Summary
وقد استخدمت عدة طرق لتحليل البروتين الدهني البلازما; ومع ذلك ، لا يزال الطرد الفائق واحدًا من أكثر الطرق شعبية وموثوقية. هنا، نحن وصف طريقة بشأن كيفية عزل البروتينات الدهنية من البلازما باستخدام كثافة متتابعة فائقة الrifugation وكيفية تحليل apolipoproteins لكل من أغراض التشخيص والبحث.
Abstract
تحليل البروتينات الدهنية والبلازمية و apolipoproteins هو جزء أساسي لتشخيص dyslipidemia ودراسات التمثيل الغذائي للدهون و تصلب الشرايين. على الرغم من وجود عدة طرق لتحليل البروتينات الدهنية البلازما، لا يزال الطرد الفائق التركيز واحدة من الأساليب الأكثر شعبية وموثوق بها. بسبب إجراء فصل سليمة، يمكن استخدام كسور البروتين الدهني المعزولة بواسطة هذه الطريقة لتحليل البروتينات الدهنية، apolipoproteins، البروتيوم، والدراسة الوظيفية للبروتينات الدهنية مع الخلايا المستزرعة في المختبر. هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل لعزل سبعة كسور البروتينات الدهنية بما في ذلك VLDL (d< 1.006 ز / مل)، IDL (d = 1.02 ز / مل)، LDLs (د = 1.04 و 1.06 ز / مل)، HDLs (d = 1.08، 1.10، و 1.21 ز/مل) من بلازما الأرانب باستخدام الطرد فوق التخوم العائمة المتتابعة. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا نقدم القراء كيفية تحليل apolipoproteins مثل apoA-I، apoB، وapoE من قبل SDS-PAGE وغربية النشاف وتظهر نتائج تمثيلية للروبوتات الدهنية وspopoprotein ملفات تعريف باستخدام نماذج الأرنب hyperlipidemic. يمكن أن تصبح هذه الطريقة بروتوكولًا قياسيًا لكل من الأطباء والعلماء الأساسيين لتحليل وظائف البروتين الدهني.
Introduction
ديسليبيديميا هو عامل الخطر الرئيسي لمرض تصلب الشرايين في العالم. ترتبط المستويات العالية من البروتينات الدهنية منخفضة الكثافة (LDLs) والمستويات المنخفضة من البروتينات الدهنية عالية الكثافة (HDLs) بشكل وثيق مع ارتفاع خطر الإصابة بأمراض القلب التاجية (CHD)1،2. في الإعداد السريري، يتم قياس كل من LDL-الكولسترول (LDL-C) والكوليسترول HDL-CHOLESTEROL (HDL-C) بشكل روتيني باستخدام محلل آلي في مختبر سريري3،4. على الرغم من هذا، فمن الضروري لتحليل ملامح البروتين الدهني في التفاصيل لتشخيص dyslipidemia ودراسة التمثيل الغذائي للدهون و تصلب الشرايين في الحيوانات البشرية والتجريبية. وقد تم الإبلاغ عن عدة طرق لتحليل البروتين الدهني البلازما مثل الطرد الفائق المركز، وحجم استبعاد الكروماتوغرافيا [الكروماتوغرافيا السائلة البروتينية السريعة (FPLC) والكرومات السائلة عالية الأداء (HPLC))، والكهربائية بواسطة agarose و Polyacrylamide الهلام الهلام، الرنين المغناطيسي النووي، وانتقائية الكيميائية باستخدام البوليانيونس والالات الأرافينت أو غيرها من المواد الكيميائية. في الخمسينات، اقترحت مجموعة هافل لأول مرة مفهوم البروتينات الدهنية المحددة بالكثافة باستخدام الطارد الشديد وصنفتها في الكريومكيرونات (CM)، وبروتينات lipoproteins ذات الكثافة المنخفضة جداً (VLDL)، وبروتينات البروتينات الدهنية المتوسطة الكثافة (IDL)، وLDL، وHLDL5 وفيما بعد، تم تعديل الطريقة بشكل أكبر من قبل مجموعات أخرى6،7. حتى الآن، الطرد المفرط هو الأسلوب الأكثر شعبية وموثوق بها في حين أن البروتوكول العملي لا يزال غير متوفر. في هذه الورقة، حاولنا وصف بروتوكول سهل الاستخدام لعزل نطاق صغير من البلازما باستخدام كثافة متتابعة عائمة الrifugugation وصفت أصلا8. عزل سبعة كسور البروتين الدهني البلازما [VLDL (d< 1.006 ز / مل), IDL (d= 1.02 غرام / مل), LDLs (d= 1.04 و 1.06 ز /مل), HDLs (d= 1.08, 1.10, و 1.21 ز /مل]] تمكن الباحثين من إجراء تحليل مستفيض لكل من البروتينات الدهنية وبروتيناتها التركيبية9,10,11. ويمكن استخدام سبعة البروتينات الدهنية الكثافة على التوالي سليمة لتحليل وظائف البروتين الدهني وتخدم أيضا إلى الخلايا القائمة على استراتيجيات في المختبر. وينبغي أن يكون هذا البروتوكول مفيدا لكل من التشخيص السريري والبحوث الأساسية. هنا استخدمنا البلازما الأرانب كمثال لإثبات هذه التقنية في حين يمكن تطبيق البلازما من الأنواع الأخرى بنفس الطريقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات لدراسات الأرانب بموافقة لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة ياماناشي (العدد المعتمد: A28-39).
