Summary
Mehrere Methoden wurden zur Analyse von Plasma-Lipoproteinen verwendet; Ultrazentrifugation ist jedoch nach wie vor eine der beliebtesten und zuverlässigsten Methoden. Hier beschreiben wir eine Methode, wie Lipoproteine aus Plasma mit sequenzieller Dichte-Ultrazentrifugation isoliert werden und wie die Apolipoproteine sowohl für diagnostische als auch für Forschungszwecke analysiert werden können.
Abstract
Die Analyse von Plasmalipoproteinen und Apolipoproteinen ist ein wesentlicher Bestandteil für die Diagnose von Dyslipidämie und Studien des Fettstoffwechsels und der Arteriosklerose. Obwohl es mehrere Methoden zur Analyse von Plasma-Lipoproteinen gibt, ist die Ultrazentrifugation immer noch eine der beliebtesten und zuverlässigsten Methoden. Aufgrund seines intakten Trennverfahrens können die mit dieser Methode isolierten Lipoproteinfraktionen zur Analyse von Lipoproteinen, Apolipoproteinen, Proteomen und funktionellen Untersuchungen von Lipoproteinen mit kultivierten Zellen in vitro verwendet werden. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von sieben Lipoproteinfraktionen, einschließlich VLDL (d<1.006 g/ml), IDL (d=1,02 g/ml), LDLs (d=1,04 und 1,06 g/ml), HDLs (d=1,08, 1,10 und 1,21 g/ml) aus Kaninchenplasma unter Verwendung sequenzieller schwimmender Ultrazentrifugation. Darüber hinaus stellen wir den Lesern vor, wie man Apolipoproteine wie ApoA-I, ApoB und ApoE von SDS-PAGE und Western Blotting analysiert und repräsentative Ergebnisse von Lipoprotein- und Apolipoproteinprofilen mit hyperlipidemischen Kaninchenmodellen zeigt. Diese Methode kann ein Standardprotokoll für Ärzte und Grundlegende Wissenschaftler werden, um Lipoproteinfunktionen zu analysieren.
Introduction
Dyslipidämie ist der Hauptrisikofaktor für atherosklerotische Erkrankungen in der Welt. Hohe Konzentrationen von Lipoproteinen mit geringer Dichte (LDLs) und niedrige Konzentrationen von Lipoproteinen mit hoher Dichte (HDLs) sind eng mit einem hohen Risiko für koronare Herzerkrankungen (CHD)1,2verbunden. Im klinischen Umfeld werden sowohl LDL-Cholesterin (LDL-C) als auch HDL-Cholesterin (HDL-C) routinemäßig mit einem automatisierten Analysator in einem klinischenLabor3,4gemessen. Trotzdem ist es wichtig, Lipoproteinprofile im Detail für die Diagnose von Dyslipidämie und die Untersuchung des Fettstoffwechsels und der Arteriosklerose bei menschlichen und experimentellen Tieren zu analysieren. Es wurden mehrere Methoden zur Analyse von Plasmalipoproteinen wie Ultrazentrifugation, Größenausschlusschromatographie [schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC) und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)], Elektrophorese durch Agarose und Polyacrylamidgele, Kernspinresonanz und selektive chemische Ausfällung mit Polyanionen und divalenten Kationen oder anderen Chemikalien beschrieben. In den 1950er Jahren schlug Havels Gruppe erstmals das Konzept der Lipoproteine vor, die durch Dichten mittels Ultrazentrifugation definiert wurden, und klassifizierte sie in Chylomicrons (CM), Lipoproteine mit sehr niedriger Dichte (VLDL), Lipoproteine mit mittlerer Dichte (IDL), LDL und HDL5 und später wurde die Methode von anderen Gruppen6,7weiter modifiziert. Bisher ist ultrazentrifugation die beliebteste und zuverlässigste Methode, während das praktische Protokoll noch nicht verfügbar ist. In diesem Artikel haben wir versucht, ein benutzerfreundliches Protokoll zur Isolierung eines kleinen Plasmamaßstabs mit sequenzieller Dichte schwebender Ultrazentrifugation zu beschreiben, die ursprünglichzuvor beschriebenwurde 8 . Isolierung von sieben Plasma-Lipoproteinfraktionen [VLDL (d<1.006 g/ml), IDL (d=1,02 g/ml), LDLs (d=1,04 und 1,06 g/ml), HDLs (d=1,08, 1.10 und 1.21 g/mL)] ermöglicht es den Forschern, eine umfassende Analyse sowohl der Lipoproteine als auch ihrer kompositorischen Apolipoproteine9,10,11zu machen. Die intakten sieben aufeinanderfolgenden Dichte-Lipoproteine können zur Analyse von Lipoproteinfunktionen und auch zur Analyse zellbasierter In-vitro-Strategien verwendet werden. Dieses Protokoll sollte sowohl für die klinische Diagnose als auch für die Grundlagenforschung nützlich sein. Hier haben wir Kaninchenplasma als Beispiel verwendet, um diese Technik zu demonstrieren, während Plasma von anderen Arten auf die gleiche Weise angewendet werden kann.
