Summary
Hier bieden we een gedetailleerd, stapsgewijs protocol voor CRISPR/ Cas9-gebaseerde genoomengineering van primaire menselijke B-cellen voor gen knock-out (KO) en knock-in (KI) om biologische functies van genen in B-cellen en de ontwikkeling van B-celtherapieën te bestuderen.
Abstract
B-cellen zijn lymfocyten afgeleid van hematopoëtische stamcellen en zijn een belangrijk onderdeel van de humorale arm van het adaptieve immuunsysteem. Ze zijn aantrekkelijke kandidaten voor celgebaseerde therapieën vanwege hun gemak van isolatie van perifeer bloed, hun vermogen om in vitro uit te breiden en hun lange levensduur in vivo. Bovendien kan hun normale biologische functie - om grote hoeveelheden antilichamen te produceren - worden gebruikt om zeer grote hoeveelheden van een therapeutisch eiwit uit te drukken, zoals een recombinant antilichaam om infectie te bestrijden, of een enzym voor de behandeling van enzymopathieën. Hier bieden we gedetailleerde methoden voor het isoleren van primaire menselijke B-cellen van perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) en het activeren / uitbreiden van geïsoleerde B-cellen in vitro. Vervolgens demonstreren we de stappen die nodig zijn bij het gebruik van het CRISPR/Cas9-systeem voor site-specifieke KO van endogene genen in B-cellen. Deze methode maakt efficiënte KO van verschillende genen mogelijk, die kunnen worden gebruikt om de biologische functies van genen van belang te bestuderen. Vervolgens demonstreren we de stappen voor het gebruik van het CRISPR/Cas9-systeem samen met een recombinant, adeno-geassocieerde, virale (rAAV) vector voor een efficiënte site-specifieke integratie van een transgene expressiecassette in B-cellen. Samen biedt dit protocol een stapsgewijs engineeringplatform dat kan worden gebruikt in primaire menselijke B-cellen om biologische functies van genen te bestuderen en voor de ontwikkeling van B-celtherapieën.
Introduction
B-cellen zijn een subgroep van de lymfocytlijn afgeleid van hematopoëtische stamcellen. Ze vervullen een cruciale rol in het adaptieve humorale immuunsysteem door grote hoeveelheden antilichamen te produceren als reactie op immuunuitdagingen1. B-cellen zijn ook voorlopers van geheugen B-cellen en de terminaal gedifferentieerde, langlevende plasmacellen, waardoor blijvende humorale immuniteit wordt geboden2. Met name plasmacellen zijn uniek onder immuuncellen in hun vermogen om grote hoeveelheden van een specifiek antilichaam te produceren terwijl ze jaren of decennia overleven3. Bovendien maakt het gemak van isolatie van perifeer bloed de B-cel afstamming een uitstekende kandidaat voor nieuwe celgebaseerde therapieën4.
Voorheen werden willekeurige integratiemethoden, zoals die met lentivirale vectoren of een Doornroosje transposon, gebruikt om B-cellen te engineeren voor transgene levering en expressie5,6,7,8. De niet-specifieke aard van deze benaderingen maakt het echter moeilijk om de biologische functies van een specifiek gen in de B-cellen te bestuderen en brengt een inherent risico met zich mee van insertie mutagenese en variabele transgene expressie en/of demping in de therapeutische setting.
Het CRISPR/Cas9-systeem is een krachtig genoomtechnologietool waarmee onderzoekers het genoom van verschillende cellen in tal van soorten nauwkeurig kunnen bewerken. Onlangs hebben twee groepen, waaronder de onze, met succes methoden ontwikkeld voor ex vivo-expansie en gerichte genoomengineering van primaire menselijke B-cellen9,10. We zullen het proces beschrijven van het zuiveren van primaire menselijke B-cellen uit een leukafoormonster. Daarna beschrijven we ons bijgewerkte protocol voor B-celexpansie en activering van geïsoleerde B-cellen. We zullen dan een proces beschrijven voor het uitschakelen van cluster van differentiatie 19 (CD19), een specifieke B-celreceptor en een kenmerk van B-cellen, door elektroporatie om CRISPR / Cas9 mRNA samen met CD19 sgRNA in geactiveerde B-cellen te introduceren.
Cas9 mRNA wordt vertaald en bindt aan de CD19 sgRNA om een CRISPR/Cas9-sgRNA ribonucleoproteïne complex (RNP) te vormen. Vervolgens leidt sgRNA in het complex Cas9 tot het creëren van double-strand break (DSB) bij de doelsequentie op exon 2 van het gen. De cellen zullen de DSB herstellen door "niet-homologe eindvoeging" door nucleotiden in te voeren of te verwijderen, wat leidt tot frameshift-mutatie en ervoor zorgt dat het gen wordt uitgeschakeld. Vervolgens meten we het verlies van CD19 door flowcytometrie en analyseren we de vorming van indels door het volgen van indels door decompositie (TIDE) analyse.
