Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Поведенческая оценка зрительной функции с помощью оптомоторного ответа и когнитивной функции через Y-лабиринт у крыс с диабетом

Published: October 23, 2020 doi: 10.3791/61806
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,4, 1, 1, 1,2, 1,2
1Center for Visual and Neurocognitive Rehabilitation, Atlanta VA Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Department of Neuroscience, Emory University, 4Gangarosa Department of Environmental Health, Emory University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Нейронная дегенерация в обоих глазах и головном мозге в результате диабета может наблюдаться с помощью поведенческих тестов, проводимых на грызунах. Y-лабиринт, мера пространственного познания, и оптомоторный ответ, мера зрительной функции, дают представление о потенциальных диагнозах и методах лечения.

Abstract

Оптомоторная реакция и Y-лабиринт являются поведенческими тестами, полезными для оценки зрительной и когнитивной функции соответственно. Оптомоторный ответ является ценным инструментом для отслеживания изменений порогов пространственной частоты (SF) и контрастной чувствительности (CS) с течением времени в ряде моделей заболеваний сетчатки, включая диабетическую ретинопатию. Аналогичным образом, Y-лабиринт может быть использован для мониторинга пространственного познания (измеряемого спонтанным чередованием) и исследовательского поведения (измеряемого рядом записей) в ряде моделей заболеваний, которые влияют на центральную нервную систему. Преимущества оптомоторного ответа и Y-лабиринта включают чувствительность, скорость тестирования, использование врожденных реакций (обучение не требуется) и возможность выполнять на бодрствующих (не обезболенных) животных. Здесь описаны протоколы как для оптомоторного ответа, так и для Y-лабиринта, а примеры их использования показаны в моделях диабета I и II типа. Методы включают подготовку грызунов и оборудования, производительность оптомоторного ответа и Y-лабиринта, а также анализ данных после тестирования.

Introduction

Более 463 миллионов человек живут с диабетом, что делает его одной из крупнейших глобальных эпидемий заболеваний1. Одним из серьезных осложнений, возникающих при диабете, является диабетическая ретинопатия (ДР), ведущая причина слепоты у взрослых американцев трудоспособного возраста2. В ближайшие 30 лет процент населения, подверженного риску ДР, по прогнозам, удвоится, поэтому крайне важно найти новые способы диагностики ДР на более ранних стадиях для предотвращения и смягчения развития ДР3. Dr традиционно считается сосудистым заболеванием4,5,6. Однако теперь, с признаками нейрональной дисфункции и апоптоза в сетчатке, который предшествует сосудистой патологии, DR определяется как имеющий нейронные и сосудистые компоненты4,5,6,7,8,9. Одним из способов диагностики ДР может быть изучение нервных аномалий в сетчатке, ткани, которая может быть более уязвимой к окислительному стрессу и метаболическому напряжению от диабета, чем другая нервная ткань10.

Снижение когнитивной и двигательной функции также происходит при диабете и часто коррелирует с изменениями сетчатки. Пожилые люди с диабетом II типа показывают худшие базовые когнитивные функции и показывают более усугубленное снижение когнитивных функций, чем контрольные участники11. Кроме того, сетчатка была установлена как расширение центральной нервной системы и патологии могут проявляться в сетчатке12. Клинически связь между сетчаткой и мозгом была изучена в контексте болезни Альцгеймера и других заболеваний, но обычно не исследуется при диабете12,13,14,15,16. Изменения в мозге и сетчатке во время прогрессирования диабета могут быть изучены с использованием животных моделей, включая крысу STZ (модель диабета типа I, в которой токсин, стрептозотоцин или STZ, используется для повреждения бета-клеток поджелудочной железы) и крысу Гото-Какидзаки (полигенная модель диабета типа II, при которой у животных спонтанно развивается гипергликемия примерно в возрасте около 3 недель). В этом протоколе приводится описание Y-лабиринта и оптомоторного ответа для оценки когнитивных и визуальных изменений у диабетических грызунов соответственно. Оптомоторная реакция (OMR) оценивает пространственную частоту (аналогичную остроте зрения) и контрастную чувствительность путем мониторинга характерных рефлексивных движений головы для измерения зрительных порогов для каждого глаза17. Пространственная частота относится к толщине или тонкости полос, а контрастная чувствительность относится к тому, насколько контрастен между полосами и фоном (рисунок 1E). Между тем, Y-лабиринт проверяет кратковременную пространственную память и исследовательскую функцию, наблюдаемую через спонтанные чередования и входы через рукава лабиринта.

Оба теста могут быть выполнены на бодрствующих, не обезболенных животных и имеют преимущество в том, что они извлекают выгоду из врожденных реакций животных, что означает, что они не требуют обучения. Оба являются относительно чувствительными, поскольку их можно использовать для выявления дефицита на ранней стадии прогрессирования диабета у грызунов, и надежными, поскольку они дают результаты, которые коррелируют с другими визуальными, сетчаточными или поведенческими тестами. Кроме того, использование OMR и Y-лабиринта в сочетании с такими тестами, как электроретинограмма и оптическая когерентная томография, может предоставить информацию о том, когда изменения сетчатки, структурные и когнитивные изменения развиваются относительно друг друга в моделях заболеваний. Эти исследования могут быть полезны для выявления нейронных дегенераций, которые возникают из-за диабета. В конечном счете, это может привести к новым диагностическим методам, которые эффективно идентифицируют ДР на ранних стадиях прогрессирования.

Системы OMR и Y-лабиринта, используемые для разработки этого протокола, описаны в Таблице материалов. Предыдущие исследования OMR, Prusky et al.18, и Y-лабиринта, Maurice et al.19, были использованы в качестве отправной точки для разработки этого протокола.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры были одобрены Комитетом по институциональным делам ветеранов Атланты по уходу за животными и их использованию и соответствовали руководству Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных (NIH Publications, 8th edition, обновлено в 2011 году).

