Summary
Se han utilizado varios métodos para analizar lipoproteínas plasmáticas; sin embargo, ultracentrifugación sigue siendo uno de los métodos más populares y confiables. Aquí, describimos un método con respecto a cómo aislar las lipoproteínas del plasma utilizando ultracentrifugación de densidad secuencial y cómo analizar las apolipoproteínas con fines diagnósticos y de investigación.
Abstract
El análisis de lipoproteínas plasmáticas y apolipoproteínas es una parte esencial para el diagnóstico de dislipidemia y estudios de metabolismo lipídico y aterosclerosis. Aunque hay varios métodos para analizar lipoproteínas plasmáticas, ultracentrifugación sigue siendo uno de los métodos más populares y fiables. Debido a su procedimiento de separación intacto, las fracciones de lipoproteína aisladas por este método se pueden utilizar para el análisis de lipoproteínas, apolipoproteínas, proteomas, y estudio funcional de lipoproteínas con células cultivadas in vitro. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para aislar siete fracciones de lipoproteína incluyendo VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), PMA (d=1.04 y 1.06 g/mL), HDL (d=1.08, 1.10, y 1.21 g/mL) de plasma de conejo utilizando ultracentrifugación flotante secuencial. Además, presentamos a los lectores cómo analizar apolipoproteínas como apoA-I, apoB y apoE por SDS-PAGE y Western blotting y mostrar resultados representativos de perfiles de lipoproteína y apolipoproteína utilizando modelos de conejo hiperlipidémico. Este método puede convertirse en un protocolo estándar para que tanto los médicos como los científicos básicos analicen las funciones de lipoproteína.
Introduction
La dislipidemia es el principal factor de riesgo de la enfermedad aterosclerótica en el mundo. Los altos niveles de lipoproteínas de baja densidad (PMA) y los bajos niveles de lipoproteínas de alta densidad (HDL) están estrechamente asociados con un alto riesgo de enfermedad coronaria (CHD)1,2. En el entorno clínico, tanto el colesterol LDL (LDL-C) como el colesterol HDL (HDL-C) se miden rutinariamente utilizando un analizador automatizado en un laboratorio clínico3,4. A pesar de esto, es esencial analizar los perfiles de lipoproteína en detalle para el diagnóstico de dislipidemia y el estudio del metabolismo lipídico y la aterosclerosis en animales humanos y experimentales. Se han notificado varios métodos para analizar lipoproteínas plasmáticas como ultracentrifugación, cromatografía de exclusión de tamaño [cromatografía líquida de proteína rápida (FPLC) y cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)], electroforesis por agarose y geles de poliacrilamida, resonancia magnética nuclear y precipitación química selectiva utilizando polianiones y cálculos divalentes u otros productos químicos. En la década de 1950, el grupo de Havel propuso por primera vez el concepto de lipoproteínas definidas por densidades utilizando ultracentrifugación y las clasificó en chylomicrons (CM), lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), lipoproteínas de densidad intermedia (IDL), LDL y HDL5 y posteriores, el método fue modificado por otros grupos6,7. Hasta ahora, ultracentrifugación es el método más popular y fiable, mientras que el protocolo práctico todavía no está disponible. En este artículo, intentamos describir un protocolo fácil de usar para aislar una pequeña escala de plasma utilizando ultracentrifugación flotante de densidad secuencial descrita originalmente anteriormente8. Aislamiento de siete fracciones plasmáticas de lipoproteína [VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), PMA (d=1.04 y 1.06 g/mL), HDLs (d=1.08, 1.10, y 1.21 g/mL)] permite a los investigadores hacer un análisis exhaustivo de las lipoproteínas y sus apolipoproteínas composicionales9,10,11. Las lipoproteínas intactas de siete densidades consecutivas se pueden utilizar para analizar las funciones de lipoproteína y también servir para estrategias in vitro basadas en células. Este protocolo debe ser útil tanto para el diagnóstico clínico como para la investigación básica. Aquí usamos plasma de conejo como ejemplo para demostrar esta técnica, mientras que el plasma de otras especies se puede aplicar de la misma manera.