1. فصل البلازما من دم الأرانب
- قم بإعداد 1.5 مل ميكروتوب تحتوي على 15 ميكرولتر من 0.5 M EDTA (pH 8.0) لجمع الدم.
- وضع أرنب في تقييد وثقب الشريان المتوسط auricular باستخدام إبرة قياس 22 وجمع الدم في أنبوب. اخلط الدم مع EDTA بلطف ووضعها على الجليد.
- أجهزة الطرد المركزي أنابيب الدم في 1500 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 ° C وجمع البلازما إلى ميكروتيتوب جديدة.
ملاحظة: 3 مل من الدم يكفي لجمع البلازما 1 مل. إذا قمت بجمع الدم من الفئران أو الحيوانات الصغيرة الأخرى، تحتاج إلى جمعها.
2. عزل البروتينات الدهنية البلازما
ملاحظة: يظهر الإجراء التخطيطي في الشكل 1. يتم عرض طريقة إعداد محلول كثافة بروميد البوتاسيوم (KBr) في الجدول 1.
- نقل 1 مل من البلازما إلى أنبوب polycarbonate فائقة الrifuge(الشكل 2A).
- تحميل هذه الأنابيب في الدوار زاوية ثابتة والطرد المركزي البلازما في 356،000 س ز ل 2.5 ساعة في 4 درجة مئوية(الشكل 2B).
ملاحظة: بالنسبة لـ Beckman TLA 120.2 الدوار، 356000 x ز (متوسط حقل الطرد المركزي النسبي، AV RCF) يتوافق مع 100،000 دورة في الدقيقة. - قطع الأنابيب باستخدام تقطيع اللحم ومن ثم جمع الجزء العلوي [VLDL (d< 1.006 ز / مل)] ، ما يقرب من 200 ميكرولتر في microtube جديدة (الشكل 2C). جمع الجزء السفلي المتبقية في أنبوب جديد polycarbonate ultracentrifuge للفصل المقبل(الشكل 2D). قياس حجم وجعل حجم إجمالي إلى 800 μL عن طريق إضافة نفس الحل الكثافة (d = 1.006 ز / مل).
ملاحظة: قم بإعداد شفرة إلى مقسم أنابيب الأنبوب. ضبط موضع النصل عند مستوى بين الكسر العلوي (200 ميكرولتر) والكسر السفلي (800 ميكرولتر). وينبغي جمع اللزوج في الجزء السفلي بعناية وبشكل كامل عن طريق الأنابيب في جميع الخطوات التالية. إذا توقف مؤقتًا، قم بذلك بعد فصل الجزء العلوي والسفلي في جميع الخطوات. تخزين العينة في 4 درجة مئوية حتى الطرد المركزي المقبل. - ضبط الكسر السفلي (إجمالي 800 ميكرولتر) إلى d = 1.02 g/mL بإضافة 58.9 ميكرولتر من d=1.21 g/mL و 141.1 ميكرولتر من d=1.02 g/mL حل (الحجم الإجمالي هو 1 مل).
- تحميل هذه الأنابيب في الدوار زاوية ثابتة والطرد المركزي في 356،000 س ز ل 2.5 ساعة في 4 درجة مئوية.
- قطع الأنابيب باستخدام تقطيع اللحم ثم جمع الجزء العلوي [IDL (d = 1.02 g/mL)] حوالي 200 ميكرولتر في ميكروتيتوب جديد. جمع الجزء السفلي المتبقية في أنبوب جديد polycarbonate ultracentrifuge للفصل المقبل. قياس حجم وجعل حجم الكلية إلى 800 μL عن طريق إضافة نفس الحل الكثافة (d = 1.02 ز / مل).
