Summary
Несколько методов были использованы для анализа липопротеинов плазмы; однако, ультрацентрифугация по-прежнему является одним из самых популярных и надежных методов. Здесь мы описываем метод, касающийся того, как изолировать липопротеины от плазмы с использованием последовательной ультрацентрифугации плотности и как анализировать аполипопротеины как для диагностических, так и для исследовательских целей.
Abstract
Анализ плазменных липопротеинов и аполипопротеинов является неотъемлемой частью диагностики дислипидемии и исследований липидного обмена и атеросклероза. Хотя существует несколько методов анализа липопротеинов плазмы, ультрацентрифугация по-прежнему является одним из самых популярных и надежных методов. Из-за своей нетронутой процедуры разделения, липопротеин фракций, изолированных этим методом могут быть использованы для анализа липопротеинов, аполипопротеинов, протеом, и функциональное исследование липопротеинов с культурными клетками in vitro. Здесь мы предоставляем подробный протокол для изоляции семи фракций липопротеинов, включая VLDL (d'lt;1.006 g/mL), IDL (d'1.02 g/mL), LDL (d'1.04 и 1.06 g/mL), HDLs (d'1.08, 1.10, и 1.21 g/mL) от плазмы кролика используя последовательно плавая ultracentrifugation. Кроме того, мы представляем читателям, как анализировать аполипопротеины, такие как apoA-I, apoB, и apoE SDS-PAGE и западной blotting и показать репрезентативные результаты липопротеинов и аполипопротеинов профилей с использованием гиперлипидемических моделей кролика. Этот метод может стать стандартным протоколом как для клиницистов, так и для основных ученых для анализа функций липопротеинов.
Introduction
Дислипидемия является основным фактором риска атеросклеротических заболеваний в мире. Высокий уровень липопротеинов низкой плотности (LDL) и низкий уровень липопротеинов высокой плотности (HDL) тесно связаны с высоким риском ишемической болезни сердца (ИБЛ)1,2. В клинических условиях, как LDL-холестерин (LDL-C) и HDL-холестерин (HDL-C) регулярно измеряются с помощью автоматизированного анализатора вклинической лаборатории 3,4. Несмотря на это, важно проанализировать профили липопротеинов в деталях для диагностики дислипидемии и изучения липидного метаболизма и атеросклероза у человека и экспериментальных животных. Сообщалось о нескольких методах анализа плазменных липопротеинов, таких как ультрацентрифугация, хроматография исключения размера (быстрая белковая жидкостная хроматография (FPLC) и высокоэфирная жидкая хроматография (HPLC), электрофорез гелями агарозы и полиакриламида, ядерный магнитный резонанс и селективные химические осадки с использованием полиалентных цилентов и других химических веществ. В 1950-х годах группа Гавел впервые предложила концепцию липопротеинов, определяемых плотностью с использованием ультрацентрифугации, и классифицировала их на чиломикронов (CM), липопротеинов очень низкой плотности (VLDL), липопротеинов средней плотности (IDL), LDL и HDL5, а затем метод был дополнительно изменендругими группами 6,7. До сих пор ультрацентрифугация является самым популярным и надежным методом, в то время как практический протокол по-прежнему недоступен. В этой статье мы попытались описать простой в использовании протокол для изоляции небольшого масштаба плазмы с использованием последовательной плотности плавающей ультрацентрифугации, первоначально описаннойранее 8. Изоляция семи фракций плазменных липопротеинов (длт;1,006 г/мл), IDL (d'1.02 г/мл), LDL (d'1.04 и 1.06 g/mL), HDL (d'1.08, 1.10, и 1.21 g/mL) позволяет исследователям сделать обширный анализ как липопротеинов, так и их композиционных аполипопротеинов9,10,11. Нетронутыми семь последовательных липопротеинов плотности могут быть использованы для анализа функций липопротеинов, а также выступающей на основе клеток в пробирке стратегии. Этот протокол должен быть полезен как для клинической диагностики, так и для фундаментальных исследований. Здесь мы использовали плазму кролика в качестве примера, чтобы продемонстрировать эту технику в то время как плазма от других видов могут быть применены таким же образом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры для исследования кролика были выполнены с одобрения Университета Яманаси институционального ухода за животными и использования комитета (Утвержденный номер: A28-39).
