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Behavior

Valutazione comportamentale della funzione visiva tramite risposta optomotoria e funzione cognitiva tramite Y-Maze nei ratti diabetici

Published: October 23, 2020 doi: 10.3791/61806
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,4, 1, 1, 1,2, 1,2
1Center for Visual and Neurocognitive Rehabilitation, Atlanta VA Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Department of Neuroscience, Emory University, 4Gangarosa Department of Environmental Health, Emory University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

La degenerazione neurale sia negli occhi che nel cervello a causa del diabete può essere osservata attraverso test comportamentali effettuati sui roditori. Il labirinto Y, una misura della cognizione spaziale, e la risposta optomotoria, una misura della funzione visiva, forniscono entrambi informazioni su potenziali diagnosi e trattamenti.

Abstract

La risposta optomotoria e il labirinto a Y sono test comportamentali utili per valutare rispettivamente la funzione visiva e cognitiva. La risposta optomotoria è uno strumento prezioso per monitorare i cambiamenti nelle soglie di frequenza spaziale (SF) e sensibilità al contrasto (CS) nel tempo in una serie di modelli di malattia retinica, tra cui la retinopatia diabetica. Allo stesso modo, il labirinto Y può essere utilizzato per monitorare la cognizione spaziale (misurata dall'alternanza spontanea) e il comportamento esplorativo (misurato da un certo numero di voci) in un certo numero di modelli di malattia che colpiscono il sistema nervoso centrale. I vantaggi della risposta optomotoria e del labirinto a Y includono la sensibilità, la velocità dei test, l'uso di risposte innate (non è necessario l'allenamento) e la capacità di essere eseguita su animali svegli (non anestetizzati). Qui, i protocolli sono descritti sia per la risposta optomotoria che per il labirinto a Y ed esempi del loro uso mostrati in modelli di diabete di tipo I e di tipo II. I metodi includono la preparazione di roditori e attrezzature, le prestazioni della risposta optomotoria e del labirinto a Y e l'analisi dei dati post-test.

Introduction

Oltre 463 milioni di persone vivono con il diabete, rendendolo una delle più grandi epidemie di malattie globali1. Una delle gravi complicazioni che derivano dal diabete è la retinopatia diabetica (DR), una delle principali cause di cecità per gli adulti americani in età lavorativa2. Nei prossimi 30 anni, si prevede che la percentuale della popolazione a rischio di DR raddoppierà, quindi è fondamentale trovare nuovi modi di diagnosticare la DR nelle sue fasi iniziali per prevenire e mitigare lo sviluppo di DR3. La DR è stata convenzionalmente ritenuta una malattia vascolare4,5,6. Tuttavia, ora con evidenza di disfunzione neuronale e apoptosi nella retina che precede la patologia vascolare, la DR è definita per avere componenti neuronali e vascolari4,5,6,7,8,9. Un modo per diagnosticare la DR sarebbe quello di esaminare le anomalie neurali nella retina, un tessuto che può essere più vulnerabile allo stress ossidativo e allo sforzo metabolico da diabete rispetto ad altri tessuti neurali10.

I declini della funzione cognitiva e motoria si verificano anche con il diabete e sono spesso correlati con i cambiamenti della retina. Gli individui più anziani con diabete di tipo II ritraggono prestazioni cognitive di base peggiori e mostrano un declino cognitivo più esacerbato rispetto ai partecipanti al controllo11. Inoltre, la retina è stata stabilita come un'estensione del sistema nervoso centrale e le patologie possono manifestarsi nella retina12. Clinicamente, la relazione tra retina e cervello è stata studiata nel contesto dell'Alzheimer e di altre malattie, ma non è comunemente esplorata con il diabete12,13,14,15,16. I cambiamenti nel cervello e nella retina durante la progressione del diabete possono essere esplorati utilizzando modelli animali, tra cui il ratto STZ (un modello di diabete di tipo I in cui la tossina, streptozotocina o STZ, viene utilizzata per danneggiare le cellule beta pancreatiche) e il ratto Goto-Kakizaki (un modello poligenico di diabete di tipo II in cui gli animali sviluppano iperglicemia spontaneamente a circa 3 settimane di età). In questo protocollo, viene fornita una descrizione per il labirinto Y e la risposta optomotoria per valutare i cambiamenti cognitivi e visivi nei roditori diabetici, rispettivamente. La risposta optomotoria (OMR) valuta la frequenza spaziale (simile all'acuità visiva) e la sensibilità al contrasto monitorando i movimenti caratteristici di tracciamento riflessivo della testa per misurare le soglie visive per ciascun occhio17. La frequenza spaziale si riferisce allo spessore o alla finezza delle barre e la sensibilità al contrasto si riferisce alla quantità di contrasto tra le barre e lo sfondo (Figura 1E). Nel frattempo, il labirinto a Y testa la memoria spaziale a breve termine e la funzione esplorativa, osservata attraverso alternanze spontanee e ingressi attraverso i bracci del labirinto.