- ضبط الكسر السفلي (إجمالي 800 ميكرولتر) إلى d = 1.04 g/mL بإضافة 94.1 ميكرولتر من d=1.21 g/mL و 105.9 ميكرولتر من d=1.04 g/mL حل (الحجم الإجمالي هو 1 مل).
- قم بتحميل هذه الأنابيب في دوار زاوية ثابتة وطاردة مركزية عند 356,000 x غم لـ 2.5 ساعة عند 4 درجات مئوية.
- قطع الأنابيب باستخدام تقطيع اللحم ومن ثم جمع الجزء العلوي [LDL (d = 1.04 غرام / مل)] ما يقرب من 200 ميكرولتر في microtube جديدة. جمع الجزء السفلي المتبقية في أنبوب جديد polycarbonate ultracentrifuge للفصل المقبل. قياس حجم وجعل المجموع إلى 800 μL عن طريق إضافة نفس الحل الكثافة (d = 1.04 ز / مل).
- ضبط الكسر السفلي (إجمالي 800 ميكرولتر) إلى d = 1.06 g/mL بإضافة 106.7 ميكرولتر من d=1.21 g/mL و 93.3 ميكرولتر من d=1.06 g/mL حل (الحجم الإجمالي هو 1 مل).
- قم بتحميل هذه الأنابيب في دوار زاوية ثابتة وطاردة مركزية عند 356,000 x غم لـ 2.5 ساعة عند 4 درجات مئوية.
- قطع الأنابيب باستخدام تقطيع اللحم ثم جمع الجزء العلوي [LDL (d = 1.06 غرام / مل)] ما يقرب من 200 ميكرولتر في ميكروتيتوب جديدة. جمع الجزء السفلي المتبقية في أنبوب جديد polycarbonate ultracentrifuge للفصل المقبل. قياس حجم وجعل المجموع إلى 800 ميكرولتر عن طريق إضافة نفس الحل الكثافة (d = 1.06 ز / مل).
- ضبط الكسر السفلي (المجموع 800 ميكرولتر) إلى d = 1.08 g/mL بإضافة 123.1 ميكرولتر من d =1.21 g/mL حل و 76.9 ميكرولتر من d = 1.08 g/mL حل (الحجم الإجمالي هو 1 مل).
- قم بتحميل هذه الأنابيب في دوار زاوية ثابتة وطاردة مركزية عند 356,000 x غم لـ 2.5 ساعة عند 4 درجات مئوية.
- قطع الأنابيب باستخدام تقطيع اللحم ومن ثم جمع الجزء العلوي [HDL2 (d = 1.08 غرام / مل)] ما يقرب من 200 ميكرولتر في microtube جديدة. جمع الجزء السفلي المتبقية في أنبوب جديد polycarbonate ultracentrifuge للفصل المقبل. قياس حجم وجعل المجموع إلى 800 ميكرولتر عن طريق إضافة نفس الحل الكثافة (d = 1.08 غرام / مل).
- ضبط الكسر السفلي (إجمالي 800 ميكرولتر) إلى d =1.10 g/mL بإضافة 145.5 ميكرولتر من d=1.21 g/mL و 54.5 ميكرولتر من d=1.10 g/mL حل (الحجم الإجمالي هو 1 مل).
- قم بتحميل هذه الأنابيب في دوار زاوية ثابتة وطاردة مركزية عند 356,000 x غم لـ 2.5 ساعة عند 4 درجات مئوية.
- قطع الأنابيب باستخدام تقطيع اللحم ومن ثم جمع الجزء العلوي [HDL2 (d = 1.10 غرام / مل)] ما يقرب من 200 ميكرولتر في ميكروتيتوب جديدة. جمع الجزء السفلي المتبقية في أنبوب جديد polycarbonate ultracentrifuge للفصل المقبل. قياس حجم وجعل المجموع إلى 800 ميكرولتر عن طريق إضافة نفس الحل الكثافة (d = 1.10 ز / مل).
- ضبط الكسر السفلي (إجمالي 800 ميكرولتر) إلى d =1.21 g/mL بإضافة 0.140 غرام من مسحوق بروميد البوتاسيوم (KBr) وإذابته بالكامل. قياس حجم وجعلها على 1 مل عن طريق إضافة d = 1.21 ز / مل الحل.
- تحميل هذه الأنابيب في الدوار زاوية ثابتة والطرد المركزي في 513،000 ز ل4 ح في 4 درجة مئوية.
ملاحظة: بالنسبة لـ Beckman TLA 120.2 الدوار، 513،000 x ز (AV RCF) يتوافق مع 120،000 دورة في الدقيقة. - قطع الأنابيب باستخدام تقطيع اللحم ثم جمع الجزء العلوي [HDL3 (d = 1.21 غرام / مل)] ما يقرب من 200 ميكرولتر في ميكروتيتوب جديدة. هذه هي الخطوة الأخيرة للطرد فوق المركز.
