Summary
Här tillhandahåller vi ett detaljerat, steg-för-steg-protokoll för CRISPR/Cas9-baserad genomteknik av primära mänskliga B-celler för gen knockout (KO) och knock-in (KI) för att studera biologiska funktioner hos gener i B-celler och utveckling av B-cellsterapier.
Abstract
B-celler är lymfocyter som härrör från hematopoetiska stamceller och är en viktig komponent i det adaptiva immunsystemets humorala arm. De gör attraktiva kandidater för cellbaserade terapier på grund av deras enkla isolering från perifert blod, deras förmåga att expandera in vitro och deras livslängd in vivo. Dessutom kan deras normala biologiska funktion - för att producera stora mängder antikroppar - användas för att uttrycka mycket stora mängder av ett terapeutiskt protein, såsom en rekombinant antikropp för att bekämpa infektion eller ett enzym för behandling av enzymopatier. Här tillhandahåller vi detaljerade metoder för att isolera primära mänskliga B-celler från perifert blod mononukleära celler (PBMCs) och aktivera/expandera isolerade B-celler in vitro. Vi demonstrerar sedan de steg som är involverade i att använda CRISPR/Cas9-systemet för platsspecifik KO av endogena gener i B-celler. Denna metod möjliggör effektiv KO av olika gener, som kan användas för att studera de biologiska funktionerna hos gener av intresse. Vi demonstrerar sedan stegen för att använda CRISPR/Cas9-systemet tillsammans med en rekombinant, adeno-associerad, viral (rAAV) vektor för effektiv platsspecifik integration av en transgene uttryckskassett i B-celler. Tillsammans ger detta protokoll en steg-för-steg-teknisk plattform som kan användas i primära mänskliga B-celler för att studera biologiska funktioner hos gener samt för utveckling av B-cellsterapier.
Introduction
B-celler är en undergrupp av lymfocyt härstamningen härrör från hematopoetiska stamceller. De utför en kritisk roll i det adaptiva humorala immunsystemet genom att producera stora mängder antikroppar som svar på immunutmaningar1. B-celler är också föregångare till minne B-celler och de terminalt differentierade, långlivade plasmacellerna, vilket ger varaktig humoral immunitet2. Plasmaceller är i synnerhet unika bland immunceller i deras förmåga att producera stora mängder av en specifik antikropp medan de överlever i år eller årtionden3. Dessutom gör den enkla isoleringen från perifert blod B-cells härstamningen till en utmärkt kandidat för nya cellbaserade terapier4.
Tidigare har slumpmässiga integrationsmetoder, såsom de som använder lentivirala vektorer eller en Törnrosatransposon, använts för att konstruera B-celler för transgeneleverans ochuttryck 5,6,7,8. Den icke-specifika karaktären hos dessa metoder gör det dock svårt att studera de biologiska funktionerna hos en specifik gen i B-cellerna och medför en inneboende risk för infogning av mutagenes och variabelt transgeneuttryck och/eller tystning i den terapeutiska miljön.
CRISPR/Cas9-systemet är ett kraftfullt genomteknikverktyg som gör det möjligt för forskare att exakt redigera arvsmassan hos olika celler i många arter. Nyligen har två grupper, inklusive vår egen, framgångsrikt utvecklat metoder för ex vivo expansion och riktad genomteknik av primära mänskliga B-celler9,10. Vi kommer att beskriva processen att rena primära mänskliga B-celler från ett leukaforesprov. Därefter kommer vi att beskriva vårt uppdaterade protokoll för B-cellsexpansion och aktivering av isolerade B-celler. Vi kommer sedan att beskriva en process för att slå ut kluster av differentiering 19 (CD19), en specifik B-cellsreceptor och ett kännetecken för B-celler, genom elektroporation för att introducera CRISPR / Cas9 mRNA tillsammans med CD19 sgRNA i aktiverade B-celler.
Cas9 mRNA översätts och binds till CD19 sgRNA för att bilda ett CRISPR/Cas9-sgRNA ribonucleoproteinkomplex (RNP). Därefter leder sgRNA i komplexet Cas9 att skapa dubbelsträngsbrytning (DSB) vid målsekvensen på exon 2 av genen. Cellerna kommer att reparera DSB genom "icke-homolog end joining" genom att införa eller ta bort nukleotider, vilket leder till frameshift mutation och orsakar genen slås ut. Vi kommer sedan att mäta förlusten av CD19 genom flödescytometri och analysera indelbildning genom att spåra indels genom nedbrytning (TIDE) analys.