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Protocol
Todos los procedimientos para los estudios de conejo se realizaron con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Yamanashi (Número aprobado: A28-39).
1. Separación plasmática de sangre de conejo
- Preparar microtubos de 1,5 ml que contengan 15 μL de 0,5 M EDTA (pH 8,0) para la recolección de sangre.
- Ponga un conejo en un retenedador y pinche una arteria intermedia auricular usando una aguja del calibre 22 y recoja sangre en un tubo. Mezcle la sangre con EDTA suavemente y colócalos en hielo.
- Centrífuga los tubos sanguíneos a 1.500 x g durante 20 minutos a 4 °C y recoge plasma en un nuevo microtubo.
NOTA: 3 ml de sangre es suficiente para recolectar plasma de 1 ml. Si recoges sangre de ratones u otros animales pequeños, necesitas juntarlas.
2. Aislamiento de lipoproteínas plasmáticas
NOTA: El procedimiento esquemático se muestra en la figura 1. El método de preparación de las soluciones de densidad de bromuro de potasio (KBr) se muestra en la Tabla 1.
- Transferir 1 ml de plasma a un tubo ultracentrífuga de policarbonato(Figura 2A).
- Cargue estos tubos en un rotor de ángulo fijo y centrífuga el plasma a 356.000 x g durante 2,5 h a 4 °C (Figura 2B).
NOTA: Para Beckman TLA 120.2 rotor, 356,000 x g (campo centrífugo relativo promedio, Av RCF) corresponde a 100,000 rpm. - Corte los tubos con una cortadora y luego recoja la fracción superior [VLDL (d<1.006 g/mL)], aproximadamente 200 μL en un nuevo microtubo (Figura 2C). Recoja la fracción inferior restante en un nuevo tubo ultracentrífuga de policarbonato para la siguiente separación (Figura 2D). Mida el volumen y haga el volumen total a 800 μL añadiendo la misma solución de densidad (d=1.006 g/mL).
NOTA: Configure una cuchilla en la cortadora de tubos. Ajuste la posición de la hoja a un nivel entre la fracción superior (200 μL) y la fracción inferior (800 μL). El precipitante viscoso en la fracción inferior debe recogerse cuidadosamente y completamente pipeteando en todos los pasos siguientes. Si se detiene, hazlo después de separar la fracción superior e inferior en todos los pasos. Guarde la muestra a 4°C hasta la siguiente centrifugación. - Ajuste la fracción inferior (total 800 μL) a d=1,02 g/ml añadiendo 58,9 μL de solución d=1,21 g/ml y 141,1 μL de solución d=1,02 g/ml (el volumen total es de 1 ml).
- Cargue estos tubos en rotor de ángulo fijo y centrífuga a 356.000 x g durante 2,5 h a 4 °C.
- Corte los tubos usando una cortadora y luego recoja la fracción superior [IDL (d=1.02 g/mL)] aproximadamente 200 μL en un nuevo microtubo. Recoge la fracción inferior restante en un nuevo tubo ultracentrífuga de policarbonato para la siguiente separación. Mida el volumen y haga el volumen total a 800 μL añadiendo la misma solución de densidad (d=1,02 g/mL).
- Ajuste la fracción inferior (total 800 μL) a d=1,04 g/ml añadiendo 94,1 μL de solución d=1,21 g/ml y 105,9 μL de solución d=1,04 g/ml (el volumen total es de 1 ml).
- Cargue estos tubos en un rotor de ángulo fijo y centrífuga a 356.000 x g durante 2,5 h a 4 °C.
- Corte los tubos usando una cortadora y luego recoja la fracción superior [LDL (d=1.04 g/mL)] aproximadamente 200 μL en un nuevo microtubo. Recoge la fracción inferior restante en un nuevo tubo ultracentrífuga de policarbonato para la siguiente separación. Mida el volumen y haga el total a 800 μL añadiendo la misma solución de densidad (d=1,04 g/mL).