3. غسيل الكلى
ملاحظة: لأن كسور الكثافة (باستثناء d<1.006 g/mL) تحتوي على تركيزات عالية من KBr، فمن الضروري إزالتها عن طريق غسيل الكلى.
- نقل كسور الكثافة إلى أنابيب غسيل الكلى ومقطع كلا طرفي مع الإغلاق.
- Dialyze ضد 2 L من عازلة غسيل الكلى مثل PBS / 1 mM EDTA لمدة 6 ساعة في 4 درجة مئوية مع التحريض باستخدام مُثير مغناطيسي.
- استبدال مع العازلة الجديدة و dialyze مرة أخرى ل6 ح آخر في 4 درجة مئوية.
- جمع كسور الكثافة وقياس حجم. ضبط جميع كسور الكثافة إلى نفس مستوى الصوت (على سبيل المثال، 250 ميكرولتر).
ملاحظة: يمكنك حساب العامل المركز من 1 مل من البلازما الأصلية (على سبيل المثال، 250 ميكرولتر من كسر الكثافة يتوافق مع التركيز أربع مرات).
4- تحليل البروتينات الدهنية
ملاحظة: بعد غسيل الكلى، تكون هذه البروتينات الدهنية جاهزة لإجراء تحليلات مختلفة. يمكن تقييم البروتينات الدهنية عن طريق قياس الدهون أو apolipoproteins أو كليهما. لقياس محتويات الدهون مثل الكوليسترول الكلي (TC)، الدهون الثلاثية (TG)، فوسفوليبيدات (PL)، والكوليسترول المجاني (FC) في كل جزء، نستخدم مجموعات قياس الألوان التجارية. لتحليل apolipoproteins، ونحن نستخدم SDS-PAGE تصور مع تلطيخ مصرف البحرين المركزي أو النشاف الغربية.
- تحليل الدهون
ملاحظة: يمكن قياس الدهون مثل TC، TG، PL و FC في جزء البروتين الدهني باستخدام مجموعات القياس المتاحة تجاريا. تعتمد الإجراءات على الكواشف المستخدمة ، لذلك اتبع تعليمات كل مجموعة مستخدمة. هنا نعرض مقايسة صغيرة نموذجية باستخدام عدة فحص انزيمية تجارية.- تطبيق 8 ميكرولتر من عينة البروتين الدهني ومادة معايرة القياسية على 96-جيدا microplate.
- إضافة 240 μL من الكاشف ومزيج عن طريق الأنابيب.
- احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- قياس OD مع قارئ microplate وحساب تركيزات الدهون.
- تحليل Apolipoprotein
- SDS-PAGE وCBB تلطيخ
- إعداد العينة: إضافة 10 ميكرولتر من 2x عينة العازلة إلى 10 ميكرولتر من كسور البروتين الدهني. سخني الخليط على حرارة 80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق باستخدام كتلة حرارة جافة.
- إعداد 4-20٪ التدرج SDS-polyacrylamide هلام وإعداد هلام على غرفة الكهرباء مليئة المخزن المؤقت تشغيل.
- تحميل عينة البروتين الدهني (10 ميكرولتر / حارة) ومعايير البروتين (5 ميكرولتر / حارة) على هلام التراص.
ملاحظة: إذا كانت العينات مركزة مرتين، سيتم تحليل كمية مكافئة من البلازما 20 ميكرولتر لكل حارة.] - تشغيل الكهرباء في 20-40 mA التيار المستمر.
- CBB تلطيخ: نقع الجل مرتين في حل تحديد مع اهتزاز لطيف لمدة 10 دقيقة. وصمة عار هلام مع CBB تلطيخ حل لمدة 30 دقيقة. شطف الجل في الماء المقطر لإزالة وصمة عار الزائدة. الجل جاهز للتصوير.
- النشاف الغربي
- إجراء الكهرباء في نفس الإجراء كما هو موضح أعلاه.
ملاحظة: حجم البروتينات الدهنية التي تم تحميلها لنشاف الغربية أقل من لCBB تلطيخ المذكورة أعلاه (على سبيل المثال 1-5 ميكرولتر). - ضع الجل وغشاء PVDF بين ورق التصفية المنقوع بالمخزن المؤقت ولوحة الشكل. إعداد شطيرة في حامل كاسيت ومكان في خزان مليئة المخزن المؤقت نقل.