1. Оптомоторный отклик (OMR)

  1. Настройка аппарата OMR (подробная информация об аппарате и программном обеспечении приведена в Таблице материалов)
    1. Выберите подходящую по размеру платформу для грызуна: мыши, крысы или крупной крысы с ограниченными возможностями (рисунок 1А).
    2. Откройте программное обеспечение OMR, которое должно открыть окно с несколькими вкладками опций и живой видеопотоком внутри OMR/виртуального барабана (рисунок 1B). Увеличивайте или уменьшайте масштаб с помощью видеокамеры по мере необходимости, чтобы платформа и ее окружение были видны.
    3. Обратите внимание на значки вдоль левой стороны живого изображения (рисунок 1C). Нажмите на значок звездочки и значок вращающихся полос, чтобы зеленая звездочка и зеленая вращающиеся полосы исчезли из живой ленты.
    4. Нажмите на значок компаса , чтобы появился зеленый круг и две перпендикулярные линии. Растяните зеленый круг так, чтобы он идеально совпадал с черным кругом на платформе, что обеспечит идеальное выравнивание OMR.
    5. Нажмите на значок компаса , потому что нет необходимости видеть круг во время тестирования. Нажмите на зеленый значок звездочки и зеленый значок вращающихся полос , чтобы они снова появились. Обратите внимание, что зеленые полосы вращаются в том же направлении, что и полосы в барабане, что позволяет исследователю знать направление полос.
    6. Перейдите на вкладку Тестирование . В разделе Тестирование перейдите на вкладку Психофизика . В разделе Пороговое значение выберите Частота для измерения пространственной частоты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение OMR использует парадигму лестницы для автоматического расчета пространственной частоты (SF). Контрастность будет поддерживаться на уровне 100%.
    7. В разделе Тестирование перейдите на вкладку Пресеты . Выберите настройки по умолчанию для Mouse18 или Rat20.
    8. В разделе Тестирование перейдите на вкладку Пустота . Установите флажок Blank on Tracking ,который приостанавливает полосы/очищает экраны компьютера в барабане всякий раз, когда мышь щелкает правой кнопкой мыши.
    9. Нажмите на вкладку Результаты , где будут отображаться результаты теста.
  2. Оценка пространственной частоты
    1. Поместите грызуна на круглую платформу в центре камеры виртуальной реальности, состоящую из четырех компьютерных мониторов, показывающих вертикальные синусоидальные решетки, вращающиеся вокруг камеры со скоростью 12 ° / с (рисунок 1D).
    2. Обратите внимание, что видеокамера, расположенная в верхней части камеры, проецирует поведение грызуна в прямом эфире на монитор компьютера.
    3. Следите за наличием или отсутствием рефлексивных действий головы грызуна, когда решетки движутся по часовой стрелке или против часовой стрелки. Убедитесь, что в программе видны иллюстрированные полосы — они покажут направление движения решетки.
      1. Следите за тем, чтобы голова грызуна двигалась в том же направлении, что и решетки. Подождите, пока не произойдет плавное преследование, а не беспорядочные всплески движения головы, чтобы считать это отслеживанием.
      2. Нажмите «Да » или « Нет » в зависимости от обстоятельств. Обратите внимание, что SF будет начинаться с 0,042 cyc / deg и настраиваться с каждым «да» и «нет», чтобы стать проще или сложнее (рисунок 1E). Нажмите « Сброс», если тест необходимо сбросить из-за случайного или неправильного нажатия «да» и «нет».
    4. Когда грызун тестируется, убедитесь, что звездочка расположена над головой грызуна.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это имеет два эффекта: 1) Он поддерживает правильную пространственную частоту. Например, если звездочка расположена между плечами, пространственная частота будет ниже, и полосы будут легче видеть, что приведет к ложно высокому баллу. 2) Для грызунов с легкими движениями головы звездочка облегчает оценку того, действительно ли голова движется.
    5. Следите за тем, чтобы система сказала «Готово», когда пространственная частота грызуна достигнута. Обратите внимание, что кнопки «Да » и « Нет » больше не будут кликабельными.
    6. Нажмите на вкладку «Результаты », которая отобразит пространственную частоту для левого глаза, правого глаза и комбинированных глаз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда программное обеспечение устанавливается таким образом, что результаты переворачиваются, т.е. правый глаз сообщается как левый глаз, а левый глаз сообщается как правый глаз. Это было обнаружено при оценке грызунов, у которых был только один глаз, пораженный в модели глаукомы.
  3. Оценка контрастной чувствительности
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тестирование контрастной чувствительности может быть выполнено сразу после этапа пространственного измерения частоты или самостоятельно в тот же день или в другой день, если грызун кажется усталым после тестирования пространственной частоты (следуйте шагам 1–2.2, если только тестирование контрастной чувствительности).
    1. Перейдите на вкладку Тестирование , а затем на вкладку Психофизика . В разделе Пороговое значение выберите Контрастность (одиночная), чтобы измерить контрастную чувствительность.
    2. Также используя парадигму лестницы, начинайте решетки с константой SF на пике кривой контрастной чувствительности (CS). Для этого нажмите на вкладку Стимул , а затем на вкладку Решетки . В поле Пространственная частота введите 0,064 для крыс и 0,103 для мышей.
    3. Начните контраст со 100% и ищите те же рефлекторные движения головы, которые наблюдаются во время пространственного частотного тестирования. Обратите внимание, что контраст будет уменьшаться по мере прохождения тестирования, пока грызун больше не перестанет иметь рефлекторные движения головы в ответ на стимул (рисунок 1E).
    4. Следите за тем, чтобы система говорила «Готово», а кнопки « Да » и « Нет » больше не были кликабельными, как только грызун больше не реагирует на визуальный стимул и порог контрастной чувствительности был достигнут. Перейдите на вкладку Результаты , где будет указана контрастная чувствительность для левого, правого глаза и комбинированных глаз.
  4. Выполнение анализа после тестирования
    1. Для исследований диабетической ретинопатии, где оба глаза, как ожидается, будут иметь одинаковый дефицит, используйте комбинированный балл (среднее значение правого и левого глаз) для анализа. Для моделей, которые вызывают дифференциальное повреждение глаз (например, бластную травму или глаукому), храните данные левого и правого глаза отдельно.
    2. Для параметра «Пространственная частота» используйте необработанные оценки (данные из вкладки «Результаты ») для анализа и усредните эти баллы вместе по группам (например, диабетические, контрольные и т. Д.).
    3. Для параметра «Контрастная чувствительность» используйте необработанное значение для расчета контрастной чувствительности по контрасту Майкельсона по сравнению с предыдущим измерением яркости экрана.

