándar, n = 3, después de la normalización contra ACTB. Los datos se representan como cambio del doblez en relación con la mucosa normal de los dos puntos (línea roja = 1). NS: no significativo; SM: marginalmente significativo en comparación con D3 por la prueba tde Student no emparejada. Abreviaturas: qRT-PCR = reacción en cadena cuantitativa de la transcripción inversa-polimerasa; GLUT5 = transportador de glucosa 5; SLC2A5 = familia 2 del portador del soluto, variante 2 de la transcripción; ACTB = β-actina. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 6:Expresión heterogénea de marcadores de células madre, CD44 y CD133, en los esferoides. Inmunotenstenimiento para los marcadores de células madre, CD133 y CD44, en los momentos indicados. Las imágenes en los paneles izquierdos muestran el etiquetado combinado de CD133 (verde) y núcleos (azul); las mismas imágenes en los paneles de la derecha muestran el etiquetado combinado de CD44 (rojo) y núcleos (azul). Las flechas verdes de los paneles izquierdos apuntan a celdas que expresan CD133 y las flechas blancas de ambos paneles apuntan a celdas o grupos de celdas que expresan CD44 y CD133. Las imágenes fueron adquiridas con un objetivo de 20x. Barra de escala: 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 7:Expresión heterogénea del marcador de células madre, MSI1, en los esferoides. Inmunotenstenimiento para el marcador de células madre MSI1 (rojo) en los momentos indicados. Las imágenes muestran el etiquetado combinado de MSI1 (rojo) y núcleos (azul). Las líneas punteadas blancas subrayan algunas estructuras similares a una cripta donde las células son positivas para el inmunoetiquetado MSI1. Las imágenes fueron tomadas a un aumento de 20x. Barra de escala: 5 μm. Abreviatura = MSI1 = Musashi 1. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 8: Análisis de marcadores de células madre por qRT-PCR. La cuantificación de los niveles de PROM1, CD44, MSI1 y ALDH1a1 se realizó en el ARNm de los esferoides en los momentos indicados. Los histogramas muestran la media ± desviación estándar, n = 3, después de la normalización contra ACTB. Los datos se representan como cambio del doblez en relación con la mucosa normal de los dos puntos (línea roja = 1). NS: no significativo; EM: marginalmente significativo en comparación con D3, utilizando la prueba tde Student no emparejada. *: P < 0,05 en comparación con D3 o D5, utilizando la prueba tde Student no emparejada. Abreviaturas: qRT-PCR = reacción en cadena cuantitativa de la transcripción inversa-polimerasa; PROM1 = prominina-1; MSI1 = Musashi 1; ALDH1α1 = aldehído deshidrogenasa 1 alfa; ACTB = β-actina. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 9:Efecto de la quimioterapia sobre los esferoides. Después de cosechar de los micropocillos, los esferoides fueron cultivados en placas agarosa-revestidas y tratados por 3 días con FOLFOX o FOLFIRI o mantenidos en (control) la condición no tratada (NT). (A)Análisis de fluorescencia debido al etiquetado de ácido nucleico en células muertas. Los histogramas muestran la media ± desviación estándar (DE), n = 4. (B)Características morfológicas de los esferoides mantenidos en las diferentes condiciones de cultivo. Las imágenes fueron tomadas con un objetivo 4x. Barra de escala: 400 μm. (C)Cuantificación de PROM1, MSI1 y ARNm ALDH1a1 por qRT-PCR. Los histogramas muestran la media ± SD, n = 4, después de la normalización contra ACTB. *: NS: no significativo; P < 0,05; **: P < 0,01; : P < 0,001 en comparación con la condición de control (NT), utilizando la prueba tde Student no emparejada. Abreviaturas: FOLFOX = 5-Fluorouracilo, 50 μg/mL; Oxaliplatino, 10 μg/mL; Leucovorina, 25 μg/mL ; FOLFIRI = 5-Fluorouracilo, 50 μg/mL; Irinotecán, 100 μg/mL; Leucovorina, 25 μg/mL; qRT-PCR = reacción en cadena de la transcripción-polimerasa reversa cuantitativa; PROM1 = prominina-1; MSI1 = Musashi 1; ALDH1α1 = aldehído deshidrogenasa 1 alfa; ACTB = β-actina. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
| Número deseado de células por esferoide | Número requerido de celdas por pozo |
| 50 | 6 x 104 |
| 100 | 1,2 x 105 |
| 200 | 2,4 x 105 |
| 300 | 3,6 x 105 |
| 400 | 4,8 x 105 |
| 500 | 6 x 105 |
| 600 | 7,2 x 105 |
| 700 | 8,4 x 105 |
| 800 | 9,6 x 105 |
| 1000 | 1,2 x 106 |
| 2000 | 2,4 x 106 |
Cuadro 1: Resumen de la formación de esferoides y siembra celular.
| Platos de 10 mm | Placas de 6 pozos | Placas de 12 pozos | Placas de 24 pozos | Placas de 96 pozos | |
| Volumen de recubrimiento | 4 mL | 300 μL | 250 μL | 150 μL | 50 μL (abajo & arriba) |
Cuadro 2: Volúmenes de solución de agarosa para recubrimiento de diferentes platos/ platos.