- تنفيذ electroblotting في 100 mA التيار الثابت لمدة 3 ساعة في 4 درجة مئوية.
- حظر: احتضان الغشاء في عازلة سد لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
- رد فعل AB الابتدائي: احتضان الأغشية في ABS الأولية المخففة مع عازلة منع لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع اهتزاز معتدل.
ملاحظة: يتم عرض التخفيف الأولي المقترح في جدول المواد. ثلاثة أنواع من ABS الابتدائي ضد apolipoproteins يمكن استخدامها بشكل غير معولي أو في الكوكتيلات. - غسل الغشاء ثلاث مرات في الغسيل العازلة مع التحريض، 5 دقيقة لكل غسل.
- رد فعل AB الثانوي: احتضان الغشاء في ABS الثانوية المخففة مع عازلة منع لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات.
ملاحظة: يتم عرض التخفيف الثانوي المقترح Ab في جدول المواد. - غسل الغشاء ثلاث مرات في الغسيل العازلة مع التحريض، 5 دقيقة لكل غسل.
- كشف ECL: ضع الغشاء على غلاف بلاستيكي. إضافة الكواشف كشف ECL واحتضان لمدة 1 دقيقة. استنزاف السائل الزائد وختم الغشاء في كيس.
- تصور الإشارات باستخدام محلل صورة.
- إجراء الكهرباء في نفس الإجراء كما هو موضح أعلاه.
- SDS-PAGE وCBB تلطيخ
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام هذا البروتوكول، عزلنا البروتين الدهني للأرانب باستخدام 1 مل من البلازما وحصلنا على 7 كسور كثافة. كسور الكثافة المعزولة كافية لقياس الدهون وروبروبروتينات apolipoproteins كما هو موضح أعلاه لمعظم أغراض البحث. ويمكن أيضا أن تستخدم نفس الإجراء لعزل البروتينات الدهنية البلازما من البشر والأنواع الأخرى. بالنسبة للحيوانات الصغيرة الحجم مثل الفئران ، يلزم البلازما المجمعة. ويبين الشكل 3 ملامح البروتين الدهني من نوع البرية (WT) الأرانب تغذية إما العادية القياسية (NS) النظام الغذائي أو ارتفاع نسبة الكولسترول في الدم (HC) النظام الغذائي. الأرانب هي الحيوانات الأعشاب حتى البلازما TC، TG، ومستويات PL عموما أقل من البشر والفئران. في NS تغذية الأرانب الغذائية، يتم توزيع TC أساسا في HDL3 (د = 1.21 ز / مل) ويليه LDL (d = 1.04 غرام / مل) (الشكل 3A). على نظام غذائي NS، يتم توزيع 39٪ من البلازما TG في VLDLs في حين أن 57٪ من البلازما PL ترد في HDL3 (الشكل 3A). عندما تم تحدي الأرانب مع اتباع نظام غذائي مكمل مع ارتفاع الكوليسترول في الدم، أنها تطورت بسرعة إلى ارتفاع الكوليسترول. كما هو مبين في الشكل 3B، تتميز ملامح البروتين الدهني بارتفاع ملحوظ من VLDLs (165-fold↑ في VLDL-TC ، 1.5-fold↑ في VLDL-TG ، و 30-fold↑ في VLDL-PL مقارنة بالأرانب التي تغذيها NS). لأن VLDLs معزولة عن الأرانب التي تغذيها الكوليسترول غنية في استرات cholesteryl والانتقال إلى موقف β على agarose هلام الكهرباء، وغالبا ما تسمى β-VLDLs لتمييزها عن VLDLs العادية التي تنتقل إلى موقف ما قبل β.