Entrambi i test possono essere eseguiti in animali svegli e non anestetizzati e hanno il vantaggio di capitalizzare sulle risposte innate degli animali, il che significa che non richiedono addestramento. Entrambi sono relativamente sensibili, in quanto possono essere utilizzati per rilevare i deficit nelle prime fasi della progressione del diabete nei roditori e affidabili, in quanto producono risultati correlati ad altri test visivi, retinici o comportamentali. Inoltre, l'utilizzo dell'OMR e del labirinto Y in combinazione con test come l'elettroretinogramma e le scansioni di tomografia a coerenza ottica può fornire informazioni su quando i cambiamenti retinici, strutturali e cognitivi si sviluppano l'uno rispetto all'altro nei modelli di malattia. Queste indagini potrebbero essere utili per identificare le degenerazioni neurali che si verificano a causa del diabete. In definitiva, questo potrebbe portare a nuovi metodi diagnostici che identificano efficacemente la DR nelle prime fasi della progressione.

I sistemi OMR e Y-maze utilizzati per sviluppare questo protocollo sono descritti nella Tabella dei materiali. Precedenti ricerche sull'OMR, di Prusky et al.18, e sul labirinto Y, di Maurice et al.19, sono state utilizzate come punto di partenza per sviluppare questo protocollo.

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Protocol

Tutte le procedure sono state approvate dall'Atlanta Veterans Affairs Institutional Animal Care and Use Committee e conformi alla guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso di animali da laboratorio (NIH Publications, 8a edizione, aggiornata nel 2011).

1. La risposta optomotoria (OMR)

  1. Impostare l'apparato OMR (dettagli su apparecchi e software nella Tabella dei materiali)
    1. Scegli la piattaforma di dimensioni appropriate per il roditore: topo, ratto o ratto grande/alterato (Figura 1A).
    2. Aprire il software OMR, che dovrebbe aprirsi in una finestra con diverse schede di opzioni e un feed video in diretta all'interno dell'OMR / tamburo virtuale (Figura 1B). Ingrandire o rimpicciolire con la videocamera secondo necessità in modo che la piattaforma e l'ambiente circostante siano visibili.
    3. Notare le icone lungo il lato sinistro dell'immagine dal vivo (Figura 1C). Fai clic sull'icona dell'asterisco e sull'icona delle strisce rotanti in modo che sia l'asterisco verde che le strisce rotanti verdi scompaiano dal feed live.
    4. Fare clic sull'icona della bussola in modo che vengano visualizzati un cerchio verde e due linee perpendicolari. Allunga il cerchio verde in modo che si allinei perfettamente con il cerchio nero sulla piattaforma, il che garantirà che l'OMR sia perfettamente allineato.
    5. Fare clic sull'icona della bussola perché non è necessario vedere il cerchio durante il test. Fai clic sull'icona dell'asterisco verde e sull'icona delle strisce rotanti verdi per farle riapparire. Si noti che le strisce verdi ruotano nella stessa direzione delle strisce nel tamburo, consentendo al ricercatore di conoscere la direzione delle strisce.
    6. Fare clic sulla scheda Test . In Test, fai clic sulla scheda Psicofisica . In Soglia selezionare Frequenza per misurare la frequenza spaziale.
      NOTA: il software OMR utilizza un paradigma di scala per calcolare automaticamente la frequenza spaziale (SF). Il contrasto sarà mantenuto al 100%.
    7. In Test, fare clic sulla scheda Predefiniti . Selezionare le impostazioni predefinite per Mouse18 o Rat20.
    8. In Test, fare clic sulla scheda Blanking . Seleziona la casella Blank on Tracking , che metterà in pausa le strisce / spegnerà gli schermi del computer nel tamburo ogni volta che si fa clic con il pulsante destro del mouse.
    9. Fare clic sulla scheda Risultati , che è dove verranno visualizzati i risultati del test.
  2. Valutare la frequenza spaziale
    1. Posizionare il roditore sulla piattaforma circolare al centro della camera di realtà virtuale composta da quattro monitor di computer che mostrano griglie a onda sinusoidale verticale che circondano la camera ad una velocità di 12 ° / s (Figura 1D).
    2. Si noti che la videocamera posizionata nella parte superiore della camera sta proiettando il comportamento del roditore dal vivo sul monitor del computer.
    3. Cerca la presenza o l'assenza di azioni riflessive da parte della testa del roditore mentre le grate si muovono in senso orario o antiorario. Assicurati che le barre illustrate siano visibili nel programma, che mostreranno la direzione del movimento della griglia.
      1. Fai attenzione che la testa del roditore si muova nella stessa direzione delle grate. Aspetta che ci sia un inseguimento regolare, non esplosioni irregolari di movimento della testa, per contarlo come tracciamento.
      2. Fare clic su Sì o No a seconda dei casi. Si noti che SF inizierà con 0,042 cyc / deg e si regolerà con ogni sì e no per diventare più facile o più difficile (Figura 1E). Fare clic su Ripristina se il test deve essere ripristinato a causa di un clic accidentale o errato di sì e no.
    4. Mentre il roditore viene testato, assicurati di mantenere l'asterisco posizionato sopra la testa del roditore.
      NOTA: Questo ha due effetti: 1) Mantiene la frequenza spaziale corretta. Se l'asterisco è posizionato tra le spalle, ad esempio, la frequenza spaziale sarà più bassa e le barre saranno più facili da vedere, risultando in un punteggio falsamente alto. 2) Per i roditori con lievi movimenti della testa, l'asterisco rende più facile valutare se la testa si sta effettivamente muovendo.
    5. Fai attenzione che il sistema dica "Fatto" quando viene raggiunta la frequenza spaziale del roditore. Si noti che i pulsanti Sì e No non saranno più cliccabili.
    6. Fare clic sulla scheda Risultati , che visualizzerà la frequenza spaziale per l'occhio sinistro, l'occhio destro e gli occhi combinati.
      NOTA: a volte il software è impostato in modo tale che i risultati vengano capovolti, ovvero l'occhio destro viene segnalato come occhio sinistro e l'occhio sinistro viene segnalato come occhio destro. Questo è stato scoperto durante la valutazione dei roditori che avevano un solo occhio lesionato in un modello di glaucoma.
  3. Valutare la sensibilità al contrasto
    NOTA: il test di sensibilità al contrasto può essere eseguito immediatamente dopo la fase di misurazione della frequenza spaziale o da solo nello stesso giorno o in un giorno diverso se il roditore appare affaticato dopo il test della frequenza spaziale (seguire i passaggi 1-2.2 se si verifica solo la sensibilità al contrasto).
    1. Fare clic sulla scheda Test e quindi sulla scheda Psicofisica . In Soglia selezionare Contrasto (singolo) per misurare la sensibilità al contrasto.
    2. Utilizzando anche un paradigma a scala, avviare grigliate con costante SF al culmine della curva sensibilità di contrasto (CS). Per fare ciò, fare clic sulla scheda Stimolo e quindi sulla scheda Grate . Nella casella Frequenza spaziale digitare 0,064 per i ratti e 0,103 per i topi.
    3. Inizia il contrasto al 100% e cerca gli stessi movimenti riflessivi della testa visti durante i test di frequenza spaziale. Si noti che il contrasto diminuirà man mano che il test progredisce fino a quando il roditore non avrà più movimenti riflessi della testa in risposta allo stimolo (Figura 1E).
    4. Fai attenzione che il sistema dica "Fatto" e che i pulsanti Sì e No non siano più cliccabili una volta che il roditore non risponde più allo stimolo visivo e la soglia di sensibilità al contrasto è stata raggiunta. Fare clic sulla scheda Risultati , in cui verrà elencata la sensibilità al contrasto per l'occhio sinistro, l'occhio destro e gli occhi combinati.
  4. Eseguire analisi post-test
    1. Per gli studi sulla retinopatia diabetica, in cui ci si aspetta che entrambi gli occhi abbiano deficit simili, utilizzare il punteggio combinato (media degli occhi destro e sinistro) per l'analisi. Per i modelli che causano danni differenziali agli occhi (ad esempio, lesioni da esplosione o glaucoma), tenere separati i dati dell'occhio sinistro e destro.
    2. Per Frequenza spaziale, utilizzare i punteggi grezzi (i dati della scheda Risultati ) per l'analisi e calcolare la media di questi punteggi insieme per gruppo (ad esempio, diabetico, controllo, ecc.).
    3. Per Sensibilità di contrasto, utilizzare il valore grezzo per calcolare la sensibilità di contrasto riportata dal contrasto di Michelson da una precedente misurazione della luminanza dello schermo.