Vi kommer sedan att beskriva processen att använda CRISPR / Cas9 tillsammans med en rekombinant AAV6 vektor (rAAV6, en givarmall för homologi-riktad reparation (HDR)) för att medla platsspecifik insättning av förbättrat grönt fluorescerande protein (EGFP) vid den adeno-associerade virusintegrationsplats 1 (AAVS1) genen. AAVS1-genen är en aktiv locus utan kända biologiska funktioner och en AAV viral integrationsplats på det mänskliga genomet; Därför anses det vara en "säker hamn" för genomteknik. Här rapporterar vi att expansion och aktivering av B-celler tillät upp till 44-faldig expansion under 7 dagars kultur (figur 1). Elektroporering av B-celler visade en liten minskning av den totala cellhälsan (figur 2A) vid 24 h post-transfection. Spridningsdiagramanalysen av CD19-markören(figur 2B)visade en minskning av de redigerade cellerna med upp till 83 % (figur 2C).
TIDE:s analys av kromatograferna (figur 3A) visade att de % indels liknade den % proteinförlusten genom flödescytometri (figur 3B). Flödescytometrianalysen av KI-experimentet visade att cellerna som fick AAV-vektor (figur 4), tillsammans med RNP, uttryckte upp till 64% EGFP-positiva celler (figur 5A) och senare visade framgångsrik integration genom junction polymeraskedjereaktion (PCR) (Figur 5B). Antalet celler visade att alla prover snabbt återhämtade sig inom 3 dagar efter tekniken (figur 5C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Leukapheresis prover från friska donatorer erhölls från en lokal blodbank. Alla experiment som beskrivs här bestämdes vara undantagna för forskning av Institutional Review Board (IRB) och godkändes av Institutional Biosafety Committee (IBC) vid University of Minnesota.
OBS: Alla experiment utfördes i enlighet med den universella försiktigheten för blodburna patogener, med sterila/aseptiska tekniker och korrekt biosäkerhet nivå-2 utrustning.
1. Förbered kosttillskott för B-cellsexpansionsmedium
- Reconstitute CpG oligonukleotid till en koncentration av 1 mg/ml.
- Reconstitute CD40 ligand (CD40L) till en koncentration av 100 μg/ml.
- Rekonstruera rekombinant människa IL-10 (rhIL-10) till en koncentration av 50 μg/ml.
- Rekonstruera rekombinant människa IL-15 (rhIL-15) till en koncentration av 10 μg/ml.
OBS: Förvara varje tillägg i små alikvoter vid -20 °C till -80 °C i upp till 6 månader.
2. Förbered basalt medium
- Kombinera B-cellsbasalt medium med 5% (v/v) mediatillskott för in vitro immuncellexpansion (t.ex. CTS Immune Cell SR) och 1% (v/v) penicillin och streptomycin.
- Filtersterilisera basalmediet med en filteradapter på 0,22 μm till en steriliserad flaska.
- Håll basalmediet vid 4 °C i upp till 1 månad.
3. Förbered B-cellsexpansionsmedium
- Överför den erforderliga mängden basalt medium till en steril behållare för att odla B-cellerna vid 5 × 105 celler/ml.
- Komplettera det basala mediet med 1 μg/mL CpG, 100 ng/mL CD40L, 50 ng/mL rhIL-10 och 10 ng/mL rhIL-15.
- Filtrera B-cellsexpansionsmediet med ett filter på 0,22 μm.
- Balansera B-cellsexpansionsmediet i vävnadskulturinkubatorn vid 37 °C, 5 % CO2 med fuktighet i minst 30 minuter före användning.
OBS: Förbered nytt B-cellsexpansionsmedium som ska användas under en dag. Förbered inte B-cellsexpansionsmediet som ska användas i flera dagar. Detta medierecept uppmuntrar spridning av minne B celler och aktiverade primära mänskliga B celler.
4. Mänsklig B-cellsrening och expansion
OBS: Tillsätt 99–100 % isopropylalkohol i en temperaturkontrollerad frysbehållare enligt tillverkarens anvisningar och kyl frysbehållaren vid 4 °C innan steg 4.1 påbörjas.
- Isolera PBMCs från ett leukaforesprov
- Överför ett leukaforesprov (ca 8–10 ml) till ett sterilt koniskt rör på 50 ml.
- Öka volymen till 35 ml med steril 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Skikta försiktigt ett 35 ml leukaforesprov på 15 ml densitetsgradientmedium.
- Centrifug vid 500 × g i 25 min utan broms, ta bort plasmaskiktet utan att störa den buffy kappan (PBMC-skiktet), samla PBMCs från gränssnittet och överför till ett nytt sterilt 50 mL koniskt rör.
- Ta upp PBMCs till 50 ml med 1x PBS.
- Centrifugera vid 500 × g i 5 min utan broms. Ta bort supernatanten utan att störa PBMC-pelleten, som kan verka röd.
- Tillsätt 7 ml ammoniumklorid-kaliumlysbuffert, pipett 3 gånger för att blanda väl och inkubera vid rumstemperatur (RT) i 3 min.
- Ta upp volymen till 50 ml med 1x PBS.
- Centrifugera vid 400 × g i 5 min med lågmotståndsbroms. Ta bort supernaten utan att störa pelleten. Pelleten ska se rosa eller vit ut.