| genes | Imprimaciones | secuencia | Longitud del producto | |
| Marcadores de diferenciación | ALPI | adelante | CTG GTA CTC AGA TGC TGA CA | 81 |
| Marcha atrás | ATG TTG GAG ATG AGC TGA GT | |||
| SLC2A5 | adelante | TAC CCA TAC TGG AAG GAT GA | 94 | |
| Marcha atrás | AAC AGG ATC AGA GCA TGA AG | |||
| Marcadores de células madre | ALDH1a1 | adelante | GCC TTC ACA GGA TCA ACA GAG | 147 |
| Marcha atrás | TGC AAA TTC AAC AGC ATT GTC | |||
| MSI1 | adelante | AGT TGG CAG ACT ACG CAG GA | 131 | |
| Marcha atrás | TGG TCC ATG AAA GTG ACG AAG | |||
| PROM1 | adelante | GTA AGA ACC CGG ATC AAA AGG | 131 | |
| Marcha atrás | GCC TTG TCC TTG GTA GTG TTG | |||
| CD44 | adelante | TGC CTT TGA TGG ACC AAT TAC | 160 | |
| Marcha atrás | TGA AGT GCT GCT CCT TTC ACT | |||
| OLFM4 | adelante | TCT GTG TCC CAG TTG TTT TCC | 118 | |
| Marcha atrás | ATT CCA AGC GTT CCA CTC TGT | |||
| Genes de limpieza | ACTB | adelante | CAC CAT TGG CAA TGA GCG GTT C | 134 |
| Marcha atrás | AGG TCT TTG CGG ATG TCC ACG T | |||
| PPIB | adelante | ATG ATC CAG GGC GGA GAC TT | 100 | |
| Marcha atrás | GCC CGT AGT GCT TCA GTT TG |
Cuadro 3: Cebadores utilizados para la reacción en cadena de la transcripción-polimerasa inversa cuantitativa.
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Discussion
Los modelos 3D in vitro superan los principales inconvenientes experimentales de los cultivos celulares de cáncer 2D, ya que parecen ser más confiables para recapitular las características tumorales típicas, incluido el microambiente y la heterogeneidad celular. Los modelos 3D de esferoides comúnmente utilizados son libres de andamios (cultivados en condiciones de baja unión) o basados en andamios (utilizando biomateriales para cultivar células). Estos métodos presentan diferentes desventajas ya que dependen de la naturaleza del andamio utilizado o dan lugar a esferoides que son variables en estructura y tamaño.
El actual protocolo divulga las condiciones optimizadas para producir los esferoides homogéneos de la variedad de células de la adenocarcinoma de los dos puntos, Caco2, usando un método andamio-libre. Los esferoides son fácilmente cosechados y contrariamente a un estudio previamente reportado41,crecen con éxito y también se pueden analizar sus características de crecimiento durante el tiempo en cultivo. Por otra parte, con este nuevo método, los esferoides (a) proliferan activamente, (b) presentan una tasa muy baja de muerte celular, (c) se organizan para formar un lumen dentro de las esferas, y (d) exhiben capacidad de diferenciación de las células componentes. Dado que el objetivo final del nuevo enfoque era su uso para estudios sobre biología del CSC, se analizó la expresión de diferentes marcadores de CSCs. Curiosamente, los marcadores presentaron un patrón de expresión dinámica en función del punto-tiempo y definieron diferentes poblaciones de CSC.
De suma importancia, los esferoides generados a través de este protocolo podrían ser utilizados para el análisis de fármacos relevantes para aplicaciones clínicas como los regímenes quimioterapéuticos, FOLFOX y FOLFIRI. Los resultados también subrayan una respuesta heterogénea de las células a los fármacos en función del marcador CSC analizado. Esta observación es consistente con la visión actual de que las poblaciones heterogéneas y múltiples de células tipo CSC dentro de los tumores muestran diversas propiedades de quimiosensibilidad/quimiorresistencia42,43. Este hallazgo potencia fuertemente la aplicabilidad de este nuevo método para la investigación a gran escala. Además de las aplicaciones reportadas en este estudio, el nuevo protocolo también se puede utilizar para una gama más amplia de análisis (por ejemplo, extracción de ARN y/o ADN y análisis a gran escala, western blotting e inmunofluorescencia). De hecho, el volumen de esferoides y las características de crecimiento se pueden determinar fácilmente aplicando la fórmula del volumen de la esfera que, si es necesario, también tiene en cuenta diferentes diámetros para contrarrestar las desviaciones de una forma perfectamente esférica. Sin embargo, los parámetros específicos deben optimizarse dependiendo del tipo de célula (línea celular o cultivos primarios frescos) y la capacidad de crecimiento, como el tiempo de replicación. Sin embargo, el protocolo indica pasos críticos que se pueden ajustar fácilmente.
