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Cancer Research

स्तन कैंसर और सामान्य कोशिकाओं में टीजीएफ-β सिग्नलिंग और टीजीएफ-β-प्रेरित एपिथेलियल-टू-मेसेन्चिमल संक्रमण का अध्ययन

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61830
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Oncode Institute and Department of Cell Chemical Biology, Leiden University Medical Center

ERRATUM NOTICE

Summary

हम इस सिग्नलिंग मार्ग में शामिल प्रोटीन और जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करके टीजीएफ-β सिग्नलिंग और टीजीएफ-β-प्रेरित ईएमटी की जांच करने के लिए एक व्यवस्थित कार्यप्रवाह का वर्णन करते हैं। इन तरीकों में वेस्टर्न ब्लॉटिंग, एक लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर परख, क्यूपीसीआर और इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग शामिल हैं ।

Abstract

विकास कारक-β (टीजीएफ-β) को बदलना एक स्रावित बहुआयामी कारक है जो अंतरकोशिकीय संचार में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। टीजीएफ-β सिग्नलिंग के क्षोभ स्तन कैंसर का कारण बन सकते हैं। टीजीएफ-β विशिष्ट सेल सतह टीजीएफ-β प्रकार के माध्यम से प्रसार और भेदभाव पर इसके प्रभाव को प्रकाश में डालता है और द्वितीय रिसेप्टर्स (यानी, त्ग्री और ट्राइआरआईआई) टाइप करता है जिसमें एक आंतरिक सेरीन/थ्रेओनीन किनेज़ डोमेन होता है। टीजीएफ-β-प्रेरित हेट्रोमेरिक कॉम्प्लेक्स गठन पर, सक्रिय TοRI फॉस्फोरिटिंग SMAD2 और SMAD3 द्वारा इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग प्राप्त करता है। ये सक्रिय SMADs विशिष्ट लक्ष्य जीन को विनियमित करने के लिए SMAD4 के साथ विषममैरिक परिसर बनाते हैं, जिसमें प्लाज्मिनोजेन एक्टिवेशन अवरोधक 1 (पाई-1, SERPINE1 जीन द्वारा एन्कोड किया गया) शामिल है। एपिथेलियल-टू-मेसेंचिमल संक्रमण (ईएमटी) का प्रेरण प्राथमिक स्थल पर या दूर की साइटों पर उपनिवेशीकरण के दौरान एपिथेलियल कैंसर कोशिकाओं को एक आक्रामक फेनोटाइप हासिल करने और ट्यूमर प्रगति को चलाने की अनुमति देता है। TGF-β EMT ड्राइविंग द्वारा स्तन कैंसर आक्रमण के एक शक्तिशाली प्रेरक के रूप में कार्य करता है । यहां, हम उदाहरण के रूप में प्रेमलग्नंत मानव MCF10A-आरएएस (M2) कोशिकाओं और माउस एनएमएमजी एपिथेलियल कोशिकाओं का उपयोग करके टीजीएफ-β सिग्नलिंग और ईएमटी प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए व्यवस्थित तरीकों का वर्णन करते हैं। हम पश्चिमी ब्लॉटिंग, SMAD3/SMAD4-निर्भर ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि द्वारा टीजीएफ-β-प्रेरित SMAD2 फॉस्फोरिलेशन का निर्धारण करने के तरीकों का वर्णन करते हैं, जो मात्रात्मक वास्तविक समय-बहुलक श्रृंखला प्रतिक्रिया (क्यूआरटी-पीसीआर) द्वारा लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर गतिविधि और SERPINE1 लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति का उपयोग करके है। इसके अलावा, आकृति विज्ञान, एपिथेलियल और मेसेंचिमल मार्कर अभिव्यक्ति, फिलामेंटस ऐक्टिन स्टेनिंग और ई-कैडेरिन के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला में परिवर्तन को मापने के द्वारा टीजीएफ-β-प्रेरित ईएमटी की जांच करने के लिए तरीकों का वर्णन किया गया है। दो चयनात्मक छोटे अणु TGF-β रिसेप्टर kinase अवरोधकों, GW788388 और SB431542, TGF-β प्रेरित SMAD2 phosphorylation, लक्ष्य जीन और EMT मार्कर अभिव्यक्ति में परिवर्तन ब्लॉक करने के लिए इस्तेमाल किया गया । इसके अलावा, हम एडिपोसाइट्स में मेसेंचिमल स्तन Py2T मुरीन एपिथेलियल ट्यूमर कोशिकाओं के अंतर-अंतर का वर्णन करते हैं। स्तन कैंसर में टीजीएफ-β-प्रेरित सिग्नलिंग और ईएमटी की जांच करने के तरीके स्तन कैंसर के लिए नए चिकित्सीय दृष्टिकोणों में योगदान दे सकते हैं।

Introduction

साइटोकिन ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर-β (टीजीएफ-β) टीजीएफ-एएनएस (यानी, टीजीएफ-1, -2 और -3), बोन मोर्फोजेनिक प्रोटीन (बीएमपीएस) और एक्टिव्स1,2सहित संरचनात्मक और कार्यात्मक रूप से संबंधित नियामक पॉलीपेप्टिड्स के एक बड़े समूह का प्रोटोटाइप है। ये साइटोकिन्स भ्रूणीय विकास और ऊतक और अंग हो्योस्टेसिस 3 को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिकानिभातेहैं । टीजीएफ-β के गलत तरीके से कैंसर4,5सहित कई तरह की बीमारियां हो सकती हैं । टीजीएफ-β कैंसर की प्रगति में एक जटिल, दोहरी भूमिका निभाता है: सामान्य और प्रेमलग्नंट एपिथेलियल कोशिकाओं में, टीजीएफ-β प्रसार को बाधित करके ट्यूमर-दमन के रूप में व्यवहार करता है और एपोप्टोसिस6,7को प्रेरित करता है; हालांकि, ट्यूमर प्रगति के अंतिम चरण में, जब साइटोस्टैटिक प्रतिक्रियाओं को ऑन्कोजीन की सक्रियता या ट्यूमर दबाने वाले जीन के नुकसान से अवरुद्ध कर दिया जाता है, टीजीएफ-β कैंसर कोशिकाओं में एपिथेलियल-टू-मेसेंचिमल संक्रमण (ईएमटी) को बढ़ावा देकर ट्यूमर बढ़ाने का काम करता है, जिससे कैंसर सेल आक्रमण और मेटास्टेसिस को सक्षम करता है, ट्यूमर माइक्रोएनवायरनमेंट में कोशिकाओं पर अभिनय, और एंजियोजेनेसिस और प्रतिरक्षा चोरी8,9,10को उत्तेजित करता है।