Vervolgens beschrijven we het proces van het gebruik van CRISPR/Cas9 samen met een recombinante AAV6-vector (rAAV6, een donorsjabloon voor homologie-gerichte reparatie (HDR)) om sitespecifieke invoeging van verbeterd groen fluorescerend eiwit(EGFP) te bemiddelen bij het adeno-geassocieerde virusintegratiesite 1 (AAVS1) gen. Het AAVS1-gen is een actieve locus zonder bekende biologische functies en een AAV virale integratieplaats op het menselijk genoom; daarom wordt het beschouwd als een "veilige haven" voor genoomtechniek. Hier melden we dat uitbreiding en activering van B-cellen tot 44-voudige expansie in 7 dagen cultuur mogelijk maakte (figuur 1). Elektroporatie van B-cellen vertoonde een lichte vermindering van de algehele celgezondheid (figuur 2A) na transfectie van 24 uur. De spreidingsplotanalyse van de CD19-markering (figuur 2B) liet tot 83% vermindering van de bewerkte cellen zien (figuur 2C).
Tide-analyse van de chromatografen (figuur 3A) toonde aan dat de % indels vergelijkbaar was met het % eiwitverlies door flowcytometrie (figuur 3B). Flowcytometrie-analyse van het KI-experiment toonde aan dat de cellen die een AAV-vector kregen (figuur 4), samen met RNP, tot 64% EGFP-positieve cellen (figuur 5A) uitdrukten en later een succesvolle integratie vertoonden door junction polymerasekettingreactie (PCR) (Figuur 5B). Celtellingen toonden aan dat alle monsters snel herstelden binnen 3 dagen na de engineering (Figuur 5C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Leukaferesemonsters van gezonde donoren werden verkregen van een lokale bloedbank. Alle hier beschreven experimenten werden vrijgesteld voor onderzoek door de Institutional Review Board (IRB) en werden goedgekeurd door het Institutional Biosafety Committee (IBC) van de Universiteit van Minnesota.
OPMERKING: Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de universele voorzorgsmaatregel voor door bloed overgedragen pathogenen, met steriele/aseptische technieken en de juiste bioveiligheidsniveau-2-apparatuur.
1. Bereid supplementen voor B-cel expansiemedium
- Reconstitueer cpg oligonucleotide tot een concentratie van 1 mg/ml.
- Reconstitueer CD40 ligand (CD40L) tot een concentratie van 100 μg/ml.
- Reconstitueer recombinant humaan IL-10 (rhIL-10) tot een concentratie van 50 μg/ml.
- Reconstitueer recombinant humaan IL-15 (rhIL-15) tot een concentratie van 10 μg/ml.
OPMERKING: Bewaar elk supplement in kleine aliquots bij -20 °C tot -80 °C gedurende maximaal 6 maanden.
2. Bereid basaal medium voor
- Combineer B-cel basaal medium met 5% (v/v) media supplement voor in vitro immuuncel expansie (bijv. CTS Immune Cell SR) en 1% (v/v) penicilline en streptomycine.
- Fililiseer het basale medium met een filteradapter van 0,22 μm in een gesteriliseerde fles.
- Houd het basale medium maximaal 1 maand op 4 °C.
3. Bereid B-cel expansiemedium voor
- Breng de vereiste hoeveelheid van het basale medium over in een steriele container om de B-cellen op 5 × 105 cellen/ml te laten groeien.
- Vul het basale medium aan met 1 μg/ml CpG, 100 ng/ml CD40L, 50 ng/ml rhIL-10 en 10 ng/ml rhIL-15.
- Filter het B-cel expansiemedium met een filter van 0,22 μm.
- Equilibreert het B-cel expansiemedium in de weefselkweek incubator bij 37 °C, 5% CO2 met vochtigheid gedurende ten minste 30 minuten voor gebruik.
OPMERKING: Bereid het nieuwe B-cel expansiemedium voor om één dag te gebruiken. Bereid het B-cel expansiemedium niet voor op gebruik gedurende meerdere dagen. Dit mediarecept stimuleert de proliferatie van geheugen B-cellen en geactiveerde primaire menselijke B-cellen.
4. Menselijke B-cel zuivering en expansie
OPMERKING: Voeg 99-100% isopropylalcohol toe aan een temperatuurgecontroleerde vriescontainer, volgens de instructies van de fabrikant, en koel de vriescontainer op 4 °C voordat u met stap 4.1 begint.
- PBMC's isoleren uit een leukafoormonster
- Breng een leukaforesemonster (ongeveer 8-10 ml) over in een steriele conische buis van 50 ml.
- Breng het volume op 35 ml met steriele 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Leg een leukafoormonster van 35 ml voorzichtig op 15 ml dichtheidsgradiëntmedium.
- Centrifugeer op 500 × g gedurende 25 minuten zonder rem, verwijder de plasmalaag zonder de buffy coat (PBMC-laag) te verstoren, verzamel de PBMC's van de interface en breng over naar een nieuwe steriele 50 ml conische buis.
- Breng de PBMC's naar 50 ml met 1x PBS.
- Centrifugeer op 500 × g gedurende 5 minuten zonder rem. Verwijder het supernatant zonder de PBMC-pellet te verstoren, die rood kan lijken.
- Voeg 7 ml ammoniumchloride-kaliumlysebuffer toe, pipet 3 keer om goed te mengen en incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 3 minuten.
- Breng het volume op 50 ml met 1x PBS.
- Centrifugeer op 400 × g gedurende 5 minuten met rem met lage weerstand. Verwijder het supernatant zonder de pellet te verstoren. De pellet moet er roze of wit uitzien.