2. Y-лабиринт

  1. Подготовка грызунов к тестированию
    1. Приспособите грызунов к комнате за 30 минут до тестирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исследователь может оставаться в комнате с включенным светом, но должен молчать в течение этого времени.
    2. Очистите Y-образный лабиринт безопасным для животных дезинфицирующим раствором и протрите весь дезинфицирующий раствор бумажными полотенцами. Убедитесь, что лабиринт сухой.
  2. Проведение Y-лабиринта
    1. Обозначьте начальное плечо Y-лабиринта как B, а остальные 2 плеча как A и C (рисунок 2A). Поместите одного грызуна в руку, ближайшую к исследователю (рука B), недалеко от центра Y-лабиринта. После того, как грызун был помещен, запустите таймер (подробности о лабиринте и таймере в таблице материалов).
      1. Позвольте каждому грызуну исследовать Y-лабиринт в течение 8 минут. Делайте записи в течение этого времени и отмечайте любые наблюдения. Сядьте в нескольких футах от лабиринта, держа его в поле зрения, и избегайте шума.
      2. Запишите исходное местоположение как A, и каждый раз, когда грызун делает вход в новую руку, записывайте новое местоположение грызуна (рисунок 2B). Определите запись как все четыре конечности грызуна, находящиеся в одной из рук.
      3. Следите за тем, чтобы грызуны прятались и оставались неподвижными в одном рукаве лабиринта. Если грызун остается в одном и том же месте более 60 с и, по-видимому, не проявляет исследовательского поведения, переместите грызуна к центру Y-лабиринта и продолжайте испытание.
    2. После каждого грызуна удалите все каловые массы и очистите лабиринт дезинфицирующим раствором.
      1. Убедитесь, что весь дезинфицирующий раствор протерт бумажными полотенцами, а лабиринт полностью высохнет, прежде чем помещать следующего грызуна в лабиринт.
  3. Рассчитайте спонтанное чередование и исследовательское поведение
    1. Рассчитайте исследовательское поведение как общее количество записей, сделанных в течение 8 минут.
    2. Рассчитайте пространственное познание, измеренное спонтанным чередованием:
      количество успешных чередований/(общее количество записей - 2)
      1. Определите успешное чередование, когда грызун перемещается в три разных места последовательно (пример: ABC, CAB, BCA и т. Д.). Обратите внимание на каждое успешное чередование (рисунок 2B).
      2. Если движения были записаны как ACABCABABCABC, не обращайте внимания на два начальных начальных места при вычислении спонтанного чередования (так, что в знаменателе 11 движений). Подсчитайте количество точных движений (точных движений = 8). Рассчитайте процент точности как: 8/(13 - 2) = 72,7%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

OMR считается успешным, если пространственные пороги частоты и контрастной чувствительности могут быть получены от грызуна. Здесь использование OMR для оценки пространственной частоты проиллюстрировано наивными контрольными крысами Brown-Norway и Long-Evans, как молодыми (3-6 месяцев), так и пожилыми (9-12 месяцев). Коричнево-норвежские крысы обычно показывают более высокую базовую пространственную частоту, чем крысы Лонг-Эванса. Кроме того, влияние старения на пространственную частоту наблюдалось у крыс Лонг-Эванса (рисунок 3А). Данные были проанализированы с использованием односторонней ANOVA с последующими пост-специальными сравнениями Холмса-Сидака, поскольку результаты для молодых и пожилых людей были получены из разных когорт.

Использование OMR для оценки контрастной чувствительности проиллюстрировано в модели STZ диабета I типа, которая получала лечение физическими упражнениями. Крысы Лонг-Эванс были отнесены к одной из четырех групп: контрольная, контрольная + активная, диабетическая и диабетическая + активная. Крысам с диабетом вводили внутривенные инъекции токсина СТЗ, чтобы повредить бета-клетки поджелудочной железы и вызвать гипергликемию. Активные крысы получали 30 минут упражнений на беговой дорожке, 5 дней в неделю. У неактивных крыс была заблокированная беговая дорожка. Значительный дефицит контрастной чувствительности (рисунок 3В) наблюдался у крыс с диабетом. Лечение физическими упражнениями уменьшало эти дефициты (рисунок 3B). Эти результаты демонстрируют, что OMR полезен как для выявления и отслеживания дефицита сетчатки с течением времени, так и для оценки влияния лечения и вмешательств на заболевание сетчатки22. Данные были проанализированы с использованием двухсторонних повторных измерений ANOVA с последующими пост-специальными сравнениями Холмса-Сидака. Обратите внимание, что результаты могут быть представлены в виде данных, нормализованных для контроля (рисунок 3B), или в виде необработанных значений (рисунок 3A; для пространственной частоты: в циклах / градус или c / d; для контрастной чувствительности: произвольные единицы или a.u.). Как правило, для нахождения существенной разницы с ОМР необходимо 6–10 животных, в зависимости от тяжести травмы.