टीजीएफ-β को परिपक्व कार्बोक्सी-टर्मिनल टीजीएफ-β और विलंबता से जुड़े पेप्टाइड (एलएपी)11से युक्त एक निष्क्रिय अग्रदूत अणु के रूप में स्रावित किया जाता है। इस छोटे से परिसर को अव्यक्त टीजीएफ-β-बाइंडिंग प्रोटीन (एलटीबीपी)12से सहसंबद्ध किया जा सकता है । परिपक्व टीजीएफ-β की रिहाई विशिष्ट प्रोटीज की कार्रवाई द्वारा मध्यस्थता की जा सकती है जो लैप को क्लीव करती है या एक इंटीग्रीन-निर्भर प्रक्रिया13,14में गोद के यांत्रिक खींच द्वारा। एलटीबीपी के अलावा, ग्लाइकोप्रोटीन एक पुनरावृत्ति प्रमुख (जीएआरपी) नियामक टी कोशिकाओं (ट्रेग्स) की सतह पर अत्यधिक व्यक्त किया जाता है और टीजीएफ-β15, 16की सक्रियता को विनियमित करने में एलटीबीपी के समान भूमिका निभाता है। GARP सीधे डिसल्फाइड लिंकेज और नॉनकोवेलेंट एसोसिएशन के माध्यम से अव्यक्त टीजीएफ-β को बांधता है। GARP/TGF-β परिसर से टीजीएफ-β की सक्रियता के लिए इंटीग्रिटीज17की आवश्यकता होती है । परिपक्व टीजीएफ-β सिग्नलिंग शुरू करने के लिए टीजीएफ-β सेरीन/थ्रेनिन किनेज रिसेप्टर्स, यानी टीजीएफ-β टाइप I (TοRI) और टीजीएफ-β टाइप II (TοRII) रिसेप्टर्स18 से बांधता है । TGF-β T <3> के लिए TοRII के लिए बाध्यकारी TοRI की भर्ती और एक विषमता परिसर के गठन को बढ़ावा देता है । इसके बाद, Tsri को एक छोटी ग्लाइसिन-और सेरीन-रिच (जीएस) आकृति में सेरीन और थ्रेओनिन अवशेषों पर TsriI kinase द्वारा फॉस्फोरिलेटेड किया गया है, जिसके परिणामस्वरूप इसकी सक्रियता19,20है। सक्रियण पर, सक्रिय TοRI रंगरूटों और फॉस्फोरलेट अपने सब्सट्रेट्स: दो रिसेप्टर विशिष्ट SMADs (आर-SMADs) जिसमें SMAD2 और SMAD3(चित्रा 1)शामिल हैं । आर-SMADs दो तथाकथित पागल होमोलॉजी डोमेन, MH1 और MH2 के साथ एक समान समग्र संरचना साझा करते हैं, जो एक प्रोलाइन-रिच लिंकर क्षेत्र(चित्रा 2)से अलग हैं। SMAD3 के MH1 डोमेन के भीतर डीएनए बाध्यकारी आकृति SMAD2 और SMAD3 के बीच संरक्षित नहीं है, और SMAD2 सीधे अपने MH1 डोमेन (exon 3 और L1) में दो सम्मिलन के कारण डीएनए बांध नहीं सकते हैं । SMAD2 और SMAD3 को उनके सी-टर्मिनी(चित्रा 2)में एसएसएक्सएस आकृति के फॉस्फोरिलेशन द्वारा सक्रिय किया जा सकता है। फॉस्फोरिलेटेड SMAD2/3 एक आम SMAD मध्यस्थ, SMAD4 के साथ हेट्रोमेरिक परिसरों का रूप लेते हैं, जो लक्ष्य जीन(चित्र 1)7,21के प्रतिलेखन को संशोधित करने के लिए नाभिक में स्थानांतरित होते हैं। यह विहित SMAD सिग्नलिंग मार्ग ठीक विनियमित है और विशिष्ट सेलुलर और ऊतक प्रतिक्रियाओं जैसे सेल भाग्य और ट्यूमर सेल मेटास्टेसिस और आक्रमण22के विनियमन के रूप में उत्पन्न करता है । टीजीएफ-β-SMAD सिग्नलिंग के अलावा, डाउनस्ट्रीम सेलुलर प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने के लिए रिसेप्टर्स द्वारा गैर-SMAD सिग्नलिंग रास्ते भी सीधे सक्रिय किए जा सकते हैं23।

ट्यूमर प्रगति के दौरान, ईएमटी के प्रेरण के लिए टीजीएफ-β-प्रेरित SMAD-निर्भर और SMAD-स्वतंत्र रास्ते की सक्रियता की आवश्यकता होती है। ईएमटी एक प्रतिवर्ती प्रक्रिया है जिसमें ट्यूमर कोशिकाएं एक एपिथेलियल फेनोटाइप से अलग होती हैं, जो सेल-सेल संपर्कों के नुकसान से जुड़ी होती है और एपिकल-बेसल ध्रुवीयता में कमी आती है, जो बढ़ी हुई गतिशीलता और आक्रमण क्षमता24के साथ एक मेसेंकिमल फेनोटाइप के लिए होती है। ईएमटी को एन-कैडेरिन, विमेंटिन, जेब2 और घोंघा/2 सहित मेसेंचिमल मार्कर प्रोटीन की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति और ई-कैडेरिन और β-कैटेरिन(चित्र 3)25जैसे एपिथेलियल मार्कर के सहवर्ती डाउनरेगुलेशन की विशेषता है। हालांकि, एक एपिथेलियल से एक मेसेंचिमल राज्य में संक्रमण अक्सर अधूरा होता है, और कोशिकाओं को मिश्रित एपिथेलियल और मेसेंचिमल (ई/एम) विशेषताओं का लाभ होता है। इंटरनेशनल ईएमटी एसोसिएशन द्वारा हाल ही में एक पत्र में मध्यवर्ती ई/एम फेनोटाइपिक राज्यों से गुजरने वाली कोशिकाओं की प्रक्रिया को एपिथेलियल-मेसेनचिमल प्लास्टिसिटी (ईएमपी)26के रूप में वर्णन करने का प्रस्ताव किया गया था । यह प्लास्टिसिटी आंशिक ईएमटी, हाइब्रिड ई/एम स्थिति, एक मेटास्टेबल ईएमटी स्टेट, एक ईएमटी सातत्य और एक ईएमटी स्पेक्ट्रम26को संदर्भित करता है । ईएमटी के दौरान, ट्यूमर कोशिकाएं कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) गुणों को प्राप्त करती हैं और टुकड़ी-प्रेरित एपोप्टोसिस27के लिए अधिक प्रतिरोधी हो जाती हैं। जबकि ईएमटी प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं में एक आक्रामक फेनोटाइप के अधिग्रहण के लिए जिम्मेदार है और कैंसर की प्रगति को चलाता है,इसकेविपरीत, मेसेंचिमल-एपिथेलियल संक्रमण (मेट) को दूर मेटास्टैटिक साइटों28, 29पर प्रसारित ट्यूमर कोशिकाओं की वृद्धि में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है। हाल ही में एक अध्ययन से पता चला है कि EMT-व्युत्पन्न स्तन कैंसर कोशिकाओं को adipocytes में स्थानांतरित किया जा सकता है, जो मेटास्टेसिस को बाधित करने और ट्यूमर कोशिकाओं में चिकित्सा प्रतिरोध को दूर करने और कैंसर30को समाप्त करने का अवसर प्रदान कर सकता है । स्तन कैंसरजनन में ईएमटी की सक्रियता में टीजीएफ-β सिग्नलिंग की महत्वपूर्ण भूमिका के कारण, हम पश्चिमी ब्लॉटिंग के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल, एक लूसिफ़ेरेस ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टर परख, मात्रात्मक वास्तविक समय-बहुलक चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर), और टीजीएफ-β सिग्नलिंग, टीजीएफ-β-प्रेरित ईएमटी की जांच के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस, और एडीपो में ईएमटी-व्युत्पन्न मुरीन स्तन एपिथेलियल ट्यूमर सेप्टेस के स्थानांतरण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। ये तकनीक सेल बायोलॉजी फील्ड में सबसे ज्यादा इस्तेमाल होने वाले एनालिटिकल टूल्स हैं । क्यूआरटी-पीसीआर का उपयोग मात्रात्मक तरीके से एमआरएनए अभिव्यक्ति के स्तर का पता लगाने, विशेषता और मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाता है। मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर), एक वैकल्पिक तकनीक की तुलना में, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (आरटी) -पीसीआर का उपयोग अर्ध-मात्रात्मक तरीके से एमआरएनए अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है31,32। पश्चिमी ब्लॉटिंग का उपयोग अर्ध-मात्रात्मक तरीके से संवेदनशीलता और विशिष्टता के फायदों के साथ दिए गए सेल lysate नमूने में विशिष्ट प्रोटीन के स्तर की जांच करने के लिए किया जाता है। इस प्रकार, हम टीजीएफ-β सिग्नलिंग की जांच करने में मदद करने के लिए जीन अभिव्यक्ति से प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए एक व्यवस्थित कार्यप्रवाह प्रस्तुत करते हैं जिसे अन्य सिग्नलिंग रास्तों पर भी लागू किया जा सकता है।

Protocol

1. पश्चिमी ब्लॉटिंग का उपयोग करके टीजीएफ-β-प्रेरित SMAD2 फॉस्फोरिलेशन का विश्लेषण

नोट: Prealignant मानव स्तन MCF10A-रास कोशिकाओं को एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया गया TGF-β संकेत प्रतिक्रियाओं३३की जांच । सैद्धांतिक रूप से, नीचे वर्णित विधियां अन्य टीजीएफ-β-उत्तरदायी सेल लाइनों पर भी लागू होती हैं।