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Protocol
Alle Verfahren für Kaninchenstudien wurden mit Genehmigung des Institutionellen Tierpflege- und Verwendungsausschusses der Universität Yamanashi (genehmigte Nummer: A28-39) durchgeführt.
1. Plasmatrennung von Kaninchenblut
- Bereiten Sie 1,5 ml Mikroröhrchen mit 15 l 0,5 M EDTA (pH 8,0) für die Blutentnahme vor.
- Legen Sie ein Kaninchen in einen Restrainer und punktieren Sie eine auriculare Zwischenschlagader mit einer 22-Spur-Nadel und sammeln Sie Blut in eine Röhre. Mischen Sie das Blut mit EDTA sanft und legen Sie es auf Eis.
- Zentrifugieren Sie die Blutröhrchen bei 1.500 x g für 20 min bei 4 °C und sammeln Sie Plasma in einem neuen Mikrorohr.
HINWEIS: 3 ml Blut reichen aus, um 1 ml Plasma zu sammeln. Wenn Sie Blut von Mäusen oder anderen kleinen Tieren sammeln, müssen Sie sie bündeln.
2. Isolierung von Plasma-Lipoproteinen
HINWEIS: Die schematische Prozedur ist in Abbildung 1dargestellt. Die Zubereitungsmethode von Kaliumbromid (KBr) Dichtelösungen ist in Tabelle 1dargestellt.
- Übertragen Sie 1 ml Plasma in ein Polycarbonat-Ultrazentrifugenrohr (Abbildung 2A).
- Beladen Sie diese Rohre in einem festen Winkelrotor und zentrieren Sie das Plasma bei 356.000 x g für 2,5 h bei 4 °C(Abbildung 2B).
HINWEIS: Für Beckman TLA 120.2 Rotor entspricht 356.000 x g (durchschnittliches relatives Zentrifugalfeld, Av RCF) 100.000 U/min. - Schneiden Sie die Rohre mit einem Slicer und sammeln Sie dann den oberen Bruch [VLDL (d<1.006 g/ml)], ca. 200 'L in ein neues Mikrorohr (Abbildung 2C). Sammeln Sie den verbleibenden unteren Bruch in ein neues Polycarbonat-Ultrazentrifugenrohr für die nächste Trennung (Abbildung 2D). Messen Sie das Volumen und machen Sie das Gesamtvolumen auf 800 l, indem Sie die gleiche Dichtelösung (d=1,006 g/ml) hinzufügen.
HINWEIS: Richten Sie eine Klinge auf den Rohrschneider ein. Passen Sie die Position der Klinge auf einer Ebene zwischen dem oberen Bruch (200 l) und dem unteren Bruch (800 l) an. Der viskose Niederschlag in der unteren Fraktion sollte sorgfältig und vollständig durch Pipettieren in allen folgenden Schritten gesammelt werden. Wenn Sie anhalten, tun Sie dies nach dem Trennen des oberen und unteren Bruchs in allen Schritten. Bewahren Sie die Probe bei 4°C bis zur nächsten Zentrifugation auf. - Passen Sie den unteren Anteil (insgesamt 800 l) auf d=1,02 g/ml an, indem Sie 58,9 l d=1,21 g/ml Lösung und 141,1 l d=1,02 g/ml Lösung (das Gesamtvolumen beträgt 1 ml) hinzufügen.
