Summary
Vários métodos têm sido utilizados para analisar lipoproteínas plasmáticas; no entanto, a ultracentrifugação ainda é um dos métodos mais populares e confiáveis. Aqui, descrevemos um método sobre como isolar as lipoproteínas do plasma usando ultracentrifugação de densidade sequencial e como analisar as apolipoproteínas para fins diagnósticos e de pesquisa.
Abstract
A análise de lipoproteínas plasmáticas e apolipoproteínas é parte essencial para o diagnóstico de dislipidemia e estudos de metabolismo lipídico e aterosclerose. Embora existam vários métodos para analisar lipoproteínas plasmáticas, a ultracentrifugação ainda é um dos métodos mais populares e confiáveis. Devido ao seu procedimento de separação intacto, as frações de lipoproteína isoladas por este método podem ser utilizadas para análise de lipoproteínas, apolipoproteínas, proteomes e estudo funcional de lipoproteínas com células cultivadas in vitro. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para isolar sete frações de lipoproteína, incluindo VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1,02 g/mL), LDLs (d=1,04 e 1,06 g/mL), HDLs (d=1,08, 1,10, e 1,21 g/mL) do plasma de coelho usando ultracentrifugação flutuante sequencial. Além disso, apresentamos aos leitores como analisar apolipoproteínas como apoA-I, apoB e apoE por SDS-PAGE e mancha ocidental e mostrar resultados representativos de perfis de lipoproteína e apolipoproteína usando modelos de coelho hiperlipidêmica. Este método pode se tornar um protocolo padrão tanto para médicos quanto cientistas básicos analisarem as funções de lipoproteína.
Introduction
A dislipidemia é o principal fator de risco da doença aterosclerótica no mundo. Altos níveis de lipoproteínas de baixa densidade (LDLs) e baixos níveis de lipoproteínas de alta densidade (HDLs) estão intimamente associados a um alto risco de doença cardíaca coronariana (CHD)1,2. No cenário clínico, tanto o LDL-colesterol (LDL-C) quanto o HDL-colesterol (HDL-C) são medidos rotineiramente usando um analisador automatizado em um laboratório clínico3,4. Apesar disso, é essencial analisar os perfis de lipoproteína em detalhes para o diagnóstico de dislipidemia e o estudo do metabolismo lipídico e da aterosclerose em animais humanos e experimentais. Vários métodos foram relatados para analisar lipoproteínas plasmáticas, como ultracentrifugação, cromatografia de exclusão de tamanho [cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC) e cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)], eletrofose por géis de agarose e poliacrilamida, ressonância magnética nuclear e precipitação química seletiva usando polianões e cára divalentes ou outros produtos químicos. Na década de 1950, o grupo de Havel propôs pela primeira vez o conceito de lipoproteínas definidas por densidades usando ultracentrifugação e as classificou em chylomicrons (CM), lipoproteínas de baixa densidade (VLDL), lipoproteínas de densidade intermediária (IDL), LDL e HDL5 e posteriormente, o método foi modificado por outros grupos6,7. Até agora, a ultracentrifugação é o método mais popular e confiável, enquanto o protocolo prático ainda não está disponível. Neste artigo, tentamos descrever um protocolo fácil de usar para isolar uma pequena escala de plasma usando ultracentrifugação flutuante de densidade sequencial originalmente descrita anteriormente8. Isolamento de sete frações de lipoproteína plasmáticas [VLDL (d<1,006 g/mL), IDL (d=1,02 g/mL), LDLs (d=1,04 e 1,06 g/mL), HDLs (d=1,08, 1.10, e 1,21 g/mL)] permite que os pesquisadores façam uma análise extensiva das lipoproteínas e suas apolipoproteínas composicionais9,10,11. As sete lipoproteínas de densidade consecutiva podem ser usadas para analisar funções de lipoproteína e também servir para estratégias in vitro baseadas em células. Este protocolo deve ser útil tanto para o diagnóstico clínico quanto para a pesquisa básica. Aqui usamos o plasma de coelho como exemplo para demonstrar essa técnica, enquanto o plasma de outras espécies pode ser aplicado da mesma forma.