1. Плазменное отделение от крови кролика
- Подготовка 1,5 мл микротрубок, содержащих 15 мкл 0,5 М ЭДТА (рН 8,0) для сбора крови.
- Положите кролика в утолитель и проколоть иллюкулярную промежуточную артерию с помощью 22 калибровочных игл и собрать кровь в трубку. Смешайте кровь с ЭДТА осторожно и положить их на лед.
- Центрифуга трубки крови на 1500 х г в течение 20 мин при 4 градусов по Цельсию и собирать плазму на новый микротрубоколы.
ПРИМЕЧАНИЕ: 3 мл крови достаточно для сбора 1 мл плазмы. Если вы собираете кровь у мышей или других мелких животных, вам нужно объединить их.
2. Изоляция плазменных липопротеинов
ПРИМЕЧАНИЕ: Схематическая процедура показана на рисунке 1. Метод приготовления растворов плотности бромистого калия (KBr) показан в таблице 1.
- Передача 1 мл плазмы в поликарбонатную ультрацентрифугную трубку(рисунок 2A).
- Загрузите эти трубки в ротор с фиксированным углом и центрифугу плазмы на 356 000 х г при 2,5 ч при 4 градусах поЦельсию (рисунок 2B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для ротора Beckman TLA 120.2, 356 000 x g (среднее относительное центробежное поле, Av RCF) соответствует 100 000 об/мин. - Разрежьте трубки с помощью среза, а затем соберите верхнюю фракцию «VLDL (d'lt;1.006 g/mL)», приблизительно 200 л в новую микротрубу(рисунок 2C). Соберите оставшуюся нижнюю фракцию в новую поликарбонатную ультрацентрифугную трубку для следующего разделения(рисунок 2D). Измерьте объем и сделайте общий объем до 800 йл, добавив тот же раствор плотности (d'1.006 g/mL).
ПРИМЕЧАНИЕ: Установите лезвие к срезу трубки. Отрегулируйте положение лезвия на уровне между верхней фракцией (200 МКЛ) и нижней фракцией (800 МКЛ). Вязкий обрыв в нижней фракции должны быть собраны тщательно и полностью трубопроводов во всех следующих шагов. Если пауза, сделать это после разделения верхней и нижней фракции во всех шагах. Храните образец при 4 градусов по Цельсию до следующей центрифугации. - Отрегулируйте нижнюю фракцию (всего 800 мкл) до d'1.02 g/mL, добавив 58,9 мл раствора d'1.21 g/mL и 141,1 мл раствора d'1.02 g/mL (общий объем составляет 1 мл).
- Загрузите эти трубки в ротор с фиксированным углом и центрифугу при 356 000 х г при 2,5 ч при 4 градусах Цельсия.
- Разрежьте трубки с помощью среза, а затем соберите верхнюю фракцию «IDL» (d'1.02 g/mL)» приблизительно 200 МКЛ в новую микротруборубу. Соберите оставшуюся нижнюю фракцию в новую поликарбонатную ультрацентрифугную трубку для следующего отделения. Измерьте объем и сделайте общий объем до 800 йл, добавив тот же раствор плотности (d'1.02 g/mL).
- Отрегулируйте нижнюю фракцию (всего 800 мкл) до d'1.04 g/mL, добавив 94,1 МЛ раствора d'1.21 g/mL и 105,9 мл раствора d'1.04 g/mL (общий объем составляет 1 мл).
- Загрузите эти трубки в ротор с фиксированным углом и центрифугу при 356 000 х г при 2,5 ч при 4 градусах Цельсия.