2. Il labirinto a Y

  1. Preparare i roditori per i test
    1. Adattare i roditori alla stanza per 30 minuti prima del test.
      NOTA: Il ricercatore può rimanere nella stanza con le luci accese ma dovrebbe rimanere in silenzio durante questo periodo.
    2. Pulire il labirinto a Y con una soluzione igienizzante sicura per gli animali e pulire via tutte le soluzioni igienizzanti con carta assorbente. Assicurati che il labirinto sia asciutto.
  2. Condurre il labirinto a Y
    1. Etichettare il braccio iniziale del labirinto a Y come B e gli altri 2 bracci come A e C (Figura 2A). Posiziona un roditore nel braccio più vicino al ricercatore (braccio B) vicino al centro del labirinto a Y. Una volta posizionato il roditore, avviare il timer (dettagli sul labirinto e sul timer nella Tabella dei materiali).
      1. Consenti a ciascun roditore di esplorare il labirinto a Y per 8 minuti. Prendi le registrazioni durante questo periodo e prendi nota di eventuali osservazioni. Siediti a diversi metri di distanza dal labirinto mantenendolo in vista ed evita di fare rumore.
      2. Registrare la posizione di partenza come A e ogni volta che il roditore entra in un nuovo braccio, registrare la nuova posizione del roditore (Figura 2B). Definire una voce come tutti e quattro gli arti del roditore che si trovano in una delle braccia.
      3. Fai attenzione ai roditori per nascondersi e rimanere fermi in un braccio del labirinto. Se il roditore rimane nello stesso punto per più di 60 s e non sembra mostrare un comportamento esplorativo, sposta il roditore verso il centro del labirinto a Y e continua la prova.
    2. Dopo ogni roditore, rimuovere eventuali feci e pulire il labirinto con una soluzione igienizzante.
      1. Assicurarsi che tutta la soluzione igienizzante sia spazzata via con asciugamani di carta e che il labirinto sia completamente asciutto prima di posizionare il prossimo roditore nel labirinto.
  3. Calcola l'alternanza spontanea e il comportamento esplorativo
    1. Calcola il comportamento esplorativo come il numero totale di voci effettuate durante 8 min.
    2. Calcola la cognizione spaziale misurata dall'alternanza spontanea:
      il numero di alternanze riuscite/(il numero totale di voci - 2)
      1. Definire un'alternanza di successo mentre il roditore si sposta in tre posizioni diverse in sequenza (esempio: ABC, CAB, BCA, ecc.). Annotare ogni alternanza riuscita (Figura 2B).
      2. Se i movimenti sono stati registrati come ACABCABABCABC, ignorare le due posizioni iniziali di partenza nel calcolo dell'alternanza spontanea (in modo tale che ci siano 11 movimenti nel denominatore). Contare il numero di movimenti precisi (movimenti accurati = 8). Calcola la precisione percentuale come: 8/(13 - 2) = 72,7%.