OPMERKING: Om de vers geïsoleerde B-cellen te blijven kweeken, bereidt u het B-cel expansiemedium voor voordat u begint met B-celisolatie (stap 4.2).
- B-cel isolatie van PBMC's met behulp van menselijke primaire B-cel negatieve isolatie kit
- Resuspend PBMC's in de isolatiebuffer tot een concentratie van 5 × 107 cellen/ml.
OPMERKING: Als het totale aantal PBMC's minder dan 5 × 107 cellen bedraagt, verkleint u het volume van de isolatiebuffer om 5 × 107 cellen/ml te behouden. De minimale en maximale volumes celsuspensie zijn respectievelijk 0,25 ml en 8 ml. - Breng tot 8 ml (5 × 107 cellen/ml) over in een steriele, polypropyleen buis met ronde bodem met dop.
- Voeg 50 μL/ml cocktailversterker toe aan de PBMC's.
- Voeg 50 μL/ml isolatiecocktail toe aan de PBMC's, sluit de buis af en keer 2-3 keer om om te mengen.
- Incubeer bij RT gedurende 5 minuten; in de4e minuut van incubatie, vortex magnetische microbeads gedurende ten minste 30 s.
- Breng 50 μL magnetische microbeads per 1 ml PBMC's over, sluit de buis af en keer 2-3 keer om om te mengen.
- Vul tot 10 ml aan met isolatiebuffer en pipetteer 2-3 keer zachtjes op en neer.
- Plaats de buis in een magnetisch station en incubeer bij RT gedurende 3 minuten.
- Houd de magneet en de buis bij elkaar en keer in één beweging de magneet en de buis om om de celsuspensie in de nieuwe buis te gieten. Gooi de oude buis weg.
- Herhaal stap 4.2.8 (verkort de incubatietijd tot 2 min) en giet de B-cel suspensie in een schone conische buis.
- De verrijkte B-cellen zijn klaar voor gebruik. Als cellen onmiddellijk worden gebruikt, gaat u verder met rubriek 4.3 (Menselijke B-cel expansie). Controleer de zuiverheid van de geïsoleerde B-cellen door middel van flowcytometrie (optioneel). Als cellen voor gebruik moeten worden ingevroren, gaat u verder met stap 4.2.12.
- Om de B-cellen in te vriezen, centrifugeer op 400 × g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren.
- Resuspendeer de cellen in het vriesmedium bij10 7 cellen/ml en aliquot 1 ml/cryoviaal.
- Plaats het cryovial in de gekoelde vriescontainer en bewaar het 's nachts bij -80 °C; breng vervolgens het bevroren cryovial over naar een vloeibare stikstoftank; houd bevroren cellen tot 1 jaar.
OPMERKING: Het verwachte rendement van geïsoleerde B-cellen is 2%-8% van de totale PBMC's, met 95%-99% levensvatbaarheid.
- Resuspend PBMC's in de isolatiebuffer tot een concentratie van 5 × 107 cellen/ml.
- Menselijke B-cel expansie
OPMERKING: Als u vers geïsoleerde B-cellen gebruikt, slaat u stap 4.3.1–4.3.5 over. Tel de cellen en breng het benodigde aantal cellen over in een steriele conische buis en ga verder met stap 4.3.6.- Pre-warm foetale runderserum (FBS) in een waterbad voordat de B-cellen ontdooien. Bereid 20 ml B-cel expansiemedium voor, breng over in een T25-kolf en kalibreer het medium ten minste 15 minuten voor gebruik in een weefselkweekincubator (bij 37 °C, 5% CO2, met vochtigheid).
- Ontdooi B-cellen in een waterbad van 37 °C. Breng tijdens het wachten 2 ml voorverwarmde FBS over in een steriele conische buis van 15 ml.
- Nadat de B-cellen volledig zijn ontdooid, voegt u onmiddellijk 1 ml voorverwarmde FBS, drop-wise, toe aan het monster. Incubeer bij RT gedurende 1 min.
- Pipetteer voorzichtig om het monster opnieuw op te schorten en breng het hele volume, dropwise, over in een conische buis met 2 ml voorverwarmde FBS.
- Breng het volume op 15 ml met steriele 1x PBS, dop en draai de buis 2-3 keer voorzichtig om.
- Centrifugeer op 400 × g gedurende 5 min.
- Gooi het supernatant weg zonder de celkorrel te verstoren, resuspendeer de celkorrel met 1 ml pre-geëquilibreerd B-cel expansiemedium en tel de cellen. Het totale celnummer moet ongeveer 107 cellen zijn.
- Breng de cellen over in een kolf met 20 ml van het voorgequilibreerde B-cel expansiemedium. De uiteindelijke concentratie van de cellen moet ongeveer 5 x 105 cellen/ml zijn.
- Incubeer de kolf verticaal in een weefselkweekincubator.
- Ververs het expansiemedium elke 2 dagen volledig door het hele volume B-cellen over te brengen naar een steriele conische buis en herhaal stap 4.3.6–4.3.9.
OPMERKING: De T25-kolf kan 10-20 ml medium bevatten; De T75-kolf kan tot 20-60 ml medium bevatten.