Y-лабиринт считается успешным, если грызун входит не менее чем в 5 рукавов лабиринта в течение 8 минут. Здесь способность Y-лабиринта оценивать когнитивную функцию и исследовательское поведение проиллюстрирована на крысе Гото-Какидзаки, полигенной, не тучной модели диабета II типа, которая развивает умеренную гипергликемию, начиная с возраста 2-3 недель и не требует добавок инсулина. Значительный дефицит пространственного познания, измеряемый спонтанным чередованием (рисунок 4A), и исследовательского поведения, измеряемого количеством записей (рисунок 4B), наблюдался у крыс Гото-Какидзаки по сравнению с контрольной группой Wistar, начиная с 7-недельного возраста. Контрольные крысы, по-видимому, демонстрируют снижение исследовательского поведения с 4 до 8 недель. Эта тенденция также наблюдается в долгосрочных исследованиях (возраст 8+ месяцев). Снижение движения может быть связано с отсутствием новизны при повторном воздействии лабиринта или общим уменьшением движения с возрастом. Контрольные крысы, по-видимому, показывают увеличение пространственного познания с 4 до 8 недель. Эта тенденция не наблюдается в долгосрочных исследованиях, в которых животные бегут ежемесячно, а не еженедельно (на самом деле часто наблюдается снижение со старением), и, таким образом, это увеличение пространственного познания может быть связано с обучающим эффектом бега лабиринта раз в неделю. Данные были проанализированы с использованием двухсторонних повторных измерений ANOVA с последующими пост-специальными сравнениями Холмса-Сидака. Минимум 10 животных, в зависимости от тяжести травмы, обычно необходимы, чтобы найти существенную разницу с Y-лабиринтом.

Этот протокол генерировал данные о зрительных и когнитивных функциях в моделях диабета типа I и типа II. Баллы для отдельных животных были усреднены вместе и использованы для выявления значительных различий между группами лечения на ранних стадиях прогрессирования диабета. Выполнение как сетчатки, так и когнитивных оценок с течением времени в моделях системных заболеваний, таких как диабет, позволяет контролировать временное появление дефицита с течением времени. Например, в модели Гото-Какидзаки было показано, что дефицит функции сетчатки предшествует когнитивному и исследовательскому дефициту поведения23 (рисунок 5).

Figure 1
Рисунок 1: Настройка оборудования OMR. (A) Изображение мышиных, крыс и больших или ослабленных крысиных платформ. (B) Изображение экрана компьютера во время тестирования. (C) Панель кнопок во время тестирования. (D) Схема крысы на платформе в камере. (E) Примеры градиентов, показывающих увеличение пространственной частоты и контрастной чувствительности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Настройка оборудования Y-лабиринта. (A) Изображение Y-лабиринта с обозначенными гербами. (B) Изображение лабораторной тетради с примером записи Y-лабиринта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Использование OMR для отслеживания визуальных функций. (A) Пространственные пороговые значения частоты для молодых (n = 11) и возрастных (n = 15) коричнево-норвежских (BN) и молодых (n = 20) и возрастных (n = 13) крыс Long-Evans (LE). На этом рисунке представлены данные Brown-Norway от Feola et al., 201921. (B) Использование OMR для отслеживания снижения функции сетчатки с течением времени и защитных эффектов физических упражнений в модели STZ крыс диабета типа I. Пороги контрастной чувствительности для неактивных диабетических крыс по сравнению с активными диабетическими крысами и контрольными крысами. Темно-серые звездочки представляют различия между обеими контрольными группами и обеими группами диабетиков. Оранжевые звездочки представляют различия между неактивными диабетическими крысами и активными диабетическими крысами. На этом рисунке представлены данные по подмножеству крыс из Allen et al., 201822. Среднее ± SEM. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Использование Y-лабиринта для отслеживания когнитивных функций и исследовательского поведения с течением времени в модели Гото-Какидзаки диабета II типа по сравнению с контрольной группой Wistar. (A) Когнитивная функция (спонтанное чередование) у крыс Гото-Какизаки (диабетик) и Вистар (контроль) в возрасте от 4 до 8 недель. (Б) Исследовательское поведение (количество записей) в возрасте от 4 до 8 недель. Среднее ± SEM. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Звездочки представляют различия между крысами Гото-Какидзаки и Вистар в каждой точке времени. Только одна когорта крыс была запущена от 4 недель до 8 недель (GK: n = 7; Wistar: n = 10). Все остальные когорты проводились от 5 недель до 8 недель (ГК: n = 22; Wistar: n = 23) для общего числа n 29 (GK) и 33 (Wistar) на неделях с 5 по 8. Эта цифра была изменена из Allen et al., 201923. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Хронология функциональных изменений в модели Гото-Какидзаки диабета II типа. После появления гипергликемии первые изменения, наблюдаемые у крысы Гото-Какизаки, были в функции сетчатки, измеренной электроретинограммой (ЭРГ), появляющейся в возрасте 4 недель. Когнитивные и исследовательские изменения поведения появились после 6-недельного возраста. Эта цифра была изменена из Allen et al., 201923. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

OMR и Y-лабиринт позволяют проводить неинвазивную оценку зрительной функции и дефицита когнитивных функций у грызунов с течением времени. В этом протоколе было продемонстрировано, что OMR и Y-лабиринт отслеживают визуальный и когнитивный дефицит у моделей диабета грызунов.