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Representative Results

L'OMR è considerato di successo se le soglie di frequenza spaziale e sensibilità al contrasto possono essere ottenute da un roditore. Qui, l'uso dell'OMR per valutare la frequenza spaziale è illustrato nei ratti brown-norvegia e long-evans di controllo naïve, sia giovani (3-6 mesi) che invecchiati (9-12 mesi). I ratti brown-norvegesi mostrano tipicamente una frequenza spaziale di base più elevata rispetto ai ratti Long-Evans. Inoltre, è stato osservato un effetto di invecchiamento sulla frequenza spaziale nei ratti Long-Evans (Figura 3A). I dati sono stati analizzati utilizzando un ANOVA unidirezionale seguito da confronti post-hoc di Holms-Sidak poiché i risultati giovani e anziani provenivano da diverse coorti.

L'uso dell'OMR per valutare la sensibilità al contrasto è illustrato nel modello STZ del diabete di tipo I che ha ricevuto un trattamento di intervento fisico. I ratti Long-Evans sono stati assegnati a uno dei quattro gruppi: controllo, controllo + attivo, diabetico e diabetico + attivo. Ai ratti diabetici sono state somministrate iniezioni endovenose della tossina STZ per danneggiare le cellule beta pancreatiche e indurre iperglicemia. I ratti attivi hanno ricevuto 30 minuti di esercizio sul tapis roulant, 5 giorni alla settimana. I ratti inattivi avevano un tapis roulant bloccato. Deficit significativi nella sensibilità al contrasto (Figura 3B) sono stati osservati nei ratti diabetici. Il trattamento con esercizio fisico ha ridotto questi deficit (Figura 3B). Questi risultati dimostrano che l'OMR è utile sia per rilevare e tracciare i deficit retinici nel tempo sia per valutare gli effetti dei trattamenti e degli interventi sulla malattia della retina22. I dati sono stati analizzati utilizzando una misura ripetuta bidirezionale ANOVA seguita da confronti post-hoc Holms-Sidak. Si noti che i risultati possono essere presentati come dati normalizzati al controllo (Figura 3B) o come valori grezzi (Figura 3A; per la frequenza spaziale: in cicli/gradi o c/d; per sensibilità al contrasto: unità arbitrarie o a.u.). In genere, sono necessari 6-10 animali, a seconda della gravità della lesione, per trovare una differenza significativa con l'OMR.

Il labirinto a Y è considerato di successo se il roditore entra in almeno 5 bracci del labirinto entro 8 minuti. Qui, la capacità del labirinto Y di valutare la funzione cognitiva e il comportamento esplorativo è illustrata nel ratto Goto-Kakizaki, un modello poligenico e non obeso di diabete di tipo II che sviluppa iperglicemia moderata a partire dalle 2-3 settimane di età e non richiede l'integrazione di insulina. Deficit significativi nella cognizione spaziale, misurata dall'alternanza spontanea (Figura 4A), e nel comportamento esplorativo, misurato dal numero di voci (Figura 4B), sono stati osservati nei ratti Goto-Kakizaki rispetto ai controlli Wistar a partire dalle 7 settimane di età. I ratti di controllo sembrano mostrare una diminuzione del comportamento esplorativo da 4 a 8 settimane. Questa tendenza è osservata anche in studi a lungo termine (8+ mesi di età). La diminuzione del movimento potrebbe essere dovuta alla mancanza di novità con l'esposizione ripetuta al labirinto o una diminuzione generale del movimento con l'età. I ratti di controllo sembrano mostrare un aumento della cognizione spaziale da 4 a 8 settimane. Questa tendenza non è osservata negli studi a lungo termine in cui gli animali vengono eseguiti mensilmente anziché settimanalmente (infatti, si osserva spesso un declino con l'invecchiamento), e quindi, questo aumento della cognizione spaziale può essere dovuto a un effetto di apprendimento dell'esecuzione del labirinto una volta alla settimana. I dati sono stati analizzati utilizzando una misura ripetuta bidirezionale ANOVA seguita da confronti post-hoc Holms-Sidak. Un minimo di 10 animali, a seconda della gravità della lesione, sono in genere necessari per trovare una differenza significativa con il labirinto Y.

Questo protocollo ha generato dati sulla funzione visiva e cognitiva in modelli di diabete di tipo I e di tipo II. I punteggi per i singoli animali sono stati mediati insieme e utilizzati per rilevare differenze significative tra i gruppi di trattamento nelle prime fasi della progressione del diabete. L'esecuzione di valutazioni sia retiniche che cognitive nel tempo in modelli di malattie sistemiche come il diabete consente il monitoraggio della comparsa temporale dei deficit nel tempo. Ad esempio, nel modello Goto-Kakizaki, i deficit della funzione retinica hanno dimostrato di precedere i deficit cognitivi ed esplorativi del comportamento23 (Figura 5).