  1. संस्कृति स्तन एपिथेलियल सेल लाइन MCF10A-रास ३७ डिग्री सेल्सियस पर है Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम (DMEM)/F12 5% घोड़े सीरम के साथ एल ग्लूटामाइन युक्त, 20 एनजी/एमएल एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ), 10 मिलीग्राम/एमएल इंसुलिन, १०० एनजी/एमएल हैजा एंटेरोटॉक्सिन, ०.५ मिलीग्राम/एमएल हाइड्रोकॉर्टिसोन, और 1:100 पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन-स्ट्रेप) ।
  2. 1 मिनट के लिए 0.25% ट्राइपसिन-ईडीटीए के 1 मिलियन के साथ एमसीएफ 10ए-रास कोशिकाओं को ट्रिप्सिन करें और सेल काउंटर का उपयोग करके व्यवहार्य कोशिकाओं को गिनें।
  3. बीज कोशिकाओं को 5×10 5 कोशिकाओं/अच्छी तरह से घनत्व पर 6-अच्छीप्लेटों में ।
  4. रात भर के विकास के बाद, या तो टीजीएफ-β (5 एनजी/एमएल) या लिगांड बफर (4 mM HCl, ०.१% फैटी-फ्री गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए)) के साथ कोशिकाओं का इलाज करें, और फिर संस्कृति माध्यम को हटा दें और धीरे से फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 1 mL के साथ कोशिकाओं को धोएं ।
  5. बर्फ पर 6-अच्छी प्लेटों में ठंडी कोशिकाएं और प्रीकूल्ड रेडियो प्रतिरक्षा वर्षा परख (रिपा) लाइसिस बफर (150 mM NaCl) के 150 माइक्रोन जोड़ें, 0.1% ट्राइटन एक्स-100, 0.5% सोडियम डिऑक्सीकोटलेट, 0.1% एसडीएस, 50 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0, और हौसले से जोड़ा मिनी प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल)। लाइसिस को 10 मिनट के लिए बर्फ पर आगे बढ़ने दें।
  6. प्लास्टिक सेल स्क्रैपर का उपयोग करके डिश से अनुयायी कोशिकाओं को स्क्रैप करें, फिर धीरे-धीरे सेल निलंबन को प्रीकूल्ड माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  7. सेंट्रलाइज सेल 10 मिनट के लिए 150 सेंट्रलाइज्ड फोर्स(एक्स जी)पर 4 डिग्री सेल्सियस पर ले जाते हैं और सुपरनेट को फ्रेश 1.5-एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में ट्रांसफर करते हैं।
  8. डिटर्जेंट संगत (डीसी) प्रोटीन परख किट का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता को मापें।
  9. प्रत्येक नमूने से 30 माइक्रोग्राम प्रोटीन को 10% सोडियम डोडेसिल सल्फिलेक्ट पॉलीएक्रिलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज) जेल पर लोड करें और 1.5-2 घंटे के लिए 100 वी के वोल्टेज पर जेल चलाएं।
  10. प्रोटीन को जेल से 1-1.5 घंटे के लिए 110 वी के वोल्टेज पर 45-माइक्रोन माइक्रोनाइलाइडीन डिफ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली में स्थानांतरित करें।
  11. पीवीडीएफ झिल्ली को प्रोटीन साइड (जिस तरफ जेल का सामना करना पड़ रहा था) के साथ एक उपयुक्त कंटेनर में स्थानांतरित करें, और संक्षेप में आसुत पानी में झिल्ली को कुल्ला दें।
  12. पानी को त्यागें, पोंसाऊ एस समाधान जोड़ें, और झिल्ली को 1-2 मिनट के लिए एक कमाल के मंच पर रखें।
  13. झिल्ली को जल्दी से धोकर आसुत पानी से डी-दाग करें और फिर इसे 1 मिनट के लिए धोएं।
  14. फिर, पीवीडीएफ झिल्ली को एक हल्के बॉक्स पर रखें, और समान कुल प्रोटीन लोडिंग की जांच करने के लिए एक तस्वीर लें।
  15. ट्वीन 20 (टीबीएसटी, 20 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.4, 150 एमएमएम एनएसीएल, और 0.1% ट्वीन 20) के साथ ट्राइज़-बफर नमकीन के साथ झिल्ली धोएं जब तक कि कोई दृश्यमान धुंधला न हो।
  16. बफर (टीबीटी समाधान में 5% स्किम दूध) को अवरुद्ध करने में झिल्ली डालें और इसे कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  17. झिल्ली को टीबीस्ट से दो बार धोएं।
  18. फॉस्फो-SMAD2 (पी-SMAD2; 1:1000, घर में बने 34),कुल SMAD2/3 1:1000 और ग्लाइफेल्डिहाइड 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज़ (GAPDH; 1:1000) के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें, रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर ।
  19. टीबीटी के साथ झिल्ली को दो बार धोएं और 2 घंटे के लिए खरगोश या माउस (1:5000) के खिलाफ एक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
  20. 30 सेकंड के लिए पश्चिमी ईसीएल सब्सट्रेट के साथ पीवीडीएफ झिल्ली को इनक्यूबेट करें, और इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके सिग्नल का पता लगाएं।
  21. जैविक ट्रिप्लिकेट प्राप्त करने के लिए कम से कम तीन बार प्रयोग दोहराएं।

2. TGF-β-प्रेरित SMAD3-निर्भर प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण

  1. SMAD3/SMAD4-निर्भर CAGA12-लूसिफ़ेरेस ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टर परख प्रदर्शन करते हैं ।
    1. संस्कृति और चरण 1 में वर्णित MCF10A-रास कोशिकाओं की कोशिश । बीज कोशिकाओं को 5×10 4 कोशिकाओं पर24-अच्छी प्लेटों में/
    2. सीडिंग के बाद दिन, प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं को टीजीएफ-β/SMAD3-inducible (CAGA)के 12 लूसिफ़ेरेस ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टर के 12 लूसिफ़ेरेस ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टर पॉलीथीनिमीन (पीईआई) का उपयोग करके β-गैलेक्टोसिडेस अभिव्यक्ति के35 और 80 एनजी का निर्माण करते हैं। विभिन्न कुओं के बीच ट्रांसफैक्शन दक्षता में अंतर को सामान्य करने के लिए β-गैलेक्टोसिडेस का ट्रांसफेक्शन किया जाता है। ट्रिपलआईटीकेट में हर प्रायोगिक समूह का गठन करें।
    3. इनक्यूबेशन के 24 घंटे के बाद, सीरम मुक्त DMEM-उच्च ग्लूकोज के साथ कोशिकाओं भूखा और, 6 घंटे बाद, टीजीएफ-β (5 एनजी/एमएल) या ligand बफर (4 mM HCl, ०.१% बीएसए) कोशिकाओं के लिए एक वाहन नियंत्रण के रूप में जोड़ें ।
    4. इनक्यूबेशन के एक और 24 घंटे के बाद, प्रीवार्मेड पीबीएस के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं।
    5. इसमें 120 माइक्रोन/वेल 1× लाइसिस बफर डालें और धीरे-धीरे प्लेट को 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर हिलाएं।
    6. एक ल्यूमिनोमीटर का उपयोग कर लूसिफ़ेरेस गतिविधि को मापने के लिए 96-अच्छी तरह से सफेद परख माइक्रोप्लेट के प्रत्येक कुएं में 30 माइक्रोल को स्थानांतरित करें।
    7. β-गैलेक्टोसिडेज गतिविधि को मापने के लिए 96-अच्छी तरह से पारदर्शी प्लेट के प्रत्येक कुएं में 50 μl को स्थानांतरित करें।
    8. β-गैलेक्टोसिडेज गतिविधि के लिए लूसिफ़ेरेस गतिविधि को सामान्य करें और जैविक ट्रिपलिट्स प्राप्त करने के लिए कम से कम तीन बार प्रयोगों को दोहराएं।
  2. मात्रात्मक वास्तविक समय-पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर) का उपयोग करके टीजीएफ-β लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करें।
    1. संस्कृति और चरण 1 में वर्णित MCF10A-रास कोशिकाओं की कोशिश । बीज कोशिकाओं को 5×10 5 कोशिकाओं पर 6-अच्छीप्लेटों में और कोशिकाओं को रात भर पालन करने की अनुमति देते हैं ।
    2. 6 घंटे के लिए टीजीएफ-β (5 एनजी/एमएल) या लिगांड बफर (4 mM HCl, 0.1% बीएसए) के साथ कोशिकाओं का इलाज करें, और फिर पीबीएस के 1 मिलीएल के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं।
    3. आरएनए आइसोलेशन किट का उपयोग करके कुल आरएनए को अलग करें।
    4. एक नैनोड्रॉप के साथ आरएनए एकाग्रता का निर्धारण करें और पहले स्ट्रैंड सीडीएनए संश्लेषण किट का उपयोग करके आरएनए के 1 माइक्रोन के साथ सीडीएनए संश्लेषण करें।
    5. 10 माइक्रोन रिएक्शन मिश्रण में दस गुना पतला सीडीएनए के साथ मात्रात्मक वास्तविक समय-पीसीआर-पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) करने के लिए वास्तविक समय-पीसीआर डिटेक्शन सिस्टम का उपयोग करें जिसमें गपध (सामान्यीकरण के लिए), SERPINE1 (PAI-1 प्रोटीन को एन्कोडिंग) के लिए विशिष्ट मानव फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर शामिल हैं, एक TGF-β/SMAD लक्ष्य जीन),SMAD7 (TGF-β/SMAD लक्ष्य जीन) और qPCR मास्टर मिक्स । ट्रिपलआईटीकेट में हर प्रायोगिक समूह का गठन करें।
      नोट: क्यूआरटी-पीसीआर में लक्षित मानव जीन का पता लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर दृश्य तालिका 1में सूचीबद्ध हैं ।
    6. निम्नलिखित क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया स्थितियों का उपयोग करें: आरंभीकरण, 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 10 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, डेनैचेशन; एनीलिंग, 30 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस; और विस्तार, 10 सेकंड के लिए 80 डिग्री सेल्सियस; विकृति, एनीलिंग और एक्सटेंशन 40 बार दोहराया जाता है।
    7. जैविक ट्रिप्लिकेट प्राप्त करने के लिए कम से कम तीन बार प्रयोग दोहराएं।