- Ajuste la fracción inferior (total 800 μL) a d=1,06 g/ml añadiendo 106,7 μL de solución d=1,21 g/ml y 93,3 μL de solución d=1,06 g/ml (el volumen total es de 1 ml).
- Cargue estos tubos en un rotor de ángulo fijo y centrífuga a 356.000 x g durante 2,5 h a 4 °C.
- Corte los tubos usando una cortadora y luego recoja la fracción superior [LDL (d=1.06 g/mL)] aproximadamente 200 μL en un nuevo microtubo. Recoge la fracción inferior restante en un nuevo tubo ultracentrífuga de policarbonato para la siguiente separación. Mida el volumen y haga el total a 800 μL añadiendo la misma solución de densidad (d=1,06 g/mL).
- Ajuste la fracción inferior (total 800 μL) a d=1,08 g/ml añadiendo 123,1 μL de solución d=1,21 g/ml y 76,9 μL de solución d=1,08 g/ml (el volumen total es de 1 ml).
- Cargue estos tubos en un rotor de ángulo fijo y centrífuga a 356.000 x g durante 2,5 h a 4 °C.
- Corte los tubos usando una cortadora y luego recoja la fracción superior [HDL2 (d=1.08 g/mL)] aproximadamente 200 μL en un nuevo microtubo. Recoge la fracción inferior restante en un nuevo tubo ultracentrífuga de policarbonato para la siguiente separación. Mida el volumen y haga el total a 800 μL añadiendo la misma solución de densidad (d=1,08 g/mL).
- Ajuste la fracción inferior (total 800 μL) a d=1,10 g/ml añadiendo 145,5 μL de solución d=1,21 g/ml y 54,5 μL de solución d=1,10 g/ml (el volumen total es de 1 ml).
- Cargue estos tubos en un rotor de ángulo fijo y centrífuga a 356.000 x g durante 2,5 h a 4 °C.
- Corte los tubos usando una cortadora y luego recoja la fracción superior [HDL2 (d=1.10 g/mL)] aproximadamente 200 μL en un nuevo microtubo. Recoge la fracción inferior restante en un nuevo tubo ultracentrífuga de policarbonato para la siguiente separación. Mida el volumen y haga el total a 800 μL añadiendo la misma solución de densidad (d=1.10 g/mL).
- Ajuste la fracción inferior (total 800 μL) a d=1,21 g/ml añadiendo 0,140 g de bromuro de potasio (KBr) en polvo y disuelva por completo. Mida el volumen y consédelos a 1 mL añadiendo solución d=1.21 g/mL.
- Cargue estos tubos en rotor de ángulo fijo y centrífuga a 513.000 x g durante 4 h a 4 °C.
NOTA: Para el rotor Beckman TLA 120.2, 513.000 x g (Av RCF) corresponde a 120.000 rpm. - Cortar los tubos usando una cortadora y luego recoger la fracción superior [HDL3 (d = 1.21 g / mL)] aproximadamente 200 μL en un nuevo microtubo. Este es el último paso para la ultracentrorifugación.
3. Diálisis
NOTA: Debido a que las fracciones de densidad (excepto d<1.006 g/mL fracción) contienen altas concentraciones de KBr, es necesario eliminarlas por diálisis.
- Transfiera las fracciones de densidad a un tubo de diálisis y recorte ambos extremos con cierres.
- Diabólico contra 2 L de tampón de diálisis como PBS/ 1 mM EDTA durante 6 h a 4 °C con agitación usando un agitador magnético.
- Sustitúyalo por un nuevo búfer y diabólico de nuevo durante otras 6 h a 4 °C.
- Recopile las fracciones de densidad y mida el volumen. Ajuste todas las fracciones de densidad al mismo volumen (por ejemplo, 250 μL).