OBS: Om du vill fortsätta att odla de nyisolerade B-cellerna bereder du B-cellsexpansionsmediet innan du påbörjar isoleringen av B-celler (steg 4.2).
- B-cellsisolering från PBMCs med humant primärt B-cells negativt isoleringskit
- Återanvänd pbmcs i isoleringsbufferten till en koncentration av 5 × 107 celler/ml.
OBS: Om det totala antalet PBMCs är mindre än 5 × 107 celler, skala ner volymen av isoleringsbufferten för att upprätthålla 5 × 107 celler/ml. Minsta och högsta volymer cellfjädring är 0,25 ml respektive 8 ml. - Överför upp till 8 ml (5 × 107 celler/ml) till ett sterilt, polypropylen, rundbottnat rör med lock.
- Tillsätt 50 μL/ml cocktailförstärkare till PBMCs.
- Tillsätt 50 μL/ml Isolation Cocktail till PBMCs, kapa röret och vänd 2–3 gånger för att blanda.
- Inkubera på RT i 5 minuter; i den4:e inkubationsminuten virvelmagnetiska mikrober i minst 30 s.
- Överför 50 μL magnetiska mikrober per 1 ml PBMCs, kapa röret och vänd 2–3 gånger för att blanda.
- Toppa upp till 10 ml med isoleringsbuffert och försiktigt pipett upp och ner 2–3 gånger.
- Placera röret i en magnetstation och inkubera på RT i 3 minuter.
- Håll ihop magneten och röret, och i en rörelse, vänd ihop magneten och röret för att hälla cellupphängningen i det nya röret. Kassera det gamla röret.
- Upprepa steg 4.2.8 (minska inkubationstiden till 2 min) och häll B-cellsupphängningen i ett rent koniskt rör.
- De berikade B-cellerna är klara att användas. Om celler kommer att användas omedelbart, fortsätt till avsnitt 4.3 (Human B-cellsexpansion). Kontrollera renheten hos de isolerade B-cellerna genom flödescytometri (valfritt). Om celler ska frysas före användning fortsätter du att steg 4.2.12.
- För att frysa B-cellerna, centrifug vid 400 × g i 5 min och kassera supernaten utan att störa pelleten.
- Återanvänd cellerna i frysmedel vid 107 celler/ml och alikvot 1 ml/kryovial.
- Placera kryovialen i den kylda frysbehållaren och förvara vid -80 °C över natten; överför sedan den frusna kryovialen till en flytande kvävetank; hålla frysta celler upp till 1 år.
OBS: Förväntad avkastning av isolerade B-celler är 2%-8% av de totala PBMCs, med 95%-99% livskraft.
- Återanvänd pbmcs i isoleringsbufferten till en koncentration av 5 × 107 celler/ml.
- Mänsklig B-cellsexpansion
OBS: Om du använder nyisolerade B-celler hoppar du över steg 4.3.1–4.3.5. Räkna cellerna och överför det önskade antalet celler till ett sterilt koniskt rör och fortsätt med steg 4.3.6.- Förvärmt fetalt bovint serum (FBS) i ett vattenbad innan B-cellerna tinas upp. Förbered 20 ml B-cellsexpansionsmedium, överför till en T25-kolv och förjämför mediet i en vävnadskulturell inkubator (vid 37 °C, 5 % CO2, med fuktighet) minst 15 minuter före användning.
- Tina B-celler i ett 37 °C vattenbad. Under väntan, överför 2 ml förvärmd FBS till ett sterilt 15 ml koniskt rör.
- När B-cellerna är helt tinade, tillsätt omedelbart 1 ml förvärmd FBS, droppvis, i provet. Inkubera på RT i 1 minut.
- Försiktigt pipett för att återanvända provet och överföra hela volymen, droppevis, till ett koniskt rör som innehåller 2 ml förvärmd FBS.
- Ta upp volymen till 15 ml med steril 1x PBS, lock och vänd röret försiktigt 2-3 gånger.
- Centrifugera vid 400 × g i 5 min.
- Kassera supernatanten utan att störa cellpelleten, återanvänd cellpelleten med 1 ml förjämfört B-cellsexpansionsmedium och räkna cellerna. Det totala cellnumret ska vara cirka 107 celler.
- Överför cellerna till en kolv som innehåller 20 ml av det förjämviktade B-cellsexpansionsmediet. Den slutliga koncentrationen av cellerna bör vara cirka 5 x 105 celler/ml.
- Inkubera kolven vertikalt i en inkubator för vävnadskultur.
- Uppdatera expansionsmediet helt varannan dag genom att överföra hela volymen B-celler till ett sterilt koniskt rör och upprepa steg 4.3.6–4.3.9.
OBS: T25-kolven rymmer 10–20 ml medium; T75 kolv rymmer upp till 20–60 ml medium.