- Beladen Sie diese Rohre in Festwinkelrotor und Zentrifuge bei 356.000 x g für 2,5 h bei 4 °C.
- Schneiden Sie die Rohre mit einem Schneideschneider und sammeln Sie dann den oberen Bruch [IDL (d=1,02 g/ml)] ca. 200 l in ein neues Mikrorohr. Sammeln Sie die verbleibende untere Fraktion in ein neues Polycarbonat-Ultrazentrifugenrohr für die nächste Trennung. Messen Sie das Volumen und machen Sie das Gesamtvolumen auf 800 l, indem Sie die gleiche Dichtelösung (d=1,02 g/ml) hinzufügen.
- Passen Sie den unteren Anteil (insgesamt 800 l) auf d=1,04 g/ml an, indem Sie 94,1 l d=1,21 g/ml Lösung und 105,9 l d=1,04 g/ml Lösung (das Gesamtvolumen beträgt 1 ml) hinzufügen.
- Beladen Sie diese Rohre in einem festwinkeligen Rotor und Zentrifuge bei 356.000 x g für 2,5 h bei 4 °C.
- Schneiden Sie die Rohre mit einem Schneideschneider und sammeln Sie dann den oberen Bruch [LDL (d=1,04 g/ml)] ca. 200 l in ein neues Mikrorohr. Sammeln Sie die verbleibende untere Fraktion in ein neues Polycarbonat-Ultrazentrifugenrohr für die nächste Trennung. Messen Sie das Volumen und machen Sie die Gesamtmenge auf 800 l, indem Sie die gleiche Dichtelösung (d=1,04 g/ml) hinzufügen.
- Passen Sie den unteren Anteil (insgesamt 800 l) auf d=1,06 g/ml an, indem Sie 106,7 l d=1,21 g/ml Lösung und 93,3 l d=1,06 g/ml Lösung (das Gesamtvolumen beträgt 1 ml) hinzufügen.
- Beladen Sie diese Rohre in einem festwinkeligen Rotor und Zentrifuge bei 356.000 x g für 2,5 h bei 4 °C.
- Schneiden Sie die Rohre mit einem Schneideschneider und sammeln Sie dann den oberen Bruch [LDL (d=1,06 g/ml)] ca. 200 l in ein neues Mikrorohr. Sammeln Sie die verbleibende untere Fraktion in ein neues Polycarbonat-Ultrazentrifugenrohr für die nächste Trennung. Messen Sie das Volumen und machen Sie die Gesamtmenge auf 800 l, indem Sie die gleiche Dichtelösung (d=1,06 g/ml) hinzufügen.
- Passen Sie den unteren Anteil (insgesamt 800 l) auf d=1,08 g/ml an, indem Sie 123,1 l d=1,21 g/ml Lösung und 76,9 l d=1,08 g/ml Lösung (das Gesamtvolumen beträgt 1 ml) hinzufügen.
- Beladen Sie diese Rohre in einem festwinkeligen Rotor und Zentrifuge bei 356.000 x g für 2,5 h bei 4 °C.
- Schneiden Sie die Rohre mit einem Slicer und sammeln Sie dann den oberen Bruch [HDL2 (d=1,08 g/ml)] ca. 200 l in ein neues Mikrorohr. Sammeln Sie die verbleibende untere Fraktion in ein neues Polycarbonat-Ultrazentrifugenrohr für die nächste Trennung. Messen Sie das Volumen und machen Sie die Gesamtmenge auf 800 l, indem Sie die gleiche Dichtelösung (d=1,08 g/ml) hinzufügen.
- Passen Sie den unteren Anteil (insgesamt 800 l) auf d=1,10 g/ml an, indem Sie 145,5 l d=1,21 g/ml Lösung und 54,5 l d=1,10 g/ml Lösung (das Gesamtvolumen beträgt 1 ml) hinzufügen.
- Beladen Sie diese Rohre in einem festwinkeligen Rotor und Zentrifuge bei 356.000 x g für 2,5 h bei 4 °C.