NOTA: Puede calcular el factor concentrado a partir de 1 ml de plasma original (por ejemplo, 250 μL de fracción de densidad corresponde a cuatro veces la concentración).
4. Análisis de lipoproteínas
NOTA: Después de la diálisis, estas lipoproteínas están listas para diferentes análisis. Las lipoproteínas se pueden evaluar midiendo lípidos o apolipoproteínas o ambas. Para medir contenidos lipídicos como colesterol total (TC), triglicéridos (TG), fosfolípidos (PL) y colesterol libre (FC) en cada fracción, utilizamos kits de ensayo colorimétricos enzimáticos comerciales. Para el análisis de apolipoproteínas, utilizamos SDS-PAGE visualizado con tinción CBB o hinchazón occidental.
- Análisis lipídico
NOTA: Los lípidos como TC, TG, PL y FC en la fracción de lipoproteína se pueden medir utilizando kits de medición disponibles comercialmente. Los procedimientos dependen de los reactivos utilizados, así que siga las instrucciones de cada kit utilizado. Aquí mostramos un ensayo típico de microplacas usando un kit de ensayo enzimático comercial.- Aplique 8 μL de muestra de lipoproteína y sustancia de calibración estándar en microplaca de 96 pozos.
- Añadir 240 μL de reactivo de ensayo y mezclar por pipeteo.
- Incubar a 37 °C durante 10 min.
- Mida el sistema operativo con un lector de microplacas y calcule las concentraciones de lípidos.
- Análisis de Apolipoprotein
- Manchas SDS-PAGE y CBB
- Preparación de la muestra: Añadir 10 μL de 2x buffer de muestra a 10 μL de fracción de lipoproteína. Caliente la mezcla a 80 °C durante 5 minutos utilizando un bloque de calor seco.
- Prepare un gel SDS-poliacrilamida de gradiente del 4-20% y configure el gel en la cámara de electroforesis llena de amortiguador de funcionamiento.
- Cargue la muestra de lipoproteína (10 μL/carril) y los estándares proteicos (5 μL/carril) en el gel de apilamiento.
NOTA: Si las muestras se concentran dos veces, se analizará una cantidad equivalente de plasma de 20 μL por carril.] - Ejecute la electroforesis a una corriente constante de 20-40 mA.
- Tinción CBB: Remoje el gel dos veces en solución de fijación con agitación suave durante 10 minutos. Manchar el gel con solución de tinción CBB durante 30 min. Enjuague el gel en agua destilada para eliminar el exceso de manchas. El gel está listo para fotografiar.
- Hinchazón occidental
- Realice la electroforesis en el mismo procedimiento descrito anteriormente.
NOTA: El volumen de lipoproteínas cargadas para la hinchazón occidental es menor que para las manchas de CBB descritas anteriormente (por ejemplo, 1-5 μL). - Coloque el gel y la membrana PVDF entre el papel filtrante empapado en búfer de transferencia y la almohadilla de formulario. Coloque el sándwich en un casete de soporte y colóquelo en un tanque lleno de búfer de transferencia.
- Realice el electroblotting a una corriente constante de 100 mA durante 3 h a 4 °C.
- Bloqueo: Incubar la membrana en amortiguador de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C.
- Reacción ab primaria: Incubar las membranas en los abdominales primarios diluidos con amortiguador de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C con temblores leves.
NOTA: La dilución primaria sugerida ab se muestra en la tabla de materiales. Tres tipos de abs primarios contra apolipoproteínas se pueden utilizar individualmente o en cócteles. - Lave la membrana tres veces en búfer de lavado con agitación, 5 minutos por lavado.
- Reacción ab secundaria: Incubar la membrana en los abdominales secundarios diluido con amortiguador de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente con agitación.
NOTA: La dilución ab secundaria sugerida se muestra en la tabla de materiales. - Lave la membrana tres veces en búfer de lavado con agitación, 5 minutos por lavado.