بالإضافة إلى الدهون، يمكن ببساطة تحليل apolipoproteins من قبل SDS-PAGE إما عن طريق تلطيخ مصرف البحرين المركزي أو النشاف الغربية(الشكل 4). تم تشغيل سبعة كسور البروتين الدهني من WT الأرانب تغذية إما NS أو حمية HC على 4-20٪ SDS-polyacrylamide هلام وتصور مع تلطيخ مصرف البحرين المركزي (الشكل 4A). على نظام غذائي HC، كانت محتويات apoB-100 و apoE في VLDLs (d<1.006 g/mL)، وIDLs (d=1.02 g/mL)، وLDLs (d=1.04 g/mL) مرتفعة بشكل ملحوظ مقارنة بالأرانب على نظام غذائي NS. وعلاوة على ذلك، قارنا أيضا apolipoprotein وملامح lipoprotein من ثلاثة الأرانب hyperlipidemic مختلفة: HC تغذية الأرانب WT النظام الغذائي، apoE خروج المغلوب (KO) الأرانب، وواتانابي هتورميدميك (WHHL) الأرانب مع نقص مستقبلات LDL عن طريق النشاف الغربية(الشكل 4B). تم تجزئة البروتين الدهني البلازما بنسبة 4-20٪ SDS-PAGE وتبعها النشاف الغربي مع الأجسام المضادة ضد apoE، apoB، و apoA-I. تتميز الجسيمات المحتوية على apoB (VLDLs وIDLs وLDLs) من WT الأرانب التي تتغذى على النظام الغذائي HC بزيادة محتويات apoB-100 و apoE في حين أظهرت الأرانب apoE KO زيادة ملحوظة في apoB-48 جنبا إلى جنب مع ظهور apoA-I. الأرانب WHHL هي نقص وراثيا في وظائف مستقبلات LDL لذلك هناك زيادة ملحوظة من apoB-100 في LDLs يرافقه انخفاض apoA-I في HDLs، وهو ما يشبه فرط الكوليسترول في الدم الأسرة البشرية.
الشكل 1: رسم تخطيطي للطرد فوق المركزي العائم المتتابع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صور تمثيلية لعزلة البروتين الدهني البلازما. (أ) البلازما من الأرانب normolipidemic و hyperlipidemic. (B) VLDL تعويم طفح (d< 1.006 ز / مل) والكسر السفلي (د> 1.006 ز / مل) بعد الrifugation فائقة التركيز. (C) أنبوب تشريح وجمع من الجزء العلوي من قبل ماصة. (D) مجموعة من الكسر السفلي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: كمية محتويات الدهون في كل جزء من البروتين الدهني المعزول عن الأرانب العادية (A) والأرانب التي تتغذى على الكوليسترول (B). تم فصل البروتينات الدهنية البلازما بواسطة طرد فائق التركيز العائمة المتتابعة من البلازما من الأرانب من النوع البري على نظام غذائي عادي(A)أو نظام غذائي عالي الكوليسترول (B). تم قياس الكوليسترول الكلي (TC) والدهون الثلاثية (TG) والفوسفوليبيدات (PL). يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ± SEM (n = 6). وقد تم تعديل هذا الرقم من يان ه وآخرون12. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مقارنة توزيع البروتين apolipoprotein باستخدام تلطيخ مصرف CBB (A) والناشاف الغربي (B). تم عزل البلازما عن طريق الطرد الشديد وproteins اجزء من قبل 4-20٪ SDS-PAGE. (A) Apolipoprotein لمحات من نوع البرية (WT) الأرانب تغذية على معيار عادي (NS) النظام الغذائي وارتفاع الكوليسترول في الدم (HC) وتصور من قبل تلطيخ مصرف البحرين المركزي. بالمقارنة مع NS تغذية الأرانب الغذائية (يسار), أظهرت الأرانب HC تغذية النظام الغذائي (يمين) زيادة apoB-100 و apoE محتويات في VLDLs, IDLs, وLDLs. (B) مقارنة ميزات apolipoprotein من الأرانب WT على NS أو نظام غذائي HC, apoE KO (خروج المغلوب) الأرانب على حمية HC, وWHHL الأرانب على الحمية NS. تم تنفيذ النشاف الغربي مع "أجسام مضادة كوكتيل" ضد apoE، apoB، وapoA-I. بالمقارنة مع الأرانب normolipidemic (WT الأرانب على نظام غذائي NS، اليسار الأول)، وغيرها من ثلاثة الأرانب hyperlipidemic المعرض فريدة ومختلفة apolipoprotein ملامح. تتميز الجسيمات المحتوية على apoB (VLDLs وIDLs وLDLs) من أرانب WT التي تتغذى على HC بزيادة محتويات apoB-100 و apoE في حين أظهرت أرانب apoE KO زيادة ملحوظة في apoB-48 جنبا إلى جنب مع ظهور apoA-I. أظهرت WHHL زيادة ملحوظة في apoB-100 في LDLs مصحوبة بـ apoA-I في HDLs. وقد تم تعديل هذا الرقم من Niimi M et al.10. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| محلول الكثافة (g/mL) | KBr (ز) | الماء المقطر (مل) |
| d=1.006 | 8.404 | 1000 |
| d= 1.02 | 28.271 | 1000 |
| d=1.04 | 57.261 | 1000 |
| d=1.06 | 86.958 | 1000 |
| d= 1.08 | 117.365 | 1000 |
| d= 1.10 | 148.490 | 1000 |
| d= 1.21 | 333.394 | 1000 |
الجدول 1: إعداد محلول كثافة بروميد البوتاسيوم (KBr). الوزن (ز) من KBr إضافة إلى 1000 مل الماء المقطر هو مبين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تعد الدهون المفرطة من أهم عوامل الخطر لمرض تصلب الشرايين. وهكذا، تحليل البروتينات الدهنية البلازما ليس فقط ضروري لتشخيص مرضى dyslipidemia ولكن أيضا مهم للتحقيق في الآليات الجزيئية لعملية التمثيل الغذائي البروتين الدهني و تصلب الشرايين. في هذه الدراسة، وصفنا بروتوكول عزل وتحليل البروتينات الدهنية البلازما التي يمكن تطبيقها في المختبرات حيث يتوفر الطارد الشديد. المعلومات التي يتم الحصول عليها من خلال هذه الطريقة شاملة ومباشرة ولذلك فمن المستحسن لكل من علماء البحوث السريرية والأساسية. ويمكن أيضا أن تستخدم البروتينات الدهنية المعزولة للتحقيق في العديد من جوانب أخرى من وظائف البروتين الدهني مثل المجهر الإلكترون البقعة السلبية13,14, أكسدة9,15,بروتوميك 16, ثقافة الخلية القائمة في دراسة في المختبر مثل الكولسترول efflux مقولة9 و lipoprotein امتصاص المقايسة17.