Algunos puntos de preocupación deben ser considerados al llevar a cabo la generación de esferoides descritos en este artículo. En primer lugar, se deben realizar varios pasos de lavado con la solución de enjuague antia adherencia para promover la homogeneidad y compactación de las esferas. En este caso, fueron necesarios dos lavados. En segundo lugar, las burbujas deben eliminarse de los micropocillos, ya que esto puede perturbar la correcta formación de los esferoides. En tercer lugar, una vez que las células se siembran en cada micropcillo después de la etapa de centrifugación, la placa debe permanecer imperturbable durante dos días. Las consideraciones y los cambios adicionales en el protocolo son necesarios al estudiar los primeros pasos de la formación del esferoide, incluyendo posiblemente un sistema automatizado de la visualización y de la proyección de imagen. En cuarto lugar, cambiar el medio sin molestar a los esferoides, dado que están en suspensión, puede ser un desafío. Por lo tanto, se recomienda cambiar solo la mitad del volumen cada vez. Quinto, al cosechar los esferoides, es importante preservar su estructura. Por lo tanto, se recomienda el uso de pipetas serológicas o micropipetas con las puntas cortadas para todos los pasos de dispensación después del enjuague en un medio que contiene suero o PBS para evitar que los esferoides se adhieran a las puntas.
También se pueden encontrar algunas limitaciones al utilizar este protocolo. En primer lugar, no todas las líneas celulares o tipos de celdas tienen los mismos parámetros de cultivo; en algunos casos, la heterogeneidad celular y el número de pasajes/envejecimiento de las células también pueden afectar la capacidad de formar esferoides. En segundo lugar, en contra de los organoides, puede ser difícil mantener los esferoides durante mucho tiempo en cultivo. Además, no pueden ser replicados por fragmentación simple a través de una punta de micropipeta15. En tercer lugar, este protocolo no se puede adaptar para el análisis de un solo esferoide porque la recuperación manual de esferoides uno por uno puede ser complicada. Esta técnica es más adecuada para obtener altas cantidades de esferoides homogéneos al mismo tiempo. Por último, para estudios que investiguen los efectos de factores de crecimiento originados en otros tipos celulares o que analicen la importancia del microambiente, sería importante enriquecer el modelo y realizar experimentos de co-cultivo.
En conclusión, la presente metodología describe un nuevo protocolo para generar y cultivar eficientemente esferoides a partir de células Caco2. Los resultados demuestran que este método se puede aplicar al estudio de la heterogeneidad del tumor y para el análisis de CSCs. Este método también se puede utilizar para la detección de fármacos de alto rendimiento y el estudio de la biología de células madre en células cancerosas y no cancerosas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar
Acknowledgments
Reconocemos las plataformas de la histología de la proyección de imagen y del recherche del anípata (CRCL, CLB). Estamos en deuda con la farmacia del Hospital Centre Léon Bérard (CLB) por el amable regalo de FOLFOX y FOLFIRI. También agradecemos a Brigitte Manship por la lectura crítica del manuscrito. El trabajo fue apoyado por el FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) y por el Inca (PLBIO19-289). MVG y LC recibieron apoyo del FRM y CF recibieron apoyo de la fundación ARC y del Centre Léon Bérard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37 µm Reversible Strainer, Large | STEMCELL Technologies | 27250 | To be used with 50 mL conical tubes |
| 5-Fluorouracil | Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB) | - | stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Aggrewell 400 24-well plates | STEMCELL Technologies | 34411 | 1,200 microwells per well for spheroid formation and growth |
| Anti Caspase3 - Rabbit | Cell Signaling | 9661 | dilution 1:200 |
| Anti Musashi-1 (14H1) - Rat | eBioscience/Thermo Fisher | 14-9896-82 | dilution 1:500 |
| Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL | STEMCELL Technologies | 07010 | |
| Anti-CD133 (13A4) - Rat | Invitrogen | 14-133-82 | dilution 1:100 |
| Anti-CD44 -Rabbit | Abcam | ab157107 | dilution 1:2000 |
| Anti-PCNA - Mouse | Dako | M0879 | dilution 1:1000 |
| Anti-β-catenin - Mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-7963 | dilution 1:50 |
| Black multiwell plates | Thermo Fisher Scientific | 237108 | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma | C1909 | |
| CLARIOstar apparatus | BMG Labtech | microplate reader | |
| Dako pen | marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids | ||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21202 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10037 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10042 | dilution 1:1000 |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 10569010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Fluorogel mounting medium with DAPI | Interchim | FP-DT094B | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11077 | dilution 1:1000 |
| ImageJ software | Spheroid image analysis | ||
| Irinotecan | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL |
| iScript reverse transcriptase | Bio-Rad | 1708891 | |
| Leucovorin | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| Nucleospin RNA XS Kit | Macherey-Nagel | 740902 .250 | |
| Oxaliplatin | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140130 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190250 | |
| SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR420B | |
| SYTOX- Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | nucleic acid stain; dilution 1:5000 |
| Trypsin-EDTA (0.05 %) | Gibco | 25300062 | |
| Zeiss-Axiovert microscope | inverted microscope for acquiring images of spheroids |
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