Figure 1
Figura 1: Configurazione dell'apparecchiatura OMR. (A) Immagine di piattaforme di topo, ratto e ratto grande o alterato. (B) Immagine dello schermo del computer durante il test. (C) Pannello di pulsanti durante il test. (D) Schema del ratto sulla piattaforma in camera. (E) Gradienti di esempio che mostrano l'aumento della frequenza spaziale e della sensibilità al contrasto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Configurazione dell'apparecchiatura del labirinto a Y. (A) Immagine del labirinto a Y con le braccia etichettate. (B) Immagine di un quaderno di laboratorio con esempio della registrazione del labirinto a Y. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Utilizzo dell'OMR per tenere traccia della funzione visiva. (A) Soglie di frequenza spaziale per i ratti giovani (n = 11) e di età (n = 15), Brown-Norway (BN) e giovani (n = 20) e anziani (n = 13) Long-Evans (LE). Questa figura presenta i dati Brown-Norway di Feola et al., 201921. (B) Utilizzo dell'OMR per monitorare la ridotta funzione retinica nel tempo e gli effetti protettivi dell'esercizio in un modello di diabete di tipo I nel ratto STZ. Soglie di sensibilità al contrasto per ratti diabetici inattivi rispetto a ratti diabetici attivi e ratti di controllo. Gli asterischi grigio scuro rappresentano differenze tra entrambi i gruppi di controllo ed entrambi i gruppi diabetici. Gli asterischi arancioni rappresentano le differenze tra ratti diabetici inattivi e ratti diabetici attivi. Questa figura presenta i dati di un sottoinsieme di ratti di Allen et al., 201822. Media ± SEM. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Utilizzo del labirinto a Y per tracciare la funzione cognitiva e il comportamento esplorativo nel tempo nel modello Goto-Kakizaki del diabete di tipo II rispetto ai controlli Wistar. (A) Funzione cognitiva (alternanza spontanea) per ratti Goto-Kakizaki (diabetici) e Wistar (controllo) da 4 a 8 settimane di età. (B) Comportamento esplorativo (numero di ingressi) dalle 4 alle 8 settimane di età. Media ± SEM. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Gli asterischi rappresentano le differenze tra i ratti Goto-Kakizaki e Wistar in ogni punto temporale. Solo una coorte di ratti è stata eseguita da 4 settimane a 8 settimane (GK: n = 7; Wistar: n = 10). Tutte le altre coorti sono state eseguite da 5 settimane a 8 settimane (PO: n = 22; Wistar: n = 23) per un totale di n di 29 (GK) e 33 (Wistar) alle settimane da 5 a 8. Questa cifra è stata modificata da Allen et al., 201923. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Cronologia dei cambiamenti funzionali nel modello Goto-Kakizaki del diabete di tipo II. Dopo la comparsa di iperglicemia, i primi cambiamenti osservati nel ratto Goto-Kakizaki sono stati nella funzione retinica, misurata mediante elettroretinogramma (ERG), che compaiono a 4 settimane di età. I cambiamenti cognitivi ed esplorativi del comportamento sono comparsi dopo le 6 settimane di età. Questa cifra è stata modificata da Allen et al., 201923. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

L'OMR e il labirinto Y consentono la valutazione non invasiva della funzione visiva e dei deficit cognitivi nei roditori nel tempo. In questo protocollo, l'OMR e il labirinto Y hanno dimostrato di tracciare i deficit visivi e cognitivi nei modelli di diabete dei roditori.

Passaggi critici nel protocollo

L'OMR

Alcuni punti importanti da considerare quando si esegue l'OMR per valutare la funzione visiva sono i parametri di prova utilizzati, la progettazione sperimentale e la tempistica dei test e l'esperienza del ricercatore che esegue le misurazioni. Uno dei passaggi più critici nel protocollo è assicurarsi che i parametri siano impostati correttamente. Inoltre, come parte della configurazione, la camera OMR deve essere pulita con una soluzione igienizzante o un altro disinfettante approvato prima e dopo ogni roditore. È anche importante che il ricercatore che esegue le misure sia stato formato e abbia esperienza nell'esecuzione delle misure. I migliori risultati si vedono quando i roditori sono calmi e acclimatati nella stanza lasciandoli nelle loro gabbie per 30 minuti prima di iniziare l'esperimento. È anche importante determinare la frequenza spaziale di base e la sensibilità al contrasto ogni volta che si inizia a lavorare con un nuovo ceppo e notare che non tutti i ceppi mostreranno gli stessi livelli di base. I ratti brown-norvegesi hanno una maggiore frequenza spaziale di base rispetto ai ratti Long-Evans. Nel frattempo, alcuni ceppi di ratti albini sembrano aver compromesso la frequenza spaziale24, mentre altri ceppi di ratti albini non mostrano affatto un comportamento di tracciamento. Molti fattori possono contribuire alla risposta limitata degli animali albini sull'OMR: binocularità disturbata a causa della decussazione differenziale delle fibre del nervo ottico, mancanza di melanina nella parte posteriore dell'occhio e grande percentuale di doppi coni di opsina. Indipendentemente da ciò, i ratti albini potrebbero non essere soggetti appropriati per il test OMR poiché le loro prestazioni potrebbero essere troppo vicine al limite di rilevamento.