- Schneiden Sie die Rohre mit einem Slicer und sammeln Sie dann den oberen Bruch [HDL2 (d=1,10 g/ml)] ca. 200 l in ein neues Mikrorohr. Sammeln Sie die verbleibende untere Fraktion in ein neues Polycarbonat-Ultrazentrifugenrohr für die nächste Trennung. Messen Sie das Volumen und machen Sie die Gesamtmenge auf 800 l, indem Sie die gleiche Dichtelösung (d=1,10 g/ml) hinzufügen.
- Den unteren Anteil (insgesamt 800 l) auf d=1,21 g/ml einstellen, indem man 0,140 g Kaliumbromidpulver (KBr) hinzufügt, und vollständig auflösen. Messen Sie das Volumen und machen Sie sie auf 1 ml, indem Sie d=1,21 g/ml Lösung hinzufügen.
- Beladen Sie diese Rohre in Festwinkelrotor und Zentrifuge bei 513.000 x g für 4 h bei 4 °C.
HINWEIS: Für Beckman TLA 120.2 Rotor entspricht 513.000 x g (Av RCF) 120.000 Umdrehungen von 120.000 Umdrehungen/ Min. - Schneiden Sie die Rohre mit einem Slicer und sammeln Sie dann den oberen Bruch [HDL3 (d=1,21 g/ml)] ca. 200 l in ein neues Mikrorohr. Dies ist der letzte Schritt für die Ultrazentrifugation.
3. Dialyse
HINWEIS: Da die Dichtefraktionen (außer d<1.006 g/ml) hohe KBr-Konzentrationen enthalten, ist es notwendig, sie durch Dialyse zu entfernen.
- Übertragen Sie die Dichtefraktionen auf einen Dialyseschlauch und schneiden Sie beide Enden mit Verschlüssen ab.
- Dialyse gegen 2 L Dialysepuffer wie PBS/ 1 mM EDTA für 6 h bei 4 °C mit Rührer mit Magnetrührer.
- Durch neuen Puffer ersetzen und bei 4 °C noch mal 6 h dialysieren.
- Sammeln Sie die Dichtefraktionen und messen Sie das Volumen. Passen Sie alle Dichtefraktionen auf das gleiche Volumen an (z. B. 250 l).
HINWEIS: Sie können den konzentrierten Faktor aus 1 ml Originalplasma berechnen (z. B. entspricht 250 l Dichteanteil der vierfachen Konzentration).
4. Analyse von Lipoproteinen
HINWEIS: Nach der Dialyse sind diese Lipoproteine für verschiedene Analysen bereit. Lipoproteine können entweder durch Messung von Lipiden oder Apolipoproteinen oder beidem bewertet werden. Zur Messung von Lipidgehalten wie Gesamtcholesterin (TC), Triglyceriden (TG), Phospholipiden (PL) und freiem Cholesterin (FC) in jeder Fraktion verwenden wir kommerzielle enzymatische kolorekmetrische Assay-Kits. Für die Analyse von Apolipoproteinen verwenden wir SDS-PAGE visualisiert mit CBB-Färbung oder Western Blotting.
- Lipidanalyse
HINWEIS: Lipide wie TC, TG, PL und FC in der Lipoproteinfraktion können mit handelsüblichen Messkits gemessen werden. Die Verfahren hängen von den verwendeten Reagenzien ab, also befolgen Sie die Anweisungen jedes verwendeten Kits. Hier zeigen wir einen typischen Mikroplatten-Assay mit einem kommerziellen enzymatischen Assay-Kit.- Tragen Sie 8 L Lipoproteinprobe und Standardkalibrierungssubstanz auf 96-Well-Mikroplatte auf.
- Fügen Sie 240 L Assay-Reagenz hinzu und mischen Sie sie durch Pipettieren.
- Bei 37 °C für 10 min inkubieren.
- Messen Sie die OD mit einem Mikroplattenleser und berechnen Sie Lipidkonzentrationen.
- Apolipoprotein-Analyse
- SDS-PAGE und CBB Färbung
- Probenvorbereitung: Fügen Sie 10 l 2x Probenpuffer zu 10 l Lipoproteinfraktion hinzu. Erhitzen Sie das Gemisch bei 80 °C für 5 min mit einem trockenen Wärmeblock.