Критические шаги в протоколе

The OMR

Некоторые важные моменты, которые следует учитывать при выполнении OMR для оценки зрительной функции, - это используемые параметры тестирования, экспериментальный дизайн и сроки тестирования, а также опыт исследователя, выполняющего измерения. Одним из наиболее важных шагов в протоколе является проверка правильности установки параметров. Кроме того, в рамках настройки камера OMR должна быть очищена дезинфицирующим раствором или другим одобренным дезинфицирующим средством до и после каждого грызуна. Также важно, чтобы исследователь, выполняющий меры, был обучен и имел опыт выполнения мер. Наилучшие результаты видны, когда грызуны спокойны и акклиматизируются в комнате, оставляя их в своих клетках в течение 30 минут перед началом эксперимента. Также важно определить базовую пространственную частоту и контрастную чувствительность всякий раз, когда начинается работа с новым штаммом, и отметить, что не все штаммы будут демонстрировать одинаковые базовые уровни. Коричнево-норвежские крысы имеют большую базовую пространственную частоту, чем крысы Лонг-Эванса. Между тем, некоторые штаммы крыс-альбиносов, по-видимому, скомпрометировали пространственную частоту24, в то время как другие штаммы крыс-альбиносов вообще не проявляют следящего поведения. Многие факторы могут способствовать ограниченной реакции животных-альбиносов на OMR: нарушенная бинокулярность из-за дифференциальной декуссации волокон зрительного нерва, отсутствие меланина в задней части глаза и большая доля двойных опсиновых колбочек. Несмотря на это, крысы-альбиносы могут не быть подходящими субъектами для тестирования OMR, поскольку их производительность может быть слишком близка к пределу обнаружения.

Y-лабиринт

Критический компонент выполнения Y-лабиринта включает минимизацию помех в течение периода записи. Первоначальное размещение грызуна в лабиринте следует делать только после того, как он позволит грызуну акклиматизироваться в помещении в течение 30 минут. Это позволяет грызуну приспособиться к новой среде и предотвращает влияние любых мешающих факторов на нормальное поведение грызуна. Минимизация нарушений во время каждого испытания очень важна. Это включает в себя избегание громких звуков и обеспечение того, чтобы исследователь находился вне поля зрения грызуна. Эти отвлекающие факторы могут вызвать стресс у грызуна. Также важно отметить, что стены помещения должны оставаться максимально голыми с нейтральным цветом. Любые яркие цвета на стенах или плакатах могут отвлечь грызунов и повлиять на их исследовательскую модель поведения.

Ограничения метода и модификации и устранение неполадок метода

The OMR

Потенциальное ограничение OMR заключается в том, что на него может влиять предвзятость экспериментатора, и разные экспериментаторы могут иметь немного разные результаты, поскольку оценка OMR субъективна. Может быть легко пропустить слишком тонкое движение головы или классифицировать исследовательское поведение как движение головы. Поскольку предвзятость может повлиять на результаты OMR, лучше всего, если экспериментатор будет замаскирован для группы лечения и дизайна исследования, когда это возможно. Разработка автоматического OMR или сравнение результатов двух тестировщиков также может помочь уменьшить предвзятость экспериментатора.

Одна из распространенных проблем, которая может возникнуть во время тестирования OMR, заключается в том, что грызун неоднократно спрыгивает с платформы, что затрудняет получение визуального порога. Если это произойдет, обратите на это внимание и осторожно поместите крысу обратно на платформу; также может потребоваться повторно измерить крысу на следующий день. Кроме того, крысы, которые никогда не измерялись ранее, могут участвовать в исследовательском поведении при помещении в OMR. Если это проблема, наличие дополнительной базовой меры через неделю или около того после первого измерения может помочь повысить точность. Тесты с чрезмерным количеством такого поведения должны быть отброшены.

Другие факторы, такие как возраст или обонятельные сигналы, также могут способствовать нежелательной активности. Поэтому важно проектировать эксперименты в соответствии со сроками развития зрительной системы у крыс и тщательно очищать платформу и камеру до и после тестирования каждого грызуна. Следует также учитывать время суток, когда проводятся измерения OMR, так как предыдущие исследования показали, что в пространственной частоте есть циркадные ритмы25. Запуск крыс до полудня, по-видимому, лучше всего подходит для их концентрации (лаборатория Рэйчел Аллен — личные наблюдения). Если крысы становятся слишком отвлеченными, это может помочь осторожно постучать по внешней стороне OMR.

Скорость, с которой выполняется тестирование, также может повлиять на результаты. Измерения могут стать менее точными через 30 минут или около того, если грызуны теряют интерес к стимулу. Поэтому более точные результаты могут быть получены при проведении измерений примерно за ≤20 мин. Продолжительность одного испытания (для SF или CS) составляет 5–10 минут для эксперта и 30 минут для новичка. Если грызун демонстрирует мало движения, проводит большую часть своего времени за грумингом или иным образом не смотрит в сторону брусков, он может быть утомлен. Грызун может быть запущен снова в другой день. Кроме того, тестирование SF и CS может быть выполнено в разные дни, особенно для новых тестировщиков, которые могут быть медленнее. Частота, с которой проводится тест, также может повлиять на результаты — выполнение его еженедельно или раз в две недели помогает животным оставаться акклиматизированными к тесту, но выполнение его каждый день или через день может вызвать гиперпроницаемость26. Мы не проводим более одной пробной версии в день, хотя мы часто проводим как SF, так и CS в один и тот же день или даже в одном и том же заседании. Кумулятивное суточное время для бега когорты крыс (n = 10) составляет 2 ч для эксперта.