Il labirinto a Y

Una componente critica dell'esecuzione del labirinto a Y comporta la riduzione al minimo dei disturbi durante il periodo di registrazione. Il posizionamento iniziale del roditore nel labirinto dovrebbe essere fatto solo dopo aver permesso al roditore di acclimatarsi alla stanza per 30 minuti. Ciò consente al roditore di adattarsi al nuovo ambiente e impedisce a qualsiasi fattore confondente di influire sul normale comportamento del roditore. Ridurre al minimo i disturbi durante ogni prova è molto importante. Ciò include evitare rumori forti e assicurarsi che il ricercatore sia fuori dalla vista del roditore. Queste distrazioni possono causare stress al roditore. È anche importante notare che le pareti della stanza dovrebbero rimanere il più nude possibile con un colore neutro. Qualsiasi colore brillante sulle pareti o sui poster può distrarre il roditore e può influire sul loro modello di comportamento esplorativo.

Limitazioni del metodo e modifiche e risoluzione dei problemi del metodo

L'OMR

Una potenziale limitazione dell'OMR è che può essere influenzato dal bias dello sperimentatore e diversi sperimentatori possono avere risultati leggermente diversi poiché il punteggio OMR è soggettivo. Può essere facile perdere un movimento della testa troppo sottile o classificare il comportamento esplorativo come un movimento della testa. Poiché il pregiudizio può influenzare i risultati OMR, è meglio se lo sperimentatore è mascherato al gruppo di trattamento e alla progettazione dello studio quando possibile. Lo sviluppo di un OMR automatico o il confronto dei risultati di due tester potrebbe anche aiutare a ridurre la distorsione dello sperimentatore.

Un problema comune che può verificarsi durante il test OMR è quando il roditore salta ripetutamente dalla piattaforma, rendendo difficile ottenere una soglia visiva. Se ciò accade, prendine nota e posiziona delicatamente il topo sulla piattaforma; potrebbe anche essere necessario misurare nuovamente il ratto il giorno seguente. Inoltre, i ratti che non sono mai stati misurati prima potrebbero impegnarsi in comportamenti esplorativi quando collocati nell'OMR. Se questo è un problema, avere una misura di base aggiuntiva una settimana o giù di lì dopo la prima misurazione può aiutare a migliorare l'accuratezza. I test con quantità eccessive di questi comportamenti dovrebbero essere scartati.

Altri fattori come l'età o i segnali olfattivi potrebbero anche contribuire ad attività indesiderate. Pertanto, è importante progettare esperimenti in conformità con la tempistica dello sviluppo del sistema visivo nei ratti e pulire a fondo la piattaforma e la camera prima e dopo aver testato ciascun roditore. Anche l'ora del giorno in cui vengono eseguite le misurazioni OMR dovrebbe essere considerata, poiché studi precedenti hanno dimostrato che ci sono ritmi circadiani nella frequenza spaziale25. Correre i ratti prima di mezzogiorno sembra essere la cosa migliore per la loro attenzione (laboratorio di Rachael Allen - osservazioni personali). Se i ratti diventano troppo distratti, può essere utile toccare delicatamente l'esterno dell'OMR.

Anche la velocità con cui viene eseguito il test può influire sui risultati. Le misure possono diventare meno accurate dopo circa 30 minuti se i roditori perdono interesse per lo stimolo. Pertanto, risultati più accurati possono essere ottenuti quando le misurazioni vengono effettuate in circa ≤20 minuti. La durata di una singola prova (per SF o CS) è di 5-10 minuti per un esperto e 30 minuti per un principiante. Se un roditore mostra poco movimento, trascorre la maggior parte del suo tempo a toelettare o altrimenti non guarda nella direzione delle barre, potrebbe essere affaticato. Il roditore può essere eseguito di nuovo in un giorno diverso. Inoltre, i test SF e CS possono essere eseguiti in giorni diversi, in particolare per i tester più recenti che potrebbero essere più lenti. Anche la frequenza con cui viene eseguito il test può influenzare i risultati: eseguirlo settimanalmente o ogni due settimane aiuta gli animali a rimanere acclimatati al test, ma eseguirlo ogni giorno o a giorni alterni può causare iperacuità26. Non eseguiamo più di una prova al giorno, anche se spesso eseguiamo sia SF che CS nello stesso giorno o anche nella stessa seduta. Il tempo giornaliero cumulativo per l'esecuzione di una coorte di ratti (n = 10) è di 2 ore per un esperto.

L'OMR misura ogni occhio in modo indipendente, con conseguente punteggi visivi separati per ciascun occhio. Nei modelli di glaucoma di Morrison e microsfere e in un modello di schiacciamento del nervo ottico, il nostro laboratorio non ha osservato alcun impatto dell'occhio danneggiato sull'occhio non danneggiato27. In un modello di esplosione, con l'esplosione diretta a un occhio, l'occhio controlaterale ha mostrato danni, ma ciò potrebbe anche essere dovuto a un effetto di esplosione parziale28. Nei ratti di controllo, non ci dovrebbe essere alcuna differenza nei risultati tra direzioni in senso orario o antiorario, ma alcuni roditori potrebbero avere un pregiudizio; quindi, sarebbe meglio alternare le direzioni29, se il sistema OMR non si alterna automaticamente.