- Bereiten Sie 4-20% GradientS-Polyacrylamid-Gel vor und richten Sie das Gel auf der mit Laufpuffer gefüllten Elektrophoresekammer ein.
- Laden Sie Lipoproteinproben (10 l/Lane) und Proteinstandards (5 l/Lane) auf das Stapelgel.
ANMERKUNG: Wenn die Proben zweimal konzentriert sind, wird pro Spur eine entsprechende Menge von 20 L Plasma analysiert.] - Elektrophorese bei 20–40 mA Konstantstrom laufen.
- CBB-Färbung: Das Gel zweimal in Befestigungslösung mit sanftem Schütteln für 10 min einweichen. Das Gel mit CBB-Färbungslösung für 30 min färben. Spülen Sie das Gel in destilliertem Wasser, um den überschüssigen Fleck zu entfernen. Das Gel ist zum Fotografieren bereit.
- Western Blotting
- Führen Sie die Elektrophorese im gleichen Verfahren wie oben beschrieben durch.
HINWEIS: Das Volumen der Lipoproteine, die für die Western-Blotting geladen werden, ist geringer als bei der oben beschriebenen CBB-Färbung (z. B. 1–5 l). - Legen Sie das Gel und die PVDF-Membran zwischen Transferpuffer-getränktem Filterpapier und Formpad. Richten Sie das Sandwich in eine Halterkassette ein und legen Sie es in einen mit Transferpuffer gefüllten Tank.
- Elektroblotting bei 100 mA Konstantstrom für 3 h bei 4 °C durchführen.
- Blockierung: Inkubieren Sie die Membran im Sperrpuffer für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C.
- Primäre Ab-Reaktion: Inkubieren Sie die Membranen im primären Abs mit Sperrpuffer für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C mit leichtem Schütteln verdünnt.
HINWEIS: Die vorgeschlagene primäre Ab-Verdünnung ist in der Materialtabelledargestellt. Drei Arten von primären Abs gegen Apolipoproteine können singoder in Cocktails verwendet werden. - Waschen Sie die Membran dreimal im Waschpuffer mit Rührung, 5 min pro Wäsche.
- Sekundäre Ab-Reaktion: Inkubieren Sie die Membran im sekundären Abs mit Sperrpuffer für 1 h bei Raumtemperatur mit Rührung verdünnt.
HINWEIS: Die vorgeschlagene sekundäre Ab-Verdünnung ist in der Materialtabelledargestellt. - Waschen Sie die Membran dreimal im Waschpuffer mit Rührung, 5 min pro Wäsche.
- ECL-Erkennung: Legen Sie die Membran auf eine Plastikfolie. ECL-Detektionsreagenzien hinzufügen und 1 min inkubieren. Überschüssige Flüssigkeit abtropfen lassen und die Membran in einem Beutel versiegeln.
- Visualisieren Sie die Signale mit einem Bildanalysator.
- Führen Sie die Elektrophorese im gleichen Verfahren wie oben beschrieben durch.
- SDS-PAGE und CBB Färbung
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Representative Results
Mit diesem Protokoll isolierten wir Kaninchen-Lipoproteine mit 1 ml Plasma und erhielten sieben Dichtefraktionen. Isolierte Dichtefraktionen reichen aus, um Lipide und Apolipoproteine zu messen, wie oben beschrieben, für die meisten Forschungszwecke. Das gleiche Verfahren kann auch für die Isolierung von Plasma-Lipoproteinen von menschlichen und anderen Arten verwendet werden. Für kleine Tiere wie Mäuse ist gepooltes Plasma erforderlich. Abbildung 3 zeigt Lipoproteinprofile von Wildtypkaninchen (WT) gefüttert entweder eine normale Standard (NS) Diät oder hohe Cholesterin (HC) Ernährung. Kaninchen sind Pflanzenfresser, so dass ihre Plasma-TC-, TG- und PL-Spiegel im Allgemeinen niedriger sind als Menschen und Mäuse. Bei NS-gefütterten Kaninchen wird TC hauptsächlich in HDL3 (d=1,21 g/ml) und gefolgt von LDL (d=1,04 g/ml) (Abbildung 3A) verteilt. Bei einer NS-Diät werden 39 % des Plasma-TG in VLDLs verteilt, während 57 % des Plasmapl in HDL3 enthalten sind (Abbildung 3A). Wenn Kaninchen mit einer Diät mit hohem Cholesterinspiegel ergänzt herausgefordert wurden, entwickelten sie sich schnell zu Hypercholesterinämie. Wie in Abbildung 3Bdargestellt, zeichnen sich die Lipoproteinprofile durch eine deutliche Erhöhung der VLDLs (165-fach in VLDL-TC, 1,5-fach in VLDL-TG und 30-fach in VLDL-PL im Vergleich zu NS-gefütterten Kaninchen) aus. Da VLDLs, die von cholesteringefütterten Kaninchen isoliert sind, reich an Cholesterlester sind und sich auf die β Position bei der Agarose-Gel-Elektrophorese bewegen, werden sie oft als β-VLDLs bezeichnet, um sie von normalen VLDLs zu unterscheiden, die sich in die Vor-β Position bewegen.
Zusätzlich zu den Lipiden können Apolipoproteine einfach per SDS-PAGE entweder durch CBB-Färbung oder Western Blotting analysiert werden (Abbildung 4). Sieben Lipoproteinfraktionen von WT-Kaninchen, die entweder mit einer NS- oder einer HC-Diät gefüttert wurden, wurden auf einem 4-20% SDS-Polyacrylamid-Gel ausgeführt und mit CBB-Färbung visualisiert (Abbildung 4A). Bei einer HC-Diät waren sowohl ApoB-100- als auch ApoE-Gehalte in VLDLs (d<1.006 g/mL), IDLs (d=1,02 g/ml) und LDLs (d=1,04 g/ml) im Vergleich zu Kaninchen auf einer NS-Diät deutlich erhöht. Darüber hinaus verglichen wir auch Apolipoprotein- und Lipoproteinprofile von drei verschiedenen hyperlipidemischen Kaninchen: HC-diätgefütterte WT-Kaninchen, ApoE-Knockout (KO)-Kaninchen und Watanabe-vererbbisierbare hyperlipidem (WHHL) Kaninchen mit LDL-Rezeptormangel durch Western Blotting (Abbildung 4B). Plasmalipoproteine wurden durch 4-20% SDS-PAGE fraktioniert und gefolgt von Western Blotting mit Antikörpern gegen ApoE, ApoB und ApoA-I. Die apoBhaltigen Partikel (VLDLs, IDLs und LDLs) von HC-gefütterten WT-Kaninchen zeichnen sich durch einen erhöhten ApoB-100- und ApoE-Gehalt aus, während ApoE-KO-Kaninchen zusammen mit dem Auftreten von ApoA-I einen deutlichen Anstieg von ApoB-48 zeigten. WHHL-Kaninchen sind genetisch mangelhaft in LDL-Rezeptor-Funktionen, so gibt es eine deutliche Zunahme von ApoB-100 in LDLs begleitet von reduzierten ApoA-I in HDLs, die ähnlich wie menschliche familiäre Hypercholesterinämie ist.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der sequenziellen schwimmenden Ultrazentrifugation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative Bilder der Plasma-Lipoprotein-Isolierung. (A) Plasma von normolipidemischen und hyperlipidemmischen Kaninchen. (B) Floated top VLDL (d<1.006 g/mL) und untere Fraktion (d>1.006 g/ml) nach Ultrazentrifugation. (C) Rohrschnitt und Sammlung des oberen Bruchs durch eine Pipette. (D) Auflistung des unteren Bruchs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Quantifizierung des Lipidgehalts in jeder Lipoproteinfraktion, die von normalen Kaninchen (A) und cholesteringefütterten Kaninchen (B) isoliert wird. Plasma-Lipoproteine wurden durch sequenzielle schwimmende Ultrazentrifugation aus Plasma von Wildkaninchen entweder auf einer normalen Standarddiät (A) oder einer diäthohen Cholesterindiät (B) getrennt. Es wurden Gesamtcholesterin (TC), Triglyceride (TG) und Phospholipide (PL) gemessen. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (n=6) ausgedrückt. Diese Zahl wurde von Yan H et al.12geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Vergleich der Apolipoproteinverteilung mit CBB-Färbung (A) und Western Blotting (B). Plasma wurde durch Ultrazentrifugation isoliert und Lipoproteine wurden durch 4-20% SDS-PAGE fraktioniert. (A) Apolipoproteinprofile von Wildtypkaninchen (WT) mit normaler Standarddiät (NS) und einer diäteten Ernährung mit hohem Cholesterinspiegel (HC) wurden durch CBB-Färbung visualisiert. Im Vergleich zu NS-gefütterten Kaninchen (links) zeigten HC-gefütterte Kaninchen (rechts) einen erhöhten ApoB-100- und ApoE-Gehalt in VLDLs, IDLs und LDLs. (B) Vergleich der Apolipoprotein-Merkmale von WT-Kaninchen auf einer NS- oder HC-Diät, ApoE KO (Knockout)-Kaninchen auf einer HC-Diät und WHHL-Kaninchen auf einer NS-Diät. Western Blotting wurde mit "Cocktail-Antikörpern" gegen ApoE, ApoB und ApoA-I durchgeführt. Im Vergleich zu normolipidemischen Kaninchen (WT-Kaninchen auf NS-Diät, zuerst links) weisen andere drei hyperlipidemische Kaninchen einzigartige und unterschiedliche Apolipoproteinprofile auf. Die apoBhaltigen Partikel (VLDLs, IDLs und LDLs) von HC-gefütterten WT-Kaninchen zeichnen sich durch einen erhöhten ApoB-100- und ApoE-Gehalt aus, während ApoE KO-Kaninchen zusammen mit dem Auftreten von ApoA-I einen deutlichen Anstieg von ApoB-48 zeigten. WHHL zeigte einen deutlichen Anstieg von ApoB-100 in LDLs, begleitet von reduzierten ApoA-I in HDLs. Diese Zahl wurde von Niimi M et al.10geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Dichtelösung (g/mL) | KBr (g) | Destilliertes Wasser (mL) |
| d=1,006 | 8.404 | 1000 |
| d=1,02 | 28.271 | 1000 |
| d=1,04 | 57.261 | 1000 |
| d=1,06 | 86.958 | 1000 |
| d=1,08 | 117.365 | 1000 |
| d=1,10 | 148.490 | 1000 |
| d=1,21 | 333.394 | 1000 |
Tabelle 1: Zubereitung von Kaliumbromid (KBr) Dichtelösungen. Das Gewicht (g) von KBr add to 1000 ml destilliertes Wasser wird angezeigt.
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Discussion
Hyperlipidämie ist einer der wichtigsten Risikofaktoren für atherosklerotische Erkrankungen. Daher ist die Analyse von Plasmalipoproteinen nicht nur für die Diagnose von Dyslipidämie-Patienten wichtig, sondern auch wichtig für die Untersuchung molekularer Mechanismen des Lipoproteinstoffwechsels und der Arteriosklerose. In dieser Studie haben wir das Protokoll der Isolierung und Analyse von Plasma-Lipoproteinen beschrieben, das in Laboratorien angewendet werden kann, in denen Ultrazentrifugation verfügbar ist. Die mit dieser Methode gewonnenen Informationen sind umfassend und unkompliziert, daher wird sie sowohl für klinische als auch für Grundlagenforscher empfohlen. Isolierte Lipoproteine können auch für die Untersuchung vieler anderer Facetten von Lipoproteinfunktionen wie Negativ-Flecken-Elektronenmikroskopie13,14, Oxidizierbarkeit9,15, Proteomik16, Zellkultur-basierte In-vitro-Studie wie Cholesterin-Efflux-Assay9 und Lipoprotein-Aufnahme-Assay17verwendet werden.