5. Primaire menselijke B-cel techniek
- Engineer B cellen op 48 ± 2 uur na expansie/activering voor optimale resultaten. Bereid het B-cel expansiemedium voor, aliquot 1 ml van het medium in een 48-well weefselkweekplaat en pre-equilibreer in een weefselkweek incubator ten minste 15 minuten voor gebruik.
OPMERKING: Volg bij het ontwerpen van een CRISPR/Cas9 sgRNA voor een interessant gen de onderstaande stappen.
- Ontwerp sgRNAs met behulp van een online tool11.
- Ontwerp sgRNAs op een exon die gemeenschappelijk is voor alle isovormen van het eiwit.
- Bestel chemisch gemodificeerde sgRNA bij gerenommeerde bedrijven.
- sgRNA komt meestal in lyofiele vorm; reconstituteer sgRNA in steriele DNase/RNase-vrije Tris-EDTA (TE) buffer tot een concentratie van 1 μg/μL. - Bereid CRISPR/Cas9 transfecterend substraat voor door 1 μL (1 μg/μL) chemisch gemodificeerd sgRNA te mengen met 1,5 μL (1 μg/μL) chemisch gemodificeerd Streptococcus pyogenes Cas 9 (S.p. Cas9) nuclease per transfectiereactie. Gebruik voor controle 1 μL TE-buffer in plaats van sgRNA.
OPMERKING: Wanneer CD19 sgRNA wordt gebruikt voor een gen KO-experiment, zie figuur 2 voor resultaten. Wanneer AAVS1 sgRNA wordt gebruikt voor een gen KI-experiment, zie figuur 5 voor resultaten.- Houd alle onderdelen op ijs.
- Meng voorzichtig en breng 2,5 μL CRISPR/Cas9 transfecterend substraat per reactie over in een buis van een 8-buiss strip van 0,2 ml; gereserveerd bij RT.
- Schakel een nucleofector (elektroporator) in en bereid transfectiereagentia voor zoals aangegeven in tabel 1.
OPMERKING: Dit is een goede stap voor een pauze, indien nodig, door alle reagentia op ijs te zetten. Verwijder alle reagentia uit het ijs wanneer u klaar bent om het experiment te hervatten. Bij gebruik van S.p. Cas9-eiwit moet de onderzoeker CRISPR/Cas9-sgRNA ribonucleoproteïne vooraf complex maken door 1 μg sgRNA te mengen met 5 μg S.p. Cas9-eiwit, eventuele bubbels te vermijden en het mengsel ten minste 20 minuten voor gebruik bij RT te incuberen voor optimale resultaten. - Tel en breng 106 B cellen per transfectiereactie over in een steriele conische buis.
- Breng het volume op 15 ml met steriele 1x PBS en centrifugeer gedurende 5 minuten op 400 × g. Bereid tijdens het wachten het reagens voor primaire celtransfectie (tabel 2) voor en zet het apart bij RT.
- Gooi het supernatant weg zonder de celkorrel te verstoren.
- Resuspendeer de celkorrel met 10 ml steriel 1x PBS en centrifugeer gedurende 5 minuten op 400 × g.
- Gooi het supernatant volledig weg zonder de celkorrel te verstoren.
- Breng 0,5 μg chemisch gemodificeerd GFP mRNA (als transfectiereporter) per 106 B-cellen over naar de celkorrel (optioneel).
- Resuspend de celkorrel met 20 μL primair celtransfectiereagens per 106 B-cellen; meng voorzichtig door 5-6 keer te pipetten. Breng 20,5 μL per transfectiereactie over in de 0,2 ml buis van de 8-buiss strip met 2,5 μL van het CRISPR/Cas9 transfectiesubstraat.
- Pipetteer één keer op en neer om het hele volume (23 μL) te mengen en over te brengen in een transfectie cuvette. Dop en tik de cuvette voorzichtig op de bank om ervoor te zorgen dat de vloeistof de bodem van de cuvette bedekt.
- Gebruik het humane primaire B-cel protocol op de nucleofector voor transfectie.
OPMERKING: De nucleofector (elektroporator) kan buiten de weefselkweekkap worden geplaatst en gebruikt. Sluit de cuvette af om steriliteit te garanderen. - Laat de elektroporated cellen in de cuvette bij RT gedurende 15 minuten rusten.
- Breng 80 μL van het vooraf geëquilibreerde B-cel expansiemedium van de weefselkweekplaat over in de transfectiereactie in de cuvette. Plaats de cuvette gedurende 30 minuten in de weefselkweek-incubator.
- Pipetteer een paar keer om het hele volume van het monster van de cuvette te mengen en over te brengen naar een geschikte put van een 48-put weefselkweekplaat met 1 ml van het B-cel expansiemedium. De uiteindelijke concentratie van de cellen moet 106 cellen/ml zijn.
- Als u een gen KI-experiment uitvoert, brengt u rAAV6-vector bij 500.000 veelvoudigheid van infectie over in de juiste put met elektroporated cellen (ongeveer 45 minuten na elektroporatie). Zie voorbeeld rAAV6 vectorconstructie in figuur 4A.