- Вырежьте трубки с помощью среза, а затем соберите верхнюю фракцию «LDL» (d'1.04 g/mL)» приблизительно 200 л в новую микротрубосеку. Соберите оставшуюся нижнюю фракцию в новую поликарбонатную ультрацентрифугную трубку для следующего отделения. Измерьте объем и сделайте итог до 800 йл путем добавлять такое же разрешение плотности (d'1.04 g/mL).
- Отрегулируйте нижнюю фракцию (всего 800 мкл) до d'1.06 g/mL, добавив 106,7 мл раствора d'1.21 g/mL и 93,3 мл раствора d'1.06 g/mL (общий объем составляет 1 мл).
- Загрузите эти трубки в ротор с фиксированным углом и центрифугу при 356 000 х г при 2,5 ч при 4 градусах Цельсия.
- Вырежьте трубки с помощью среза, а затем соберите верхнюю фракцию «LDL» (d'1.06 g/mL)» приблизительно 200 л в новую микротруборубу. Соберите оставшуюся нижнюю фракцию в новую поликарбонатную ультрацентрифугную трубку для следующего отделения. Измерьте объем и сделайте итог до 800 йл путем добавлять такое же разрешение плотности (d'1.06 g/mL).
- Отрегулируйте нижнюю фракцию (всего 800 мкл) до d'1.08 g/mL, добавив 123,1 МЛ раствора d'1.21 g/mL и 76,9 мл раствора d'1.08 g/mL (общий объем составляет 1 мл).
- Загрузите эти трубки в ротор с фиксированным углом и центрифугу при 356 000 х г при 2,5 ч при 4 градусах Цельсия.
- Вырежьте трубки с помощью среза, а затем соберите верхнюю фракцию «HDL2» (d'1.08 g/mL)» приблизительно 200 йл в новую микротрубь. Соберите оставшуюся нижнюю фракцию в новую поликарбонатную ультрацентрифугную трубку для следующего отделения. Измерьте объем и сделайте итог до 800 йл путем добавлять такой же разрешение плотности (d'1.08 g/mL).
- Отрегулируйте нижнюю фракцию (всего 800 мл) до d'1.10 g/mL, добавив 145,5 мл раствора d'1.21 g/mL и 54,5 мл раствора d'1.10 g/mL (общий объем составляет 1 мл).
- Загрузите эти трубки в ротор с фиксированным углом и центрифугу при 356 000 х г при 2,5 ч при 4 градусах Цельсия.
- Вырежьте трубки с помощью среза, а затем соберите верхнюю фракцию «HDL2» (d'1.10 g/mL)» приблизительно 200 йл в новую микротрубу. Соберите оставшуюся нижнюю фракцию в новую поликарбонатную ультрацентрифугную трубку для следующего отделения. Измерьте объем и сделайте итог до 800 йл путем добавлять такое же разрешение плотности (d'1.10 g/mL).
- Отрегулируйте нижнюю фракцию (всего 800 мл) до d'1.21 g/mL, добавив 0,140 г порошка бромистого калия (KBr) и полностью растворите его. Измерьте объем и сделайте их до 1 мл, добавив раствор d'1.21 g/mL.
- Загрузите эти трубки в ротор с фиксированным углом и центрифугу при 513 000 х г при 4 ч при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для ротора Beckman TLA 120.2, 513,000 x g (Av RCF) соответствует 120,000 об/мин. - Вырежьте трубки с помощью срез, а затем соберите верхнюю фракцию «HDL3» (d'1.21 g/mL)» приблизительно 200 йл в новую микротрубочных труб. Это последний шаг для ультрацентрифугации.
3. Диализ
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку фракции плотности (кроме фракций d'lt;1.006 g/mL) содержат высокие концентрации KBr, необходимо удалить их с помощью диализа.
- Перенесите фракции плотности на диализные трубки и зажим оба конца с замыканиями.
