Summary
Her tilbyr vi en detaljert, trinnvis protokoll for CRISPR/Cas9-basert genomteknikk av primære humane B-celler for genutslag (KO) og knock-in (KI) for å studere biologiske funksjoner av gener i B-celler og utvikling av B-celleterapeutikk.
Abstract
B-celler er lymfocytter avledet fra hematopoietiske stamceller og er en nøkkelkomponent i humoralarmen til det adaptive immunsystemet. De gjør attraktive kandidater til cellebaserte terapier på grunn av deres enkle isolasjon fra perifert blod, deres evne til å utvide in vitro og deres levetid in vivo. I tillegg kan deres normale biologiske funksjon – for å produsere store mengder antistoffer – brukes til å uttrykke svært store mengder terapeutisk protein, for eksempel et rekombinant antistoff for å bekjempe infeksjon, eller et enzymopatier. Her gir vi detaljerte metoder for å isolere primære menneskelige B-celler fra perifere blodmonynukleære celler (PBMCer) og aktivere / utvide isolerte B-celler in vitro. Deretter demonstrerer vi trinnene som er involvert i bruk av CRISPR/Cas9-systemet for stedsspesifikk KO av endogene gener i B-celler. Denne metoden muliggjør effektiv KO av ulike gener, som kan brukes til å studere de biologiske funksjonene til gener av interesse. Vi demonstrerer deretter trinnene for bruk av CRISPR/Cas9-systemet sammen med en rekombinant, adeno-assosiert, viral (rAAV) vektor for effektiv stedsspesifikk integrasjon av en transgene uttrykkskassett i B-celler. Sammen gir denne protokollen en trinnvis ingeniørplattform som kan brukes i primære menneskelige B-celler for å studere biologiske funksjoner av gener så vel som for utvikling av B-celleterapeutikk.
Introduction
B-celler er en undergruppe av lymfocyttlinjen avledet fra hematopoietiske stamceller. De utfører en kritisk rolle i det adaptive humorale immunforsvaret ved å produsere store mengder antistoffer som svar på immunutfordringer1. B-celler er også forløpere til minne B-celler og de terminalt differensierte, langlivede plasmacellene, og gir dermed varig humoristisk immunitet2. Spesielt plasmaceller er unike blant immunceller i deres evne til å produsere store mengder av et bestemt antistoff mens de overlever i år eller tiår3. I tillegg gjør enkel isolasjon fra perifert blod B-cellelinjen til en utmerket kandidat for nye cellebaserte terapier4.
Tidligere har tilfeldige integrasjonsmetoder, for eksempel de som bruker lentivirale vektorer eller en Sleeping Beauty-transposon, blitt brukt til å konstruere B-celler for transgene levering og uttrykk5,6, 7,8. Imidlertid gjør den ikke-spesifikke karakteren av disse tilnærmingene det vanskelig å studere de biologiske funksjonene til et bestemt gen i B-cellene og bærer en iboende risiko for innsetting av mutagenese og variabel transgene uttrykk og / eller silencing i terapeutisk setting.
CRISPR/Cas9-systemet er et kraftig genomteknikkverktøy som gjør det mulig for forskere å redigere genomet til ulike celler nøyaktig i mange arter. Nylig har to grupper, inkludert våre egne, vellykket utviklet metoder for ex vivo-utvidelse og målrettet genomteknikk av primære menneskelige B-celler9,10. Vi vil beskrive prosessen med å rense primære humane B-celler fra en leukaforeseprøve. Etter det vil vi beskrive vår oppdaterte protokoll for B-celleutvidelse og aktivering av isolerte B-celler. Vi vil deretter beskrive en prosess for å slå ut klyngen av differensiering 19 (CD19), en spesifikk B-cellereseptor og et kjennetegn på B-celler, ved elektroporasjon for å introdusere CRISPR / Cas9 mRNA sammen med CD19 sgRNA i aktiverte B-celler.
Cas9 mRNA blir oversatt og binder seg til CD19 sgRNA for å danne et CRISPR/Cas9-sgRNA ribonucleoproteinkompleks (RNP). Deretter fører sgRNA i komplekset Cas9 til å skape dobbeltstrengsbrudd (DSB) ved målsekvensen på exon 2 av genet. Cellene vil reparere DSB ved "ikke-homolog slutt sammenføyning" ved å introdusere eller slette nukleotider, noe som fører til framehift mutasjon og forårsaker at genet blir slått ut. Vi vil deretter måle tapet av CD19 ved strømningscytometri og analysere indeldannelse ved sporing av indels ved dekomponering (TIDE) analyse.