OMR измеряет каждый глаз независимо друг от друга, что приводит к отдельным визуальным оценкам для каждого глаза. В моделях глаукомы Моррисона и микрогранул и в модели раздавливания зрительного нерва наша лаборатория не наблюдала какого-либо воздействия поврежденного глаза на неповрежденный глаз27. В модели взрыва, когда взрыв направлен на один глаз, контралатеральный глаз действительно показал повреждение, но это также может быть связано с частичным эффектом взрыва28. У контрольных крыс не должно быть никакой разницы в результатах между направлениями по часовой стрелке или против часовой стрелки, но некоторые грызуны могут иметь смещение; таким образом, было бы лучше чередовать направления29, если система OMR не чередуется автоматически.

В зависимости от модели заболевания, различия в зрительной функции в группе лечения могут варьироваться в зависимости от используемых параметров. Например, при тестировании контрастной чувствительности, если пространственная частота установлена на уровень, превышающий нормальный пространственный порог частоты и трудно разрешаемый, различия в контрастной чувствительности между группами будут небольшими. Однако, если пространственная частота установлена на уровне, который обычно легко виден крысам, различия в контрастной чувствительности между группами будут больше30. Поэтому важно учитывать дизайн исследования и нормальные пространственные пороги частоты грызунов при установке параметров для выполнения ОМР.

Y-лабиринт

Если животное напугано, оно может замерзнуть в одном углу лабиринта. Кроме того, если громкий шум происходит за пределами комнаты, животное может испугаться и не двигаться в лабиринте. Чтобы учесть эти проблемы, исследователи могут сначала акклиматизировать крыс в комнате, переместить замороженное животное в точку выбора, снова запустить животное в другой день или запустить животных в красный свет, что, как считается, делает их менее нервными, поскольку они обычно активны в темноте (Лаборатория Рэйчел Аллен — личное общение). Также рекомендуется запускать Y-лабиринт в одно и то же время каждый день, чтобы учесть изменения уровня активности в течение дня из-за циркадных ритмов. Обычно мы запускаем крыс до полудня (Лаборатория Рэйчел Аллен — личные наблюдения). Продолжительность одного испытания составляет 8 мин (10 мин, с очисткой). Мы никогда не проводим более одной пробной версии в день. Если требуется дополнительное испытание, испытание проводится в другой день. Кумулятивное суточное время бега когорты крыс (n = 10) составляет 2–3 ч. Возрастное снижение пространственного чередования наблюдалось у крыс в возрасте 9–12 месяцев и в исследовательском поведении в возрасте 12 месяцев 28.

Хотя как исследовательское поведение, так и пространственное познание снижаются у диабетических грызунов, они, по-видимому, не тесно коррелируют, и, таким образом, мы не независимо оцениваем двигательную активность до тестирования Y-лабиринта.

Значение метода по отношению к существующим/альтернативным методам

The OMR

Другие методы тестирования зрительных функций, такие как оптокинетическое отслеживание, основаны на фиксации головы животного на месте и отслеживании движений глаз. Тестирование безудержного оптомоторного отклика (OMR) позволяет проводить продольное, неинвазивное и надежное измерение зрительной функции у грызунов. В этом протоколе было описано, как OMR может быть использован для количественной оценки как пространственной частоты, так и порогов контрастной чувствительности для каждого глаза. Этот метод может быть очень полезен для выявления ранней стадии дисфункции нейронов при таких заболеваниях, как диабет. Другие тесты, такие как визуальная водная задача, также могут быть использованы для измерения пространственной частоты31, но поскольку это включает в себя обучение грызунов плавать к градиенту в модифицированном Y-лабиринте, задача занимает много времени и включает в себя много тренировок. Кроме того, OMR измеряет значения для каждого глаза независимо друг от друга, что полезно в моделях, где травма направлена на один глаз, а другой глаз служит контралатеральным контролем (например, многие модели глаукомы). Кроме того, OMR является чувствительной оценкой, способной обнаружить изменения уже через 3-4 недели после диабета, что раньше, чем другие визуальные оценки. Электрофизиологические анализы являются альтернативой поведенческим визуальным тестам. Электроретинография (ERG) более доступна, чем OMR, и может определять дефицит точных типов клеток с использованием различных компонентов ERG wave32 (a-волны представляют функцию фоторецепторной клетки, b-волны представляют функцию биполярных клеток). Между тем, OMR можно использовать для определения дефицита зрительной функции, не выявляя точную точку пробоя вдоль пути. Тем не менее, OMR является более чувствительным показателем ДР, чем ERG, причем дефицит OMR обычно наблюдается между 2-4 неделями после гипергликемии, а дефицит ERG обычно наблюдается через 4-8 недель после гипергликемии у грызунов. Тяжелая диабетическая катаракта может повлиять на OMR. Однако диабетическая катаракта у грызунов появляется и/или ухудшается под наркозом, и, таким образом, такие тесты, как ЭРГ и оптическая когерентная томография, требующие анестезии, поражаются гораздо чаще, чем ОМР, который проводится у бодрствующих животных.

Y-лабиринт

Y-лабиринт опирается на пространственное познание, как водный лабиринт Морриса, но не использует сильный отрицательный стимул (то есть воду), чтобы мотивировать животное на выполнение задачи. Таким образом, Y-лабиринт менее стрессовый для животных, а также его легче выполнять. Тем не менее, возможно, что Y-лабиринт может быть не таким чувствительным, как водный лабиринт Морриса или лабиринт Барнса. В отличие от водного лабиринта Морриса, Y-лабиринт является автоматическим поведением и не требует обучения. Таким образом, временная нагрузка, затрачиваемая на выполнение Y-лабиринта, значительно ниже.