5. Primär B-cellsteknik för människa
- Ingenjör B-celler på 48 ± 2 timmar efter expansion/aktivering för optimala resultat. Förbered B-cellsexpansionsmediet, alikvot 1 ml av mediet till en 48-brunns vävnadskulturell platta och förjämvikt i en vävnadskulturell inkubator minst 15 minuter före användning.
OBS: När du utformar en CRISPR/ Cas9 sgRNA för en gen av intresse, följ stegen som beskrivs nedan.
- Designa sgRNAs med ett onlineverktyg11.
- Designa sgRNAs på en exon som är gemensam för alla isoformer av proteinet.
- Beställ kemiskt modifierat sgRNA från välrenommerade företag.
- sgRNA kommer vanligtvis i lyofiliserad form; rekonstituera sgRNA i steril DNase/RNase-fri Tris-EDTA -buffert (TE) till en koncentration av 1 μg/μL. - Förbered CRISPR/Cas9-transfekteringssubstrat genom att blanda 1 μL (1 μg/μL) kemiskt modifierat sgRNA med 1,5 μL (1 μg/μL) kemiskt modifierad Streptococcus pyogenes Cas 9 (S.p. Cas9) nukleas per transfection reaktion. Använd 1 μL TE-buffert i stället för sgRNA för kontroll.
OBS: När CD19 sgRNA används för ett gen KO-experiment, se figur 2 för resultat. När AAVS1 sgRNA används för ett gen-KI-experiment, se figur 5 för resultat.- Håll alla komponenter på is.
- Blanda försiktigt och överför 2,5 μL CRISPR/Cas9 transfekterande substrat per reaktion till ett rör med en 0,2 ml 8-rörsremsa. avsätts på RT.
- Slå på en nukleofector (elektroporator) och förbered transfection reagenser enligt tabell 1.
OBS: Detta är ett bra steg för en paus, om nödvändigt, genom att lägga alla reagenser på is. Ta bort alla reagenser från isen när de är redo att återuppta experimentet. Vid användning av S.p. Cas9-protein måste prövaren förkomplext CRISPR/Cas9-sgRNA ribonukleoprotein genom att blanda 1 μg sgRNA med 5 μg S.p. Cas9-protein, undvika bubblor och inkubera blandningen vid RT i minst 20 minuter före användning för optimalt resultat. - Räkna och överför 106 B celler per transfektionsreaktion till ett sterilt koniskt rör.
- Ta upp volymen till 15 ml med steril 1x PBS och centrifug vid 400 × g i 5 min. Förbered det primära celltransfectionreagenset (tabell2)medan du väntar och ställ åt sidan på RT.
- Kassera supernaten utan att störa cellpelleten.
- Återanvänd cellpelleten med 10 ml steril 1x PBS och centrifugera vid 400 × g i 5 min.
- Kassera supernaten helt utan att störa cellpelleten.
- Överför 0,5 μg kemiskt modifierat GFP mRNA (som transfection reporter) per 106 B celler till cellpelleten (valfritt).
- Återanvänd cellpelleten med 20 μL primärcellstransfektionsreagens per 106 B-celler. blanda försiktigt genom pipetting 5–6 gånger. Överför 20,5 μL per transfection-reaktion till 0,2 ml-röret på 8-rörsremsan som innehåller 2,5 μL av CRISPR/Cas9-transfectionsubstratet.
- Pipett upp och ner en gång för att blanda och överföra hela volymen (23 μL) till en transfection cuvette. Täck och knacka försiktigt på cuvette på bänken för att säkerställa att vätskan täcker botten av cuvette.
- Använd humant primärt B-cellsprotokoll på nukleofectorn för transfection.
OBS: Nukleofector (elektroporator) kan placeras och användas utanför vävnadskulturens huva. Kapsej cuvette för att säkerställa sterilitet. - Vila de elektroporerade cellerna i cuvette på RT i 15 min.
- Överför 80 μL av det förjämviktade B-cellsexpansionsmediet från vävnadskulturplattan till transfektreaktionen i cuvetten. Placera cuvette i vävnadskulturens inkubator i 30 min.
- Varsamt pipett ett par gånger för att blanda och överföra hela volymen av provet från cuvette till en lämplig brunn av en 48-brunns vävnadskulturell platta som innehåller 1 ml B-cellsexpansionsmedium. Den slutliga koncentrationen av cellerna ska vara 106 celler/ml.
- Om du utför ett gen KI-experiment, överför rAAV6 vektor vid 500 000 multiplicitet av infektion till lämplig brunn som innehåller elektroporerade celler (cirka 45 min efter elektroporering). Se exempel på rAAV6-vektorkonstruktion i figur 4A.