Darauf sollte hingewiesen werden; Es gibt jedoch mehrere Schwachstellen, die berücksichtigt werden müssen. Erstens ist diese Methode im Vergleich zu anderen Methoden relativ zeitaufwändig (mindestens drei Tage). Bei Verwendung der neuesten Tabletop-Ultrazentrifuge kann hochgeschwindigkeits-Spin (150.000 U/min) die Trennzeit 50–140 min für jede Lipoproteinfraktion18verkürzen. Zweitens kann es während der Isolierung zu Probenverlusten kommen. Um den Probenverlust zu minimieren, sollte der viskose Niederschlag in der unteren Fraktion gelöst und sorgfältig durch Pipettieren gesammelt werden. Die Zentrifugenrohre müssen fest mit einem Slicer befestigt werden, um ein Auslaufen der oberen Fraktion zu vermeiden. Darüber hinaus sollten die Proben sorgfältig aus Dialysebeuteln zurückgewonnen werden. Die Erholung kann durch einen Vergleich des gesamten Lipoproteincholesterins mit dem ursprünglichen Plasmacholesterin berechnet werden. Nach unserer Erfahrung wird die allgemeine Erholungsrate ≈ 80%19betragen. Drittens ist dieses Protokoll für eine kleine Anzahl der Proben begrenzt, da ein Rotor nur zwölf Rohre pro Zeit laufen kann. Um eine große Anzahl von Proben durchzuführen, kann es geeignet sein, andere Methoden wie Niederschlagsmethode für HDL-Vorbereitung4 und automatisierte HPLC-Lipoprotein-Analyse20zu verwenden.
Zusammenfassend bietet dieses Protokoll einen Leitfaden für Forscher, um Plasma-Lipoproteine mit sequenzieller Dichte-Ultrazentrifugation und der Analyse von Lipiden und Apolipoproteinen zu isolieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch ein Forschungsstipendium von JSPS KAKENHI Grant Number JP 20K08858, der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81941001 und 81770457), JSPS-CAS im Rahmen des Japan-China Research Cooperative Program unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22-gauge needle | Terumo | NN-2232S | For blood collection |
| 96-well microplate | greiner bio-one | 655101 | For lipids measurment |
| Anti-apolipoprotein A-I antibody | LifeSpan BioSciences | LS-C314186 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein B antibody | ROCKLAND | 600-101-111 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein E antibody | Merck Millipore | AB947 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| CBB staining kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 299-50101 | For apolipoprotein analysis |
| Centrifuge | HITACHI | himac CF15RN | |
| Closure | Spectrum | 132736 | For lipoprotein dialysis |
| Dialysis tubing | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 043-30921 | For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000 |
| Dry heat block | Major Science | MD-01N | For SDS-PAGE sample preparation |
| ECL Western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | For Western blotting |
| Electrophoresis Chamber | BIO-RAD | Mini-PROTEAN Tetra Cell | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 345-01865 | For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM) |
| Filter paper | ADVANTEC | 590 | For Western blotting |
| Fixed angle ultracentrifuge rotor | BECKMAN COULTER | 357656 | TLA-120.2 |
| Fixing solution | For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid) | ||
| Immun-Blot PVDF menbrane | BIO-RAD | 1620177 | For Western blotting |
| Lumino image analyzer | GE Healthcare | For Western blotting, ImageQuant LAS 4000 | |
| Magnetic stirrer | ADVANTEC | SR-304 | For lipoprotein dialysis |
| Microplate reader iMARK | BIO-RAD | For lipids measurment | |
| Microtube | INA-OPTIKA | SC-0150 | |
| Orbital agitator USBDbo | Stovall Life Science | ||
| Peroxidase congugated anti goat IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-035-003 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Phospholipids assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 433-36201 | For lipids measurment |
| Polycarbonate ultracentrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 343778 | |
| Potassium Bromide | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 168-03475 | For density solution |
| Power Supply | BIO-RAD | For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC | |
| Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra | BIO-RAD | 161-0377 | For SDS-PAGE and Western blotting |
| Rabbit restrainer | Natsume Seisakusho | KN-318 | For blood collection |
| Rotor | HITACHI | T15A43 | |
| SDS-PAGE running buffer | 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS | ||
| SDS-PAGE sample buffer (2x) | 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol | ||
| SDS-polyacrylamide gel | 4-20% gradient polyacrylamide gel | ||
| Skim milk powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-12865 | For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS) |
| Total cholesterol assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 439-17501 | For lipids measurment |
| Triglyicerides assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 432-40201 | For lipids measurment |
| Tube slicer for thick-walled tube | BECKMAN COULTER | 347960 | For lipoprotein isolation |
| Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS) |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A95761 | Optima MAX-TL |
| Western blotting wet transfer system | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Cell |
References
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