- Detección de ECL: Coloque la membrana sobre una envoltura de plástico. Agregue reactivos de detección de ECL e incuba durante 1 min. Escurrir el exceso de líquido y sellar la membrana en una bolsa.
- Visualice las señales mediante un analizador de imágenes.
- Realice la electroforesis en el mismo procedimiento descrito anteriormente.
- Manchas SDS-PAGE y CBB
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Representative Results
Usando este protocolo, aislamos lipoproteínas de conejo usando 1 ml de plasma y obtuvimos siete fracciones de densidad. Las fracciones aisladas de densidad son suficientes para medir lípidos y apolipoproteínas como se describió anteriormente para la mayoría de los propósitos de investigación. El mismo procedimiento también se puede utilizar para aislar lipoproteínas plasmáticas de especies humanas y de otras especies. Para animales pequeños como ratones, se requiere plasma agrupado. Figura 3 muestra perfiles de lipoproteína de conejos de tipo salvaje (WT) alimentados con una dieta estándar normal (NS) o dieta de colesterol alto (HC). Los conejos son animales herbívoros por lo que sus niveles plasmáticos de TC, TG y PL son generalmente más bajos que los humanos y ratones. En los conejos alimentados por dieta NS, tc se distribuye principalmente en HDL3 (d = 1.21 g / mL) y seguido de LDL (d = 1.04 g / mL) (Figura 3A). En una dieta NS, el 39% de los TG plasmáticos se distribuyen en VLDLs, mientras que el 57% de la PL plasmática está contenida en HDL3 (Figura 3A). Cuando los conejos fueron desafiados con una dieta complementada con colesterol alto, rápidamente se convirtieron en hipercolesterolemia. Como se muestra en la Figura 3B,los perfiles de lipoproteína se caracterizan por una elevación marcada de VLDLs (165 veces↑ en VLDL-TC, 1,5 veces↑ en VLDL-TG y 30 veces↑ en VLDL-PL en comparación con conejos alimentados con NS). Debido a que los VLDLs aislados de conejos alimentados con colesterol son ricos en ésteres de colesterilo y se mueven a la posición β en la electroforesis de gel de agarose, a menudo se les llama β-VLDLs para distinguirlos de los VLDLs normales que se mueven a la posición pre-β.
Además de los lípidos, las apolipoproteínas pueden ser simplemente analizadas por SDS-PAGE ya sea por tinción CBB o hinchazón occidental (Figura 4). Siete fracciones de lipoproteína de conejos WT alimentados con un NS o una dieta HC se ejecutaron en un gel 4-20% SDS-poliacrylamide y se visualizaron con tinción CBB(Figura 4A). En una dieta de HC, tanto el contenido de apoB-100 como el contenido de apoE en VLDLs (d<1.006 g/mL), los IDLs (d=1.02 g/mL) y los PMA (d=1.04 g/mL) fueron notablemente elevados en comparación con los conejos en una dieta de NS. Además, también comparamos los perfiles de apolipoproteína y lipoproteína de tres conejos hiperlipidémicos diferentes: conejos WT alimentados por dieta de HC, conejos apoE knockout (KO) y conejos hiperlipidémicos heredables watanabe (WHHL) con deficiencia de receptores LDL por hinchazón occidental (Figura 4B). Las lipoproteínas plasmáticas fueron fraccionadas por 4-20% SDS-PAGE y seguidas por la hinchazón occidental con anticuerpos contra apoE, apoB y apoA-I. Las partículas que contienen apoB (VLDLs, IDLs y LDL) de conejos WT alimentados por dieta de HC se caracterizan por un aumento del apoB-100 y un contenido apoE, mientras que los conejos KO apoE mostraron un marcado aumento de apoB-48 junto con la apariencia de apoA-I. Los conejos WHHL son genéticamente deficientes en las funciones de los receptores LDL, por lo que hay un marcado aumento de apoB-100 en los LDL acompañados de una reducción de la apoA-I en los HDLs, que es similar a la hipercolesterolemia familiar humana.