Выводы и будущие применения или направления метода

The OMR

OMR полезен для измерения зрительной функции у грызунов путем отслеживания движений головы. Это эффективный метод, но есть обновления и дополнения, которые постоянно вносятся для улучшения протокола. Некоторые новые методы используют грызуна, останавливающего голову в качестве отрицательного индикатора OMR в сочетании с отслеживанием головы в качестве положительного показателя33. Это позволяет быстрее и точнее измерять зрительную функцию34. Еще один способ, которым этот процесс был изменен, заключается в разработке системы, которая будет автоматически отслеживать голову без искусственных маркеров, чтобы уменьшить несоответствия, которые могут возникнуть в результате человеческих тестеров35. По состоянию на 2016 год автоматизированная или количественная система OMR под названием qOMR была хорошо разработана и коммерчески доступна. В вышеуказанном протоколе OMR удалось обнаружить дефицит пространственной частоты и контрастной чувствительности у крыс с диабетом, а также защиту от дефицита при лечении (физическом упражнении).

Y-лабиринт

Y-лабиринт раскрывает информацию об исследовательском поведении и пространственном познании и использовался здесь для выявления поведенческого дефицита у диабетических грызунов в 7 недель. Существуют и другие тесты для наблюдения за когнитивной функцией (например, водный лабиринт Морриса, лабиринт Барнса, распознавание новых объектов), и возможно, что эти тесты могут быть в состоянии выявить снижение когнитивных функций раньше или предоставить информацию о различных аспектах познания. Будущие направления для Y-лабиринта включают размещение нового объекта или пищевого стимула в одном из рукавов и наблюдение за исследовательским паттерном грызуна36. Вариация этого включает в себя блокирование одного из рукавов Y-лабиринта, позволяя грызуну исследовать две оставшиеся руки, а затем вновь открыть доступ к третьей руке и оценить, сколько времени грызун проводит в третьей новой руке. Еще одним ценным улучшением, которое может быть сделано в отношении Y-лабиринта, является разработка автоматического отслеживания грызунов с целью записи их движений. Это устранило бы необходимость ручной регистрации движений грызунов и сделало бы расчеты спонтанных чередований более точными и эффективными.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана наградами Департамента по делам ветеранов rehab R&D Service Career Development Awards (CDA-1, RX002111; КДА-2; RX002928) для RSA и (CDA-2, RX002342) для AJF и Национальных институтов здравоохранения (NIH-NICHD F31 HD097918 для DACT и NIH-NIEHS T32 ES012870 для DACT) и NEI Core Grant P30EY006360.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
OptoMotry HD CerebralMechanics Inc. OMR apparatus & software
Timer Thomas Scientific 810029AR
Y-Maze apparatus San Diego Instruments 7001-043 Available specifically for rats