OPMERKING: Bijvoorbeeld: Een controlemonster wordt geëlektropoeerd zonder CRISPR/Cas9 of de rAAV6-vector. Een monster met alleen vector wordt geëlektropoeerd zonder CRISPR/Cas9 en vervolgens getransduceerd met de rAAV6-vector. Een KI-monster wordt geëlektropoeerd met CRISPR/Cas9 en vervolgens getransduceerd met de rAAV6-vector. rAAV6 moet homologiearmen tot en na de beoogde DSB-site voor HDR bevatten. - Plaats de plaat in een weefselkweek-incubator bij 37 °C en 5% CO2 bij vochtigheid.
- Tel de cellen en noteer de levensvatbaarheid op dag 1 post-engineering.
- Ververs het B-cel expansiemedium om de 2 dagen door de cellen te tellen en vervolgens het hele volume van de cellen over te brengen in een schone microcentrifugebuis van 1,5 ml. Centrifugeer op 400 × g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren. Resuspend de cellen met 100 μL vers B-cel expansiemedium, en overdracht naar een put van een 24-well weefsel cultuur plaat. Breng het gemiddelde volume omhoog om een uiteindelijke celconcentratie te bereiken bij 5 × 105 cellen/ml.
OPMERKING: Een 48-put plaat kan tot 1 ml medium/put bevatten; een 24-put plaat kan tot 2 ml medium/put bevatten; een 12-put plaat kan tot 4 ml medium / goed bevatten, en een 6-put plaat kan tot 8 ml medium / goed bevatten. - Laat de gemanipuleerde cellen ten minste 5 dagen uitzetten voordat u downstreamanalyses uitvoert, zoals voor flowcytometrieanalyse, TIDE-analyse en junction PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het bijgewerkte uitbreidings- en activeringsprotocol maakte een snelle uitbreiding van B-cellen tot 44 keer in 7 dagen mogelijk(figuur 1; n =3 donoren). In het KO-experiment toonde het aantal B-cellen met trypanblauwe kleuring meer dan 80% levensvatbare cellen met een lichte vermindering van het celherstel in zowel de controle- als de CD19 KO-monsters bij 24 uur post-elektroporatie(figuur 2A; p ≥ 0,05, n = 3 donoren). Dit resultaat geeft aan dat elektroporatie de algehele gezondheid van B-cellen enigszins beïnvloedde. B-cellen werden verzameld op dag 5 posttransfectie voor flowcytometrie en TIDE-analyses. Representatieve spreidingspercelen van het controle- en KO-monster vertoonden respectievelijk 14% en 95% CD19-negatieve cellen (figuur 2B). De kwantificering van de stroompercelen vertoonde een significante vermindering van de CD19-expressie in de KO-monsters in vergelijking met de controle (figuur 2B; p ≤ 0,0001, n = 3 donoren). Chromatogrammen van genomische sequencing (zie primersequenties in tabel 3) vertoonden dubbele pieken in de CD19 KO B-cellen, wat duidt op inserties/deleties van nucleotiden post-CRISPR/Cas9-gemedieerde DSB, terwijl in het besturingselement enkele pieken werden waargenomen, wat erop wijst dat er in dit monster geen DSB voorkwam (figuur 3A). Indelanalyse van de chromatografen (met behulp van een gratis online TIDE-analysetool) van de KO-monsters toonde een hoog percentage indelvorming (>90%) bij de CD19-locus, wat overeenkomt met % CD19-eiwitverlies gedetecteerd door flowcytometrie (figuur 3B; p ≥ 0,05, n = 3 donoren). Deze resultaten geven aan dat CRISPR/Cas9 efficiënt een CD19 KO in B-cellen heeft gegenereerd. B-cellen uit het KI-experiment werden verzameld op dag 12 post-engineering voor flowcytometrie en junction PCR-analyses (tabel 4). Scatterplots toonden 64% van de EGFP-positieve cellen in het monster dat de rAAV6-vector (figuur 4) samen met RNP ontving, terwijl er geen EGFP-positieve cel werd waargenomen in het besturingselement; minimale EGFP-positiviteit werd waargenomen in het monster dat alleen AAV-vector ontving (figuur 5A). Een junction PCR-versterking (zie primersequenties in tabel 3) toonde 1,5 Kbps amplicons in het KI-monster (figuur 5B), terwijl geen PCR-product werd waargenomen in het controlemonster of vectormonster. Celtellingen toonden aan dat het engineeringproces het celherstel in het KI-monster meer beïnvloedt dan het besturingselement of de vectormonsters (figuur 5B). Alle monsters herstelden echter snel binnen 3 dagen na de engineering (figuur 5B). Samen geven deze resultaten aan dat een succesvolle integratie van EGFP op de AAVS1-locus leidt tot een stabiele expressie van EGFP ten minste 12 dagen na de engineering.