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Protocol
Todos os procedimentos para estudos de coelhos foram realizados com aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Yamanashi (número aprovado: A28-39).
1. Separação de plasma do sangue de coelho
- Prepare microtubos de 1,5 mL contendo 15 μL de 0,5 M EDTA (pH 8.0) para coleta de sangue.
- Coloque um coelho em um contidor e perfure uma artéria intermediária auricular usando uma agulha calibre 22 e colete sangue em um tubo. Misture o sangue com EDTA suavemente e coloque-os no gelo.
- Centrifugar os tubos de sangue a 1.500 x g por 20 min a 4 °C e coletar plasma para um novo microtubo.
NOTA: 3 mL de sangue é suficiente para coletar plasma de 1 mL. Se você coletar sangue de ratos ou outros animais pequenos, você precisa juncioná-los.
2. Isolamento de lipoproteínas plasmáticas
NOTA: O procedimento esquemático é mostrado na Figura 1. O método de preparação das soluções de densidade de brometo de potássio (KBr) é mostrado na Tabela 1.
- Transfira 1 mL de plasma para um tubo de ultracentrífuga de policarbonato(Figura 2A).
- Carregue esses tubos em um rotor de ângulo fixo e centrífugue o plasma a 356.000 x g por 2,5 h a 4 °C(Figura 2B).
NOTA: Para o rotor Beckman TLA 120.2, 356.000 x g (campo centrífuga relativo médio, Av RCF) corresponde a 100.000 rpm. - Corte os tubos usando um cortador e, em seguida, colete a fração superior [VLDL (d<1.006 g/mL)], aproximadamente 200 μL em um novo microtubo(Figura 2C). Colete a fração inferior restante em um novo tubo de ultracentrifuagem de policarbonato para a próxima separação(Figura 2D). Meça o volume e faça o volume total até 800 μL adicionando a mesma solução de densidade (d=1,006 g/mL).
NOTA: Coloque uma lâmina no cortador do tubo. Ajuste a posição da lâmina em um nível entre a fração superior (200 μL) e a fração inferior (800 μL). O precipitante viscoso na fração inferior deve ser coletado cuidadosamente e completamente por pipetação em todas as etapas seguintes. Em caso de pausa, faça-o depois de separar a fração superior e inferior em todas as etapas. Armazene a amostra a 4°C até a próxima centrifugação. - Ajuste a fração inferior (total de 800 μL) para d=1,02 g/mL adicionando 58,9 μL de solução d=1,21 g/mL e 141,1 μL de solução d=1,02 g/mL (o volume total é de 1 mL).
- Carregue estes tubos em rotor de ângulo fixo e centrífuga a 356.000 x g por 2,5 h a 4 °C.
- Corte os tubos usando um cortador e, em seguida, colete a fração superior [IDL (d=1,02 g/mL)] aproximadamente 200 μL em um novo microtubo. Colete a fração inferior restante em um novo tubo de ultracentrífuga de policarbonato para a próxima separação. Meça o volume e faça o volume total até 800 μL adicionando a mesma solução de densidade (d=1,02 g/mL).
- Ajuste a fração inferior (total de 800 μL) para d=1,04 g/mL adicionando 94,1 μL de solução d=1,21 g/mL e 105,9 μL de solução d=1,04 g/mL (o volume total é de 1 mL).
- Carregue esses tubos em um rotor de ângulo fixo e centrífuga a 356.000 x g por 2,5 h a 4 °C.
- Corte os tubos usando um cortador e, em seguida, colete a fração superior [LDL (d=1,04 g/mL)] aproximadamente 200 μL em um novo microtubo. Colete a fração inferior restante em um novo tubo de ultracentrífuga de policarbonato para a próxima separação. Meça o volume e faça o total de 800 μL adicionando a mesma solução de densidade (d=1,04 g/mL).