Vi vil deretter beskrive prosessen med å bruke CRISPR/Cas9 sammen med en rekombinant AAV6-vektor (rAAV6, en donormal for homologistyrt reparasjon (HDR)) for å formidle stedsspesifikk innsetting av forbedret grønt fluorescerende protein(EGFP) på det adeno-tilknyttede virusintegrasjonsstedet 1 (AAVS1) genet. AAVS1-genet er et aktivt locus uten kjente biologiske funksjoner og et AAV viralt integrasjonssted på det menneskelige genom; Derfor regnes det som en "trygg havn" for genomteknikk. Her rapporterer vi at utvidelse og aktivering av B-celler tillot opptil 44 ganger ekspansjon på 7 dager med kultur (figur 1). Elektroporasjon av B-celler viste en liten reduksjon av den totale cellehelsen (figur 2A) ved 24 timers ettertransfeksjon. Scatter-plottanalysen av CD19-merket (figur 2B) viste opptil 83 % reduksjon i de redigerte cellene (figur 2C).
TIDE-analysen av kromatografiene (figur 3A) viste at % indels var lik % proteintap ved strømningscytometri (figur 3B). Flowcytometrianalyse av KI-eksperimentet viste at cellene som fikk AAV-vektor (figur 4), sammen med RNP, uttrykte opptil 64% EGFP-positive celler (figur 5A) og senere viste vellykket integrasjon ved knutepunktpolymerasekjedereaksjon (PCR) (Figur 5B). Celleantall viste at alle prøver raskt ble gjenopprettet innen 3 dager etter teknikk (Figur 5C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Leukafereseprøver fra friske donorer ble hentet fra en lokal blodbank. Alle eksperimenter beskrevet her ble fastslått å være unntatt for forskning av Institutional Review Board (IRB) og ble godkjent av Institutional Biosafety Committee (IBC) ved University of Minnesota.
MERK: Alle eksperimenter ble utført i samsvar med den universelle forholdsregelen for blodbårne patogener, med sterile/aseptiske teknikker og riktig biosikkerhetsnivå-2-utstyr.
1. Forbered kosttilskudd for B-celle ekspansjonsmedium
- Rekonstituer CpG oligonukleotid til en konsentrasjon på 1 mg/ml.
- Rekonstituer CD40-ligand (CD40L) til en konsentrasjon på 100 μg/ml.
- Rekonstituer rekombinant human IL-10 (rhIL-10) til en konsentrasjon på 50 μg/ml.
- Rekonstituer rekombinant human IL-15 (rhIL-15) til en konsentrasjon på 10 μg/ml.
MERK: Oppbevar hvert tilskudd i små aliquots ved -20 °C til -80 °C i opptil 6 måneder.
2. Forbered basal medium
- Kombiner B-celle basal medium med 5% (v / v) medietilskudd for in vitro immuncelleutvidelse (f.eks. CTS Immun Cell SR) og 1% (v / v) penicillin og streptomycin.
- Filtrer-steriliser basalmediet ved hjelp av en 0,22 μm filteradapter i en sterilisert flaske.
- Hold basalmediet ved 4 °C i opptil 1 måned.
3. Forbered B-celle ekspansjonsmedium
- Overfør den nødvendige mengden av basalmediet til en steril beholder for å dyrke B-cellene ved 5 × 105 celler / ml.
- Suppler basalmediet med 1 μg/ml CpG, 100 ng/ml CD40L, 50 ng/ml rhIL-10 og 10 ng/ml rhIL-15.
- Filtrer B-celleutvidelsesmediet ved hjelp av et 0,22 μm filter.
- Likevekt B-celle ekspansjonsmediet i vevskulturinkubatoren ved 37 °C, 5 % CO2 med fuktighet i minst 30 minutter før bruk.
MERK: Forbered friskt B-celle ekspansjonsmedium som skal brukes i én dag. Ikke klargjør B-celleutvidelsesmediet som skal brukes i flere dager. Denne medieoppskriften oppmuntrer til spredning av minne B-celler og aktiverte primære menneskelige B-celler.
4. Human B-celle rensing og ekspansjon
MERK: Tilsett 99–100 % isopropylalkohol i en temperaturkontrollert frysebeholder, følg produsentens anvisning, og avkjøl frysebeholderen ved 4 °C før du begynner på trinn 4.1.
- Isolere PBMCer fra en leukaforeseprøve
- Overfør en leukaforeseprøve (ca. 8–10 ml) til et sterilt konisk rør på 50 ml.
- Få opp volumet til 35 ml med steril 1x fosfatbufret saltvann (PBS).
- Lag forsiktig en 35 ml leukaforeseprøve på 15 ml tetthetsgradientmedium.
- Sentrifuge ved 500 × g i 25 minutter uten brems, fjern plasmalaget uten å forstyrre buffy-kappen (PBMC-laget), samle PBMC-ene fra grensesnittet og overfør til et nytt sterilt 50 ml konisk rør.
- Få opp PBMC-ene til 50 ml med 1x PBS.
- Sentrifuge ved 500 × g i 5 min uten brems. Fjern supernatanten uten å forstyrre PBMC-pelletsen, som kan virke rød.
- Tilsett 7 ml ammonium-klorid-kaliumlysebuffer, pipette 3 ganger for å blande godt, og inkuber ved romtemperatur (RT) i 3 minutter.
- Få opp volumet til 50 ml med 1x PBS.