OBS: Till exempel: Ett kontrollprov kommer att elektroporeras utan CRISPR/ Cas9 eller rAAV6-vektorn. Ett vektorprov elektroporeras utan CRISPR/Cas9 och transduceras sedan med rAAV6-vektorn. Ett KI-prov kommer att elektroporeras med CRISPR/Cas9 och sedan transduceras med rAAV6-vektorn. rAAV6 måste innehålla homologiska armar upp- och nedströms den riktade DSB-platsen för HDR. - Placera plattan i en vävnadskulturinkubator vid 37 °C och 5 % CO2 med fuktighet.
- Räkna cellerna och registrera livskraften dag 1 efter tekniken.
- Uppdatera B-cellsexpansionsmediet varannan dag genom att räkna cellerna och sedan överföra hela volymen av cellerna till ett rent 1,5 ml mikrocentrifugrör. Centrifug vid 400 × g i 5 min och kassera supernatanten utan att störa pelleten. Återanvänd cellerna med 100 μL färskt B-cellsexpansionsmedium och överför till en brunn av en 24-brunns vävnadskulturplatta. Ta upp medelvolymen för att uppnå en slutlig cellkoncentration vid 5 × 105 celler/ml.
OBS: En 48-brunnsplatta kan rymma upp till 1 ml medium/brunn; en 24-brunnsplatta kan rymma upp till 2 ml medium/brunn; en 12-brunnsplatta kan rymma upp till 4 ml medium/brunn, och en 6-brunnsplatta kan rymma upp till 8 ml medium/brunn. - Låt de konstruerade cellerna expandera i minst 5 dagar innan de utför nedströmsanalyser som för flödescytometrianalys, TIDE-analys och korsning PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det uppdaterade expansions- och aktiveringsprotokollet möjliggjorde snabb expansion av B-celler upp till 44 gånger på 7 dagar (figur 1; n = 3 givare). I KO-experimentet visade B-cellsantalet med trypanblå färgning mer än 80% livskraftiga celler med en liten minskning av cellåtervinningen i både kontrollen och CD19 KO-proverna vid 24 h postelektroporering (Figur 2A; p ≥ 0,05, n = 3 givare). Detta resultat indikerar att elektroporation påverkade den totala B-cellshälsan något. B celler samlades på dag 5 post-transfection för flöde cytometri och TIDE analyser. Representativa spridningsdiagram för kontroll- och KO-provet visade 14 % respektive 95 % CD19-negativa celler (figur 2B). Kvantifieringen av flödesdiagrammen visade en betydande minskning av CD19-uttrycket i KO-proverna jämfört med kontrollen (figur 2B,p ≤ 0,0001, n = 3 givare). Kromatogram av genomisk sekvensering (se primersekvenser i tabell 3) visade dubbla toppar i CD19 KO B-cellerna, vilket indikerar införanden/borttagningar av nukleotider efter CRISPR/Cas9-medierad DSB, medan enstaka toppar observerades i kontrollen, vilket indikerar att ingen DSB inträffade i detta prov (figur 3A). Indelanalys av kromatograferna (med hjälp av ett gratis tidvattenanalysverktyg online) av KO-proverna visade att ko-proverna uppvisade en hög % indelbildning (>90%) vid CD19-locus, vilket överensstämmer med % CD19-proteinförlust som detekteras av flödescytometri (figur 3B, p ≥ 0,05, n = 3 givare). Dessa resultat visar att CRISPR/Cas9 effektivt genererade en CD19 KO i B-celler. B-celler från KI-experimentet samlades in dag 12 efter teknik för flödescytometri och korsning PCR-analyser (Tabell 4). Spridningsdiagram visade 64 % av egfp-positiva celler i det prov som fick rAAV6-vektorn (figur 4) tillsammans med RNP, medan ingen EGFP-positiv cell observerades i kontrollen. minimal EGFP-positivitet observerades i det prov som endast fick AAV-vektor (figur 5A). En PCR-förstärkning i korsning (se primersekvenser i tabell 3)visade 1,5 kbit/s ampliconer i KI-provet (figur 5B), medan ingen PCR-produkt observerades i vare sig kontroll- eller vektorprovet. Antalet celler visade att den tekniska processen påverkar cellåtervinningen i KI-provet mer än kontrollproverna eller vektorproverna (figur 5B). Alla prover återhämtade sig dock snabbt inom 3 dagar efter tekniken (figur 5B). Tillsammans tyder dessa resultat på att en framgångsrik integrering av EGFP vid AAVS1-locus leder till ett stabilt uttryck för EGFP minst 12 dagar efter tekniken.