- Ajuste a fração inferior (total de 800 μL) para d=1,06 g/mL adicionando 106,7 μL de solução d=1,21 g/mL e 93,3 μL de solução d=1,06 g/mL (o volume total é de 1 mL).
- Carregue esses tubos em um rotor de ângulo fixo e centrífuga a 356.000 x g por 2,5 h a 4 °C.
- Corte os tubos usando um cortador e, em seguida, colete a fração superior [LDL (d=1,06 g/mL)] aproximadamente 200 μL em um novo microtubo. Colete a fração inferior restante em um novo tubo de ultracentrífuga de policarbonato para a próxima separação. Meça o volume e faça o total de 800 μL adicionando a mesma solução de densidade (d=1,06 g/mL).
- Ajuste a fração inferior (total de 800 μL) para d=1,08 g/mL adicionando 123,1 μL de solução d=1,21 g/mL e 76,9 μL de solução d=1,08 g/mL (o volume total é de 1 mL).
- Carregue esses tubos em um rotor de ângulo fixo e centrífuga a 356.000 x g por 2,5 h a 4 °C.
- Corte os tubos usando um cortador e, em seguida, colete a fração superior [HDL2 (d=1,08 g/mL)] aproximadamente 200 μL em um novo microtubo. Colete a fração inferior restante em um novo tubo de ultracentrífuga de policarbonato para a próxima separação. Meça o volume e faça o total de 800 μL adicionando a mesma solução de densidade (d=1,08 g/mL).
- Ajuste a fração inferior (total de 800 μL) para d=1,10 g/mL adicionando 145,5 μL de solução d=1,21 g/mL e 54,5 μL de solução d=1,10 g/mL (o volume total é de 1 mL).
- Carregue esses tubos em um rotor de ângulo fixo e centrífuga a 356.000 x g por 2,5 h a 4 °C.
- Corte os tubos usando um cortador e, em seguida, colete a fração superior [HDL2 (d=1,10 g/mL)] aproximadamente 200 μL em um novo microtubo. Colete a fração inferior restante em um novo tubo de ultracentrífuga de policarbonato para a próxima separação. Meça o volume e faça o total de 800 μL adicionando a mesma solução de densidade (d=1,10 g/mL).
- Ajuste a fração inferior (total de 800 μL) para d=1,21 g/mL adicionando 0,140 g de brometo de potássio (KBr) em pó e dissolvendo-o completamente. Meça o volume e faça-os a 1 mL adicionando a solução d=1,21 g/mL.
- Carregue estes tubos em rotor de ângulo fixo e centrífuga a 513.000 x g por 4 h a 4 °C.
NOTA: Para o rotor Beckman TLA 120.2, 513.000 x g (Av RCF) corresponde a 120.000 rpm. - Corte os tubos usando um cortador e, em seguida, colete a fração superior [HDL3 (d=1,21 g/mL)] aproximadamente 200 μL em um novo microtubo. Este é o último passo para a ultracentrifugação.
3. Diálise
NOTA: Como as frações de densidade (exceto fração d<1,006 g/mL) contêm altas concentrações de KBr, é necessário removê-las por diálise.
- Transfira as frações de densidade para uma tubulação de diálise e corte ambas as extremidades com fechamentos.
- Dialisar contra 2 L de tampão de diálise como PBS/ 1 mM EDTA por 6h a 4 °C com agitação usando um agitador magnético.
- Substitua por novo buffer e volte a dilisar por mais 6h a 4 °C.
- Colete as frações de densidade e meça o volume. Ajuste todas as frações de densidade para o mesmo volume (por exemplo, 250 μL).
NOTA: Você pode calcular o fator concentrado a partir de 1 mL de plasma original (por exemplo, 250 μL de fração de densidade corresponde a quatro vezes concentração).
4. Análise de lipoproteínas
NOTA: Após a diálise, essas lipoproteínas estão prontas para diferentes análises. As lipoproteínas podem ser avaliadas medindo lipídios ou apolipoproteínas ou ambos. Para medir conteúdos lipídicos como colesterol total (TC), triglicerídeos (TG), fosfolipídios (PL) e colesterol livre (FC) em cada fração, utilizamos kits de ensaios coloridos enzimáticos comerciais. Para análise de apolipoproteínas, utilizamos SDS-PAGE visualizado com coloração CBB ou mancha ocidental.