- Sentrifuge ved 400 × g i 5 min med lavmotstandsbrems. Fjern supernatanten uten å forstyrre pelletsen. Pellet skal se rosa eller hvit ut.
MERK: For å fortsette å dyrke de nyisolerte B-cellene, klargjør du B-celleutvidelsesmediet før du starter B-celleisolasjon (trinn 4.2).
- B-celleisolasjon fra PBMCer ved hjelp av humant primært B-celle negativt isolasjonssett
- Resuspend PBMCs i isolasjonsbufferen til en konsentrasjon på 5 × 107 celler / ml.
MERK: Hvis det totale antallet PBMCer er mindre enn 5 × 107 celler, skalerer du ned volumet av isolasjonsbuffer for å opprettholde 5 × 107 celler/ml. Minimums- og maksimumsvolumer av cellesuspensjon er henholdsvis 0,25 ml og 8 ml. - Overfør opptil 8 ml (5 × 107 celler/ml) til et sterilt polypropylen, rundbunnsrør med hette.
- Legg til 50 μL/ml cocktailforsterker i PBMC-ene.
- Tilsett 50 μL/ml isolasjonscocktail på PBMC-ene, hette røret og snu 2–3 ganger for å blande.
- Inkuber på RT i 5 min; i det fjerdeminuttet av inkubasjon, vortex magnetiske mikrober i minst 30 s.
- Overfør 50 μL magnetiske mikrober per 1 ml PBMCer, hette røret og inverter 2-3 ganger for å blande.
- Fyll opptil 10 ml med isolasjonsbuffer og rør forsiktig opp og ned 2–3 ganger.
- Plasser røret i en magnetisk stasjon og inkuber på RT i 3 minutter.
- Hold magneten og røret sammen, og i en bevegelse, snu magneten og røret sammen for å helle celleopphenget i det nye røret. Kast det gamle røret.
- Gjenta trinn 4.2.8 (reduser inkubasjonstiden til 2 min) og hell B-cellefjæringen i et rent konisk rør.
- De berikede B-cellene er klare til bruk. Hvis celler skal brukes umiddelbart, fortsetter du til seksjon 4.3 (Utvidelse av human B-celle). Kontroller renheten til de isolerte B-cellene ved strømningscytometri (valgfritt). Hvis cellene skal fryses før bruk, fortsetter du til trinn 4.2.12.
- For å fryse B-cellene, sentrifuge ved 400 × g i 5 min, og kast supernatanten uten å forstyrre pelletsen.
- Resuspend cellene i frysemedium ved 107 celler / ml, og aliquot 1 ml / kryonal.
- Plasser kryonalen i den avkjølte frysebeholderen, og oppbevar den ved -80 °C over natten; overfør deretter den frosne kryovialen til en flytende nitrogentank; holde frosne celler opptil 1 år.
MERK: Forventet utbytte av isolerte B-celler er 2%-8% av de totale PBMCene, med 95% -99% levedyktighet.
- Resuspend PBMCs i isolasjonsbufferen til en konsentrasjon på 5 × 107 celler / ml.
- Utvidelse av menneskelig B-celle
MERK: Hvis du bruker nyisolerte B-celler, hopper du over trinn 4.3.1–4.3.5. Tell cellene og overfør det nødvendige antall celler til et sterilt konisk rør og fortsett med trinn 4.3.6.- Forvarm foster bovint serum (FBS) i et vannbad før opptining av B-cellene. Forbered 20 ml B-celle ekspansjonsmedium, overfør til en T25-kolbe og forhåndskonlibrer mediet i en vevskulturinkubator (ved 37 °C, 5 % CO2, med fuktighet) minst 15 minutter før bruk.
- Tine B-celler i et 37 °C vannbad. Under venting, overfør 2 ml forvarmet FBS til et sterilt 15 ml konisk rør.
- Etter at B-cellene er helt tint, tilsett umiddelbart 1 ml forvarmet FBS, drop-wise, i prøven. Inkuber på RT i 1 min.
- Pipette forsiktig for å resuspendere prøven og overføre hele volumet, dropwise, til et konisk rør som inneholder 2 ml forvarmet FBS.
- Få opp volumet til 15 ml med steril 1x PBS, hette og inverter røret forsiktig 2-3 ganger.
- Sentrifuge ved 400 × g i 5 min.
- Kast supernatanten uten å forstyrre cellepellet, resuspend cellepellet med 1 ml forhåndslikevektet B-celle ekspansjonsmedium, og tell cellene. Det totale celletallet skal være omtrent 107 celler.
- Overfør cellene til en kolbe som inneholder 20 ml av det forhåndslikevektede B-celleutvidelsesmediet. Den endelige konsentrasjonen av cellene skal være ca. 5 x 105 celler / ml.
- Inkuber kolben vertikalt i en vevskulturinkubator.
- Oppdater ekspansjonsmediet fullstendig annenhver dag ved å overføre hele volumet av B-celler til et sterilt konisk rør og gjenta trinn 4.3.6-4.3.9.
MERK: T25-kolbe kan holde 10–20 ml middels; T75 kolbe kan holde opptil 20-60 ml medium.