A seconda del modello di malattia, le differenze del gruppo di trattamento nella funzione visiva possono variare in base ai parametri utilizzati. Ad esempio, quando si verifica la sensibilità al contrasto, se la frequenza spaziale è impostata su un livello superiore alla normale soglia di frequenza spaziale e difficile da risolvere, le differenze nella sensibilità al contrasto tra i gruppi saranno piccole. Tuttavia, se la frequenza spaziale è impostata su un livello che è normalmente facile da vedere per i ratti, le differenze nella sensibilità al contrasto tra i gruppi saranno maggiori30. Pertanto, è importante considerare il design dello studio e le normali soglie di frequenza spaziale dei roditori quando si impostano i parametri per l'esecuzione dell'OMR.

Il labirinto a Y

Se un animale è spaventato, può congelarsi in un angolo del labirinto. Inoltre, se si verifica un forte rumore fuori dalla stanza, un animale può spaventarsi e non muoversi nel labirinto. Per spiegare questi problemi, i ricercatori possono prima acclimatare i ratti nella stanza, spostare un animale congelato in un punto di scelta, eseguire di nuovo un animale in un giorno diverso o eseguire gli animali in luce rossa, il che si pensa li renda meno nervosi in quanto sono normalmente attivi nell'oscurità (Rachael Allen's Lab - comunicazione personale). Si consiglia inoltre di eseguire il labirinto Y alla stessa ora ogni giorno per tenere conto dei cambiamenti nei livelli di attività durante il giorno a causa dei ritmi circadiani. Di solito corriamo i ratti prima di mezzogiorno (Rachael Allen's Lab - osservazioni personali). La durata di una singola prova è di 8 minuti (10 minuti, con pulizia). Non eseguiamo mai più di una prova al giorno. Se è necessaria una prova aggiuntiva, la prova viene eseguita in un altro giorno. Il tempo giornaliero cumulativo per l'esecuzione di una coorte di ratti (n = 10) è di 2-3 ore. Diminuzioni legate all'età dell'alternanza spaziale sono state osservate nei ratti a 9-12 mesi di età e nel comportamento esplorativo a 12 mesi di età28.

Mentre sia il comportamento esplorativo che la cognizione spaziale diminuiscono nei roditori diabetici, i due non sembrano essere strettamente correlati e, quindi, non valutiamo in modo indipendente l'attività locomotoria prima del test del labirinto Y.

Il significato del metodo rispetto ai metodi esistenti/alternativi

L'OMR

Altri metodi di test della funzione visiva, come il tracciamento optocinetico, si basano sul fissaggio della testa dell'animale in posizione e sul monitoraggio dei movimenti oculari. Il test di risposta optomotoria sfrenata (OMR) consente una misurazione longitudinale, non invasiva e affidabile della funzione visiva nei roditori. In questo protocollo, è stato descritto come l'OMR può essere utilizzato per quantificare sia la frequenza spaziale che le soglie di sensibilità al contrasto per ciascun occhio. Questo metodo può essere molto utile per rilevare la disfunzione neuronale in fase iniziale in malattie come il diabete. Altri test come il compito visivo dell'acqua possono anche essere utilizzati per misurare la frequenza spaziale31, ma poiché ciò comporta l'addestramento dei roditori a nuotare verso un gradiente in un labirinto a Y modificato, il compito richiede molto tempo e comporta molto allenamento. Inoltre, l'OMR misura i valori per ciascun occhio in modo indipendente, il che è utile nei modelli in cui la lesione è diretta a un occhio e l'altro occhio funge da controllo controlaterale (ad esempio, molti modelli di glaucoma). Inoltre, l'OMR è una valutazione sensibile, in grado di rilevare i cambiamenti già a 3-4 settimane dopo il diabete, che è prima di altre valutazioni visive. I saggi elettrofisiologici sono un'alternativa ai test visivi comportamentali. L'elettroretinografia (ERG) è più disponibile dell'OMR e può determinare deficit in precisi tipi di cellule utilizzando diversi componenti dell'onda ERG32 (le onde a- rappresentano la funzione cellulare dei fotorecettori, le onde b- rappresentano la funzione cellulare bipolare). Nel frattempo, l'OMR può essere utilizzato per determinare un deficit nella funzione visiva, senza rivelare il punto preciso di rottura lungo il percorso. Tuttavia, l'OMR è una misura più sensibile della DR rispetto all'ERG, con i deficit OMR tipicamente osservati tra 2-4 settimane dopo l'iperglicemia e i deficit ERG tipicamente osservati 4-8 settimane dopo l'iperglicemia nei roditori. La cataratta diabetica grave può influenzare l'OMR. Tuttavia, la cataratta diabetica nei roditori appare e / o peggiora in anestesia, e quindi, test come ERG e tomografia a coerenza ottica che richiedono l'anestesia sono influenzati molto più spesso dell'OMR, che viene eseguito in animali svegli.

Il labirinto a Y

Il labirinto a Y si basa sulla cognizione spaziale come il labirinto d'acqua di Morris, ma non utilizza un forte stimolo negativo (cioè l'acqua) per motivare l'animale a svolgere il compito. Pertanto, il labirinto a Y è meno stressante per gli animali ed è anche più facile da eseguire. Tuttavia, è possibile che il labirinto Y non sia sensibile come il labirinto d'acqua di Morris o il labirinto di Barnes. A differenza del labirinto d'acqua Morris, il labirinto a Y è un comportamento automatico e non richiede allenamento. Pertanto, il carico di tempo coinvolto nell'esecuzione del labirinto Y è molto più basso.