Figur 1: B-cellexpansion in vitro. B celler såddes vid 1 × 106 celler dag 0 (noll) med en densitet av 5 × 105 per ml och expanderas 44-faldigt i 7 dagar (n=3 oberoende givare). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 2A: Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 2B: Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 2C: CRISPR/Cas9-medierad CD19-knockout (KO) i B-celler. (A) Stapeldiagram visar >70% cellåterställning (vänster panel) och >80% livskraft (höger panel) hos celler efter transfektion observerades i både kontroll- och CD19 KO-proverna vid 24 timmar efter elektroporering. B)Representativa flödesdiagram för CD19-gating av levande celler visar 84,3% respektive 3,43% CD19-positiva celler i kontrollprovet respektive CD19 KO-provet. C)Stapeldiagrammet visar en betydande minskning av CD19 i den CRISPR/Cas9-medierade CD19 KO-gruppen (p ≤ 0,0001). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 3A: Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3B: CD19-proteinförlust kontra indelbildning. (A) Kromatogram visar sekvenseringstoppar för kontroll- och CD19-knockoutprovet (KO). Den grå rutan på kontrolltopparna belyser målsekvensen för CD19 gRNA med den förväntade klippplatsen indikerad av en pil. CD19 KO visade "dubbla toppar" sekvensering runt den förutsagda klippplatsen, vilket indikerar införing / borttagningar av nukleotider efter den dubbelsträngade pausen. B)Stapeldiagram som visar konsekventa resultat mellan % cd19-proteinförlust och % indelbildning vid CD19-johannesbrödet (p ≥ 0,05). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: rAAV6 AAVS1 MND-GFP vektorkonstruktion. Uttryckskassett innehåller en stark syntetisk promotor (MND) sekvens, omedelbart följt av en förbättrad grön fluorescens protein (EGFP) kodning sekvens och poly adenylation (Poly A) sekvens. AAVS1 homologi armar flank uppströms MND promotorn och nedströms poly A sekvenser. EGFP kommer att uttryckas i förordningen av MND-initiativtagaren. Sekvenslängder anges ovanför varje komponent i konstruktionen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 5A: Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 5B: Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5C: CRISPR/Cas9- och rAAV6-medierad platsspecifik integration av EGFP:s reporterkassett i B-celler dag 12 efter tekniken. A)Representativt flödesdiagram visar inga EGFP-positiva B-celler i antingen kontroll- eller vektorprovet jämfört med 64,4 % av egfp-positiva B-celler från provet knockin (KI). B)Ki-provets reaktion av korsningspolymeraskedjan visar det förväntade 1,5 kbit/s-bandet. Inget band hittades i kontroll- eller vektorprovet. Vatten användes för att säkerställa ingen förorening under PCR-processen. (C) Stapeldiagrammet visar kontrollens celltillväxt, vektorproverna och EGFP-KI-proverna under en period av 3 dagar efter tekniken. Bruten linje anger 1 × 10 6-cellsinmatningen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Namn | gRNA-sekvens |
| CD19 (cd19) | 5'-GCTGTGCTGCAGTGCCTCAA-3' |
| AAVS1 (AAVS1) | 5'-GTCACCAATCCTGTCCCTAG-3' |
Tabell 1: gRNA-sekvenser.
| Reagenser | Volym per 1 reaktion |
| P3 Primärcellslösning | 16,4 ml |
| Tillägg 1 | 3,6 ml |
| Totala | 20 ml |
Tabell 2: Beredning av reagensblandning av nukleofection.
| Beskrivning | Sekvens | Syfte |
| CD19 framåt primers | 5'-AAATTCAGGAAAGGGTTGGAAG-3' | Förstärk CD19-locus för Indel-analys |
| CD19 Omvänd primer | 5'-GCGGACCTCTTCTGTCCATG-3' | Förstärk CD19-locus för Indel-analys |
| Korsning PCR framåt primer | 5'-GGACGAGCTGTACAAGTAACG-3' | Korsning PCR |
| Korsning PCR Omvänd primer | 5'-GAGACAGTGACCAACCATCC-3 | Korsning PCR |
Tabell 3: Primers används.
| Beskrivning | Fluorofor | Klon |
| Anti-mänsklig CD19 | PerCP (perCP) | HIB19 (HIB19) |
| Livsduglighet färgämne | eFlour 780 | - |
Tabell 4: Flödescytometriantikropp och livsduglighetsfärgning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Exakt genomteknik i primära mänskliga B-celler har varit utmanande fram till nyligen9,10. Vi hade tidigare publicerat protokoll med CRISPR /Cas9 för att konstruera primära mänskliga B-celler9. Här beskriver vi förbättrade protokoll för isolering, expansion och teknik av B-celler för att möjliggöra effektiv KO för CD19 eller för inknackning av EGFP.
Här visar vi att vårt expansionsprotokoll möjliggör snabb expansion av B-celler i kulturen för upp till 44-faldig expansion på 7 dagar (Figur 1). Detta protokoll visade en snabbare expansionshastighet än de som rapporterats av Johnson et al.9 och Hung et al.10 De kritiska stegen för att säkerställa en hälsosam och snabb expansion av primära B-celler fyller på mediet med färska aktiveringsfaktorer varannan dag och säkerställer att antalet totala B-celler i kulturen inte överstiger 2 × 106 cell/ml.