- Análise lipídica
NOTA: Lipídios como TC, TG, PL e FC na fração de lipoproteína podem ser medidos usando kits de medição disponíveis comercialmente. Os procedimentos dependem dos reagentes utilizados, então siga as instruções de cada kit utilizado. Aqui mostramos um típico ensaio de microplacão usando um kit de ensaio enzimático comercial.- Aplique 8 μL de amostra de lipoproteína e substância de calibração padrão em microplacão de 96 poços.
- Adicione 240 μL de reagente de ensaio e misture por pipetação.
- Incubar a 37 °C por 10 min.
- Meça o OD com um leitor de microplatos e calcule as concentrações lipídicas.
- Análise de apolipoproteína
- Manchas de SDS-PAGE e CBB
- Preparação da amostra: Adicione 10 μL de 2x Tampão de amostra a 10 μL de fração de lipoproteína. Aqueça a mistura a 80 °C por 5 minutos usando um bloco de calor seco.
- Prepare gel de poliacrilamida SDS-poliacrilamida de 4-20% gradiente e configure o gel na câmara de eletroforese cheia de tampão em execução.
- Carregar a amostra de lipoproteína (10 μL/lane) e os padrões proteicos (5 μL/pista) no gel de empilhamento.
NOTA: Se as amostras estiverem duas vezes concentradas, uma quantidade equivalente de plasma de 20 μL será analisada por faixa.] - Execute a eletroforese a 20-40 mA corrente constante.
- Coloração CBB: Mergulhe o gel duas vezes na solução de fixação com agitação suave por 10 minutos. Manche o gel com solução de coloração CBB por 30 minutos. Enxágüe o gel em água destilada para remover o excesso de mancha. O gel está pronto para fotografar.
- Mancha ocidental
- Realize eletroforese no mesmo procedimento descrito acima.
NOTA: O volume de lipoproteínas carregadas para a mancha ocidental é menor do que para a mancha CBB descrita acima (por exemplo, 1-5 μL). - Coloque a membrana gel e PVDF entre o papel filtro encharcado de buffer e o bloco de formulários. Coloque o sanduíche em um de suporte e coloque em um tanque cheio de tampão de transferência.
- Realize eletroblotting a 100 mA corrente constante por 3 h a 4 °C.
- Bloqueio: Incubar a membrana no tampão de bloqueio por 1h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C.
- Reação ab primária: Incubar as membranas no abs primário diluído com tampão de bloqueio por 1h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C com leve agitação.
NOTA: A diluição ab primária sugerida é mostrada na Tabela de Materiais. Três tipos de Abs primário contra apolipoproteínas podem ser usados de forma cansa ou em coquetéis. - Lave a membrana três vezes na lavagem do tampão com agitação, 5 minutos por lavagem.
- Reação ab secundária: Incubar a membrana no Abs secundário diluída com tampão de bloqueio por 1h à temperatura ambiente com agitação.
NOTA: A diluição ab secundária sugerida é mostrada na Tabela de Materiais. - Lave a membrana três vezes na lavagem do tampão com agitação, 5 minutos por lavagem.
- Detecção de ECL: Coloque a membrana em um plástico. Adicione reagentes de detecção de ECL e incubar por 1 min. Escorra o excesso de líquido e sele a membrana em um saco.
- Visualize os sinais usando um analisador de imagens.
- Realize eletroforese no mesmo procedimento descrito acima.