Conclusioni e future applicazioni o indicazioni del metodo

L'OMR

L'OMR è utile per prendere misure della funzione visiva nei roditori monitorando i movimenti della testa. È un metodo efficace, ma ci sono aggiornamenti e aggiunte che vengono continuamente apportate per migliorare il protocollo. Alcuni nuovi metodi utilizzano il roditore che mette in pausa la testa come indicatore OMR negativo combinato con il tracciamento della testa come indicatore positivo33. Ciò consente misurazioni più rapide e accurate della funzione visiva34. Un altro modo in cui questo processo è stato modificato è quello di sviluppare un sistema che traccerà automaticamente la testa senza marcatori artificiali per ridurre le incongruenze che potrebbero derivare dai tester umani35. A partire dal 2016, un sistema OMR automatizzato o quantitativo chiamato qOMR è stato ben sviluppato ed è disponibile in commercio. Nel protocollo di cui sopra, l'OMR è stato in grado di rilevare deficit nella frequenza spaziale e nella sensibilità al contrasto nei ratti diabetici, nonché la protezione contro i deficit con un trattamento (esercizio).

Il labirinto a Y

Il labirinto Y rivela informazioni sul comportamento esplorativo e sulla cognizione spaziale ed è stato utilizzato qui per rilevare deficit comportamentali nei roditori diabetici a 7 settimane. Esistono altri test per osservare la funzione cognitiva (ad esempio, il labirinto d'acqua di Morris, il labirinto di Barnes, il riconoscimento di nuovi oggetti), ed è possibile che questi test possano essere in grado di rivelare il declino cognitivo prima o fornire informazioni su diversi aspetti della cognizione. Le direzioni future per il labirinto a Y includono il posizionamento di un nuovo oggetto o di uno stimolo alimentare in uno dei bracci e l'osservazione del modello esplorativo del roditore36. Una variante di questo comporta il blocco di uno dei bracci del labirinto a Y, consentendo al roditore di esplorare i due bracci rimanenti, e quindi riaprire l'accesso al terzo braccio e valutare quanto tempo il roditore trascorre nel terzo braccio del romanzo. Un altro prezioso miglioramento che potrebbe essere fatto per quanto riguarda il labirinto a Y è lo sviluppo del tracciamento automatico dei roditori al fine di registrare i loro movimenti. Ciò eliminerebbe la necessità di registrare manualmente i movimenti dei roditori e renderebbe i calcoli delle alternanze spontanee più accurati ed efficienti.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato dal Department of Veterans Affairs Rehab R&D Service Career Development Awards (CDA-1, RX002111; CDA-2; RX002928) a RSA e (CDA-2, RX002342) ad AJF e National Institutes of Health (NIH-NICHD F31 HD097918 a DACT e NIH-NIEHS T32 ES012870 a DACT) e NEI Core Grant P30EY006360.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
OptoMotry HD CerebralMechanics Inc. OMR apparatus & software
Timer Thomas Scientific 810029AR
Y-Maze apparatus San Diego Instruments 7001-043 Available specifically for rats

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Tags

Comportamento Problema 164 retinopatia diabetica retina labirinto a Y risposta optomotoria comportamento esplorativo frequenza spaziale sensibilità al contrasto memoria spaziale alternanza spontanea

Erratum

Formal Correction: Erratum: Behavioral Assessment of Visual Function via Optomotor Response and Cognitive Function via Y-Maze in Diabetic Rats
Posted by JoVE Editors on 01/05/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Behavioral Assessment of Visual Function via Optomotor Response and Cognitive Function via Y-Maze in Diabetic Rats. The author list was updated.

The author list was updated from:

Kaavya Gudapati*1,2, Anayesha Singh*1,3, Danielle Clarkson-Townsend1,4, Andrew J. Feola1,2, Rachael S. Allen1,2
1Center for Visual and Neurocognitive Rehabilitation, Atlanta VA Medical Center,
2Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology,
3Department of Neuroscience, Emory University,
4Gangarosa Department of Environmental Health, Emory University
* These authors contributed equally

to:

Kaavya Gudapati*1,2, Anayesha Singh*1,3, Danielle Clarkson-Townsend1,4, Stephen Q. Phillips1, Amber Douglass1, Andrew J. Feola1,2, Rachael S. Allen1,2
1Center for Visual and Neurocognitive Rehabilitation, Atlanta VA Medical Center,
2Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology,
3Department of Neuroscience, Emory University,
4Gangarosa Department of Environmental Health, Emory University
* These authors contributed equally

Valutazione comportamentale della funzione visiva tramite risposta optomotoria e funzione cognitiva tramite Y-Maze nei ratti diabetici
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Gudapati, K., Singh, A.,… More

Gudapati, K., Singh, A., Clarkson-Townsend, D., Phillips, S. Q., Douglass, A., Feola, A. J., Allen, R. S. Behavioral Assessment of Visual Function via Optomotor Response and Cognitive Function via Y-Maze in Diabetic Rats. J. Vis. Exp. (164), e61806, doi:10.3791/61806 (2020).

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