5. Primær human B-celle engineering
- Ingeniør B-celler på 48 ± 2 timer etter utvidelse/aktivering for optimale resultater. Forbered B-celle ekspansjonsmediet, aliquot 1 ml av mediet til en 48-brønns vevskulturplate, og pre-likevekt i en vevskulturinkubator minst 15 min før bruk.
MERK: Når du designer en CRISPR/Cas9 sgRNA for et gen av interesse, følg trinnene nedenfor.
- Design sgRNAer ved hjelp av et online verktøy11.
- Design sgRNAer på en exon som er vanlig for alle isoformer av proteinet.
- Bestille kjemisk modifisert sgRNA fra anerkjente selskaper.
- sgRNA kommer vanligvis i lyofilisert form; rekonstituere sgRNA i steril DNase/RNase-fri Tris-EDTA (TE)-buffer til en konsentrasjon på 1 μg/μL. - Forbered CRISPR/Cas9 transfekterende substrat ved å blande 1 μL (1 μg/μL) kjemisk modifisert sgRNA med 1,5 μL (1 μg/μL) kjemisk modifiserte Streptococcus pyogenes Cas 9 (S.p. Cas9) nuklease per transfeksjonsreaksjon. For kontroll bruker du 1 μL TE-buffer i stedet for sgRNA.
MERK: Når CD19 sgRNA brukes til et ko-eksperiment av gen, se figur 2 for resultater. Når AAVS1 sgRNA brukes til et ki-eksperiment av gen, se figur 5 for resultater.- Hold alle komponentene på is.
- Bland forsiktig og overfør 2,5 μL CRISPR/Cas9 transfekterende substrat per reaksjon inn i et rør med en 0,2 ml 8-rørs stripe; satt til side ved RT.
- Slå på en nukleofektor (elektroporator), og klargjør transfeksjonsreagenser som vist i tabell 1.
MERK: Dette er et godt skritt for en pause, om nødvendig, ved å sette alle reagenser på is. Fjern alle reagenser fra is når du er klar til å gjenoppta eksperimentet. Ved bruk av S.p. Cas9-protein MÅ undersøkeren pre-komplekse CRISPR/Cas9-sgRNA ribonucleoprotein ved å blande 1 μg sgRNA med 5 μg S.p. Cas9 protein, unngå bobler og inkubere blandingen ved RT i minst 20 minutter før bruk for optimale resultater. - Tell og overfør 106 B celler per transfeksjonsreaksjon til et sterilt konisk rør.
- Ta opp volumet til 15 ml med steril 1x PBS, og sentrifuger ved 400 × g i 5 minutter. Mens du venter, klargjør du reagenset for primærcelletransfeksjon (tabell 2) og setter til side ved RT.
- Kast supernatanten uten å forstyrre cellepelleten.
- Resuspend cellepellet med 10 ml steril 1x PBS og sentrifuge ved 400 × g i 5 min.
- Kast supernatanten helt uten å forstyrre cellepelleten.
- Overfør 0,5 μg kjemisk modifisert GFP mRNA (som transfeksjonsreporter) per 106 B celler til cellepellet (valgfritt).
- Resuspend cellepellet med 20 μL primærcelle transfeksjon reagens per 106 B celler; bland forsiktig ved å pipettere 5–6 ganger. Overfør 20,5 μL per transfeksjonsreaksjon til 0,2 ml-røret på 8-rørstrimmelen som inneholder 2,5 μL av CRISPR/Cas9-transfeksjonssubstratet.
- Pipette opp og ned en gang for å blande og overføre hele volumet (23 μL) til en transfeksjonsklivett. Hette og trykk forsiktig på cuvette på benken for å sikre at væsken dekker bunnen av cuvette.
- Bruk human primær B-celleprotokoll på nukleofektoren for transfeksjon.
MERK: Nukleofektoren (elektroporatoren) kan plasseres og brukes utenfor vevskulturhetten. Cap cuvette for å sikre sterilitet. - Hvil de elektroporerte cellene i cuvette ved RT i 15 min.
- Overfør 80 μL av det forhåndslikevektede B-celle ekspansjonsmediet fra vevskulturplaten til transfeksjonsreaksjonen i cuvette. Plasser cuvette i vevskulturinkubatoren i 30 min.
- Rør forsiktig et par ganger for å blande og overføre hele volumet av prøven fra cuvette til en passende brønn av en 48-brønns vevskulturplate som inneholder 1 ml av B-celle ekspansjonsmediet. Den endelige konsentrasjonen av cellene skal være 106 celler / ml.
- Hvis du utfører et GEN KI-eksperiment, overfør rAAV6-vektoren ved 500 000 multiplisitet av infeksjon til riktig brønn som inneholder elektroporerte celler (ca. 45 min post-elektroporasjon). Se eksempel rAAV6 vektorkonstruksjon i figur 4A.