- Manchas de SDS-PAGE e CBB
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Representative Results
Usando este protocolo, isolamos lipoproteínas de coelho usando 1 mL de plasma e obtivemos sete frações de densidade. Frações de densidade isolada são suficientes para medir lipídios e apolipoproteínas, como descrito acima para a maioria dos propósitos de pesquisa. O mesmo procedimento também pode ser usado para isolar lipoproteínas plasmáticas de espécies humanas e outras. Para animais de pequeno porte, como ratos, é necessário plasma agrupado. A Figura 3 mostra perfis de lipoproteína de coelhos do tipo selvagem (WT) alimentados com uma dieta padrão normal (NS) ou dieta de colesterol alto (HC). Coelhos são animais herbívoros, então seus níveis de TC, TG e PL de plasma são geralmente mais baixos do que humanos e camundongos. Em coelhos alimentados com dieta NS, o TC é distribuído principalmente em HDL3 (d=1,21 g/mL) e seguido por LDL (d=1,04 g/mL) (Figura 3A). Em uma dieta NS, 39% do TG plasmático são distribuídos em VLDLs, enquanto 57% do PL de plasma está contido em HDL3 (Figura 3A). Quando os coelhos foram desafiados com uma dieta suplementada com colesterol alto, eles rapidamente se desenvolveram em hipercolesterolemia. Como mostrado na Figura 3B,os perfis de lipoproteína são caracterizados pela elevação acentuada de VLDLs (165 vezes↑ em VLDL-TC, 1,5 vezes↑ em VLDL-TG e 30 vezes↑ em VLDL-PL em comparação com coelhos alimentados com NS). Como os VLDLs isolados de coelhos alimentados com colesterol são ricos em ésteris de cholesteryl e se movem para a posição β na eletroforese de gel agarose, eles são frequentemente chamados de β-VLDLs para distingui-los dos VLDLs normais que se movem para a posição pré-β.
Além dos lipídios, as apolipoproteínas podem ser simplesmente analisadas por SDS-PAGE, seja por manchas de CBB ou manchas ocidentais(Figura 4). Sete frações de lipoproteína de coelhos WT alimentados com uma dieta NS ou um HC foram executadas em um gel de poliacrilamida SDS-4-20% e visualizadas com coloração CBB(Figura 4A). Em uma dieta HC, tanto os conteúdos apoB-100 quanto apoE em VLDLs (d<1,006 g/mL), IDLs (d=1,02 g/mL) e LDLs (d=1,04 g/mL) foram marcadamente elevados em comparação com coelhos em uma dieta NS. Além disso, também comparamos perfis de apolipoproteína e lipoproteína de três coelhos hiperlipidêmicos diferentes: coelhos WT alimentados por dieta HC, coelhos apoE knockout (KO) e coelhos hiperlipidêmicos watanabe (WHHL) com deficiência de receptor LDL por manchas ocidentais(Figura 4B). As lipoproteínas plasmáticas foram fracionadas por 4-20% SDS-PAGE e seguidas por manchas ocidentais com anticorpos contra apoE, apoB e apoA-I. As partículas contendo apoB (VLDLs, IDLs e LDLs) de coelhos WT alimentados por dieta HC são caracterizadas pelo aumento do conteúdo apoB-100 e apoE, enquanto os coelhos apoE KO apresentaram aumento acentuado de apoB-48, juntamente com o aparecimento de apoA-I. Coelhos WHHL são geneticamente deficientes nas funções do receptor LDL, por isso há um aumento acentuado de apoB-100 em LDLs acompanhados de apoA-I reduzido em HDLs, que é semelhante à hipercolesterolemia familiar humana.