Figura 1: Ilustración esquemática de ultracentrifugación flotante secuencial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes representativas del aislamiento de lipoproteínas plasmáticas. (A) Plasma de conejos normolipidémicos e hiperlipidémicos. (B) VLDL superior flotado (d<1.006 g/mL) y fracción inferior (d>1.006 g/mL) después de ultracentrifugación. (C) Corte de tubo y recolección de la fracción superior por una pipeta. (D) Colección de la fracción inferior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cuantificación del contenido lipídico en cada fracción de lipoproteína aislada de conejos normales (A) y conejos alimentados con colesterol (B). Las lipoproteínas plasmáticas fueron separadas por ultracentrifugación flotante secuencial del plasma de conejos de tipo salvaje en una dieta estándar normal(A)o una dieta alta en colesterol (B). Se midieron el colesterol total (TC), los triglicéridos (TG) y los fosfolípidos (PL). Los datos se expresan como media ± SEM (n=6). Esta cifra ha sido modificada desde Yan H et al.12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Comparación de la distribución de apolipoproteína mediante tinción CBB (A) y hinchazón occidental (B). El plasma fue aislado por ultracentrifugación y las lipoproteínas fueron fraccionadas por 4-20% SDS-PAGE. (A) Los perfiles de apolipoproteína de conejo de tipo salvaje (WT) alimentados con una dieta estándar normal (NS) y una dieta alta en colesterol (HC) fueron visualizados por la tinción de CBB. En comparación con los conejos alimentados a dieta de NS (izquierda), los conejos alimentados por dieta de HC (derecha) mostraron un aumento del contenido de apoB-100 y apoE en VLDLs, IDLs y PMA. (B) Comparación de las características de apolipoproteína de los conejos WT en una dieta NS o HC, conejos ko (knockout) apoE en una dieta de HC, y conejos WHHL en una dieta de NS. La hinchazón occidental se realizó con "anticuerpos de cóctel" contra apoE, apoB y apoA-I. En comparación con los conejos normolipidemicos (conejos WT en una dieta de NS, primero a la izquierda), otros tres conejos hiperlipidémicos exhiben perfiles únicos y diferentes de apolipoproteína. Las partículas que contienen apoB (VLDLs, IDLs y ODL) de conejos WT alimentados con HC se caracterizan por un aumento del contenido de apoB-100 y apoE, mientras que los conejos KO apoE mostraron un marcado aumento de apoB-48 junto con la apariencia de apoA-I. WHHL exhibió un marcado aumento de apoB-100 en los PMA acompañados de una reducción de la apoA-I en los HDL. Esta cifra ha sido modificada desde Niimi M et al.10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Solución de densidad (g/mL) | KBr (g) | Agua destilada (ml) |
| d=1.006 | 8.404 | 1000 |
| d=1.02 | 28.271 | 1000 |
| d=1.04 | 57.261 | 1000 |
| d=1.06 | 86.958 | 1000 |
| d=1.08 | 117.365 | 1000 |
| d=1.10 | 148.490 | 1000 |
| d=1.21 | 333.394 | 1000 |
Tabla 1: Preparación para soluciones de densidad de bromuro de potasio (KBr). Se muestra el peso (g) de KBr añadir a 1000 ml de agua destilada.
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Discussion
La hiperlipidemia es uno de los factores de riesgo más importantes de la enfermedad aterosclerótica. Por lo tanto, el análisis de lipoproteínas plasmáticas no sólo es esencial para el diagnóstico de pacientes con dislipidemia, sino también importante para la investigación de mecanismos moleculares del metabolismo de la lipoproteína y la aterosclerosis. En este estudio, describimos el protocolo de aislamiento y análisis de lipoproteínas plasmáticas que se pueden aplicar en los laboratorios donde hay ultracentrifugación disponible. La información obtenida por este método es completa y directa, por lo tanto, se recomienda tanto para los científicos de investigación clínicos como básicos. Lipoproteínas aisladas también se pueden utilizar para investigar muchas otras facetas de funciones de lipoproteína como microscopía electrónica de mancha negativa13,14,oxidabilidad9,15,proteómica16,cultivo celular basado en estudio in vitro como ensayo de eflujo de colesterol9 y ensayo de absorción de lipoproteína17.