Vi konstaterade också att vårt förbättrade protokoll för transfektering av CRISPR/Cas9-systemet för CD19 KO resulterade i hög CD19 KO-effektivitet(figur 2 och figur 3). I likhet med en tidigarestudie 9observerade vi en liten minskning av cellåtervinningen och livskraften efter elektroporering vid 24 h. Detta indikerar att elektroporering påverkar den totala cellhälsan hos primära B-celler. Cellerna återhämtar sig dock så småningom inom 48 timmar (data visas inte).
Fördelen med att använda detta elektroporatorprotokoll är att vi kan elektroporera prover i en mycket snabbare hastighet (16 reaktioner på mindre än 1 minut), medan tidigareprotokoll 9,10 tar cirka 10-12 min för 16 reaktioner. Dessutom eliminerar detta transfection-system den potentiella elektriska bågen hos elektroporatorn som observerats i tidigarestudier 9,10. Dessutom kan denna tekniska metod skalas upp för större antal B-celler med större, kommersiellt tillgängliga cuvettes (data visas inte).
Några kritiska steg för att säkerställa optimal övergripande cellhälsa och KO-effektivitet: Se först till att B-cellsexpansionsmediet är förberett och förjämfört i minst 15 minuter före användning. För det andra bör den totala volymen transfection substrat inte överstiga 20% (v/v) av nukleofection reagenset. För det tredje måste cellerna expanderas/aktiveras i 48 ± 2 h för optimala resultat. För det fjärde, knacka försiktigt på elektroporerings cuvette innan du placerar i elektroporatorn för att säkerställa att transfectionreaktionslösningen täcker botten av cuvetten. För det femte, var noga med att vila de elektroporerade cellerna i cuvetten i endast 15 minuter på RT; att lämna celler i nukleofection reagens efter elektroporation för länge kan skada den totala cellens överlevnad. För det sjätte, se till att inkubera cellerna med media i cuvette i högst 30 minuter. För det sjunde tenderar placeringenav 10 6 elektroporerade celler i 1 ml under de första 48 h att hjälpa cellerna att återhämta sig snabbare än att odla dem med lägre densitet (data visas inte). Slutligen kommer användning av antingen Cas9 mRNA- eller Cas9-protein att resultera i liknande redigeringseffektivitet (data som inte visas); Vi använde dock Cas9 mRNA för bekvämlighet och kostnad.
Två stora problem vid användning av CRISPR/Cas9 är off-target effekter och kromosomala flyttningar. Off-target effekter som orsakas av omaka baspar av sgRNA till målsekvensen, leda till många möjliga bindande platser på genomet och skapa flera, oönskade gen KOs. Därför bör den förväntade off-target-poängen beaktas tillsammans med målpoängen för att minimera problemet. Kromosomal flyttning kan uppstå på grund av off-target effekter eller när slå ut flera gener. Detta kan orsaka katastrofala händelser experimentellt och kliniskt. Basredigerare12 ändrar en enda nukleotid (två klasser: cytosinbasredigerare och adeninbasredigerare) för att störa skarvelementet, för att skapa ett för tidigt stoppkodon eller för att skapa en punktmutation, vilket leder till målgen KO utan DSB (granskas utförligt någonannanstans 12). Således kan basredigeringsmetoden användas för enkla eller flera gen-KPI: er för att kringgå kromosomala flyttningar.
Vi visar också att CRISPR/Cas9 tillsammans med rAAV6 kan användas för att effektivt förmedla platsspecifik KI och uttryck för EGFP vid AAVS1-locus. Vi observerade EGFP uttryck i minst 12 dagar post-engineering. Vi observerade också två EGFP-positiva populationer: ett högt och ett mellanliggande EGFP-uttryck i KI-provet dag 12 (figur 5A), medan vektorprovet visade en minimal andel celler med mellanliggande EGFP-uttryck. Vi spekulerar att detta "höga och mellanliggande populationer" fenomen beror på biallelic integration av vektorn. Ytterligare undersökning med spänna PCR13 av mellanliggande- och hög-EGFP celler kan göras för att bekräfta denna hypotes. Två varningar om att använda AAV som vektor: För det första har AAV-vektorer en liten lastkapacitet, upp till 4,7 kilobaser, vilket orsakar problem när man knackar i en stor gen. Att minska storleken på homologiarmarna kommer att möjliggöra inkvartering av en större gen, vilket i sin tur kommer att minska KI-effektiviteten (data visas inte). Alternativt kan samtidig eller sekventiell integration av flera genbelastningsvektoreranvändas 14,15. Studier har rapporterat ett immunsvar och ett godkännande av AAV-transduced celler i immunkompetenta djurmodeller16,17. Alternativt kan en icke-viral-baserad givaren HDR-mall utforskas för att kringgå problemet.