وينبغي الإشارة إلى ذلك؛ ومع ذلك، هناك العديد من نقاط الضعف التي تحتاج إلى أخذ الاعتبارات. أولاً، هذه الطريقة تستغرق وقتاً طويلاً نسبياً (ثلاثة أيام على الأقل) مقارنة بالأساليب الأخرى. إذا كان استخدام أحدث الطاولة فائقة الوضوح، عالية السرعة تدور (150،000 دورة في الدقيقة) يمكن تقصير فصل الوقت 50-140 دقيقة لكل كسر البروتين الدهني18. ثانياً، قد يحدث فقدان العينة أثناء العزل. لتقليل فقدان العينة، يجب حل اللزوج في الجزء السفلي وجمعها بعناية عن طريق الأنابيب. تحتاج أنابيب الطرد المركزي إلى الإصلاح بإحكام باستخدام مقسم شرائح لتجنب تسرب الكسر العلوي. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي استرداد العينات بعناية من أكياس غسيل الكلى. ويمكن حساب الانتعاش عن طريق مقارنة الكوليسترول البروتين الدهني الكلي مع الكولسترول البلازما الأصلي. وفقا لخبرتنا، سيتم ≈ معدل الاسترداد العام 80٪19. ثالثاً، يقتصر هذا البروتوكول على عدد قليل من العينات لأن الدوار الواحد لا يمكن أن يعمل إلا اثني عشر أنبوباً في المرة الواحدة. لتنفيذ عدد كبير من العينات، قد يكون من المناسب استخدام أساليب أخرى مثل طريقة هطول الأمطار لإعداد HDL4 وHHPLC تحليل البروتين الدهني الآلي20.
باختصار، يوفر هذا البروتوكول دليلا للباحثين لعزل البروتينات الدهنية البلازما باستخدام الكثافة التسلسلية فائقة الطرد وتحليل الدهون وproteins.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح بحثية من منحة JSPS KAKENHI رقم JP 20K08858، المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81941001 و 81770457)، JSPS-CAS في إطار برنامج التعاونية البحثية اليابانية الصينية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22-gauge needle | Terumo | NN-2232S | For blood collection |
| 96-well microplate | greiner bio-one | 655101 | For lipids measurment |
| Anti-apolipoprotein A-I antibody | LifeSpan BioSciences | LS-C314186 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein B antibody | ROCKLAND | 600-101-111 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein E antibody | Merck Millipore | AB947 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| CBB staining kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 299-50101 | For apolipoprotein analysis |
| Centrifuge | HITACHI | himac CF15RN | |
| Closure | Spectrum | 132736 | For lipoprotein dialysis |
| Dialysis tubing | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 043-30921 | For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000 |
| Dry heat block | Major Science | MD-01N | For SDS-PAGE sample preparation |
| ECL Western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | For Western blotting |
| Electrophoresis Chamber | BIO-RAD | Mini-PROTEAN Tetra Cell | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 345-01865 | For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM) |
| Filter paper | ADVANTEC | 590 | For Western blotting |
| Fixed angle ultracentrifuge rotor | BECKMAN COULTER | 357656 | TLA-120.2 |
| Fixing solution | For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid) | ||
| Immun-Blot PVDF menbrane | BIO-RAD | 1620177 | For Western blotting |
| Lumino image analyzer | GE Healthcare | For Western blotting, ImageQuant LAS 4000 | |
| Magnetic stirrer | ADVANTEC | SR-304 | For lipoprotein dialysis |
| Microplate reader iMARK | BIO-RAD | For lipids measurment | |
| Microtube | INA-OPTIKA | SC-0150 | |
| Orbital agitator USBDbo | Stovall Life Science | ||
| Peroxidase congugated anti goat IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-035-003 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Phospholipids assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 433-36201 | For lipids measurment |
| Polycarbonate ultracentrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 343778 | |
| Potassium Bromide | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 168-03475 | For density solution |
| Power Supply | BIO-RAD | For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC | |
| Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra | BIO-RAD | 161-0377 | For SDS-PAGE and Western blotting |
| Rabbit restrainer | Natsume Seisakusho | KN-318 | For blood collection |
| Rotor | HITACHI | T15A43 | |
| SDS-PAGE running buffer | 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS | ||
| SDS-PAGE sample buffer (2x) | 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol | ||
| SDS-polyacrylamide gel | 4-20% gradient polyacrylamide gel | ||
| Skim milk powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-12865 | For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS) |
| Total cholesterol assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 439-17501 | For lipids measurment |
| Triglyicerides assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 432-40201 | For lipids measurment |
| Tube slicer for thick-walled tube | BECKMAN COULTER | 347960 | For lipoprotein isolation |
| Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS) |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A95761 | Optima MAX-TL |
| Western blotting wet transfer system | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Cell |
References
- Gordon, T., Castelli, W. P., Hjortland, M. C., Kannel, W. B., Dawber, T. R. High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: The Framingham study. The American Journal of Medicine. 62 (5), 707-714 (1977).
- Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), London, England. 1267-1278 (2005).
- Nauck, M., Warnick, G. R., Rifai, N. Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation. Clinical Chemistry. 48 (2), 236-254 (2002).
- Warnick, G. R., Nauck, M., Rifai, N. Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays. Clinical Chemistry. 47 (9), 1579-1596 (2001).
- Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. The Journal of Clinical Investigation. 34 (9), 1345-1353 (1955).
- Hatch, F. T., Lees, R. S. Practical Methods for Plasma Lipoprotein Analysis. Advances in Lipid Research. 6, 1-68 (1968).
- Lindgren, F. T., Adamson, G. L., Jenson, L. C., Wood, P. D. Lipid and lipoprotein measurements in a normal adult American population. Lipids. 10 (12), 750-756 (1975).
- Fan, J., et al. Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction of plasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 8724-8728 (1994).
- Wang, Y., et al. Human Apolipoprotein A-II Protects Against Diet-Induced Atherosclerosis in Transgenic Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), 224-231 (2013).
- Niimi, M., et al. ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia. Atherosclerosis. 245, 187-193 (2016).
- Zhang, J., et al. Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in RabbitsHighlights. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1068-1075 (2017).
- Yan, H., et al. Endothelial Lipase Exerts its Anti-Atherogenic Effect through Increased Catabolism of β-VLDLs. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 40 (9), 2095-2107 (2020).
- Fan, J., et al. Overexpression of Lipoprotein Lipase in Transgenic Rabbits Inhibits Diet-induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40071-40079 (2001).
- Koike, T., et al. Expression of Human ApoAII in Transgenic Rabbits Leads to Dyslipidemia: A New Model for Combined Hyperlipidemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (12), 2047-2053 (2009).
- Ichikawa, T., et al. Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits leads to increased small dense LDL in plasma and promotes atherosclerosis. Laboratory investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (6), 715-726 (2004).
- von Zychlinski, A., Kleffmann, T. Dissecting the proteome of lipoproteins: New biomarkers for cardiovascular diseases. Translational Proteomics. 7, 30-39 (2015).
- Yan, H., et al. Apolipoprotein CIII Deficiency Protects Against Atherosclerosis in Knockout Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (2), 157-168 (2021).
- Kang, I., Park, M., Yang, S. J., Lee, M. Lipoprotein Lipase Inhibitor, Nordihydroguaiaretic Acid, Aggravates Metabolic Phenotypes and Alters HDL Particle Size in the Western Diet-Fed db/db Mice. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 3057 (2019).
- De Silva, H. V., et al. Overexpression of human apolipoprotein C-III in transgenic mice results in an accumulation of apolipoprotein B48 remnants that is corrected by excess apolipoprotein E. Journal of Biological Chemistry. 269 (3), 2324-2335 (1994).
- Usui, S., Hara, Y., Hosaki, S., Okazaki, M. A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC. Journal of Lipid Research. 43 (5), 805-814 (2002).