MERK: For eksempel: En kontrollprøve vil bli elektroporert uten CRISPR/Cas9 eller rAAV6-vektoren. En kun vektorprøve vil bli elektroporert uten CRISPR/Cas9 og deretter transduseres med rAAV6-vektoren. En KI-prøve vil bli elektroporert med CRISPR/Cas9 og deretter transduseres med rAAV6-vektoren. rAAV6 må inneholde homologiarmer opp- og nedstrøms for det målrettede DSB-nettstedet for HDR. - Plasser platen i en vevskulturinkubator ved 37 °C og 5 % CO2 med fuktighet.
- Tell cellene og registrer levedyktighet på dag 1 etter teknikk.
- Oppdater B-celleutvidelsesmediet annenhver dag ved å telle cellene og deretter overføre hele volumet av cellene til et rent 1,5 ml mikrosenterrør. Sentrifuge ved 400 × g i 5 min, og kast supernatanten uten å forstyrre pelletsen. Resuspend cellene med 100 μL friskT B-celle ekspansjonsmedium, og overfør til en brønn av en 24-brønns vevskulturplate. Få opp middels volum for å oppnå en endelig cellekonsentrasjon ved 5 × 105 celler / ml.
MERK: En 48-brønns plate kan holde opptil 1 ml medium/brønn; en 24-brønns plate kan holde opptil 2 ml medium / brønn; en 12-brønnsplate kan holde opptil 4 ml medium/brønn, og en 6-brønnsplate kan holde opptil 8 ml medium/brønn. - La de konstruerte cellene ekspandere i minst 5 dager før du utfører nedstrømsanalyser som forstrømningscytometrianalyse, TIDE-analyse og veikryss PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den oppdaterte utvidelses- og aktiveringsprotokollen gjorde det mulig å utvide B-celler raskt på opptil 44 ganger på 7 dager (Figur 1; n =3 givere). I KO-eksperimentet viste B-celleantallet ved hjelp av Trypan blå farging mer enn 80% levedyktige celler med en liten reduksjon i cellegjenoppretting i både kontrollen og CD19 KO-prøvene ved 24 timers post-elektroporasjon (Figur 2A; p ≥ 0,05, n = 3 donorer). Dette resultatet indikerer at elektroporasjon påvirket den generelle B-cellehelsen litt. B-celler ble samlet inn på dag 5 etter transfeksjon for strømningscytometri og TIDE-analyser. Representative punktplott for kontrollen og KO-utvalget viste henholdsvis 14 % og 95 % CD19-negative celler (Figur 2B). Kvantatering av strømningsplottene viste betydelig reduksjon i CD19-uttrykket i KO-prøvene sammenlignet med kontrollen (Figur 2B; p ≤ 0,0001, n = 3 givere). Kromatogrammer av genomisk sekvensering (se primersekvenser i tabell 3) viste doble topper i CD19 KO B-cellene, noe som indikerer innsetting/sletting av nukleotider etter CRISPR/Cas9-mediert DSB, mens det ble observert enkle topper i kontrollen, noe som indikerer at det ikke har skjedd noen DSB i denne prøven (Figur 3A). Indelanalyse av kromatografiene (ved hjelp av et gratis online TIDE-analyseverktøy) av KO-prøvene viste høy % av indelformasjonen (>90 %) på CD19-locus, som er i samsvar med % CD19-proteintap påvist ved strømningscytometri (figur 3B; p ≥ 0,05, n = 3 donorer). Disse resultatene indikerer at CRISPR/Cas9 effektivt genererte en CD19 KO i B-celler. B-celler fra KI-eksperimentet ble samlet inn på dag 12 etter prosjektering for flowcytometri og veikryss PCR-analyser (tabell 4). Scatter-plott viste 64% av EGFP-positive celler i prøven som mottok rAAV6-vektoren (figur 4) sammen med RNP, mens ingen EGFP-positiv celle ble observert i kontrollen; minimal EGFP-positivitet ble observert i prøven som bare mottok AAV-vektor (figur 5A). Et veikryss PCR-forsterkning (se primersekvenser i tabell 3) viste 1,5 kbps-forsterkere i KI-prøven (figur 5B), mens det ikke ble observert noe PCR-produkt i verken kontroll- eller vektorprøven. Celleantall viste at utviklingsprosessen påvirker cellegjenoppretting i KI-eksemplet mer enn kontrollen eller de bare vektoreksemplene (Figur 5B). Alle prøver kom imidlertid raskt tilbake innen 3 dager etter teknikk (Figur 5B). Sammen indikerer disse resultatene at vellykket integrasjon av EGFP ved AAVS1-locus fører til stabilt uttrykk for EGFP minst 12 dager etter prosjektering.