Figura 1: Ilustração esquemática da ultracentrifugação flutuante sequencial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens representativas do isolamento da lipoproteína plasmática. (A) Plasma de coelhos normolipidêmicos e hiperlipidêmicos. (B) Flutuado topo VLDL (d<1.006 g/mL) e fração inferior (d>1,006 g/mL) após ultracentrifugação. (C) Fatia do tubo e coleta da fração superior por uma pipeta. (D) Coleção da fração inferior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Quantitação de conteúdo lipídico em cada fração de lipoproteína isolada de coelhos normais (A) e coelhos alimentados com colesterol (B). As lipoproteínas plasmáticas foram separadas por ultracentrifugação flutuante sequencial do plasma de coelhos do tipo selvagem em uma dieta padrão normal (A) ou uma dieta de colesterol alto(B). Foram medidos colesterol total (TC), triglicerídeos (TG) e fosfolipídios (PL). Os dados são expressos como ± SEM (n=6). Este número foi modificado a partir de Yan H et al.12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Comparação da distribuição da apolipoproteína utilizando manchas de CBB (A) e manchas ocidentais (B). O plasma foi isolado pela ultracentrifugação e as lipoproteínas foram fracionadas por 4-20% de SDS-PAGE. (A) Perfis de apolipoproteína de coelho silvestre (WT) alimentados com uma dieta padrão normal (NS) e uma dieta de colesterol alto (HC) foram visualizados pela coloração da CBB. Comparados com coelhos alimentados com dieta NS (esquerda), os coelhos alimentados por dieta hc (direita) apresentaram aumento do conteúdo de ApoB-100 e apoE em VLDLs, IDLs e LDLs. (B) Comparação das características da apolipoproteína de coelhos WT em uma dieta NS ou uma dieta HC, coelhos apoE KO (knockout) em uma dieta HC, e coelhos WHHL em uma dieta NS. A mancha ocidental foi realizada com "anticorpos de coquetel" contra apoE, apoB e apoA-I. Em comparação com coelhos normolipidêmicos (coelhos WT em uma dieta NS, primeiro à esquerda), outros três coelhos hiperlipidêmicos exibem perfis únicos e diferentes de apolipoproteína. As partículas contendo apoB (VLDLs, IDLs e LDLs) de coelhos WT alimentados por HC são caracterizadas pelo aumento do conteúdo apoB-100 e apoE, enquanto os coelhos apoE KO apresentaram aumento acentuado de apoB-48, juntamente com o aparecimento de apoA-I. WHHL exibiu aumento acentuado de apoB-100 em LDLs acompanhado de apoA-I reduzido em HDLs. Este número foi modificado a partir de Niimi M et al.10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Solução de densidade (g/mL) | KBr (g) | Água destilada (mL) |
| d=1.006 | 8.404 | 1000 |
| d=1,02 | 28.271 | 1000 |
| d=1,04 | 57.261 | 1000 |
| d=1,06 | 86.958 | 1000 |
| d=1,08 | 117.365 | 1000 |
| d=1,10 | 148.490 | 1000 |
| d=1,21 | 333.394 | 1000 |
Tabela 1: Preparação para soluções de densidade de brometo de potássio(KBr). O peso (g) de KBr adiciona a 1000 mL de água destilada é mostrado.
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Discussion
A hiperlipidemia é um dos fatores de risco mais importantes da doença aterosclerótica. Assim, a análise de lipoproteínas plasmáticas não é apenas essencial para o diagnóstico de pacientes com dislipidemia, mas também importante para a investigação de mecanismos moleculares de metabolismo de lipoproteína e aterosclerose. Neste estudo, descrevemos o protocolo de isolamento e análise de lipoproteínas plasmáticas que podem ser aplicadas nos laboratórios onde a ultracentrifugação está disponível. As informações obtidas por este método são abrangentes e simples, portanto, são recomendadas tanto para cientistas clínicos quanto básicos de pesquisa. Lipoproteínas isoladas também podem ser usadas para investigar muitas outras facetas de funções de lipoproteína, como microscopia eletrônica de mancha negativa13,14, oxidabilidade9,15, proteômica16, cultura celular baseada em estudo in vitro, como colesterol efflux ensaio9 e lipoproteção de absorçãode 17.