Figuur 1: B celexpansie in vitro. B-cellen werden gezaaid op 1 × 106 cellen op dag 0 (nul) met een dichtheid van 5 × 105 per ml en 44 keer uitgebreid in 7 dagen (n=3 onafhankelijke donoren). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Afbeelding 2A: Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2B: Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2C: CRISPR/Cas9-gemedieerde CD19 knock-out (KO) in B-cellen. (A) Staafgrafiek toont >70% celterugwinning (linkerpaneel) en >80% levensvatbaarheid (rechterpaneel) van cellen na transfectie werden waargenomen in zowel de controle als de CD19 KO-monsters na 24 uur na elektroporatie. (B) Representatieve stroompercelen van CD19 gating van levende cellen tonen respectievelijk 84,3% en 3,43% CD19-positieve cellen in het controlemonster en het CD19 KO-monster. (C) Staafgrafiek toont een significante vermindering van CD19 in de CRISPR/Cas9-gemedieerde CD19 KO-groep (p ≤ 0,0001). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Afbeelding 3A: Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3B: CD19 eiwitverlies vs indelvorming. (A) Chromatogrammen geven sequencing pieken van het besturingselement en CD19 knockout (KO) monster weer. Het grijze vak op de controlepieken markeert de doelvolgorde van CD19 gRNA met de voorspelde snijplaats aangegeven door een pijl. CD19 KO toonde "dubbele pieken" sequencing rond de voorspelde snijplaats, wat wijst op het inbrengen/verwijderen van nucleotiden na de dubbelstrengs breuk. (B) Staafgrafiek met consistente resultaten tussen % CD19 eiwitverlies en % onuitwisbare vorming bij de CD19 locus (p ≥ 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: rAAV6 AAVS1 MND-GFP vector construct. Expressiecassette bevat een sterke synthetische promotor (MND) sequentie, onmiddellijk gevolgd door een verbeterde groene fluorescentie eiwit (EGFP) coderingssequentie en poly adenylatie (Poly A) sequentie. AAVS1 homologiearmen flankeren stroomopwaarts van de MND-promotor en stroomafwaarts van de poly A-sequenties. Egfp zal worden uitgedrukt in het kader van de verordening van de MND-promotor. Sequentielengten worden boven elk onderdeel van de constructie aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Afbeelding 5A: Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5B: Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5C: CRISPR/Cas9- en rAAV6-gemedieerde site-specifieke integratie van de EGFP reporter cassette in B cellen op dag 12 post-engineering. (A) Representatieve stroomplot toont geen EGFP-positieve B-cellen in het besturingselement of het vectormonster versus 64,4% van de EGFP-positieve B-cellen uit het knockin (KI)-monster. (B) Junction polymerase kettingreactie van KI monster toont de voorspelde 1,5 Kbps band; er is geen band gevonden in het besturingselement of vectormonster. Water werd gebruikt om ervoor te zorgen dat er geen verontreiniging was tijdens het PCR-proces. (C) Staafdiagram toont de celgroei van het besturingselement, de vector-only, en de EGFP-KI monsters over een periode van 3 dagen na engineering. Gebroken lijn geeft de 1 × 106 celinvoer aan. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Naam | gRNA-sequentie |
| CD19 | 5'-GCTGTGCTGCAGTGCCTCAA-3' |
| AAVS1 | 5'-GTCACCAATCCTGTCCCTAG-3' |
Tabel 1: gRNA-sequenties.
| Reagentia | Volume per 1 reactie |
| P3 Primaire celoplossing | 16,4 ml |
| Aanvulling 1 | 3,6 ml |
| Totale | 20 ml |
Tabel 2: Bereiding van nucleofection reagensmix.
| Beschrijving | Volgorde | Purpose |
| CD19 voorwaartse primers | 5'-AAATTCAGGAAAGGGTTGGAAG-3' | Versterk de CD19 locus voor Indel analyse |
| CD19 Omgekeerde primer | 5'-GCGGACCTCTTCTGTCCATG-3' | Versterk de CD19 locus voor Indel analyse |
| Junction PCR voorwaartse primer | 5'-GGACGAGCTGTACAAGTAACG-3' | Knooppunt PCR |
| Junction PCR Omgekeerde primer | 5'-GAGACAGTGACCAACCATCC-3 | Knooppunt PCR |
Tabel 3: Gebruikte primers.
| Beschrijving | Fluorofoor | Kloon |
| Anti-menselijke CD19 | PerCP | HIB19 |
| Levensvatbaarheid Kleurstof | eFlour 780 | - |
Tabel 4: Flow cytometrie antilichaam en levensvatbaarheid kleurstof.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nauwkeurige genoomtechniek in primaire menselijke B-cellen was tot voor kort een uitdaging9,10. We hadden eerder protocollen gepubliceerd met CRISPR/Cas9 om primaire menselijke B-cellente engineeren 9. Hier schetsen we verbeterde protocollen voor B-cel isolatie, uitbreiding en engineering om efficiënte KO van CD19 of voor knock-in EGFP mogelijk te maken.
Hier laten we zien dat ons expansieprotocol de snelle uitbreiding van B-cellen in cultuur mogelijk maakt voor maximaal 44-voudige expansie in 7 dagen (figuur 1). Dit protocol toonde een snellere expansiesnelheid dan die gerapporteerd door Johnson et al.9 en Hung et al.10 De kritieke stappen om een gezonde en snelle uitzetting van primaire B-cellen te garanderen, vullen het medium om de twee dagen aan met nieuwe activeringsfactoren en zorgen ervoor dat het totale B-cellen in cultuur niet groter is dan 2 × 106 cel/ml.