Figur 1: B-celleutvidelse in vitro. B-celler ble sådd ved 1 × 106 celler på dag 0 (null) med en tetthet på 5 × 105 per ml og utvidet 44 ganger på 7 dager (n = 3 uavhengige givere). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2A: Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2B: Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2C: CRISPR/Cas9-mediert CD19 knockout (KO) i B-celler. (A) Stolpediagram viser >70% cellegjenoppretting (venstre panel) og >80% levedyktighet (høyre panel) av celler etter transfeksjon ble observert i både kontrollen og CD19 KO-prøvene etter 24 timer etter elektroporasjon. (B) Representative flytplott av CD19-gating av aktive celler viser henholdsvis 84,3 % og 3,43 % CD19-positive celler i kontrollprøven og CD19 KO-eksemplet. (C) Søylediagram viser betydelig reduksjon av CD19 i CRISPR/Cas9-mediert CD19 KO-gruppe (p ≤ 0,0001). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3A: Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3B: CD19-proteintap vs indelformasjon. (A) Kromatogrammer viser sekvenseringstopper for kontrollen og CD19-utstansingsprøven (KO). Den grå boksen på kontrolltoppene uthever målsekvensen til CD19 gRNA med det anslåtte klippeområdet angitt med en pil. CD19 KO viste "doble topper" sekvensering rundt det anslåtte kuttestedet, noe som indikerer innsetting / sletting av nukleotider etter den dobbeltstrengede pausen. (B) Søylediagram som viser konsistente resultater mellom % CD19-proteintap og % indelformasjon ved CD19-locus (p ≥ 0,05). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: rAAV6 AAVS1 MND-GFP vektorkonstruksjon. Expression cassette inneholder en sterk syntetisk promotorsekvens (MND), umiddelbart etterfulgt av en forbedret grønn fluorescensprotein (EGFP) kodingssekvens og polyadenyleringssekvens (Poly A). AAVS1-homologiarmene flankerer oppstrøms for MND-promotoren og nedstrøms for poly A-sekvensene. EGFP vil bli uttrykt under regulering av MND-promotoren. Sekvenslengder er angitt over hver komponent i konstruksjonen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5A: Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5B: Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5C: CRISPR/Cas9- og rAAV6-mediert stedsspesifikk integrasjon av EGFP-reporterkassetten i B-celler på dag 12 etter teknikk. (A) Representativ strømningsplott viser ingen EGFP-positive B-celler i verken kontrollen eller den kun vektorprøven kontra 64,4 % av de EGFP-positive B-cellene fra knockin-prøven (KI). (B) Junction polymerasekjedereaksjon av KI-prøve viser det predikerte 1,5 kbps-båndet; Finner ingen bånd i kontroll- eller vektorprøven. Vann ble brukt for å sikre ingen forurensning under PCR-prosessen. (C) Stolpediagram viser cellevekst for kontrollen, kun vektoren og EGFP-KI-prøvene over en periode på 3 dager etter teknikk. Brutt linje angir 1 × 106-cellers inndata. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| navn | gRNA-sekvens |
| CD19 | 5'-GCTGTGCTGCAGTGCCTCAA-3' |
| AAVS1 | 5'-GTCACCAATCCTGTCCCTAG-3' |
Tabell 1: gRNA-sekvenser.
| Reagenser | Volum per 1 reaksjon |
| P3 Primær Celle løsning | 16,4 ml |
| Tillegg 1 | 3,6 ml |
| Totalt | 20 ml |
Tabell 2: Fremstilling av nukleofeksjonsreagensblanding.
| Beskrivelse | Sekvens | Formål |
| CD19 fremover primere | 5'-AAATTCAGGAAAGGGTTGGAAG-3' | Forsterke CD19-locus for Indel-analyse |
| CD19 Omvendt primer | 5'-GCGGACCTCTTCTGTCCATG-3' | Forsterke CD19-locus for Indel-analyse |
| Junction PCR fremover primer | 5'-GGACGAGCTGTACAAGTAACG-3' | Veikryss PCR |
| Junction PCR omvendt primer | 5'-GAGACAGTGACCAACCATCC-3 | Veikryss PCR |
Tabell 3: Primere brukt.
| Beskrivelse | Fluorofor | Klone |
| Anti-menneskelig CD19 | PerCP | HIB19 |
| Levedyktighet fargestoff | eFlour 780 | - |
Tabell 4: Flowcytometri antistoff og levedyktighetsfargestoff.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Presis genomteknikk i primære humane B-celler har vært utfordrende inntil nylig9,10. Vi hadde tidligere publisert protokoller ved hjelp av CRISPR/Cas9 for å konstruere primære menneskelige B-celler9. Her skisserer vi forbedrede protokoller for B-celleisolasjon, utvidelse og ingeniørarbeid for å muliggjøre effektiv KO av CD19 eller for knocking-in EGFP.
Her viser vi at vår ekspansjonsprotokoll tillater rask utvidelse av B-celler i kulturen i opptil 44 ganger ekspansjon på 7 dager (figur 1). Denne protokollen viste en raskere ekspansjonshastighet enn de som ble rapportert av Johnson et al.9 og Hung et al.10 De kritiske trinnene for å sikre sunn og rask utvidelse av primære B-celler etterfyller mediet med friske aktiveringsfaktorer annenhver dag og sikrer at antall totale B-celler i kulturen ikke overstiger 2 × 106 celle / ml.