- Диализ против 2 л буфера диализа, таких как PBS / 1 мМ EDTA для 6 ч при 4 градусов по Цельсию с возбуждением с помощью магнитного мешалки.
- Замените новым буфером и снова облизвуте еще на 6 ч при 4 градусах Цельсия.
- Соберите фракции плотности и измерьте объем. Отрегулируйте все фракции плотности на один и тот же объем (например, 250 МКЛ).
ПРИМЕЧАНИЕ: Вы можете рассчитать концентрированный фактор из 1 мл исходной плазмы (например, 250 МКЛ фракции плотности соответствует концентрации в четыре раза).
4. Анализ липопротеинов
ПРИМЕЧАНИЕ: После диализа эти липопротеины готовы к различным анализам. Липопротеины могут быть оценены путем измерения липидов или аполипопротеинов или обоих. Для измерения содержания липидов, таких как общий холестерин (ТК), триглицериды (TG), фосфолипиды (PL) и свободный холестерин (FC) в каждой фракции, мы используем коммерческие энзиматические наборы колоритного анализа. Для анализа аполипопротеинов, мы используем SDS-PAGE визуализированы с CBB окрашивания или западной blotting.
- Липидный анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: Липиды, такие как TC, TG, PL и FC в липопротеинов фракции могут быть измерены с помощью коммерчески доступных комплектов измерения. Процедуры зависят от используемых реагентов, поэтому следуйте инструкциям каждого используемого комплекта. Здесь мы показываем типичный анализ микропластиров с использованием коммерческого комплекта энзиматических анализов.- Нанесите 8 МКЛ образца липопротеинов и стандартное калибровочное вещество на микроплюль 96-колодец.
- Добавьте 240 МКЛ реагента анализа и смешайте с помощью пипетки.
- Инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 10 мин.
- Измерьте OD с помощью микропластицы и вычислите концентрации липидов.
- Анализ Аполипопротеинов
- SDS-PAGE и Окрашивание CBB
- Подготовка образца: Добавьте 10 йл буфера образца 2x до 10 йл фракции липопротеинов. Нагрейте смесь при температуре 80 градусов по Цельсию в течение 5 минут с помощью сухого теплового блока.
- Приготовьте 4-20% градиент SDS-полиакриламидный гель и установите гель на камеру электрофорезиса, наполненную бегущим буфером.
- Загрузите образец липопротеинов (10 л/лейн) и стандарты белка (5 л/лейн) на укладке геля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если образцы в два раза сконцентрированы, то на одну полосу будет проанализировано эквивалентное количество плазмы в 20 л». - Запуск электрофорез при постоянном токе 20-40 мА.
- CBB окрашивание: Замочите гель дважды в фиксации раствора с нежной тряской в течение 10 мин. Пятно гель с CBB окрашивания раствор в течение 30 мин. Промыть гель в дистиллированной воде, чтобы удалить избыток пятна. Гель готов к фотографированию.
- Западный blotting
- Выполните электрофорез в той же процедуре, что и описано выше.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем липопротеинов, загруженных для западного блаттинга, меньше, чем для окрашивания CBB, описанного выше (например, 1-5 МЛ). - Поместите гель и pvDF мембраны между передачей буфера пропитанной фильтровальной бумаги и формы площадку. Установите сэндвич в кассету с держателем и поместите в бак, наполненный буфером передачи.
- Выполните электроблотинг при постоянном токе 100 мА в течение 3 ч при 4 градусах Цельсия.
- Блокирование: Инкубировать мембрану в блокирующий буфер в течение 1 ч при комнатной температуре или на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию.
- Первичная реакция Ab: Инкубировать мембраны в первичном Абс разбавленный блокирующим буфером в течение 1 ч при комнатной температуре или на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию с легкой тряской.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предлагаемые первичные Ab разбавления показано в таблице материалов. Три вида первичных абс против аполипопротеинов могут быть использованы по-своему или в коктейлях. - Вымойте мембрану три раза в стиральном буфере с возбуждением, 5 мин за стирку.