We ontdekten ook dat ons verbeterde protocol voor het transfecteren van het CRISPR/Cas9-systeem voor CD19 KO resulteerde in een hoge CD19 KO-efficiëntie(figuur 2 en figuur 3). Net als bij een eerdere studie9constateerden we een lichte afname van het celherstel en de levensvatbaarheid na elektroporatie na 24 uur. Dit geeft aan dat elektroporatie de algehele celgezondheid van primaire B-cellen beïnvloedt; de cellen komen echter uiteindelijk binnen 48 uur terug (gegevens worden niet weergegeven).
Het voordeel van het gebruik van dit elektroporatorprotocol is dat we monsters veel sneller kunnen elektropoeren (16 reacties in minder dan 1 minuut), terwijl eerdere protocollen9,10 ongeveer 10-12 minuten duren voor 16 reacties. Bovendien elimineert dit transfectiesysteem de potentiële elektrische boog van de elektroporator die in eerdere studies9,10is waargenomen . Bovendien kan deze engineeringmethode worden opgeschaald voor grotere aantallen B-cellen met behulp van grotere, commercieel beschikbare cuvetten (gegevens worden niet weergegeven).
Enkele kritische stappen om een optimale algehele celgezondheid en KO-efficiëntie te garanderen: Zorg er eerst voor dat het B-cel expansiemedium ten minste 15 minuten voor gebruik wordt voorbereid en voorgekalibreerd. Ten tweede mag het totale volume transfectiesubstraat niet meer dan 20% (v/v) van het nucleofectionreagens bedragen. Ten derde moeten de cellen gedurende 48 ± 2 uur worden uitgevouwen/geactiveerd voor een optimaal resultaat. Tik ten vierde zachtjes op de elektroporatie cuvette voordat u deze in de elektroporator plaatst om ervoor te zorgen dat de transfectiereactieoplossing de onderkant van de cuvette bedekt. Ten vijfde, zorg ervoor dat u de elektroporated cellen in de cuvette voor slechts 15 minuten bij RT; het te lang laten van cellen in het nucleofectionreagens na elektroporatie kan de algehele celoverleving schaden. Ten zesde, zorg ervoor dat u de cellen niet langer dan 30 minuten incubeert met media in de cuvette. Ten zevende, het plaatsen van10 6 elektroporated cellen in 1 ml voor de eerste 48 uur heeft de neiging om cellen te helpen sneller te herstellen dan ze te cultiveren bij een lagere dichtheid (gegevens niet weergegeven). Ten slotte zal het gebruik van Cas9 mRNA- of Cas9-eiwit resulteren in vergelijkbare bewerkingsefficiënties (gegevens worden niet weergegeven); we gebruikten Cas9 mRNA echter voor gemak en kosten.
Twee grote zorgen bij het gebruik van CRISPR/Cas9 zijn off-target effecten en chromosomale translocaties. Off-target effecten veroorzaakt door niet-overeenkomende basisparen sgRNA aan de doelsequentie, leiden tot tal van mogelijke bindingsplaatsen op het genoom en creëren meerdere, ongewenste gen-KOs. Daarom moet rekening worden gehouden met de voorspelde off-target score samen met de on-target score om dit probleem te minimaliseren. Chromosomale translocatie kan optreden als gevolg van off-target effecten of bij het uitschakelen van meerdere genen. Dit kan experimenteel en klinisch catastrofale gebeurtenissen veroorzaken. Basiseditors12 veranderen een enkele nucleotide (twee klassen: cytosinebasiseditor en adeninebasiseditor) om het splicing-element te verstoren, om een voortijdige stopcodon te creëren of om een puntmutatie te creëren, wat leidt tot doelgen KO zonder DSB (elders uitgebreid bekeken12). De basisbewerkingsbenadering kan dus worden gebruikt voor KOs met één of meerdere genen om chromosomale translocaties te omzeilen.
We tonen ook aan dat CRISPR/Cas9, samen met rAAV6, kan worden gebruikt om efficiënt te bemiddelen bij site-specifieke KI en expressie van EGFP op de AAVS1 locus. We hebben egfp-expressie gedurende ten minste 12 dagen na engineering waargenomen. We hebben ook twee EGFP-positieve populaties waargenomen: een hoge en een intermediaire EGFP-expressie in de KI-steekproef op dag 12(figuur 5A),terwijl het vectormonster een minimaal percentage cellen met een intermediaire EGFP-expressie liet zien. We speculeren dat dit fenomeen van "hoge en intermediaire populaties" te wijten is aan biallelic integratie van de vector. Verder onderzoek met behulp van SPANNING PCR13 van de intermediaire en hoog-EGFP cellen kan worden gedaan om deze hypothese te bevestigen. Twee kanttekeningen bij het gebruik van AAV als vector: Ten eerste hebben AAV-vectoren een kleine laadcapaciteit, tot 4,7 kilobases, wat problemen veroorzaakt bij het kloppen in een groot gen. Het verminderen van de grootte van homologiearmen zal de aanpassing van een groter gen mogelijk maken, wat op zijn beurt de KI-efficiëntie zal verminderen (gegevens niet weergegeven). Als alternatief kan gelijktijdige of sequentiële integratie van meerdere genbeladingsvectoren worden gebruikt14,15. Studies hebben een immuunrespons en een klaring van AAV-transduceerde cellen in immunocompetente diermodellen16,17gerapporteerd . Als alternatief kan een niet-virale donor HDR-sjabloon worden verkend om dit probleem te omzeilen.