Vi fant også ut at vår forbedrede protokoll for transfekting av CRISPR/Cas9-systemet for CD19 KO resulterte i høy CD19 KO-effektivitet (figur 2 og figur 3). I likhet med en tidligere studie9, observerte vi en liten reduksjon i cellegjenoppretting og levedyktighet etter elektroporasjon ved 24 timer. Dette indikerer at elektroporasjon påvirker den generelle celletilstanden til primære B-celler; Cellene kommer imidlertid til slutt tilbake innen 48 timer (data ikke vist).
Fordelen med å bruke denne elektroporatorprotokollen er at vi kan elektroporateprøver med mye raskere hastighet (16 reaksjoner på mindre enn 1 min), mens tidligere protokoller9,10 tar omtrent 10-12 min for 16 reaksjoner. I tillegg eliminerer dette transfeksjonssystemet den potensielle elektriske lysbuen til elektroporatoren som ble observert i tidligere studier9,10. Videre kan denne ingeniørmetoden skaleres opp for større antall B-celler ved hjelp av større, kommersielt tilgjengelige cuvettes (data ikke vist).
Noen få kritiske trinn for å sikre optimal generell cellehelse og KO-effektivitet: Først må du sørge for at B-celleutvidelsesmediet er forberedt og forhåndskonlibrert i minst 15 minutter før bruk. For det andre bør det totale volumet av transfeksjonssubstrat ikke overstige 20% (v / v) av nukleofeksjonsreagenset. For det tredje må cellene utvides/aktiveres i 48 ± 2 timer for optimale resultater. For det fjerde, trykk elektroporasjonskrovetten forsiktig før du plasserer den i elektroporatoren for å sikre at transfeksjonsreaksjonsløsningen dekker bunnen av cuvette. For det femte, sørg for å hvile de elektroporerte cellene i cuvette i bare 15 min ved RT; å forlate celler i nukleofeksjonsreagensen etter elektroporasjon for lenge kan skade den totale celleoverlevelsen. For det sjette, sørg for å inkubere cellene med medier i cuvette i ikke lenger enn 30 minutter. Syvende, å plassere 106 elektroporerte celler i 1 ml i de første 48 h har en tendens til å hjelpe celler med å gjenopprette raskere enn å dyrke dem ved lavere tetthet (data ikke vist). Til slutt vil bruk av enten Cas9 mRNA eller Cas9 protein resultere i lignende redigeringseffektivitet (data ikke vist); Vi brukte imidlertid Cas9 mRNA for enkelhets skyld og kostnad.
To hovedbekymringer ved bruk av CRISPR/Cas9 er off-target effekter og kromosomale translokasjoner. Off-target effekter forårsaket av uoverensstemmende basepar av sgRNA til målsekvensen, fører til mange mulige bindingssteder på genomet og skape flere, uønskede gen KOs. Derfor bør den anslåtte off-target poengsummen tas i betraktning sammen med poengsummen på målet for å minimere dette problemet. Kromosomal translokasjon kan oppstå på grunn av off-target effekter eller når du slår ut flere gener. Dette kan forårsake katastrofale hendelser eksperimentelt og klinisk. Base redaktører12 endre en enkelt nukleotid (to klasser: cytosin base editor og adenine base editor) for å forstyrre skjøteelementet, for å skape en for tidlig stopp codon, eller for å skape en punktmutasjon, som fører til mål gen KO uten DSB (gjennomgått omfattende andre steder12). Dermed kan baseredigeringsmetoden brukes til enkelt- eller flergen-KOer for å omgå kromosomale translokasjoner.
Vi viser også at CRISPR/Cas9, sammen med rAAV6, kan brukes til effektivt å megle stedsspesifikk KI og uttrykk for EGFP ved AAVS1-locus. Vi observerte EGFP-uttrykk i minst 12 dager etter prosjektering. Vi observerte også to EGFP-positive populasjoner: et høy- og mellomliggende EGFP-uttrykk i KI-utvalget på dag 12 (figur 5A), mens den vektorbaserte prøven viste en minimal prosentandel celler med mellomliggende EGFP-uttrykk. Vi spekulerer i at dette "høye og mellomliggende populasjoner" fenomenet skyldes biallelic integrasjon av vektoren. Videre undersøkelser ved hjelp av PCR13 av mellom- og høy-EGFP-cellene kan gjøres for å bekrefte denne hypotesen. To advarsler om å bruke AAV som vektor: For det første har AAV-vektorer en liten lastekapasitet, opptil 4,7 kilobaser, noe som forårsaker problemer når du banker på et stort gen. Å redusere størrelsen på homologiarmene vil tillate overnatting av et større gen, noe som igjen vil redusere KI-effektiviteten (data ikke vist). Alternativt kan samtidig eller sekvensiell integrasjon av flere genlastevektorer brukes14,15. Studier har rapportert en immunrespons og en clearance av AAV-transduced celler i immunodumpente dyremodeller16,17. Alternativt kan en ikke-viral donor HDR-mal utforskes for å omgå dette problemet.