- Вторичная реакция Ab: Инкубировать мембрану во вторичном Абс разбавленной блокирующим буфером в течение 1 ч при комнатной температуре с возбуждением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предлагаемые вторичные Ab разбавления показано в таблице материалов. - Вымойте мембрану три раза в стиральном буфере с возбуждением, 5 мин за стирку.
- Обнаружение ECL: Поместите мембрану на полиэтиленовую пленку. Добавьте реагенты обнаружения ECL и инкубировать в течение 1 мин. Слейте лишнюю жидкость и запечатать мембрану в мешок.
- Визуализируйте сигналы с помощью анализатора изображений.
- Выполните электрофорез в той же процедуре, что и описано выше.
- SDS-PAGE и Окрашивание CBB
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя этот протокол, мы выделили липопротеины кролика, используя 1 мл плазмы и получили семь фракций плотности. Изолированных фракций плотности достаточно для измерения липидов и аполипопротеинов, как описано выше для большинства исследовательских целей. Та же процедура может быть использована для изоляции плазменных липопротеинов от человека и других видов. Для мелких животных, таких как мыши, требуется бильярдная плазма. Рисунок 3 показывает липопротеин профили диких (WT) кроликов кормили либо нормальной стандартной (NS) диеты или высокого уровня холестерина (HC) диеты. Кролики травоядные животные поэтому их уровни TC плазмы, TG, и PL вообще более низки чем люди и мыши. В NS диеты кормили кроликов, ТК в основном распространяется в HDL3 (d'1.21 g/mL) и следуют ЛПНП (d'1.04 g/mL) (Рисунок 3A). На диете NS, 39% плазмы TG распространяются в VLDLs в то время как 57% плазмы PL содержится в HDL3 (Рисунок 3A). Когда кролики были оспорены с диетпитанием дополненным с высоким cholesterol, они быстро превратились в hypercholesterolemia. Как показано на рисунке 3B, профили липопротеинов характеризуются заметной высотой VLDLs (165-кратное количество в VLDL-TC, 1,5 раза в VLDL-TG, и 30-кратное количество в VLDL-PL по сравнению с NS-кормили кроликов). Поскольку VLDLs изолированы от холестерина кормили кроликов богаты холестерил эфиры и перейти к позиции β на агарозы гель электрофорез, они часто называют β-VLDLs отличить их от нормальных VLDLs, которые переходят в предварительное β положение.
В дополнение к липидам, аполипопротеины могут быть просто проанализированы SDS-PAGE либо CBB окрашивания или западной blotting (Рисунок 4). Семь фракций липопротеинов от WT кроликов кормили либо NS или HC диеты были запущены на 4-20% SDS-полиакриламид гель и визуализированы с CBB окрашивания (Рисунок 4A). На диете HC, как apoB-100 и apoE содержание в VLDLs (d'lt;1.006 g/mL), IDLs (d'1.02 g/mL), и LDLs (d'1.04 g/mL) были заметно повышены по сравнению с кроликами на диете NS. Кроме того, мы также сравнили аполипопротеин и липопротеин профили трех различных гиперлипидемических кроликов: HC диеты кормили WT кроликов, АпоЭ нокаутом (KO) кроликов, и Watanabe напать гиперлипидемические (WHHL) кроликов с дефицитом рецепторов ЛПНП западной blotting (Рисунок 4B). Плазменные липопротеины были дробированы на 4-20% SDS-PAGE, а затем западные blotting с антителами против апоЭ, апоБ, и апоа-I. АпоБ-содержащих частиц (VLDLs, IDLs и LDLs) HC диеты кормили WT кроликов характеризуются увеличением ApoB-100 и apoE содержание в то время как APOE KO кролики показали заметное увеличение apoB-48 вместе с появлением apoA-I. WHHL кролики генетически недостаточно в функциях рецепторов ЛПНП так что заметное увеличение apoB-100 в LDLs сопровождается снижением апоА-I в HDLs, который похож на человека семейной гиперхолестеринемии.