Sammanfattningsvis har vi visat omfattande, steg-för-steg processer av isolering, expansion och teknik av B-celler som resulterade i hög genmodifiering effektivitet. Denna tekniska metod kan användas för gen KO och för att studera funktionerna hos gener i B-celler. Dessutom kan denna metod användas för att konstruera B-celler för att uttrycka en rekombinant antikropp för att bekämpa infektion. Slutligen kan denna metod tillämpas på ingenjör B-celler för att uttrycka och utsöndra terapeutiska enzymer som kan användas som en autolog cellbaserad terapi för att behandla enzymopatier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ett patent har lämnats in om metoderna för att tillverka och använda genomreigerade B-celler med M.J.J, K.L., och B.S.M. som uppfinnare. B.S.M är konsult för och äger aktier i Immusoft Inc. Immusoft Inc har sponsrat forskning i labbet i B.S.M.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av Children's Cancer Research Fund (CCRF) och NIH R01 AI146009 till B.S.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug | IDT | 1081059 | smaller size is also available |
| Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza | V4XP-3032 | |
| Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CleanCap chemically modified Cas9 mRNA | Trilink Biotechnology | L-7206-1000 | |
| CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg | Invivogen | TLRL-2006-5 | different sizes available |
| Cryostor CS10, 100 mL | STEMCELL Technology | 7930 | |
| CTS Immune Cell SR | Thermo Fisher Scientific | A2596101 | |
| EasySep human B cells isolation kit | STEMCELL Technology | 17954 | |
| eBioscience fixable viability dye eFlour 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | |
| Excellerate B cell media, Xeno-free | R&D Systems | CCM031 | B-cell basal medium |
| Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11550 | For thawing B cells only |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps | BioExpress | T-3035-1 / 490003-692 | |
| Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS | GE lifesciences | SH30256.01 | |
| Lonza 4D Nucleofector core unit | Lonza | AAF-1002B | |
| Lonza 4D Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Mega CD40 Ligand | Enzo Life Sciences | ALX-522-110-C010 | |
| Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | For freezing cells |
| Pen/Strep 100X | Sigma-Aldrich | TMS-AB2-C | |
| PerCP anti-human CD19 clone HIB19 | biolegend | 302228 | smaller size is also available |
| rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.) | Vigene Biosciences | N/A | large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL |
| Recombinant human IL-10 protein 250 ug | R&D Systems | 217-IL-250 | different sizes available |
| Recombinant human IL-15 protein 25 ug | R&D Systems | 247-ILB-025 | different sizes available |
| The Big Easy EasySep Magnet | STEMCELL Technology | 18001 | different sizes available |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Fisher Scientific | BP2476100 |
References
- LeBien, T. W., Thomas, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).
- Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. Humoral immunity due to long-lived plasma cells. Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).
- Spriggs, M. K., et al. Recombinant human CD40 ligand stimulates B cell proliferation and immunoglobulin E secretion. Journal of Experimental Medicines. 176 (6), 1543-1550 (1992).
- Fusil, F., et al. A lentiviral vector allowing physiologically regulated membrane-anchored and secreted antibody expression depending on B-cell maturation status. Molecular Therapy. 23 (11), 1734-1747 (2015).
- Luo, X. M., et al. Engineering human hematopoietic stem/progenitor cells to produce a broadly neutralizing anti-HIV antibody after in vitro maturation to human B lymphocytes. Blood. 113 (7), 1422-1431 (2008).
- Mock, U., Thiele, R., Uhde, A., Fehse, B., Horn, S. Efficient lentiviral transduction and transgene expression in primary human B cells. Human Gene Therapy Methods. 23 (6), 408-415 (2012).
- Heltemes-Harris, L. M., et al. Sleeping Beauty transposon screen identifies signaling modules that cooperate with STAT5 activation to induce B-cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 35 (26), 3454-3464 (2016).
- Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease. Scientific Reports. 8, 12144 (2018).
- Hung, K. L., et al. Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells. Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).
- Cui, Y., Xu, J., Cheng, M., Liao, X., Peng, S. Review of CRISPR/Cas9 sgRNA design tools. Interdisciplinary Sciences. 10 (2), 455-465 (2018).
- Rees, H. A., Liu, D. R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).
- Spiegel, A., Bachmann, M., Jurado Jiménez, G., Sarov, M. CRISPR/Cas9-based knockout pipeline for reverse genetics in mammalian cell culture. Methods. 164-165, 49-58 (2019).
- Suzuki, T., Kazuki, Y., Oshimura, M., Hara, T. A novel system for simultaneous or sequential integration of multiple gene-loading vectors into a defined site of a human artificial chromosome. PLoS One. 9, 110404 (2014).
- Bak, R. O., Porteus, M. H. CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors. Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).
- Shirley, J. L., de Jong, Y. P., Terhorst, C., Herzog, R. W. Immune responses to viral gene therapy vectors. Molecular Therapy. 28 (3), 709-722 (2020).
- Martino, A. T., Markusic, D. M. Immune response mechanisms against AAV vectors in animal models. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 198-208 (2020).