Oppsummert har vi demonstrert omfattende, trinnvise prosesser for isolasjon, ekspansjon og prosjektering av B-celler som resulterte i høy genmodifiseringseffektivitet. Denne ingeniørmetoden kan brukes til gen-KO og til å studere egenskapene til gener i B-celler. I tillegg kan denne metoden brukes til å konstruere B-celler for å uttrykke et rekombinant antistoff for å bekjempe infeksjon. Til slutt kan denne metoden brukes på ingeniør B-celler for å uttrykke og utskille terapeutiske enzymer som kan brukes som en autolog cellebasert terapi for å behandle enzymopatier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det er innlevert patent på metodene for å lage og bruke genomredigerte B-celler med M.J.J, K.L., og B.S.M. som oppfinnere. B.S.M er konsulent for og eier aksjer i Immusoft Inc. Immusoft Inc har sponset forskning i laboratoriet til B.S.M.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Children's Cancer Research Fund (CCRF) og NIH R01 AI146009 til B.S.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug | IDT | 1081059 | smaller size is also available |
| Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza | V4XP-3032 | |
| Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CleanCap chemically modified Cas9 mRNA | Trilink Biotechnology | L-7206-1000 | |
| CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg | Invivogen | TLRL-2006-5 | different sizes available |
| Cryostor CS10, 100 mL | STEMCELL Technology | 7930 | |
| CTS Immune Cell SR | Thermo Fisher Scientific | A2596101 | |
| EasySep human B cells isolation kit | STEMCELL Technology | 17954 | |
| eBioscience fixable viability dye eFlour 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | |
| Excellerate B cell media, Xeno-free | R&D Systems | CCM031 | B-cell basal medium |
| Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11550 | For thawing B cells only |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps | BioExpress | T-3035-1 / 490003-692 | |
| Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS | GE lifesciences | SH30256.01 | |
| Lonza 4D Nucleofector core unit | Lonza | AAF-1002B | |
| Lonza 4D Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Mega CD40 Ligand | Enzo Life Sciences | ALX-522-110-C010 | |
| Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | For freezing cells |
| Pen/Strep 100X | Sigma-Aldrich | TMS-AB2-C | |
| PerCP anti-human CD19 clone HIB19 | biolegend | 302228 | smaller size is also available |
| rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.) | Vigene Biosciences | N/A | large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL |
| Recombinant human IL-10 protein 250 ug | R&D Systems | 217-IL-250 | different sizes available |
| Recombinant human IL-15 protein 25 ug | R&D Systems | 247-ILB-025 | different sizes available |
| The Big Easy EasySep Magnet | STEMCELL Technology | 18001 | different sizes available |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Fisher Scientific | BP2476100 |
References
- LeBien, T. W., Thomas, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).
- Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. Humoral immunity due to long-lived plasma cells. Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).
- Spriggs, M. K., et al. Recombinant human CD40 ligand stimulates B cell proliferation and immunoglobulin E secretion. Journal of Experimental Medicines. 176 (6), 1543-1550 (1992).
- Fusil, F., et al. A lentiviral vector allowing physiologically regulated membrane-anchored and secreted antibody expression depending on B-cell maturation status. Molecular Therapy. 23 (11), 1734-1747 (2015).
- Luo, X. M., et al. Engineering human hematopoietic stem/progenitor cells to produce a broadly neutralizing anti-HIV antibody after in vitro maturation to human B lymphocytes. Blood. 113 (7), 1422-1431 (2008).
- Mock, U., Thiele, R., Uhde, A., Fehse, B., Horn, S. Efficient lentiviral transduction and transgene expression in primary human B cells. Human Gene Therapy Methods. 23 (6), 408-415 (2012).
- Heltemes-Harris, L. M., et al. Sleeping Beauty transposon screen identifies signaling modules that cooperate with STAT5 activation to induce B-cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 35 (26), 3454-3464 (2016).
- Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease. Scientific Reports. 8, 12144 (2018).
- Hung, K. L., et al. Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells. Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).
- Cui, Y., Xu, J., Cheng, M., Liao, X., Peng, S. Review of CRISPR/Cas9 sgRNA design tools. Interdisciplinary Sciences. 10 (2), 455-465 (2018).
- Rees, H. A., Liu, D. R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).
- Spiegel, A., Bachmann, M., Jurado Jiménez, G., Sarov, M. CRISPR/Cas9-based knockout pipeline for reverse genetics in mammalian cell culture. Methods. 164-165, 49-58 (2019).
- Suzuki, T., Kazuki, Y., Oshimura, M., Hara, T. A novel system for simultaneous or sequential integration of multiple gene-loading vectors into a defined site of a human artificial chromosome. PLoS One. 9, 110404 (2014).
- Bak, R. O., Porteus, M. H. CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors. Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).
- Shirley, J. L., de Jong, Y. P., Terhorst, C., Herzog, R. W. Immune responses to viral gene therapy vectors. Molecular Therapy. 28 (3), 709-722 (2020).
- Martino, A. T., Markusic, D. M. Immune response mechanisms against AAV vectors in animal models. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 198-208 (2020).