Рисунок 1: Схематическая иллюстрация последовательной плавающей ультрацентрифугации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Репрезентативные изображения изоляции плазменных липопротеинов. (A)Плазма нормолипидемических и гиперлипидемических кроликов. (B) Плавал верхний VLDL (d'lt;1.006 g/mL) и нижняя фракция (d'gt;1.006 g/mL) после ультрацентрифугации. (C)Нарезка трубки и сбор верхней фракции пипеткой. (D)Коллекция нижней фракции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Количественная оценка содержания липидов в каждой фракции липопротеинов, изолированных от обычных кроликов (А) и кроликов, питающихся холестерином (B). Плазменные липопротеины были отделены последовательной плавающей ультрацентрифугации от плазмы диких кроликов типа либо на нормальной стандартной диете(A) или высокой диеты холестерина (B). Измерялся общий уровень холестерина (ТК), триглицеридов (ТГ) и фосфолипидов (PL). Данные выражаются как среднее ± SEM (n'6). Эта цифра была изменена с Yan H и др.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Сравнение распределения аполипопротеинов с использованием Окрашивания CBB (A) и западного blotting (B). Плазма была выделена путем ультрацентрифугации и липопротеинов были дробированы на 4-20% SDS-PAGE. (A) Apolipoprotein профили диких типа (WT) кролика кормили на нормальной стандартной (NS) диеты и высокий уровень холестерина (HC) диета были визуализированы CBB окрашивания. По сравнению с NS диеты кормили кроликов (слева), HC диеты кормили кроликов (справа) показали увеличение ApoB-100 и apoE содержание в VLDLs, IDLs, и LDLs. (B) Сравнение аполипопротеинов особенности WT кроликов на NS или HC диеты, apoE KO (нокаут) кроликов на диете HC, и WHHL кроликов на диете NS. Западный blotting был выполнен с «антителами коктейля» против apoE, apoB, и apoA-I. По сравнению с нормолипидемическими кроликами (WT кролики на диете NS, сперва налево), другие 3 гиперлипидемических кролика exhibit уникально и по-разному профили apolipoprotein. АпоБ-содержащие частицы (VLDLs, IDLs и LDLs) HC-кормили WT кроликов характеризуются увеличением ApoB-100 и apoE содержание в то время как ApoE KO кролики показали заметное увеличение apoB-48 вместе с появлением apoA-I. WHHL продемонстрировали заметное увеличение apoB-100 в LDLs сопровождается сокращением apoA-I в HDLs. Эта цифра была изменена из Niimi M и др.10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Раствор плотности (г/мл) | КБР (г) | Дистиллированная вода (mL) |
| d-1.006 | 8.404 | 1000 |
| d-1.02 | 28.271 | 1000 |
| d-1.04 | 57.261 | 1000 |
| d-1.06 | 86.958 | 1000 |
| d'1.08 | 117.365 | 1000 |
| d-1.10 | 148.490 | 1000 |
| d-1.21 | 333.394 | 1000 |
Таблица 1: Подготовка к растворам плотности бромистого калия (KBr). Показан вес (г) KBr добавить до 1000 мл дистиллированной воды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Гиперлипидемия является одним из наиболее важных факторов риска развития атеросклеротических заболеваний. Таким образом, анализ плазменных липопротеинов необходим не только для диагностики больных дислипидемией, но и важен для исследования молекулярных механизмов метаболизма липопротеинов и атеросклероза. В этом исследовании мы описали протокол изоляции и анализа плазменных липопротеинов, которые могут быть применены в лабораториях, где имеется ультрацентрифугация. Информация, полученная с помощью этого метода, является всеобъемлющей и простой, поэтому она рекомендуется как для клинических, так и для фундаментальных ученых-исследователей. Изолированные липопротеины также могут быть использованы для исследования многих других аспектов функций липопротеинов, таких как отрицательное пятно электронноймикроскопии 13,14,окислительность 9,15,протеомика 16 , клеточной культуры,основанной в пробирке исследования, такие как холестерин эффлюкс assay9 и липопротеинов поглощенияassay 17.