Deve ser apontado; no entanto, existem vários pontos fracos que precisam levar em consideração. Em primeiro lugar, este método é relativamente demorado (três dias pelo menos) em comparação com outros métodos. Se usar a ultracentragem de mesa mais recente, o giro de alta velocidade (150.000 rpm) pode encurtar o tempo de separação de 50 a 140 minutos para cada fração de lipoproteína18. Em segundo lugar, a perda de amostra pode acontecer durante o isolamento. Para minimizar a perda de amostra, o precipitante viscoso na fração inferior deve ser dissolvido e coletado cuidadosamente por pipetação. Os tubos de centrífugas precisam ser fixados firmemente com um cortador para evitar o vazamento da fração superior. Além disso, as amostras devem ser recuperadas cuidadosamente a partir de sacos de diálise. A recuperação pode ser calculada comparando o colesterol total da lipoproteína com o colesterol plasmá plasma original. De acordo com nossa experiência, a taxa de recuperação geral será de ≈ 80%19. Terceiro, este protocolo é limitado para um pequeno número de amostras porque um rotor só pode rodar doze tubos por vez. Para realizar um grande número de amostras, pode ser adequado usar outros métodos como o método de precipitação para preparação de HDL4 e análise automatizada de lipoproteína HPLC20.
Em resumo, este protocolo fornece um guia para os pesquisadores isolarem lipoproteínas plasmáticas usando ultracentrifugação de densidade sequencial e a análise de lipídios e apolipoproteínas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado em parte por uma bolsa de pesquisa do JSPS KAKENHI Grant Number JP 20K08858, a National Natural Science Foundation of China (nº 81941001 e 81770457), JSPS-CAS sob o Programa Cooperativo de Pesquisa Japão-China.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22-gauge needle | Terumo | NN-2232S | For blood collection |
| 96-well microplate | greiner bio-one | 655101 | For lipids measurment |
| Anti-apolipoprotein A-I antibody | LifeSpan BioSciences | LS-C314186 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein B antibody | ROCKLAND | 600-101-111 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein E antibody | Merck Millipore | AB947 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| CBB staining kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 299-50101 | For apolipoprotein analysis |
| Centrifuge | HITACHI | himac CF15RN | |
| Closure | Spectrum | 132736 | For lipoprotein dialysis |
| Dialysis tubing | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 043-30921 | For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000 |
| Dry heat block | Major Science | MD-01N | For SDS-PAGE sample preparation |
| ECL Western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | For Western blotting |
| Electrophoresis Chamber | BIO-RAD | Mini-PROTEAN Tetra Cell | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 345-01865 | For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM) |
| Filter paper | ADVANTEC | 590 | For Western blotting |
| Fixed angle ultracentrifuge rotor | BECKMAN COULTER | 357656 | TLA-120.2 |
| Fixing solution | For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid) | ||
| Immun-Blot PVDF menbrane | BIO-RAD | 1620177 | For Western blotting |
| Lumino image analyzer | GE Healthcare | For Western blotting, ImageQuant LAS 4000 | |
| Magnetic stirrer | ADVANTEC | SR-304 | For lipoprotein dialysis |
| Microplate reader iMARK | BIO-RAD | For lipids measurment | |
| Microtube | INA-OPTIKA | SC-0150 | |
| Orbital agitator USBDbo | Stovall Life Science | ||
| Peroxidase congugated anti goat IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-035-003 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Phospholipids assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 433-36201 | For lipids measurment |
| Polycarbonate ultracentrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 343778 | |
| Potassium Bromide | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 168-03475 | For density solution |
| Power Supply | BIO-RAD | For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC | |
| Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra | BIO-RAD | 161-0377 | For SDS-PAGE and Western blotting |
| Rabbit restrainer | Natsume Seisakusho | KN-318 | For blood collection |
| Rotor | HITACHI | T15A43 | |
| SDS-PAGE running buffer | 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS | ||
| SDS-PAGE sample buffer (2x) | 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol | ||
| SDS-polyacrylamide gel | 4-20% gradient polyacrylamide gel | ||
| Skim milk powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-12865 | For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS) |
| Total cholesterol assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 439-17501 | For lipids measurment |
| Triglyicerides assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 432-40201 | For lipids measurment |
| Tube slicer for thick-walled tube | BECKMAN COULTER | 347960 | For lipoprotein isolation |
| Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS) |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A95761 | Optima MAX-TL |
| Western blotting wet transfer system | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Cell |
References
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