Debe señalarse; sin embargo, hay varios puntos débiles que deben tener en cuenta. En primer lugar, este método consume relativamente tiempo (al menos tres días) en comparación con otros métodos. Si utiliza la última ultracentrífuga de mesa, el giro de alta velocidad (150.000 rpm) puede acortar el tiempo de separación 50-140 min para cada fracción de lipoproteína18. En segundo lugar, la pérdida de muestras puede ocurrir durante el aislamiento. Para minimizar la pérdida de la muestra, el precipitante viscoso en la fracción inferior debe disolverse y recogerse cuidadosamente pipeteando. Los tubos centrífugas necesitan fijarse firmemente con una cortadora para evitar fugas de la fracción superior. Además, las muestras deben recuperarse cuidadosamente de las bolsas de diálisis. La recuperación se puede calcular comparando el colesterol total de lipoproteína con el colesterol plasmático original. Según nuestra experiencia, la tasa de recuperación general será ≈ 80%19. En tercer lugar, este protocolo está limitado para un pequeño número de muestras porque un rotor solo puede ejecutar doce tubos a la vez. Para realizar un gran número de muestras, puede ser adecuado utilizar otros métodos como el método de precipitación para la preparación de HDL4 y el análisis automatizado de lipoproteínas HPLC20.
En resumen, este protocolo proporciona una guía para que los investigadores aíslen las lipoproteínas plasmáticas utilizando ultracentrifugación de densidad secuencial y el análisis de lípidos y apolipoproteínas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por una beca de investigación de JSPS KAKENHI Grant Number JP 20K08858, la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 81941001 y 81770457), JSPS-CAS bajo el Programa Cooperativo de Investigación Japón-China.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22-gauge needle | Terumo | NN-2232S | For blood collection |
| 96-well microplate | greiner bio-one | 655101 | For lipids measurment |
| Anti-apolipoprotein A-I antibody | LifeSpan BioSciences | LS-C314186 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein B antibody | ROCKLAND | 600-101-111 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein E antibody | Merck Millipore | AB947 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| CBB staining kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 299-50101 | For apolipoprotein analysis |
| Centrifuge | HITACHI | himac CF15RN | |
| Closure | Spectrum | 132736 | For lipoprotein dialysis |
| Dialysis tubing | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 043-30921 | For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000 |
| Dry heat block | Major Science | MD-01N | For SDS-PAGE sample preparation |
| ECL Western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | For Western blotting |
| Electrophoresis Chamber | BIO-RAD | Mini-PROTEAN Tetra Cell | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 345-01865 | For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM) |
| Filter paper | ADVANTEC | 590 | For Western blotting |
| Fixed angle ultracentrifuge rotor | BECKMAN COULTER | 357656 | TLA-120.2 |
| Fixing solution | For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid) | ||
| Immun-Blot PVDF menbrane | BIO-RAD | 1620177 | For Western blotting |
| Lumino image analyzer | GE Healthcare | For Western blotting, ImageQuant LAS 4000 | |
| Magnetic stirrer | ADVANTEC | SR-304 | For lipoprotein dialysis |
| Microplate reader iMARK | BIO-RAD | For lipids measurment | |
| Microtube | INA-OPTIKA | SC-0150 | |
| Orbital agitator USBDbo | Stovall Life Science | ||
| Peroxidase congugated anti goat IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-035-003 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Phospholipids assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 433-36201 | For lipids measurment |
| Polycarbonate ultracentrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 343778 | |
| Potassium Bromide | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 168-03475 | For density solution |
| Power Supply | BIO-RAD | For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC | |
| Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra | BIO-RAD | 161-0377 | For SDS-PAGE and Western blotting |
| Rabbit restrainer | Natsume Seisakusho | KN-318 | For blood collection |
| Rotor | HITACHI | T15A43 | |
| SDS-PAGE running buffer | 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS | ||
| SDS-PAGE sample buffer (2x) | 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol | ||
| SDS-polyacrylamide gel | 4-20% gradient polyacrylamide gel | ||
| Skim milk powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-12865 | For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS) |
| Total cholesterol assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 439-17501 | For lipids measurment |
| Triglyicerides assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 432-40201 | For lipids measurment |
| Tube slicer for thick-walled tube | BECKMAN COULTER | 347960 | For lipoprotein isolation |
| Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS) |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A95761 | Optima MAX-TL |
| Western blotting wet transfer system | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Cell |
References
- Gordon, T., Castelli, W. P., Hjortland, M. C., Kannel, W. B., Dawber, T. R. High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: The Framingham study. The American Journal of Medicine. 62 (5), 707-714 (1977).
- Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), London, England. 1267-1278 (2005).
- Nauck, M., Warnick, G. R., Rifai, N. Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation. Clinical Chemistry. 48 (2), 236-254 (2002).
- Warnick, G. R., Nauck, M., Rifai, N. Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays. Clinical Chemistry. 47 (9), 1579-1596 (2001).
- Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. The Journal of Clinical Investigation. 34 (9), 1345-1353 (1955).
- Hatch, F. T., Lees, R. S. Practical Methods for Plasma Lipoprotein Analysis. Advances in Lipid Research. 6, 1-68 (1968).
- Lindgren, F. T., Adamson, G. L., Jenson, L. C., Wood, P. D. Lipid and lipoprotein measurements in a normal adult American population. Lipids. 10 (12), 750-756 (1975).
- Fan, J., et al. Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction of plasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 8724-8728 (1994).
- Wang, Y., et al. Human Apolipoprotein A-II Protects Against Diet-Induced Atherosclerosis in Transgenic Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), 224-231 (2013).
- Niimi, M., et al. ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia. Atherosclerosis. 245, 187-193 (2016).
- Zhang, J., et al. Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in RabbitsHighlights. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1068-1075 (2017).
- Yan, H., et al. Endothelial Lipase Exerts its Anti-Atherogenic Effect through Increased Catabolism of β-VLDLs. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 40 (9), 2095-2107 (2020).
- Fan, J., et al. Overexpression of Lipoprotein Lipase in Transgenic Rabbits Inhibits Diet-induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40071-40079 (2001).
- Koike, T., et al. Expression of Human ApoAII in Transgenic Rabbits Leads to Dyslipidemia: A New Model for Combined Hyperlipidemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (12), 2047-2053 (2009).
- Ichikawa, T., et al. Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits leads to increased small dense LDL in plasma and promotes atherosclerosis. Laboratory investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (6), 715-726 (2004).
- von Zychlinski, A., Kleffmann, T. Dissecting the proteome of lipoproteins: New biomarkers for cardiovascular diseases. Translational Proteomics. 7, 30-39 (2015).
- Yan, H., et al. Apolipoprotein CIII Deficiency Protects Against Atherosclerosis in Knockout Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (2), 157-168 (2021).
- Kang, I., Park, M., Yang, S. J., Lee, M. Lipoprotein Lipase Inhibitor, Nordihydroguaiaretic Acid, Aggravates Metabolic Phenotypes and Alters HDL Particle Size in the Western Diet-Fed db/db Mice. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 3057 (2019).
- De Silva, H. V., et al. Overexpression of human apolipoprotein C-III in transgenic mice results in an accumulation of apolipoprotein B48 remnants that is corrected by excess apolipoprotein E. Journal of Biological Chemistry. 269 (3), 2324-2335 (1994).
- Usui, S., Hara, Y., Hosaki, S., Okazaki, M. A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC. Journal of Lipid Research. 43 (5), 805-814 (2002).