Samengevat hebben we uitgebreide, stapsgewijze processen van isolatie, expansie en engineering van B-cellen gedemonstreerd die resulteerden in hoge genmodificatie-efficiënties. Deze engineeringsmethode kan worden gebruikt voor gen KO en om de functies van genen in B-cellen te bestuderen. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om B-cellen te engineeren om een recombinant antilichaam uit te drukken om infectie te bestrijden. Ten slotte kan deze methode worden toegepast op ingenieur B-cellen om therapeutische enzymen uit te drukken en af te scheiden die kunnen worden gebruikt als een autologe celgebaseerde therapie voor de behandeling van enzymopathieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er is een patent aangevraagd op de methoden voor het maken en gebruiken van genoom-bewerkte B-cellen met M.J.J, K.L., en B.S.M. als uitvinders. B.S.M is een consultant voor en bezit aandelen in Immusoft Inc. Immusoft Inc heeft onderzoek gesponsord in het lab van B.S.M.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door het Children's Cancer Research Fund (CCRF) en NIH R01 AI146009 aan B.S.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug | IDT | 1081059 | smaller size is also available |
| Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza | V4XP-3032 | |
| Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CleanCap chemically modified Cas9 mRNA | Trilink Biotechnology | L-7206-1000 | |
| CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg | Invivogen | TLRL-2006-5 | different sizes available |
| Cryostor CS10, 100 mL | STEMCELL Technology | 7930 | |
| CTS Immune Cell SR | Thermo Fisher Scientific | A2596101 | |
| EasySep human B cells isolation kit | STEMCELL Technology | 17954 | |
| eBioscience fixable viability dye eFlour 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | |
| Excellerate B cell media, Xeno-free | R&D Systems | CCM031 | B-cell basal medium |
| Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11550 | For thawing B cells only |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps | BioExpress | T-3035-1 / 490003-692 | |
| Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS | GE lifesciences | SH30256.01 | |
| Lonza 4D Nucleofector core unit | Lonza | AAF-1002B | |
| Lonza 4D Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Mega CD40 Ligand | Enzo Life Sciences | ALX-522-110-C010 | |
| Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | For freezing cells |
| Pen/Strep 100X | Sigma-Aldrich | TMS-AB2-C | |
| PerCP anti-human CD19 clone HIB19 | biolegend | 302228 | smaller size is also available |
| rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.) | Vigene Biosciences | N/A | large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL |
| Recombinant human IL-10 protein 250 ug | R&D Systems | 217-IL-250 | different sizes available |
| Recombinant human IL-15 protein 25 ug | R&D Systems | 247-ILB-025 | different sizes available |
| The Big Easy EasySep Magnet | STEMCELL Technology | 18001 | different sizes available |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Fisher Scientific | BP2476100 |
References
- LeBien, T. W., Thomas, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).
- Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. Humoral immunity due to long-lived plasma cells. Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).
- Spriggs, M. K., et al. Recombinant human CD40 ligand stimulates B cell proliferation and immunoglobulin E secretion. Journal of Experimental Medicines. 176 (6), 1543-1550 (1992).
- Fusil, F., et al. A lentiviral vector allowing physiologically regulated membrane-anchored and secreted antibody expression depending on B-cell maturation status. Molecular Therapy. 23 (11), 1734-1747 (2015).
- Luo, X. M., et al. Engineering human hematopoietic stem/progenitor cells to produce a broadly neutralizing anti-HIV antibody after in vitro maturation to human B lymphocytes. Blood. 113 (7), 1422-1431 (2008).
- Mock, U., Thiele, R., Uhde, A., Fehse, B., Horn, S. Efficient lentiviral transduction and transgene expression in primary human B cells. Human Gene Therapy Methods. 23 (6), 408-415 (2012).
- Heltemes-Harris, L. M., et al. Sleeping Beauty transposon screen identifies signaling modules that cooperate with STAT5 activation to induce B-cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 35 (26), 3454-3464 (2016).
- Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease. Scientific Reports. 8, 12144 (2018).
- Hung, K. L., et al. Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells. Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).
- Cui, Y., Xu, J., Cheng, M., Liao, X., Peng, S. Review of CRISPR/Cas9 sgRNA design tools. Interdisciplinary Sciences. 10 (2), 455-465 (2018).
- Rees, H. A., Liu, D. R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).
- Spiegel, A., Bachmann, M., Jurado Jiménez, G., Sarov, M. CRISPR/Cas9-based knockout pipeline for reverse genetics in mammalian cell culture. Methods. 164-165, 49-58 (2019).
- Suzuki, T., Kazuki, Y., Oshimura, M., Hara, T. A novel system for simultaneous or sequential integration of multiple gene-loading vectors into a defined site of a human artificial chromosome. PLoS One. 9, 110404 (2014).
- Bak, R. O., Porteus, M. H. CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors. Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).
- Shirley, J. L., de Jong, Y. P., Terhorst, C., Herzog, R. W. Immune responses to viral gene therapy vectors. Molecular Therapy. 28 (3), 709-722 (2020).
- Martino, A. T., Markusic, D. M. Immune response mechanisms against AAV vectors in animal models. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 198-208 (2020).