3. टीजीएफ-β-प्रेरित ईएमटी का विश्लेषण

  1. पश्चिमी ब्लॉटिंग का उपयोग करके प्रोटीन स्तर पर ईएमटी मार्कर की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करें।
    नोट: टीजीएफ-β-प्रेरित ईएमटी का विश्लेषण माउस एनएमएमजी एपिथेलियल कोशिकाओं का उपयोग करके एक उदाहरण के रूप में दिखाया गया है36,37।
    1. डीएमईएम-उच्च ग्लूकोज माध्यम में 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति एनएमएमजी कोशिकाएं 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1:100 पेन-स्ट्रेप के साथ पूरक हैं। प्रोटीन अलगाव और पता लगाने के लिए चरण 1 में वर्णित विधियों का उपयोग करें।
      नोट: इस प्रयोग में निम्नलिखित एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है: ई-कैडेरिन, 1:1000; एन-कैडेरिन, 1:1000; घोंघा, 1:1000; स्लग, 1:1000; तुबुलिन, 1:1000(चित्रा 3)।
  2. चरण 2.2 में वर्णित मात्रात्मक वास्तविक समय-पीसीआर का उपयोग करके एमआरएनए स्तर पर ईएमटी मार्कर की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करें।
    नोट: क्यूआरटी-पीसीआर के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी माउस प्राइमर, जिनमें CDH1 (ई-कैडेरिन प्रोटीन को एन्कोडिंग), घोंघाऔर जेबी 2 (चित्रा 3) तालिका 1में सूचीबद्ध हैं।
  3. अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस और प्रत्यक्ष फ्लोरेसेंस धुंधला का उपयोग कर ईएमटी प्रक्रिया का विश्लेषण करें।
    1. ई-कैडेरिन का अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला
      1. 6-अच्छी प्लेटों (एक कवरलिप प्रति अच्छी तरह) में बाँझ 18 मिमी-साइड स्क्वायर ग्लास कवरलिप रखें।
      2. बीज 1×105 एनएमएमएमजी कोशिकाएं 6-वेल प्लेट प्रति पूर्ण डीएमईएम के 2 मिलील के साथ और कोशिकाओं को रात भर पालन करने की अनुमति देती हैं।
      3. धीरे-धीरे एक नई 6-अच्छी प्लेट में अनुयायी कोशिकाओं के साथ कवरस्लिप को स्थानांतरित करें और कुओं में संस्कृति माध्यम के 2 एमएल जोड़ें।
      4. कोशिकाओं को 2 दिनों के लिए टीजीएफ-β (5 एनजी/एमएल) या लिगांड बफर (4 mM HCl, 0.1% बीएसए) के साथ इलाज करें।
      5. संस्कृति माध्यम को हटा दें और प्रीवार्मेड पीबीएस के 1 एमसीएल के साथ कोशिकाओं को धीरे से धोएं।
      6. 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड के 1 मिलील जोड़कर और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटिंग करके कोशिकाओं को ठीक करें। फिर, पीबीएस के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को धीरे-धीरे धोएं।
      7. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 0.1% ट्राइटन एक्स-100 के साथ फिक्स्ड कोशिकाओं को पार करें और पीबीएस के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं।
      8. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पीबीएस में 5% बीएसए के साथ कोशिकाओं को ब्लॉक करें और पीबीएस के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं।
      9. प्रत्येक कवरस्लिप के शीर्ष पर ई-कैडेरिन (पीबीएस में पतला 1:1000) के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
      10. प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें और तीन बार पीबीएस के साथ कवरस्लिप धोएं।
      11. एलेक्सा फ्लोर 555 माध्यमिक एंटीबॉडी (पीबीएस में पतला 1:500) प्रत्येक कवरस्लिप के शीर्ष पर जोड़ें और प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करते हुए कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
      12. सेकेंडरी एंटीबॉडी निकालें और कवरस्लिप को तीन बार पीबीएस से धोएं।
      13. 4′, 6-डायमिडिनो-2-फेनीलिंडोल (DAPI) के साथ बढ़ते माध्यम का उपयोग करके ग्लास स्लाइड पर कवरस्लिप (कोशिकाओं को नीचे की ओर) माउंट करें और प्रकाश से सुरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर एक बॉक्स में घुड़सवार स्लाइड स्टोर करें।
      14. SP8 कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ धुंधला निरीक्षण करें।
    2. फिलामेंटस (एफ) ऐक्टिन का सीधा फ्लोरेसेंस धुंधला।
      1. 3.3.1.1 चरण के बाद नमूने तैयार करें। 3.3.1.9 तक।
      2. फिलामेंटस ऐक्टिन (एफ-ऐक्टिन) की कल्पना करने के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एलेक्सा फ्लोर 488 फलॉइडिन (1:1000) जोड़कर कोशिकाओं को दाग दें।
      3. पीबीएस के साथ तीन बार कोशिकाओं को धोएं।
      4. DAPI के साथ बढ़ते माध्यम का उपयोग करके ग्लास स्लाइड पर कवरलिप माउंट करें और SP8 कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ छवियां लें।

Representative Results

टीजीएफ-β सिग्नलिंग का विश्लेषण
टीजीएफ-β सिग्नलिंग में महत्वपूर्ण कदम टीएक्सएस आकृति(चित्रा 2)में दो सबसे कारबॉक्सी टर्मिनल सेरीन अवशेषों का फॉस्फोरिलेशन है, जो TοRI kinase38,39द्वारा है। टीजीएफ-β सिग्नलिंग प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए, हमने फॉस्फोरिलेटेड SMAD2 के पश्चिमी ब्लॉटिंग का प्रदर्शन किया। प्रीमैग्नेंट ह्यूमन ब्रेस्ट MCF10A-Ras कोशिकाओं में, 1 घंटे के लिए टीजीएफ-β उत्तेजना के जवाब में SMAD2 के फॉस्फोरिलेशन में काफी वृद्धि हुई, जबकि कुल SMAD2/3 की अभिव्यक्ति टीजीएफ-β उपचार(चित्रा 4A)से प्रभावित नहीं थी। TGF-β प्रेरित SMAD3/4-संचालित CAGA-ल्यूक ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टर परख का उपयोग करके, हमने पाया कि TGF-β ने गैर-उपचारित कोशिकाओं(चित्रा 4B)की तुलना में MCF10A-Ras cells लाइन में लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर को स्पष्ट रूप से प्रेरित किया । इसके अलावा, हमने देखा कि SMAD7 और SERPINE1 (पाई-1 प्रोटीन एन्कोडिंग) सहित टीजीएफ-β के अच्छी तरह से विशेषता वाले प्रत्यक्ष प्रतिलेखन जीन लक्ष्यों को टीजीएफ-β-उपचारित एमसीएफ 10ए-रास कोशिकाओं(चित्रा 4C)में अत्यधिक व्यक्त किया गया था ।

टीजीएफ-β-प्रेरित ईएमटी का विश्लेषण
हमने विभिन्न तरीकों के साथ टीजीएफ-β-प्रेरित ईएमटी का मूल्यांकन किया, जैसे रूपात्मक परिवर्तन, एमआरएनए और प्रोटीन के स्तर पर ईएमटी मार्कर की अभिव्यक्ति और ईएमटी मार्कर36की इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला। एनएमएमजी एपिथेलियल कोशिकाओं को 1 और 2 दिनों के लिए टीजीएफ-β के साथ इलाज किया गया एक क्लासिक एपिथेलियल आकृति विज्ञान से एक पतली आकार के मेसेन्चिमल जैसी आकृति विज्ञान में बदल गया, जैसा कि चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी(चित्रा 5A)द्वारा दिखाया गया है। रूपात्मक परिवर्तनों के अनुरूप, हमने देखा कि टीजीएफ-β उपचार के कारण एन-कैडेरिन, घोंघा और स्लग37 (चित्रा 5B)सहित मेसेंचिमल मार्कर की प्रोटीन अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई। इसके विपरीत, टीजीएफ-β उपचार(चित्रा 5B)के 2 दिनों के बाद एनएमयूएमजी कोशिकाओं में एक एपिथेलियल मार्कर ई-कैडेरिन को डाउनरेगुइनियमित किया गया था। इसके अलावा, हमने ईएमटी मार्कर की जीन अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए मात्रात्मक वास्तविक समय-पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर) का प्रदर्शन किया। CDH1 (ई-कैडेरिन प्रोटीन को एन्कोडिंग) में काफी कमी आई थी, जबकि घोंघा और जिंक फिंगर ई-बॉक्स-बाइंडिंग होमोबॉक्स 2 (जेबी2) जैसे मेसेंचिमल मार्कर को अनुपचारित कोशिकाओं(चित्रा 5C)की तुलना में एनएमएमजी कोशिकाओं में टीजीएफ-β उत्तेजना के बाद स्पष्ट रूप से बढ़ाया गया था। एनएमएमजी कोशिकाओं में टीजीएफ-β-प्रेरित ईएमटी को ई-कैडेरिन के इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग द्वारा आगे की पुष्टि की गई थी। 2 दिनों के लिए टीजीएफ-β उत्तेजना पर, एनएमएमजी कोशिकाओं ने असं प्रेरित नियंत्रण समूह में कोशिकाओं की तुलना में कम ई-कैडेरिन व्यक्त किया, जैसा कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी(चित्रा 5D)द्वारा विश्लेषण किया गया है। इसके अलावा, टीजीएफ-β की उपस्थिति में एनएमएमजी की कोशिकाओं ने अधिक ऐक्टिन स्ट्रेस फाइबर बनाए, जैसा कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी(चित्रा 5E)द्वारा दिखाया गया है।

SB431542 और GW788388 टीजीएफ-β सिग्नलिंग और टीजीएफ-β-प्रेरित ईएमटी को रोकते हैं
SB431542 TοRI के kinase डोमेन का एक एटीपी प्रतिस्पर्धी अवरोधक है, जिसे एक्टिविन रिसेप्टर-जैसे किनेज़ 5 (ALK5) भी कहा जाता है, जबकि GW788388 TοRI और TοRII kinase गतिविधि को रोकता है। दोनों अवरोधक टीजीएफ-β रिसेप्टर सिग्नलिंग४०को रोक सकते हैं । इस प्रकार, हमने 1 घंटे के लिए टीजीएफ-β की उपस्थिति में GW788388 की विभिन्न सांद्रता के साथ एनएमएमजी कोशिकाओं का इलाज किया। जैसा कि उम्मीद थी, GW788388 ने खुराक-निर्भर तरीके(चित्रा 6A)में टीजीएफ-β-प्रेरित SMAD2 फॉस्फोरिलेशन को बाधित किया। इसके अतिरिक्त, SMAD2 के टीजीएफ-β-मध्यस्थता फॉस्फोरिलेशन को SB431542 उपचार(चित्रा 6A)द्वारा अवरुद्ध कर दिया गया था। फॉस्फोरिलेटेड SMAD2/3 SMAD4 के साथ एक विषममिक परिसर बनाता है और लक्ष्य जीन के प्रतिलेखन को संशोधित करने के लिए नाभिक में स्थानांतरित करता है। इसलिए, हमने SMAD2/3 के इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग द्वारा एनएमएमजी कोशिकाओं में SMAD2/3 के स्थानांतरण की जांच की । आंकड़ों से पता चला है कि SB431542 और GW788388 दोनों ने टीजीएफ-β-प्रेरित परमाणु स्थानांतरण और एनएमएमजी कोशिकाओं(चित्रा 6B)में SMAD2/3 के संचय को काफी बाधित किया । इसके अलावा, SB431542 और GW788388 के निरोधात्मक प्रभाव भी महत्वपूर्ण TGF-β लक्ष्य ईएमटी में शामिल जीन के mRNA अभिव्यक्ति के स्तर में देखा गया, पाई-1, घोंघा, ई-cadherin और फाइब्रोनेक्टिन (चित्रा 6C)सहित । इन आंकड़ों में सुझाव दिया गया कि SB431542 और GW788388 ने टीजीएफ-β सिग्नलिंग और टीजीएफ-β-प्रेरित ईएमटी को अवरुद्ध कर दिया ।

एडिपोसाइट्स में मेसेंचिमल स्तन कैंसर कोशिकाओं के अंतर-अंतर का विश्लेषण
ईएमटी कैंसर में सेलुलर प्लास्टिसिटी को बढ़ाने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और चिकित्सा प्रतिरोध के विकास में परिणाम देता है। कैंसर सेल प्लास्टिसिटी को सीधे लक्षित किया जा सकता है और ट्रांस-विभेदन दृष्टिकोण के साथ बाधित किया जा सकता है, जैसे कि जबरन एडिपोजेनेसिस30। हमने Py2T मुरीन स्तन कैंसर कोशिकाओं का उपयोग किया, जो ईएमटी-प्रेरित कैंसर सेल प्लास्टिसिटी के सेलुलर मॉडल के रूप में माउस मैमेरी ट्यूमर वायरस-पॉलीओमा मिडिल ट्यूमर-एंटीजन (एमएमटीवी-पाइएमटी) ट्रांसजेनिक माउस की स्तन ग्रंथि से प्राप्त हुए थे। एक स्थापित प्रोटोकॉल41के आधार पर, हमने एडीपोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए 10 दिनों के लिए एंटी-डायबिटिक दवा रोसिग्लिटाजोन के साथ ईएमटी-व्युत्पन्न Py2T मुरीन स्तन कैंसर कोशिकाओं का इलाज किया। आदिपोजेनेसिस का आकलन तेल लाल ओ धुंधला का उपयोग करके लिपिड बूंदों की कल्पना करके किया गया था। रोसिग्लिटाजोन-इलाज Py2T मुरीन स्तन कैंसर कोशिकाओं(चित्रा 7)में वसा कोशिकाओं को आसानी से पाया गया, जिसने यह दर्शाया कि अकेले रोसिग्लिटाजोन के साथ उपचार एडीपोसाइट्स में ईएमटी-व्युत्पन्न स्तन कैंसर कोशिकाओं के अंतर को बढ़ावा देने के लिए पर्याप्त है।

Figure 1
चित्रा 1: TGF-β/SMAD सिग्नलिंग । टीजीएफ-β सिग्नलिंग टीजीएफ-β के बाध्यकारी के साथ टीजीएफ-β प्रकार II रिसेप्टर (TοRII), एक संविलियन सक्रिय किनेज़ के लिए शुरू होता है, जो फॉस्फोरलेट टीजीएफ-β प्रकार मैं रिसेप्टर (TοRI) करता है। फिर, सक्रिय TοRI kinase फॉस्फोरलेट SMAD2/3। दो कार्बक्सी टर्मिनल फॉस्फोरिलेटेड सेरिन अवशेषों के साथ SMAD2 के एसएसएक्सएस आकृति युक्त पेप्टाइड का उपयोग फॉस्फोर-SMAD2 (p-SMAD2) को पहचानने वाले पॉलीक्लोनल एंटीसेरा प्राप्त करने के लिए किया गया था। इसलिए, पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा पी-SMAD2 अभिव्यक्ति के विश्लेषण का उपयोग टीजीएफ-β सिग्नलिंग मार्ग की सक्रियता निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। फॉस्फोरिलेटेड SMAD2/3 SMAD4 के साथ हेट्रोमेरिक कॉम्प्लेक्स बना सकता है, जो तब ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रियाओं को मिलाना करने के लिए नाभिक में स्थानांतरित हो जाता है। सीएजीए12-लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर परख और मात्रात्मक रियल टाइम पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) टीजीएफ-β लक्ष्य जीन जैसे SMAD7 और SERPINE1 (एन्कोडिंग पाई-1 प्रोटीन) की एमआरएनए अभिव्यक्ति के लिए, टीजीएफ-β-प्रेरित SMAD3-निर्भर ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: आर-SMADs (SMAD2 और SMAD3) की योजनाबद्ध संरचना । MH1 (ब्लू) और MH2 (पीला) डोमेन आर-SMADs के बीच संरक्षित कर रहे हैं, लेकिन लिंकर क्षेत्र (ग्रे) संरक्षित नहीं है । SMAD3 के MH1 डोमेन एक डीएनए बाध्यकारी आकृति बंदरगाहों, जबकि SMAD2 सीधे डीएनए बांध नहीं कर सकते, क्योंकि एक प्रविष्टि (exon 3) अपने MH1 डोमेन में । MH2 डोमेन SMAD अल्पाधिकार, TGF-β रिसेप्टर्स के साथ बातचीत, और प्रोटीन बाध्यकारी मध्यस्थता और प्रतिलेखन विनियमन में शामिल है मध्यस्थता । SMAD2 और SMAD3 को उनकी सी टर्मिनी में एसएसएक्सएस आकृति (लाल रंग में) के फॉस्फोरिलेशन द्वारा सक्रिय किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: TGF-β-प्रेरित EMT । टीजीएफ-β-प्रेरित एपिथेलियल-मेसेन्चिमल ट्रांजिशन (ईएमटी) के दौरान, कोशिकाओं को बढ़ी हुई कोशिका गतिशीलता और आक्रमण क्षमता के साथ मेसेंचिमल विशेषताओं के एपिथेलियल और अधिग्रहण की हानि से गुजरना पड़ता है। ईएमटी के शामिल होने से एन-कैडेरिन, जेब2 और घोंघे 1/2 जैसे मेसेंचिमल मार्कर की अभिव्यक्ति होती है, साथ ही ई-कैडेरिन, β-कैटेनिन और क्लाउडिन-1 सहित एपिथेलियल मार्कर की डाउनरेगुलेशन भी होती है । एपिथेलियल/मेसेंचिमल (ई/एम) विशेषताओं के संचित नुकसान या लाभ के कारण एक कोशिका को मध्यवर्ती राज्यों में प्रतिवर्ती तरीके से प्रवेश करना पड़ता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: TGF-β MCF10A-रास कोशिकाओं में प्रतिक्रियाओं का संकेत । (A)MCF10A-Ras कोशिकाओं के साथ या तो 1 घंटे के लिए TGF-β (२.५ एनजी/एमएल) के बिना इलाज किया गया, और सेल lysates फॉस्फोरिलेटेड SMAD2 (पी-SMAD2), कुल SMAD2/3 और GAPDH (एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में) के लिए इम्यूनोब्लोटेड थे । आकार मार्कर दाईं ओर दिखाया गया है। कांग्रेस: TGF-β उपचार के बिना नियंत्रण समूह । (ख)MCF10A-Ras कोशिकाओं में SMAD3-SMAD4-निर्भर CAGA 12-लूसिफेरेज (ल्यूक) ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टर का उपयोग करते हुए टीजीएफ-β(5एनजी/एमएल) गतिविधि का विश्लेषण । मानों को β-गैलेक्टोसिडेस (1Gal) गतिविधि के लिए सामान्यीकृत किया जाता है। डेटा का मतलब ± एस डी, एन = 3 के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । छात्र का टी टेस्ट, ****P ≤ 0.001(C)क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण TGF-β लक्ष्य जीन SMAD7 और SERPINE1 (PAI-1 प्रोटीन encoding) MCF10A-रास कोशिकाओं में 6 घंटे के लिए TGF-β (२.५ एनजी/एमएलएएल) के साथ इलाज किया । गप्पध का उपयोग आंतरिक नियंत्रण के रूप में किया जाता था। डेटा का मतलब ± एस डी, एन = 3 के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । छात्र की टी परीक्षा, ***P ≤ 0.001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: एनएमएमजी कोशिकाओं में टीजीएफ-β-प्रेरित ईएमटी। (A)एनएमएमजी कोशिकाओं की आकृति विज्ञान 1 या 2 दिनों के लिए टीजीएफ-β (2.5 एनजी/एमएल) के साथ इलाज किया जाता है। टीजीएफ-β की उपस्थिति में, एनएमएमजी कोशिकाओं को एक मेसेंचिमल फेनोटाइप में स्थानांतरित कर दिया गया। स्केल बार = 150 माइक्रोन(बी)एनएमएमजी कोशिकाओं के साथ या 2 दिनों के लिए TGF-β (5 एनजी/एमएल) के बिना इलाज किया गया, और EMT मार्कर पश्चिमी दाग द्वारा विश्लेषण किया गया । आकार मार्कर के रूप में सही पर संकेत दिया है। कांग्रेस: TGF-β उपचार के बिना नियंत्रण समूह । (C)एनएमटीएमजी कोशिकाओं में ईएमटी मार्कर(सीडीएच1 (ई-कैडेरिन प्रोटीन),घोंघा और जेब2 का जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण टीजीएफ-β (5 एनजी/एमएल) के साथ 2 दिनों के लिए इलाज किया जाता है । गप्पध का उपयोग आंतरिक नियंत्रण के रूप में किया जाता था। परिणाम ± डी, एन = 3 के मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । छात्र का टी-टेस्ट, * पी ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ****P ≤ 0.001। (घ)एनएमएमजी कोशिकाओं को 2 दिनों के लिए टीजीएफ-β (२.५ एनजी/एमएल) उपचार के बाद एपिथेलियल मार्कर ई-कैडेरिन (लाल) की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस से दाग दिया गया था । नाभिक DAPI (नीला) के साथ जवाबी दाग थे । छवियों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ कैप्चर किया गया था। स्केल बार = 50 माइक्रोन(ई)एनएमएमजी कोशिकाओं को एफ-ऐक्टिन की कल्पना करने के लिए फ्लोरोसेइन-फ्लामोइडिन (ग्रीन) से दाग दिया गया था। नाभिक DAPI (नीला) के साथ जवाबी दाग थे । स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: TGF-1ignaling और TGF-β प्रेरित EMT SB431542 और GW788388 द्वारा बाधित किया गया । (क)एनएमएमजी कोशिकाओं का इलाज 1 घंटे के लिए टीजीएफ-β (5 एनजी/एमएल) की उपस्थिति या अनुपस्थिति में 10 माइक्रोन एसबी 431542 (एसबी) या जीडब्ल्यू 788388 (जीडब्ल्यू) की संकेत सांद्रता के साथ किया गया । पी-एस्मा 2, SMAD2/3 और GAPDH के लिए सेल lysotted थे । (ख)एनएमएमजी कोशिकाओं का इलाज SB431542 (एसबी) के 5 माइक्रोनएम या जीडब्ल्यू 788388 (जीडब्ल्यू) के 10 माइक्रोन के साथ 1 घंटे के लिए टीजीएफ-β के 5 एनजी/एमएल की उपस्थिति या अनुपस्थिति में किया गया और SMAD2/3 (ग्रीन) के परमाणु स्थानांतरण का पता लगाने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस से दाग दिया गया । छवियों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ कैप्चर किया गया था। (C)टीजीएफ-β लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति, जिसमें पीएई-1 और जीन एन्कोडिंग ईएमटी मार्कर शामिल हैं, जिनमें घोंघा, ई-कैडेरिन और फाइब्रोनेक्टिन शामिल हैं, का विश्लेषण एसबी या जीडब्ल्यू उपचार और टीजीएफ-β उत्तेजना के बाद एनएमएमजी कोशिकाओं में रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर) द्वारा ४८ घंटे के लिए किया गया था । गप्प एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में कार्य करता था। नियंत्रण गैर-उपचारित कोशिकाओं को दर्शाता है। इस आंकड़े को पीटरसन एम एट अलसे संशोधित किया गया है । 34 प्रकाशक से अनुमति के साथ. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: ईएमटी-व्युत्पन्न Py2T मुरीन स्तन कैंसर कोशिकाओं को adipocytes में अंतर करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है। Py2T murine स्तन कैंसर कोशिकाओं को पूरा EMT प्रेरित करने के लिए 20 दिनों के लिए 2 एनजी/एमएल TGF-β के साथ उत्तेजित किया गया । फिर, कोशिकाओं को या तो डीएमएसओ के साथ वाहन नियंत्रण या रोसिग्लिटाजोन (2 माइक्रोन) के साथ 10 दिनों के लिए इलाज किया गया ताकि मेसेंकिमल कैंसर कोशिकाओं के भेदभाव की अनुमति दी जा सके और एडिपोजेनेसिस को प्रेरित किया जा सके। हर 2 दिन में माध्यम बदला जाता था। उपचार के 10 दिनों के बाद, कोशिकाओं तेल लाल ओ स्केल बार = 50 μm के साथ दाग रहे थे. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

प्रजातियां जीन नाम फॉरवर्ड (5' से 3') रिवर्स (5' से 3 ')
मनुष्‍य गप्पे TGCACCACCAACTACTGCTTAGTAGC GGCATGGACTGTGGCATCATGG
SMAD7 टीसीसीएजीजीसीटीजीटीसीटीसीटीटीसीटीसीटीसीसी जीटीसीसीगेटगैक्टटीजीसीसीजी
SERPINE1 CACAAATCAGACGGCAGCACT CATCGGGCGTGGGAACTC
माउस गप्पे TGGCAAAGTAGATTTTTTGCC AAGATGGGATGATGGGCTTCCCCCG
सीडीएच1 ACCAAAGTGACGCTGAAGTC GAGGATGTACTTGGCAATGG
घोंघा CAGCTGGCCAGGCTCTCGGT GCGAGGGCCCCCCCCGGAGCA
जेब2 टीटीसीटीसीसीसीसीटीसीटीजीजीटीसीजीटीसीटीजीसीसी टीटीटीसीजीजीसीसीएटकैटकैट

तालिका 1: क्यूआरटी-पीसीआर के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर।

Discussion

TGF-β/SMAD सिग्नलिंग स्तन कैंसर की प्रगति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, क्योंकि यह EMT7उत्प्रेरण द्वारा स्तन कैंसर सेल आक्रामकता और मेटास्टेसिस को बढ़ावा दे सकता है । यहां, हमने रिसेप्टर-प्रेरित SMAD सक्रियण से SMAD-मध्यस्थता प्रतिलेखन और जैविक प्रतिक्रियाओं के लिए TGF-β-शुरू किए गए सिग्नलिंग की जांच करने के लिए एक तार्किक कार्यप्रवाह का वर्णन किया। हम SMAD2 फॉस्फोरिलेशन के विश्लेषण का वर्णन करके शुरू किया, TGF के साथ जारी-β-प्रेरित SMAD3-निर्भर ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रियाओं और दोनों जीन और प्रोटीन के स्तर पर EMT मार्कर अभिव्यक्ति के लिए TGF-β/SMAD संकेत प्रतिक्रिया का विश्लेषण, और अंत में TGF-β प्रेरित EMT की जांच की । हमने टीजीएफ-β/SMAD सिग्नलिंग पाथवे३५की गतिविधि की निगरानी के लिए, पाई-1 प्रमोटर से प्राप्त सीएजीए बक्से वाले CAGA 12-लूसिफ़ेरेस ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टर का इस्तेमाल किया । इस रिपोर्टर निर्माण सक्रियण के लिए SMAD3 और SMAD4 की आवश्यकता है । पिछले अध्ययनों से पता चला है कि SMAD4 तनु TGF-β प्रेरित CAGA 12-लूसिफ़ेरेस गतिविधि३७के नॉकआउट । रिपोर्टर परख के अलावा, SMAD2 और SMAD3 सहित अंतर्जात SMADs के फॉस्फोरिलेशन स्थिति का निर्धारण, TGF-β संकेत प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए एक और तरीका है । दरअसल, टीजीएफ-β परिवार के अन्य सदस्य, जैसे विकास और विभेदन कारक (जीडीएफ)-8/मायोस्टैटिन और जीडीएफ-9, टीआरआई42, 43, 44को उलझाने के द्वारा SMAD2/3 प्रोटीन के माध्यम से संकेतों को भी स्थानांतरित करतेहैं। सीएजीए 12-लूसिफेरेज रिपोर्टर के अलावा टीजीएफ-β सिग्नलिंग की सक्रियता का पता लगाने के लिए ऐसे ही कई रिपोर्टर्स का इस्तेमाल किया गया है । उदाहरण के लिए, जुंबे प्रमोटर से प्राप्त प्रतिक्रिया तत्वों के साथ एक ट्रांसक्रिप्शनल (एसबीई)4-लक्स रिपोर्टर को टीजीएफ-β, एक्टिविन और बीएमपीएस45द्वारा कुशलतापूर्वक प्रेरित किया जा सकता है।

पश्चिमी ब्लॉटिंग और क्यूपीसीआर का उपयोग टीजीएफ-β-प्रेरित ईएमटी का विश्लेषण करने के लिए किया गया था, जो एपिथेलियल मार्कर (यानी ई-कैडेरिन) और मेसेंचिमल मार्कर (यानी, एन-कैडेरिन, घोंघा, स्लग और जेब2) की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए क्लासिक तरीके हैं। हमने ई-कैडेरिन के अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग और एफ-ऐक्टिन के प्रत्यक्ष फ्लोरेसेंस स्टेनिंग का भी प्रदर्शन किया। इन परख ने टीजीएफ-β उपचार के बाद कोशिकाओं के मेसेन्चिमल फेनोटाइप को और मान्य किया। इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला की सीमा यह है कि कोशिकाओं को एंटीबॉडी और इमेजिंग के साथ इनक्यूबेशन से पहले तय करने की जरूरत है, और यह जीवित कोशिकाओं में EMT मार्कर अभिव्यक्ति में परिवर्तन की जांच करने के लिए मुश्किल है । हाल ही में, EMT रिपोर्टर सेल लाइनों के डिजाइन, जैसे A549 फेफड़े adenocarcinoma-vimentin-RFP, यह संभव लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (RFP) टैग vimentin की अभिव्यक्ति के माध्यम से वास्तविक समय में mesenchymal कोशिकाओं के लिए epithelial कोशिकाओं के परिवर्तन की निगरानी करने के लिए बनाया गया है । इस मंच का उपयोग दवा स्क्रीनिंग और नई दवा विकास46के लिए किया जा सकता है। लाइफएक्ट डाई, एक 17-अमीनो-एसिड पेप्टाइड, जो जीवित कोशिकाओं में एफ-ऐक्टिन संरचनाओं को दाग सकता है, सेलुलर प्रक्रियाओं47के साथ हस्तक्षेप किए बिना वास्तविक समय में ऐक्टिन साइटोस्केलेटन की कल्पना करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण बनता जा रहा है। इस अध्ययन में, हमने टीजीएफ-β सिग्नलिंग और टीजीएफ-β-प्रेरित ईएमटी पर उनके निरोधात्मक प्रभाव को मान्य करने के लिए दो छोटे अणु अवरोधकों, SB431542 और GW788388 का उपयोग किया। विशेष रूप से, GW788388 शक्तिशाली T <3>RI और TοRII गतिविधि को रोकता है, जबकि SB431542 केवल TοRI (और ALK4 और ALK7) पर एक निरोधात्मक प्रभाव पड़ता है । पिछले अध्ययनों से पता चला है कि GW788388 SB43154240की तुलना में वीवो में अधिक शक्तिशाली है। ईएमटी के अवरोध के अलावा, GW788388 ने गुर्दे में फाइब्रोसिस मार्कर की अभिव्यक्ति को कम कर दिया, और मधुमेह चूहों में GW788388 के मौखिक प्रशासन ने स्पष्ट रूप से ग्लोमेर्यूलोपैथी25,48में कमी की।

ईएमटी कैंसर सेल प्लास्टिसिटी को बढ़ावा देने में एक आवश्यक भूमिका निभाता है और दवा प्रतिरोध और मेटास्टेसिस 49में परिणाम देता है। इसलिए, विशिष्ट साइटोटॉक्सिक दवाओं50 के साथ ईएमटी-व्युत्पन्न कोशिकाओं को लक्षित करना या मेसेंचिमल-टू-एपिथेलियल ट्रांजिशन (एमईटी)51 के माध्यम से पुनर्संरुतीकरण को कैंसर सेल मेटास्टेसिस और चिकित्सा प्रतिरोध को दूर करने के लिए एक दृष्टिकोण के रूप में प्रस्तावित किया गया है। हालांकि, मेट दूर के अंगों52में प्रसारित कैंसर कोशिकाओं के प्रसार में योगदान देता है, जो ईएमटी के चिकित्सीय प्रतिवर्तन का उपयोग करते समय उल्टा हो सकता है। हाल ही में, एक नए अध्ययन ने सीधे एडीपोसाइट्स30में भेदभाव के लिए EMT-व्युत्पन्न स्तन कैंसर कोशिकाओं को लक्षित करके एक चिकित्सीय अंतरव्यवहार दृष्टिकोण की सूचना दी । इशाय-रोने एट की पढ़ाई । अल.30 ने Py2T मुरीन एपिथेलियल कैंसर कोशिकाओं का उपयोग किया जो टीजीएफ-β के साथ दीर्घकालिक उपचार के जवाब में मेसेंचिमल कोशिकाओं में संक्रमण से गुजरा था। उन्होंने दिखा दिया कि एमईके अवरोधकों के संयोजन में रोसिग्लिटाज़ोन ने एपिथेलियल भेदभाव और एडिपोजेनेसिस को बढ़ाया। हालांकि, हमने पाया कि अकेले रोसिग्लिटाज़ोन मेसेंचिमल पाइ2टी मुरीन कोशिकाओं के अंतर को एडीपोसाइट्स में प्रेरित करने के लिए पर्याप्त था।

संक्षेप में, इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले तरीकों ने टीजीएफ-β सिग्नलिंग और टीजीएफ-β-प्रेरित ईएमटी की जांच करने के लिए एक तार्किक कार्यप्रवाह प्रदान किया। दो अवरोधक, SB431542 और GW788388, टीजीएफ-β-प्रेरित प्रतिक्रियाओं और EMT को ब्लॉक कर सकते हैं । इसके अलावा, हमने अकेले रोसिग्लिटाज़ोन का भी प्रदर्शन किया, जो कुछ टीजीएफ-β-प्रेरित मेसेन्चिमल स्तन कैंसर कोशिकाओं में एडिपोजेनेसिस को प्रेरित करता है। हालांकि हम केवल कई स्तन कैंसर सेल लाइनों का इस्तेमाल किया TGF β प्रतिक्रियाओं की जांच, यहां वर्णित तरीकों अंय (कैंसर) कोशिकाओं को एक्सपेरिमेंट किया जा सकता है । यहां, हमने सेलुलर प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने के लिए विभिन्न टीजीएफ-β सांद्रता का उपयोग किया। अधिकांश सेल प्रकारों में, टीजीएफ-β 0.01-10 एनजी/एमएल53 की एकाग्रता सीमा में अपनी जैविक गतिविधि डालती है और खुराक-प्रतिक्रिया पैटर्न में सिग्नलिंग लाती है। प्राथमिक एंडोथेलियल कोशिकाओं में, गोजातीय महाधमनी एंडोथेलियल कोशिकाओं सहित, टीजीएफ-β ने 0.025 एनजी/एमएल पर फॉस्फोरलेटेड SMAD2 की पर्याप्त अभिव्यक्ति को प्रेरित किया, 0.25 एनजी/एमएल पर अधिकतम पहुंच गया, और उच्च सांद्रता53के जवाब में इस स्तर पर बने रहे। हमारे अध्ययन में, हमने मजबूत प्रतिक्रियाएं प्राप्त करने के लिए ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टर परख के लिए MCF10A-Ras कोशिकाओं में TGF-β (5 एनजी/एमएल) की उच्च एकाग्रता का उपयोग किया। SMAD2 फॉस्फोरिलेशन और लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति को कम खुराक पर टीजीएफ-β द्वारा प्रेरित किया जा सकता है; इस प्रकार, हमने कोशिकाओं के इलाज के लिए 2.5 एनजी/एमएल टीजीएफ-β का उपयोग किया। हालांकि, सबसे उपयुक्त काम एकाग्रता सेल प्रकार और अनुमानित प्रभावों पर निर्भर करती है। टीजीएफ-β की सबसे अच्छी एकाग्रता निर्धारित करने के लिए, विभिन्न खुराक (कम से उच्च) कोशिकाओं का इलाज करने की सिफारिश की जाती है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम जे. जेड. और कैंसर जीनोमिक्स सेंटर नीदरलैंड (CGC) के लिए चीनी छात्रवृत्ति परिषद (सीएससी) के समर्थन को स्वीकार करते हैं । एनएल) से पीटी डी

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
18 mm-side square glass coverslips Menzel Gläser 631-1331
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Vector Laboratories H-1200
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Alexa Fluor 555 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21422
Anti-E-cadherin antibody BD Biosciences 610181
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) antibody Merck Millipore MAB374
Anti-N-cadherin antibody BD Biosciences 610920
Anti-Slug antibody Cell Signaling Technology 9585
anti-SMAD2/3 antibody Becton Dickinson 610842
Anti-Snail antibody Cell Signaling Technology 3879
Anti-Tubulin antibody Cell Signaling Technology 2148
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2058
Cholera enterotoxin Sigma-Aldrich C8052
Clarity Western ECL Substrate Bio-Rad 1705060
DC protein assay kit Bio-Rad 5000111
DMEM-high glucose Thermo Fisher Scientific 11965092
DMEM-high glucose medium Thermo Fisher Scientific 11965092
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)/F12 Thermo Fisher Scientific 11039047
epidermal growth factor (EGF) Merck Millipore 01-107
Fetal bovine serum (FBS) BioWest S1860-500
GoTaq qPCR Master Mix PROMEGA A600X
Horse serum Thermo Fisher Scientific 26050088
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0135
Insulin Sigma-Aldrich 91077C
Mini Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836153001
NucleoSpin RNA II kit BIOKE´ 740955
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) Thermo Fisher Scientific 15140148
Polyethylenimine (PEI) Polyscience 23966
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Merck Millipore IPVH00010
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Fisher Scientific K1621
Rosiglitazone Sigma-Aldrich 557366-M
Skimmed milk Campina: Elk
Equipment
ChemiDoc Imaging System Bio-Rad 17001402
CFX Connect Detection System Bio-Rad 1855201
Luminometer Perkin Elmer 2030-0050
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND-2000

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कैंसर रिसर्च अंक 164 विकास कारक-β को बदलना एपिथेलियल-टू-मेसेनचिमल संक्रमण स्तन कैंसर पश्चिमी ब्लॉटिंग ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टर इम्यूनोफ्लोरेसेंस अवरोधक एडिपोजेनेसिस

Erratum

Formal Correction: Erratum: Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells
Posted by JoVE Editors on 12/15/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells. NMuMG was mislabeled as cancer cells.

NMuMG cells are non-transformed epithelial breast cells established from a mouse mammary gland. NMuMG cells are frequently used as a model system to investigate TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition (EMT). EMT is induced by TGF-β in premalignant human MCF 10A-RAS (M2) cells and mouse MMTV-PyMT breast cancer cell line. The article has been updated to reflect this.

स्तन कैंसर और सामान्य कोशिकाओं में टीजीएफ-β सिग्नलिंग और टीजीएफ-β-प्रेरित एपिथेलियल-टू-मेसेन्चिमल संक्रमण का अध्ययन
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Zhang, J., Thorikay, M., van der… More

Zhang, J., Thorikay, M., van der Zon, G., van Dinther, M., ten Dijke, P. Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells. J. Vis. Exp. (164), e61830, doi:10.3791/61830 (2020).

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