Следует отметить; однако есть несколько слабых моментов, которые необходимо учитывать. Во-первых, этот метод является относительно трудоемким (по крайней мере, три дня) по сравнению с другими методами. При использовании последней столешницы ультрацентрифуг, высокоскоростной спин (150000 об / мин) может сократить время разделения 50-140 мин для каждого липопротеинафракции 18. Во-вторых, потеря выборки может произойти во время изоляции. Чтобы свести к минимуму потерю образца, вязкий обрыв в нижней фракции должны быть растворен и собраны тщательно трубопроводов. Центрифуги трубы необходимо исправить плотно с ломтиком, чтобы избежать утечки верхней фракции. Кроме того, образцы должны быть тщательно извлечены из диализных мешков. Восстановление может быть рассчитано путем сравнения общего холестерина липопротеинов с оригинальным холестерином плазмы. Согласно нашему опыту, общий уровень восстановления будет ≈ 80%19. В-третьих, этот протокол ограничен для небольшого числа образцов, потому что один ротор может работать только двенадцать трубок за раз. Для выполнения большого количества образцов, это может быть подходящим для использования других методов, таких как метод осадков для HDLподготовки 4 и автоматизированного анализа липопротеинов HPLC20.
Таким образом, этот протокол содержит руководство для исследователей, чтобы изолировать плазменные липопротеины с использованием последовательной плотности ультрацентрифугации и анализа липидов и аполипопротеинов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана научно-исследовательскими грантами от JSPS KAKENHI Grant Number JP 20K08858, Национального фонда естественных наук Китая (No 81941001 и 81770457), JSPS-CAS в рамках японо-китайской программы научно-исследовательского сотрудничества.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22-gauge needle | Terumo | NN-2232S | For blood collection |
| 96-well microplate | greiner bio-one | 655101 | For lipids measurment |
| Anti-apolipoprotein A-I antibody | LifeSpan BioSciences | LS-C314186 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein B antibody | ROCKLAND | 600-101-111 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein E antibody | Merck Millipore | AB947 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| CBB staining kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 299-50101 | For apolipoprotein analysis |
| Centrifuge | HITACHI | himac CF15RN | |
| Closure | Spectrum | 132736 | For lipoprotein dialysis |
| Dialysis tubing | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 043-30921 | For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000 |
| Dry heat block | Major Science | MD-01N | For SDS-PAGE sample preparation |
| ECL Western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | For Western blotting |
| Electrophoresis Chamber | BIO-RAD | Mini-PROTEAN Tetra Cell | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 345-01865 | For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM) |
| Filter paper | ADVANTEC | 590 | For Western blotting |
| Fixed angle ultracentrifuge rotor | BECKMAN COULTER | 357656 | TLA-120.2 |
| Fixing solution | For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid) | ||
| Immun-Blot PVDF menbrane | BIO-RAD | 1620177 | For Western blotting |
| Lumino image analyzer | GE Healthcare | For Western blotting, ImageQuant LAS 4000 | |
| Magnetic stirrer | ADVANTEC | SR-304 | For lipoprotein dialysis |
| Microplate reader iMARK | BIO-RAD | For lipids measurment | |
| Microtube | INA-OPTIKA | SC-0150 | |
| Orbital agitator USBDbo | Stovall Life Science | ||
| Peroxidase congugated anti goat IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-035-003 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Phospholipids assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 433-36201 | For lipids measurment |
| Polycarbonate ultracentrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 343778 | |
| Potassium Bromide | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 168-03475 | For density solution |
| Power Supply | BIO-RAD | For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC | |
| Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra | BIO-RAD | 161-0377 | For SDS-PAGE and Western blotting |
| Rabbit restrainer | Natsume Seisakusho | KN-318 | For blood collection |
| Rotor | HITACHI | T15A43 | |
| SDS-PAGE running buffer | 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS | ||
| SDS-PAGE sample buffer (2x) | 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol | ||
| SDS-polyacrylamide gel | 4-20% gradient polyacrylamide gel | ||
| Skim milk powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-12865 | For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS) |
| Total cholesterol assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 439-17501 | For lipids measurment |
| Triglyicerides assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 432-40201 | For lipids measurment |
| Tube slicer for thick-walled tube | BECKMAN COULTER | 347960 | For lipoprotein isolation |
| Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS) |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A95761 | Optima MAX-TL |
| Western blotting wet transfer system | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Cell |
References
- Gordon, T., Castelli, W. P., Hjortland, M. C., Kannel, W. B., Dawber, T. R. High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: The Framingham study. The American Journal of Medicine. 62 (5), 707-714 (1977).
- Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), London, England. 1267-1278 (2005).
- Nauck, M., Warnick, G. R., Rifai, N. Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation. Clinical Chemistry. 48 (2), 236-254 (2002).
- Warnick, G. R., Nauck, M., Rifai, N. Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays. Clinical Chemistry. 47 (9), 1579-1596 (2001).
- Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. The Journal of Clinical Investigation. 34 (9), 1345-1353 (1955).
- Hatch, F. T., Lees, R. S. Practical Methods for Plasma Lipoprotein Analysis. Advances in Lipid Research. 6, 1-68 (1968).
- Lindgren, F. T., Adamson, G. L., Jenson, L. C., Wood, P. D. Lipid and lipoprotein measurements in a normal adult American population. Lipids. 10 (12), 750-756 (1975).
- Fan, J., et al. Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction of plasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 8724-8728 (1994).
- Wang, Y., et al. Human Apolipoprotein A-II Protects Against Diet-Induced Atherosclerosis in Transgenic Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), 224-231 (2013).
- Niimi, M., et al. ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia. Atherosclerosis. 245, 187-193 (2016).
- Zhang, J., et al. Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in RabbitsHighlights. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1068-1075 (2017).
- Yan, H., et al. Endothelial Lipase Exerts its Anti-Atherogenic Effect through Increased Catabolism of β-VLDLs. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 40 (9), 2095-2107 (2020).
- Fan, J., et al. Overexpression of Lipoprotein Lipase in Transgenic Rabbits Inhibits Diet-induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40071-40079 (2001).
- Koike, T., et al. Expression of Human ApoAII in Transgenic Rabbits Leads to Dyslipidemia: A New Model for Combined Hyperlipidemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (12), 2047-2053 (2009).
- Ichikawa, T., et al. Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits leads to increased small dense LDL in plasma and promotes atherosclerosis. Laboratory investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (6), 715-726 (2004).
- von Zychlinski, A., Kleffmann, T. Dissecting the proteome of lipoproteins: New biomarkers for cardiovascular diseases. Translational Proteomics. 7, 30-39 (2015).
- Yan, H., et al. Apolipoprotein CIII Deficiency Protects Against Atherosclerosis in Knockout Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (2), 157-168 (2021).
- Kang, I., Park, M., Yang, S. J., Lee, M. Lipoprotein Lipase Inhibitor, Nordihydroguaiaretic Acid, Aggravates Metabolic Phenotypes and Alters HDL Particle Size in the Western Diet-Fed db/db Mice. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 3057 (2019).
- De Silva, H. V., et al. Overexpression of human apolipoprotein C-III in transgenic mice results in an accumulation of apolipoprotein B48 remnants that is corrected by excess apolipoprotein E. Journal of Biological Chemistry. 269 (3), 2324-2335 (1994).
- Usui, S., Hara, Y., Hosaki, S., Okazaki, M. A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC. Journal of Lipid Research. 43 (5), 805-814 (2002).