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. IDF. International Diabetes Federation Diabetes Atlas, 9th edn. , Available from: https://diabetesatlas.org/upload/resources/material/20200302_133351_IDFATLAfinal-web.pdf (2019).
  2. Wang, W., Lo, A. C. Y. Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), (2018).
  3. Akpek, E. K., Smith, R. A. Overview of age-related ocular conditions. The American Journal of Managed Care. 19 (5), Suppl 67-75 (2013).
  4. Urano, F. Wolfram syndrome: diagnosis, management, and treatment. Current Diabetes Reports. 16 (1), 6 (2016).
  5. Adeva-Andany, M. M., Funcasta-Calderón, R., Fernández-Fernández, C., Ameneiros-Rodríguez, E., Domínguez-Montero, A. Subclinical vascular disease in patients with diabetes is associated with insulin resistance. Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Reviews. 13 (3), 2198-2206 (2019).
  6. Chin, J. A., Sumpio, B. E. Diabetes mellitus and peripheral vascular disease: diagnosis and management. Clinics in Podiatric Medicine and Surgery. 31 (1), 11-26 (2014).
  7. Barber, A. J., Gardner, T. W., Abcouwer, S. F. The significance of vascular and neural apoptosis to the pathology of diabetic retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (2), 1156-1163 (2011).
  8. Pardue, M. T., Allen, R. S. Neuroprotective strategies for retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. 65, 50-76 (2018).
  9. Aung, M. H., Kim, M. K., Olson, D. E., Thule, P. M., Pardue, M. T. Early visual deficits in streptozotocin-induced diabetic long evans rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (2), 1370-1377 (2013).
  10. Antonetti, D. A., et al. Diabetic retinopathy: seeing beyond glucose-induced microvascular disease. Diabetes. 55 (9), 2401-2411 (2006).
  11. Logroscino, G., Kang, J. H., Grodstein, F. Prospective study of type 2 diabetes and cognitive decline in women aged 70-81 years. BMJ. 328 (7439), 548 (2004).
  12. London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nature Reviews Neurology. 9 (1), 44-53 (2013).
  13. Archibald, N. K., Clarke, M. P., Mosimann, U. P., Burn, D. J. The retina in Parkinson's disease. Brain. 132 (5), 1128-1145 (2009).
  14. Sakai, R. E., Feller, D. J., Galetta, K. M., Galetta, S. L., Balcer, L. J. Vision in multiple sclerosis: the story, structure-function correlations, and models for neuroprotection. Journal of Neuroophthalmology. 31 (4), 362-373 (2011).
  15. Wong, T. Y., et al. Retinal microvascular abnormalities and incident stroke: the Atherosclerosis Risk in Communities Study. The Lancet. 358 (9288), 1134-1140 (2001).
  16. Marquié, M., et al. Association between retinal thickness and β-amyloid brain accumulation in individuals with subjective cognitive decline: Fundació ACE Healthy Brain Initiative. Alzheimer's Research & Therapy. 12 (1), 37 (2020).
  17. Thomas, B. B., Seiler, M. J., Sadda, S. R., Coffey, P. J., Aramant, R. B. Optokinetic test to evaluate visual acuity of each eye independently. Journal of Neuroscience Methods. 138 (1-2), 7-13 (2004).
  18. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Vision Science. 45 (12), 4611-4616 (2004).
  19. Maurice, T., et al. Behavioral evidence for a modulating role of σ ligands in memory processes. I. Attenuation of dizocilpine (MK-801)-induced amnesia. Brain Research. 647 (1), 44-56 (1994).
  20. Douglas, R. M., et al. Independent visual threshold measurements in the two eyes of freely moving rats and mice using a virtual-reality optokinetic system. Visual Neuroscience. 22 (5), 677-684 (2005).
  21. Feola, A. J., et al. Menopause exacerbates visual dysfunction in experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 186, 107706 (2019).
  22. Allen, R. S., et al. TrkB signalling pathway mediates the protective effects of exercise in the diabetic rat retina. European Journal of Neuroscience. 47 (10), 1254-1265 (2018).
  23. Allen, R. S., et al. Retinal deficits precede cognitive and motor deficits in a rat model of type II diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (1), 123-133 (2019).
  24. Prusky, G. T., Harker, K. T., Douglas, R. M., Whishaw, I. Q. Variation in visual acuity within pigmented, and between pigmented and albino rat strains. Behavioural Brain Research. 136 (2), 339-348 (2002).
  25. Hwang, C. K., et al. Circadian rhythm of contrast sensitivity is regulated by a dopamine-neuronal PAS-domain protein 2-adenylyl cyclase 1 signaling pathway in retinal ganglion cells. Journal of Neuroscience. 33 (38), 14989-14997 (2013).
  26. Mui, A. M., et al. Daily visual stimulation in the critical period enhances multiple aspects of vision through BDNF-mediated pathways in the mouse retina. PLoS One. 13 (2), 0192435 (2018).
  27. Feola, A. J., et al. Menopause exacerbates visual dysfunction in experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 186, 107706 (2019).
  28. Allen, R. S., et al. Long-term functional and structural consequences of primary blast overpressure to the eye. Journal of Neurotrauma. 35 (17), 2104-2116 (2018).
  29. Maaswinkel, H., Li, L. Spatio-temporal frequency characteristics of the optomotor response in zebrafish. Vision Research. 43 (1), 21-30 (2003).
  30. Benkner, B., Mutter, M., Ecke, G., Münch, T. A. Characterizing visual performance in mice: an objective and automated system based on the optokinetic reflex. Behavioral Neuroscience. 127 (5), 788-796 (2013).
  31. Lehmann, K., Schmidt, K. F., Löwel, S. Vision and visual plasticity in ageing mice. Restorative Neurology and Neuroscience. 30, 161-178 (2012).
  32. Leinonen, H., Tanila, H. Vision in laboratory rodents-tools to measure it and implications for behavioral research. Behavioral Brain Research. 352, 172-182 (2018).
  33. Spielmann, M., Schröger, E., Kotz, S. A., Pechmann, T., Bendixen, A. Using a staircase procedure for the objective measurement of auditory stream integration and segregation thresholds. Frontiers in Psychology. 4, 534 (2013).
  34. Shi, C., et al. Optimization of optomotor response-based visual function assessment in mice. Scientific Reports. 8 (1), 9708 (2018).
  35. You, M., Yamane, T., Tomita, H., Sugano, E., Akashi, T. A novel rat head gaze determination system based on optomotor responses. PLoS One. 12 (4), 0176633 (2017).
  36. Whyte, A. J., et al. Reward-related expectations trigger dendritic spine plasticity in the mouse ventrolateral orbitofrontal cortex. The Journal of Neuroscience. 39 (23), 4595-4605 (2019).

Tags

Поведение проблема 164 диабетическая ретинопатия сетчатка Y-лабиринт оптомоторный ответ исследовательское поведение пространственная частота контрастная чувствительность пространственная память спонтанное чередование

Erratum

Formal Correction: Erratum: Behavioral Assessment of Visual Function via Optomotor Response and Cognitive Function via Y-Maze in Diabetic Rats
Posted by JoVE Editors on 01/05/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Behavioral Assessment of Visual Function via Optomotor Response and Cognitive Function via Y-Maze in Diabetic Rats. The author list was updated.

The author list was updated from:

Kaavya Gudapati*1,2, Anayesha Singh*1,3, Danielle Clarkson-Townsend1,4, Andrew J. Feola1,2, Rachael S. Allen1,2
1Center for Visual and Neurocognitive Rehabilitation, Atlanta VA Medical Center,
2Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology,
3Department of Neuroscience, Emory University,
4Gangarosa Department of Environmental Health, Emory University
* These authors contributed equally

to:

Kaavya Gudapati*1,2, Anayesha Singh*1,3, Danielle Clarkson-Townsend1,4, Stephen Q. Phillips1, Amber Douglass1, Andrew J. Feola1,2, Rachael S. Allen1,2
1Center for Visual and Neurocognitive Rehabilitation, Atlanta VA Medical Center,
2Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology,
3Department of Neuroscience, Emory University,
4Gangarosa Department of Environmental Health, Emory University
* These authors contributed equally

Поведенческая оценка зрительной функции с помощью оптомоторного ответа и когнитивной функции через Y-лабиринт у крыс с диабетом
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gudapati, K., Singh, A.,… More

Gudapati, K., Singh, A., Clarkson-Townsend, D., Phillips, S. Q., Douglass, A., Feola, A. J., Allen, R. S. Behavioral Assessment of Visual Function via Optomotor Response and Cognitive Function via Y-Maze in Diabetic Rats. J. Vis. Exp. (164), e61806, doi:10.3791/61806 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter