Summary
Burada, B hücrelerindeki genlerin biyolojik fonksiyonlarını ve B hücre terapötiklerinin gelişimini incelemek için gen nakavt (KO) ve knock-in (KI) için birincil insan B hücrelerinin CRISPR/ Cas9 tabanlı genom mühendisliği için ayrıntılı, adım adım bir protokol sunuyoruz.
Abstract
B hücreleri hematopoetik kök hücrelerden elde edilen lenfositlerdir ve adaptif bağışıklık sisteminin humoral kolunun önemli bir bileşenidir. Periferik kandan izolasyon kolaylığı, in vitroyu genişletme yetenekleri ve in vivo olarak uzun ömürlü olmaları nedeniyle hücre bazlı tedaviler için çekici adaylar yaparlar. Ek olarak, normal biyolojik işlevleri -büyük miktarlarda antikor üretmek için- enfeksiyonla savaşmak için rekombinant antikor veya enzimopatiklerin tedavisi için bir enzim gibi çok büyük miktarlarda terapötik proteini ifade etmek için kullanılabilir. Burada, primer insan B hücrelerini periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC) izole etmek ve izole edilmiş B hücrelerini in vitro olarak etkinleştirmek / genişletmek için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz. Daha sonra B hücrelerindeki endojen genlerin bölgeye özgü KO'su için CRISPR/Cas9 sisteminin kullanılmasıyla ilgili adımları gösteriyoruz. Bu yöntem, ilgi çekici genlerin biyolojik işlevlerini incelemek için kullanılabilecek çeşitli genlerin verimli KO'suna izin verir. Daha sonra CRISPR/Cas9 sistemini kullanma adımlarını, B hücrelerindeki transgene ifade kasetinin raya özgü verimli entegrasyonu için rekombinant, adeno ilişkili, viral (rAAV) vektör ile birlikte gösteriyoruz. Birlikte, bu protokol, birincil insan B hücrelerinde genlerin biyolojik işlevlerini incelemek ve B hücre terapötiklerinin geliştirilmesi için kullanılabilecek adım adım bir mühendislik platformu sağlar.
Introduction
B hücreleri hematopoetik kök hücrelerden elde edilen lenfosit soyunun bir alt grubudur. Bağışıklık sorunlarına yanıt olarak büyük miktarlarda antikor üreterek adaptif humoral bağışıklık sisteminde kritik bir rol oynarlar1. B hücreleri aynı zamanda bellek B hücrelerinin ve ölümcül olarak farklılaştırılmış, uzun ömürlü plazma hücrelerinin öncüleridir, böylece kalıcı humoral bağışıklıksağlar 2. Plazma hücreleri, özellikle, yıllarca veya onlarca yıl hayatta kalırken belirli bir antikorun büyük miktarlarda üretme yeteneklerinde bağışıklık hücreleri arasında benzersizdir3. Ek olarak, periferik kandan izolasyon kolaylığı, B hücre soyunun yeni hücre bazlı tedaviler için mükemmel bir aday olduğunu yapar4.
Daha önce, lentiviral vektörler veya Uyuyan Güzel transposon kullananlar gibi rastgele entegrasyon yöntemleri, transgene doğum ve ifade 5 , 6,7,8için B hücrelerini tasarlamak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu yaklaşımların spesifik olmayan doğası, B hücrelerindeki belirli bir genin biyolojik fonksiyonlarının incelenmesini zorlaştırır ve terapötik ortamda eklemeli mutajensis ve değişken transgene ekspresyonu ve / veya susturma riski taşır.
CRISPR/Cas9 sistemi, araştırmacıların çok sayıda türdeki çeşitli hücrelerin genomunu hassas bir şekilde düzenlemelerini sağlayan güçlü bir genom mühendisliği aracıdır. Son zamanlarda, bizimki de dahil olmak üzere iki grup, ex vivo genişleme için yöntemler geliştirdi ve birincil insan B hücrelerinin genom mühendisliğini hedefledi9,10. Birincil insan B hücrelerini lökorezis örneğinden arındırma sürecini açıklayacağız. Bundan sonra, B hücresi genişletme ve izole B hücrelerinin aktivasyonu için güncellenmiş protokolümüzü açıklayacağız. Daha sonra CRISPR/Cas9 mRNA'yı CD19 sgRNA ile birlikte aktif B hücrelerine tanıtmak için elektroporasyon yoluyla belirli bir B hücre reseptörü ve B hücrelerinin ayırt edici bir özelliği olan 19 (CD19) farklılaşma kümesini devirmek için bir süreç açıklayacağız.
CAS9 mRNA çevrilir ve CRISPR/Cas9-sgRNA ribonucleoprotein kompleksi (RNP) oluşturmak için CD19 sgRNA'ya bağlanır. Daha sonra, kompleksteki sgRNA, Cas9'un genin ekson 2'sinde hedef sırada çift iplikçik kırılması (DSB) oluşturmasına neden olur. Hücreler, nükleotidleri tanıtarak veya silerek, frameshift mutasyona yol açarak ve genin bayıltılmasına neden olarak DSB'yi "homolog olmayan uç birleştirme" ile onaracak. Daha sonra akış sitometrisi ile CD19 kaybını ölçecek ve ayrışma (TIDE) analizi ile indellerin takibi ile indel oluşumunu analiz edeceğiz.
Daha sonra CRISPR/Cas9'u, adeno ile ilişkili virüs entegrasyon sitesi 1 (AAVS1) genine gelişmiş yeşil floresan proteinin(EGFP) raya özgü yerleştirilmesine aracılık etmek için rekombinant bir AAV6 vektörü (rAAV6, homolojiye yönelik onarım (HDR) için bir donör şablonu) ile birlikte kullanma sürecini açıklayacağız. AAVS1 geni, bilinen biyolojik işlevleri olmayan aktif bir lokus ve insan genomunda bir AAV viral entegrasyon bölgesidir; bu nedenle, genom mühendisliği için "güvenli bir liman" olarak kabul edilir. Burada, B hücrelerinin genişlemesi ve aktivasyonunun 7 günlük kültürde 44 kata kadar genişlemeye izin verdiğini bildiriyoruz (Şekil 1). B hücrelerinin elektroporasyonunun transeksiyon sonrası 24 saat genel hücre sağlığında(Şekil 2A)hafif bir azalma gösterdiği görüldü. CD19 işaretleyicisinin dağılım grafiği analizi (Şekil 2B) düzenlenen hücrelerde% 83'e kadar azalma gösterdi (Şekil 2C).
Kromatografların GELGIT analizi (Şekil 3A) % indellerin akış sitometrisi ile % protein kaybına benzer olduğunu ortaya koydu (Şekil 3B). KI deneyinin akış sitometrisi analizi, RNP ile birlikte AAV vektörü alan hücrelerin (Şekil 4), % 64'e kadar EGFP pozitif hücreleri (Şekil 5A) ifade ettiğini ve daha sonra kavşak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile başarılı entegrasyon gösterdiğini göstermiştir (Şekil 5B). Hücre sayımları, tüm örneklerin mühendislik sonrası 3 gün içinde hızla kurtarıldığunu göstermiştir (Şekil 5C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sağlıklı donörlerden lökerez örnekleri yerel bir kan bankasından alındı. Burada açıklanan tüm deneyler Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından araştırmadan muaf olarak belirlenmiş ve Minnesota Üniversitesi Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBC) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Tüm deneyler kan kaynaklı patojenler için evrensel önlem doğrultusunda, steril/aseptik teknikler ve uygun biyogüvenlik seviye-2 ekipmanları ile gerçek gerçekleştirildi.
1. B hücre genişletme ortamı için takviyeler hazırlayın
- CpG oligonükleotidini 1 mg/mL konsantrasyona yeniden inşa edin.
- CD40 ligandını (CD40L) 100 μg/mL konsantrasyonda yeniden inşa edin.
- Rekombinant insan IL-10'u (rhIL-10) 50 μg/mL konsantrasyona yeniden inşa edin.
- Rekombinant insan IL-15'i (rhIL-15) 10 μg/mL konsantrasyona yeniden inşa edin.
NOT: Her takviyeyi -20 °C ila -80 °C'de 6 aya kadar küçük aliquotlarda saklayın.
2. Bazal ortam hazırlayın
- B hücreli bazal ortamı, in vitro immün hücre genişlemesi (örneğin, CTS Immune Cell SR) ve% 1 (v/v) penisilin ve streptomisiin için% 5 (v/v) medya takviyesi ile birleştirin.
- Bazal ortamı 0,22 μm filtre adaptörü kullanarak sterilize edilmiş bir şişeye filtreleyin.
- Bazal ortamı 1 aya kadar 4 °C'de tutun.
3. B hücre genişletme ortamını hazırlayın
- B hücrelerini 5 × 105 hücre/mL'de kültüre etmek için gerekli miktarda bazal ortamı steril bir kaba aktarın.
- Bazal ortamı 1 μg/mL CpG, 100 ng/mL CD40L, 50 ng/mL rhIL-10 ve 10 ng/mL rhIL-15 ile destekleyin.
- B hücre genişletme ortamını 0,22 μm filtre kullanarak filtreleyin.
- B hücre genleşme ortamını doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de, %5 CO2'de kullanmadan önce en az 30 dakika boyunca nemle dengeler.
NOT: Bir gün boyunca kullanmak üzere taze B hücre genişletme ortamı hazırlayın. B hücresi genişletme ortamını birden çok gün boyunca kullanmak üzere hazırlamayın. Bu medya tarifi, bellek B hücrelerinin ve aktif birincil insan B hücrelerinin çoğalmasını teşvik eder.
4. İnsan B hücreli arınma ve genişleme
NOT: Üreticinin talimatına uyarak sıcaklık kontrollü bir dondurma kabına %99-100 izopropil alkol ekleyin ve 4.1. adıma başlamadan önce dondurma kabını 4 °C'de soğutun.
- PBMC'leri lökorezis örneğinden ayırma
- Lökorezis örneğini (yaklaşık 8-10 mL) steril 50 mL konik tüpe aktarın.
- Steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile hacmi 35 mL'ye getirin.
- 35 mL lökorezis örneğini 15 mL yoğunluk degrade ortamına dikkatlice katmanlayın.
- Fren olmadan 25 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj yapın, buffy coat'u (PBMC katmanı) rahatsız etmeden plazma tabakasını çıkarın, PBMC'leri arayüzden toplayın ve yeni bir steril 50 mL konik tüpe aktarın.
- PBMC'leri 1x PBS ile 50 mL'ye getirin.
- Frensiz 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj. Kırmızı görünebilecek PBMC peletini bozmadan üst düğmeyi çıkarın.
- 7 mL amonyum-klorür-potasyum lizis tamponu, iyice karıştırmak için pipet 3 kez ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) 3 dakika kuluçkaya yatırın.
- 1x PBS ile sesi 50 mL'ye getirin.
- Düşük direnç freni ile 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj. Peletin rahatsız etmeden süpernatant çıkarın. Pelet pembemsi veya beyaz görünmelidir.
NOT: Yeni yalıtılmış B hücrelerini kültüre etmeye devam etmek için, B hücre yalıtımını başlatmadan önce B hücresi genişletme ortamını hazırlayın (adım 4.2).
- İnsan birincil B hücresi negatif izolasyon kiti kullanan PBMC'lerden B hücresi yalıtımı
- İzolasyon arabelleğindeki PBMC'leri 5 × 107 hücre/mL konsantrasyona yeniden biriktirin.
NOT: PBMC'lerin toplam sayısı 5 × 107 hücreden azsa, 5 × 107 hücre/mL korumak için yalıtım arabelleği hacmini küçültün. Minimum ve maksimum hücre süspansiyonu hacimleri sırasıyla 0,25 mL ve 8 mL'dir. - 8 mL'ye (5 × 107 hücre/mL) kadar steril, polipropilen, kapaklı yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın.
- PBMC'lere 50 μL/mL Kokteyl Arttırıcı ekleyin.
- PBMC'lere 50 μL/mL İzolasyon Kokteyli ekleyin, tüpü kaplayın ve karıştırmak için 2-3 kez ters çevirin.
- RT'de 5 dakika kuluçkaya yatır; inkübasyonun4. dakikasında, en az 30 sn boyunca girdap manyetik mikrobeadlar.
- 1 mL PBMC başına 50 μL manyetik mikrobead aktarın, tüpü kaplayın ve karıştırmak için 2-3 kez ters çevirin.
- İzolasyon tamponu ile 10 mL'ye kadar üst üste yerleştirin ve 2-3 kez hafifçe pipetleyin.
- Tüpü manyetik bir istasyona yerleştirin ve RT'de 3 dakika kuluçkaya yatırın.
- Mıknatısı ve tüpü bir arada tutun ve bir hareketle, hücre süspansiyonu yeni tüpe dökmek için mıknatısı ve tüpü birlikte ters çevirin. Eski tüpü atın.
- 4.2.8 adımını tekrarlayın (kuluçka süresini 2 dakikaya düşürün) ve B hücre süspansiyonunu temiz bir konik tüpe dökün.
- Zenginleştirilmiş B hücreleri kullanıma hazırdır. Hücreler hemen kullanılacaksa, bölüm 4.3'e (İnsan B hücresi genişlemesi) devam edin. İzole edilmiş B hücrelerinin saflığını akış sitometrisine göre kontrol edin (isteğe bağlı). Hücreler kullanılmadan önce dondurulacaksa, 4.2.12 adımına devam edin.
- B hücrelerini dondurmak için, 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjün ve peletin rahatsız etmeden süpernatantı atın.
- Hücreleri 10 7 hücre/mL ve aliquot1 mL/cryovial'da donma ortamında yeniden depolar.
- Cryovial'ı soğutulmuş dondurma kabına yerleştirin ve gece boyunca -80 °C'de saklayın; daha sonra, dondurulmuş cryovial'ı sıvı bir azot tankına aktarın; donmuş hücreleri 1 yıla kadar saklayın.
NOT: İzole B hücrelerinin beklenen verimi toplam PBMC'lerin %2-%8'idir ve %95-%99 yaşayabilirlik oranına sahiptir.
- İzolasyon arabelleğindeki PBMC'leri 5 × 107 hücre/mL konsantrasyona yeniden biriktirin.
- İnsan B hücresi genişlemesi
NOT: Yeni yalıtılmış B hücreleri kullanıyorsanız, 4.3.1–4.3.5 adımlarını atlayın. Hücreleri sayın ve gerekli sayıda hücreyi steril konik bir tüpe aktarın ve 4.3.6 adımına devam edin.- B hücrelerini çözmeden önce bir su banyosunda önceden ısınan fetal sığır serumu (FBS). 20 mL B hücreli genleşme ortamı hazırlayın, bir T25 şişesine aktarın ve ortamı kullanımdan en az 15 dakika önce bir doku kültürü inkübatöründe (37 °C,% 5 CO2, nem ile) ön aşındırın.
- B hücrelerini 37 °C su banyosunda çözün. Beklerken, önceden ısıtılmış 2 mL FBS'yi steril 15 mL konik bir tüpe aktarın.
- B hücreleri tamamen çözüldükten sonra, hemen numuneye damla açısından 1 mL önceden ısıtılmış FBS ekleyin. RT'de 1 dakika kuluçkaya yaslanın.
- Numuneyi yeniden çıkarmak ve tüm hacmi damla yönünde, önceden ısıtılmış 2 mL FBS içeren konik bir tüpe aktarmak için hafifçe pipet.
- Steril 1x PBS, kapak ile hacmi 15 mL'ye getirin ve tüpü 2-3 kez hafifçe ters çevirin.
- 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj.
- Hücre peletini bozmadan süpernatantı atın, hücre peletini 1 mL önceden dengelenmiş B hücre genişletme ortamı ile yeniden atın ve hücreleri sayın. Toplam hücre sayısı yaklaşık 107 hücre olmalıdır.
- Hücreleri önceden dengelenmiş B hücre genişletme ortamının 20 mL'lik bir şişeye aktarın. Hücrelerin son konsantrasyonu yaklaşık 5 x 105 hücre/mL olmalıdır.
- Şişeyi bir doku kültürü inkübatöründe dikey olarak kuluçkaya yatırın.
- B hücrelerinin tüm hacmini steril konik bir tüpe aktararak genişletme ortamını her 2 günde bir tamamen yenileyin ve 4.3.6–4.3.9 adımlarını tekrarlayın.
NOT: T25 şişesi 10-20 mL orta dayanabilir; T75 şişesi 20-60 mL'ye kadar orta dayanabilir.
5. Birincil insan B hücre mühendisliği
- Mühendis B hücreleri, optimum sonuçlar için genişleme/aktivasyondan sonra 48 ± 2 saat. B hücre genleşme ortamını hazırlayın, ortamın 1 mL'lik aliquot'ını 48 kuyulu bir doku kültürü plakasına hazırlayın ve kullanımdan en az 15 dakika önce bir doku kültürü inkübatöründe ön dengeyi kullanın.
NOT: İlgi çekici bir gen için CRISPR/Cas9 sgRNA tasarlarken, aşağıda özetlenen adımları izleyin.
- Çevrimiçi bir araç kullanarak sgRNA'lar tasarlayın11.
- Proteinin tüm izoformlarında ortak olan bir ekson üzerinde sgRNA'lar tasarlayın.
- Saygın şirketlerden kimyasal olarak değiştirilmiş sgRNA sipariş edin.
- sgRNA genellikle lyophilized formda gelir; steril DNase/RNase içermeyen Tris-EDTA (TE) tamponunda sgRNA'yı 1 μg/μL konsantrasyonda yeniden inşa edin. - Kimyasal olarak modifiye edilmiş 1,5 μL (1 μg/μL) kimyasal modifiye Streptococcus pyogenes Cas 9 (S.p. Cas9) nükleaz per transeksiyon reaksiyonu ile 1 μL (1 μg/μL) karıştırarak CRISPR/Cas9 transfecting substratı hazırlayın. Kontrol için sgRNA yerine 1 μL TE arabelleği kullanın.
NOT: CD19 sgRNA gen KO deneyi için kullanıldığında, sonuçlar için Şekil 2'ye bakın. Bir gen KI deneyi için AAVS1 sgRNA kullanıldığında, sonuçlar için Şekil 5'e bakın.- Tüm bileşenleri buzda tutun.
- Hafifçe karıştırın ve reaksiyon başına 2,5 μL CRISPR/Cas9 transfeksiyon substratını 0,2 mL 8 tüplü bir şeritli bir tüpe aktarın; RT'de bir kenara koyun.
- Bir nükleofector (elektroporatör) açın ve Tablo 1'degösterildiği gibi transfeksiyon reaktifleri hazırlayın.
NOT: Bu, gerekirse tüm reaktifleri buza koyarak duraklama için iyi bir adımdır. Deneye devam etmeye hazır olduğunuzda tüm reaktifleri buzdan çıkarın. S.p. Cas9 proteinini kullanırken, araştırmacı CRISPR/Cas9-sgRNA ribonucleoprotein'i 1 μg sgRNA'yı 5 μg S.p. Cas9 proteini ile karıştırarak, kabarcıklardan kaçınarak ve optimum sonuçlar için kullanmadan önce karışımı RT'de en az 20 dakika inkübe ederek önceden karmaşık hale etmelidir. - Transeksiyon reaksiyonuna 106 B hücreyi steril konik bir tüpe sayın ve aktarın.
- Steril 1x PBS ile hacmi 15 mL'ye getirin ve 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj. Beklerken, birincil hücre transfeksiyon reaktifini (Tablo 2) hazırlayın ve RT'de bir kenara koyun.
- Hücre peletini bozmadan süpernatant atın.
- Hücre peletini 10 mL steril 1x PBS ve santrifüj ile 400 × g'da 5 dakika boyunca yeniden ıslatın.
- Hücre peletini bozmadan süpernatant'ı tamamen atın.
- 106 B hücre başına 0,5 μg kimyasal olarak modifiye edilmiş GFP mRNA'yı (transfeksiyon muhabiri olarak) hücre peletine aktarın (isteğe bağlı).
- Hücre peletini 106 B hücre başına 20 μL birincil hücre transfeksiyon reaktifi ile yeniden biriktirin; 5-6 kez pipetleme ile hafifçe karıştırın. CRISPR/Cas9 transfeksiyon substratının 2,5 μL'sini içeren 8 tüplü şeridin 0,2 mL tüpüne transfeksiyon reaksiyonu başına 20,5 μL aktarın.
- Pipet, tüm hacmi (23 μL) bir transfection cuvette'e karıştırmak ve aktarmak için bir kez yukarı ve aşağı. Sıvının cuvette'in altını kapladığından emin olmak için tezgah üzerindeki cuvette'i hafifçe kaplayın ve dokunun.
- Transfection için nükleofectorda insan birincil B hücre protokolünü kullanın.
NOT: Nükleofector (elektroporatör) doku kültürü başlığının dışına yerleştirilecek ve kullanılabilir. Steriliteyi sağlamak için cuvette'i kapla. - Elektroporlu hücreleri 15 dakika boyunca RT'de cuvette dinlendirin.
- Önceden dengelenmiş B hücre genleşme ortamının 80 μL'lik kısmını doku kültürü plakasından cuvette transfeksiyon reaksiyonuna aktarın. Cuvette'i doku kültürü inkübatörüne 30 dakika yerleştirin.
- Numunenin tüm hacmini cuvetten B hücre genleşme ortamının 1 mL'lik 48 kuyulu doku kültürü plakasının uygun bir kuyusuna karıştırmak ve aktarmak için birkaç kez hafifçe pipetlayın. Hücrelerin son konsantrasyonu 106 hücre/mL olmalıdır.
- Bir gen KI deneyi yapıyorsanız, 500.000 çok miktarda enfeksiyonun rAAV6 vektörü elektroporlu hücreler (yaklaşık 45 dk post-electroporation) içeren uygun kuyuya aktarın. Şekil 4A'dakirAAV6 vektör yapısına bakın.
NOT: Örneğin: Bir kontrol numunesi CRISPR/Cas9 veya rAAV6 vektörü olmadan elektroporlu hale gelecektir. Crispr/Cas9 olmadan yalnızca vektöre özel bir numune elektroporlanacak ve daha sonra rAAV6 vektörü ile transdüklenecektir. Bir KI numunesi CRISPR/Cas9 ile elektropore edilecek ve daha sonra rAAV6 vektörü ile transdüklenecektir. rAAV6, HDR için hedeflenen DSB sitesinin yukarı ve aşağı akış homoloji kollarını içermelidir. - Plakayı 37 °C'de bir doku kültürü inkübatörüne ve nem ile% 5 CO2'ye yerleştirin.
- Hücreleri sayın ve mühendislik sonrası 1.
- Hücreleri sayarak ve ardından hücrelerin tüm hacmini temiz bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktararak B hücre genişletme ortamını her 2 günde bir yenileyin. 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj ve peletı bozmadan süpernatantı atın. Hücreleri 100 μL taze B hücre genleşme ortamı ile yeniden biriktirin ve 24 kuyulu bir doku kültürü plakası kuyusuna aktarın. 5 × 105 hücre/mL'de son hücre konsantrasyonuna ulaşmak için orta hacmi getirin.
NOT: 48 kuyulu bir plaka 1 mL'ye kadar orta / kuyu tutabilir; 24 kuyulu bir plaka 2 mL'ye kadar orta / kuyu tutabilir; 12 kuyulu bir plaka 4 mL orta / kuyuya kadar dayanabilir ve 6 kuyulu bir plaka 8 mL orta / kuyuya kadar tutabilir. - Akış sitometrisi analizi, TIDE analizi ve bağlantı PCR'si gibi aşağı akış analizleri yapmadan önce tasarlanmış hücrelerin en az 5 gün boyunca genişlemesine izin verin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Güncellenmiş genişletme ve aktivasyon protokolü, B hücrelerinin 7 günde 44 kata kadar hızlı genişlemesini sağladı(Şekil 1; n =3 donörler). KO deneyinde, Trypan mavi boyama kullanan B hücre sayısı, hem kontrolde hem de CD19 KO örneklerinde 24 saat post-elektroporasyonda hücre iyileşmesinde hafif bir azalma ile% 80'den fazla uygulanabilir hücre gösterdi(Şekil 2A; p ≥ 0.05, n = 3 donör). Bu sonuç, elektroporasyonun genel B hücre sağlığını biraz etkilediğini gösterir. Akış sitometrisi ve TIDE analizleri için 5. Kontrolün ve KO örneğinin temsili saçılma çizimleri sırasıyla% 14 ve% 95 CD19 negatif hücreler göstermiştir (Şekil 2B). Akış çizilerinin niceliği, kontrol ile karşılaştırıldığında KO örneklerinde CD19 ekspresyonunda önemli bir azalma göstermiştir(Şekil 2B; s ≤ 0.0001, n = 3 donör). Genomik dizileme kromatogramları (Tablo 3'tekiastar dizilerine bakın), CD19 KO B hücrelerinde CRISPR/Cas9 aracılı DSB sonrası nükleotidlerin eklemelerini/delesyonlarını gösteren çift tepeler gösterirken, kontrolde tek tepeler gözlendi ve bu örnekte DSB oluşmadığını gösterdi(Şekil 3A). KO örneklerinin kromatograflarının indel analizi (ücretsiz bir çevrimiçi TIDE analiz aracı kullanılarak) yüksek oranda indel oluşumu gösterdi (>%90) akış sitometrisi ile saptanan % CD19 protein kaybı ile uyumlu olan CD19 lokusta(Şekil 3B; p ≥ 0.05, n = 3 donör). Bu sonuçlar CRISPR/Cas9'un B hücrelerinde verimli bir cd19 KO oluşturduğunu göstermektedir. KI deneyinden B hücreleri, akış sitometrisi ve kavşak PCR analizleri için mühendisliksonrası 12. Dağılım çizelhleri RNP ile birlikte rAAV6 vektörünü alan örnekte EGFP pozitif hücrelerin%64'ünügösterirken, kontrolde EGFP pozitif hücre gözlenmedi; sadece AAV vektörü alan örnekte minimal EGFP pozitifliği gözlenmiştir(Şekil 5A). Bir bağlantı PCR amplifikasyonu (Tablo 3'tekiastar dizilerine bakın) KI örneğinde (Şekil 5B) 1,5Kbps amplicon gösterirken, kontrol veya sadece vektör örneğinde PCR ürünü gözlenmedi. Hücre sayıları, mühendislik sürecinin KI örneğindeki hücre iyileşmesini kontrolden veya yalnızca vektör örneklerinden daha fazla etkilediğini göstermiştir (Şekil 5B). Bununla birlikte, tüm numuneler mühendislik sonrası 3 gün içinde hızla geri tepti (Şekil 5B). Birlikte, bu sonuçlar EGFP'nin AAVS1 lokusta başarılı bir şekilde entegrasyonunun EGFP'nin mühendislik sonrası en az 12 gün istikrarlı bir şekilde ifade etmesine yol açtığını göstermektedir.
Şekil 1: B hücre genleşme in vitro. B hücreleri 0. günde 1 ×10 6 hücrede (sıfır) mL başına 5 × 10 5 yoğunlukta tohumlandı ve7 günde 44 kat genişletildi (n=3 bağımsız donör). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2A: Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2B: Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2C: B hücrelerinde CRISPR/Cas9 aracılı CD19 nakavt (KO). (A) Çubuk grafikte, elektroporasyon sonrası 24 saatte hem kontrolde hem de CD19 KO örneklerinde transeksiyon sonrası hücrelerin %70 hücre kurtarma (sol panel) ve %80 canlılığı (sağ panel) gözlenmiştir. (B) Canlı hücrelerin CD19 gating'inin temsili akış çizikleri, kontrol örneğinde ve CD19 KO örneğinde sırasıyla% 84.3 ve% 3.43 CD19 pozitif hücreleri gösterir. (C) Çubuk grafik CRISPR/Cas9 aracılı CD19 KO grubunda CD19'un önemli ölçüde azalmasını gösterir (s ≤ 0.0001). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3A: Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3B: CD19 protein kaybı vs indel oluşumu. (A) Kromatogramlar, kontrolün sıralama tepelerini ve CD19 nakavt (KO) örneğini tasvir eder. Denetim tepelerindeki gri kutu, cd19 gRNA'nın hedef sırasını bir okla gösterilen tahmin edilen kesim bölgesiyle vurgular. CD19 KO, tahmin edilen kesim bölgesinin etrafında çift iplikli kırılmadan sonra nükleotitlerin yerleştirilmesini / silindiğini gösteren "çift tepeler" dizilimi gösterdi. (B) CD19 lokusunda % CD19 protein kaybı ve % indel oluşumu arasında tutarlı sonuçlar gösteren çubuk grafik (p ≥ 0.05). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: rAAV6 AAVS1 MND-GFP vektör yapısı. İfade kaseti güçlü bir sentetik promotör (MND) dizisi içerir, hemen ardından gelişmiş bir yeşil floresan proteini (EGFP) kodlama dizisi ve poli adenilasyon (Poli A) dizisi. AAVS1 homoloji kolları, MND promotörünün yukarısını ve poli A dizilerinin aşağı akışını yansır. EGFP, MND organizatörünün düzenlemesi kapsamında ifade edilecektir. Sıra uzunlukları yapının her bileşeninin üzerinde gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5A: Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5B: Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5C: CRISPR/Cas9- ve rAAV6 aracılı 12. (A) Temsili akış grafiği, kontrolde veya sadece vektör örneğinde EGFP pozitif B hücresi ve knockin (KI) örneğinden EGFP pozitif B hücrelerinin% 64,4'üne karşı hiçbir EGFP pozitif B hücresi göstermiyor. (B) KI örneğinin kavşak polimeraz zincir reaksiyonu tahmin edilen 1,5 Kbps bandını gösterir; denetimde veya yalnızca vektör örneğinde bant bulunamadı. PCR işlemi sırasında kirlenme olmamasını sağlamak için su kullanılmıştır. (C) Çubuk grafik, mühendislik sonrası 3 gün boyunca kontrolün, yalnızca vektörün ve EGFP-KI örneklerinin hücre büyümesini tasvir eder. Kırık çizgi 1 × 106 hücre girişini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Adı | gRNA sırası |
| CD19 | 5'-GCTGTGCTGCAGTGCCTCAA-3' |
| AAVS1 | 5'-GTCACCAATCCTGTCCCTAG-3' |
Tablo 1: gRNA dizileri.
| Reaktif | 1 reaksiyon başına hacim |
| P3 Birincil Hücre çözümü | 16,4 mL |
| Ek 1 | 3,6 mL |
| Toplam | 20 mL |
Tablo 2: Nükleofeksiyon reaktif karışımının hazırlanması.
| Açıklama | Sıra | Amaç |
| CD19 ileri astarlar | 5'-AAATTCAGGAAGGGGGAAG-3' | Indel analizi için CD19 lokusu güçlendirin |
| CD19 Ters astar | 5'-GCGGACCTTCTGTCCATG-3' | Indel analizi için CD19 lokusu güçlendirin |
| Junction PCR ileri astar | 5'-GGACGAGCTGTACAAGTAACG-3' | Kavşak PCR |
| Kavşak PCR Ters astar | 5'-GAGACAGTGACCAACCATCC-3 | Kavşak PCR |
Tablo 3: Kullanılan astarlar.
| Açıklama | Florofor | Klon |
| İnsan karşıtı CD19 | PerCP | Hİb19 |
| Uygulanabilirlik Boyası | eFlour 780 | - |
Tablo 4: Akış sitometri antikoru ve canlılık boyası.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Birincil insan B hücrelerinde hassas genom mühendisliği yakın zamana kadar zorlu olmuştur9,10. Daha önce crispr/cas9 kullanarak birincil insan B hücrelerini tasarlamak için protokoller yayınlamıştık9. Burada, CD19'un verimli KO'suna izin vermek veya EGFP'yivurmak için B hücre yalıtımı, genişletme ve mühendislik için geliştirilmiş protokolleri özetliyoruz.
Burada genişleme protokolümüzün B hücrelerinin kültürde 7 günde 44 kata kadar hızla genişlemesine izin verdiğini gösteriyoruz (Şekil 1). Bu protokol, Johnson ve ark.9 ve Hung ve ark.10 tarafından bildirilenlerden daha hızlı bir genişleme oranı gösterdi Birincil B hücrelerinin sağlıklı ve hızlı genişlemesini sağlamak için kritik adımlar, ortamı her iki günde bir taze aktivasyon faktörleriyle yeniliyor ve kültürdeki toplam B hücre sayısının 2 × 106 hücre / mL'yi geçmemesini sağlıyor.
Ayrıca, CRISPR/Cas9 sistemini CD19 KO için transfecting için geliştirilmiş protokolümüzün yüksek CD19 KO verimliliğine neden olduğunu gördük (Şekil 2 ve Şekil 3). Önceki bir çalışmaya benzer9, 24 saat içinde hücre iyileşmesinde ve elektroporasyon sonrası canlılıkta hafif bir azalma gözlemledik. Bu, elektroporasyonun birincil B hücrelerinin genel hücre sağlığını etkilediğini gösterir; ancak, hücreler sonunda 48 saat içinde geri tepti (veriler gösterilmedi).
Bu elektroporatör protokolünü kullanmanın yararı, numuneleri çok daha hızlı bir hızda (1 dakikadan daha kısa sürede 16 reaksiyon) elektroporat haline getirebilirken, önceki protokoller9,10 16 reaksiyon için yaklaşık 10-12 dakika sürer. Ek olarak, bu transfeksiyon sistemi, önceki çalışmalarda gözlemlenen elektroporatörnün potansiyel elektrik arkını ortadan kaldırır9,10. Ayrıca, bu mühendislik yöntemi daha büyük, piyasada bulunan cuvettes kullanılarak daha fazla sayıda B hücresi için ölçeklendirilebilir (veriler gösterilmez).
En iyi genel hücre sağlığını ve KO verimliliğini sağlamak için birkaç kritik adım: İlk olarak, B hücre genişletme ortamının kullanımdan önce en az 15 dakika boyunca hazırlandığından ve ön dengede olduğundan emin olun. İkinci olarak, transfeksiyon substratının toplam hacmi nükleofeksiyon reaktifinin% 20'sini (v / v) geçmemelidir. Üçüncü olarak, en iyi sonuçlar için hücreler 48 ± 2 saat boyunca genişletilmeli/aktive edilmelidir. Dördüncü olarak, transfeksiyon reaksiyon çözeltisinin cuvette'in altını kapladığından emin olmak için elektroporatöre yerleştirmeden önce elektroporasyon cuvette'e hafifçe dokunun. Beşinci olarak, elektroporlu hücreleri cuvette rt'de sadece 15 dakika dinlendirerek emin olun; elektroporasyondan sonra hücreleri nükleofeksiyon reaktifinde çok uzun süre bırakmak genel hücre sağkalımını zarar verebilir. Altıncı olarak, hücreleri cuvette'de 30 dakikadan daha uzun süre medya ile kuluçkaya yatırdığınızdan emin olun. Yedinci olarak, ilk 48 saat için 1 mL'ye 106 elektroporlu hücre yerleştirmek, hücrelerin daha düşük yoğunlukta kültlemekten daha hızlı iyileşmesine yardımcı olma eğilimindedir (veriler gösterilmez). Son olarak, Cas9 mRNA veya Cas9 proteini kullanmak benzer düzenleme verimliliklerine neden olur (veriler gösterilmez); ancak, kolaylık ve maliyet için Cas9 mRNA kullandık.
CRISPR/Cas9 kullanırken iki önemli endişe hedef dışı etkiler ve kromozomal translokasyonlardır. SgRNA'nın uyumsuz baz çiftlerinin hedef diziye neden olduğu hedef dışı etkiler, genomda çok sayıda olası bağlama bölgesine yol açar ve birden fazla istenmeyen gen KO'su oluşturur. Bu nedenle, bu sorunu en aza indirmek için hedefteki puanla birlikte öngörülen hedef dışı puan dikkate alınmalıdır. Kromozomal translokasyon, hedef dışı etkilere bağlı olarak veya birden fazla geni nakavt ederken ortaya çıkabilir. Bu deneysel ve klinik olarak feci olaylara neden olabilir. Temel editörler12, birleştirme elemanını bozmak, erken bir durdurma kodon oluşturmak veya DSB olmadan gen KO'yu hedeflemeye yol açan bir nokta mutasyonu oluşturmak için tek bir nükleotid (iki sınıf: sitozin temel editörü ve adenin baz editörü) değiştirir (başka bir yerde kapsamlı olarakincelenmiştir 12). Bu nedenle, baz düzenleme yaklaşımı kromozomal translokasyonları atlatmak için tek veya çok genli KO'lar için kullanılabilir.
Crispr/Cas9'un rAAV6 ile birlikte, AAVS1 lokusunda haline özgü KI ve EGFP'nin ekspresyonuna verimli bir şekilde aracılık etmek için kullanılabileceğini de gösteriyoruz. Egfp ekspresyonlarını mühendislik sonrası en az 12 gün boyunca gözlemledik. Ayrıca iki EGFP pozitif popülasyon gözlemledik: 12. günde KI örneğinde yüksek ve orta-EGFP ekspresyolü (Şekil 5A), sadece vektör örneği ise ara EGFP ekspresyonlu hücrelerin minimum yüzdesini gösterdi. Bu "yüksek ve orta popülasyonlar" olgusunun vektörün iki yönlü entegrasyonundan kaynaklandığını tahmin ediyoruz. Bu hipotezi doğrulamak için orta ve yüksek EGFP hücrelerinin PCR13'üne yayılan daha fazla araştırma yapılabilir. AAV'nin vektör olarak kullanılması konusunda iki uyarı: İlk olarak, AAV vektörleri 4,7 kilobases'e kadar küçük bir kargo kapasitesine sahiptir ve büyük bir geni çalarken sorunlara neden oluyor. Homoloji kollarının boyutunu azaltmak, daha büyük bir genin konaklamasına izin verecek ve bu da KI verimliliğini azaltacaktır (veriler gösterilmez). Alternatif olarak, birden fazla gen yükleme vektörün eşzamanlı veya sıralı entegrasyonukullanılabilir 14,15. Çalışmalar, immün özürlü hayvan modellerinde immün yanıt ve AAV transdüklenmiş hücrelerin açıklığı bildirilmiştir16,17. Alternatif olarak, bu sorunu atlatmak için viral tabanlı olmayan bir donör HDR şablonu araştırılabilir.
Özetle, yüksek gen modifikasyon verimlilikleri ile sonuçlanan B hücrelerinin izolasyonu, genişletilmesi ve mühendisliğinin kapsamlı, adım adım süreçlerini gösterdik. Bu mühendislik yöntemi gen KO'sunda ve B hücrelerindeki genlerin fonksiyonlarını incelemek için kullanılabilir. Ek olarak, bu yöntem enfeksiyona karşı savaşmak için rekombinant bir antikor ifade etmek için B hücrelerini tasarlamak için kullanılabilir. Son olarak, bu yöntem, enzimopatikleri tedavi etmek için otolog hücre bazlı bir tedavi olarak kullanılabilecek terapötik enzimleri ifade etmek ve salgılamak için mühendis B hücrelerine uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
M.J.J, K.L. ve B.S.'nin mucit olarak bulunduğu genom düzenlemeli B hücrelerinin yapım ve kullanma yöntemleri hakkında bir patent başvurusu .M. B.S.M, Immusoft Inc.M.
Acknowledgments
Bu çalışma Çocuk Kanser araştırma fonu (CCRF) ve NIH R01 AI146009 tarafından B.S.M'a finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug | IDT | 1081059 | smaller size is also available |
| Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza | V4XP-3032 | |
| Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CleanCap chemically modified Cas9 mRNA | Trilink Biotechnology | L-7206-1000 | |
| CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg | Invivogen | TLRL-2006-5 | different sizes available |
| Cryostor CS10, 100 mL | STEMCELL Technology | 7930 | |
| CTS Immune Cell SR | Thermo Fisher Scientific | A2596101 | |
| EasySep human B cells isolation kit | STEMCELL Technology | 17954 | |
| eBioscience fixable viability dye eFlour 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | |
| Excellerate B cell media, Xeno-free | R&D Systems | CCM031 | B-cell basal medium |
| Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11550 | For thawing B cells only |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps | BioExpress | T-3035-1 / 490003-692 | |
| Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS | GE lifesciences | SH30256.01 | |
| Lonza 4D Nucleofector core unit | Lonza | AAF-1002B | |
| Lonza 4D Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Mega CD40 Ligand | Enzo Life Sciences | ALX-522-110-C010 | |
| Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | For freezing cells |
| Pen/Strep 100X | Sigma-Aldrich | TMS-AB2-C | |
| PerCP anti-human CD19 clone HIB19 | biolegend | 302228 | smaller size is also available |
| rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.) | Vigene Biosciences | N/A | large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL |
| Recombinant human IL-10 protein 250 ug | R&D Systems | 217-IL-250 | different sizes available |
| Recombinant human IL-15 protein 25 ug | R&D Systems | 247-ILB-025 | different sizes available |
| The Big Easy EasySep Magnet | STEMCELL Technology | 18001 | different sizes available |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Fisher Scientific | BP2476100 |
References
- LeBien, T. W., Thomas, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).
- Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. Humoral immunity due to long-lived plasma cells. Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).
- Spriggs, M. K., et al. Recombinant human CD40 ligand stimulates B cell proliferation and immunoglobulin E secretion. Journal of Experimental Medicines. 176 (6), 1543-1550 (1992).
- Fusil, F., et al. A lentiviral vector allowing physiologically regulated membrane-anchored and secreted antibody expression depending on B-cell maturation status. Molecular Therapy. 23 (11), 1734-1747 (2015).
- Luo, X. M., et al. Engineering human hematopoietic stem/progenitor cells to produce a broadly neutralizing anti-HIV antibody after in vitro maturation to human B lymphocytes. Blood. 113 (7), 1422-1431 (2008).
- Mock, U., Thiele, R., Uhde, A., Fehse, B., Horn, S. Efficient lentiviral transduction and transgene expression in primary human B cells. Human Gene Therapy Methods. 23 (6), 408-415 (2012).
- Heltemes-Harris, L. M., et al. Sleeping Beauty transposon screen identifies signaling modules that cooperate with STAT5 activation to induce B-cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 35 (26), 3454-3464 (2016).
- Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease. Scientific Reports. 8, 12144 (2018).
- Hung, K. L., et al. Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells. Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).
- Cui, Y., Xu, J., Cheng, M., Liao, X., Peng, S. Review of CRISPR/Cas9 sgRNA design tools. Interdisciplinary Sciences. 10 (2), 455-465 (2018).
- Rees, H. A., Liu, D. R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).
- Spiegel, A., Bachmann, M., Jurado Jiménez, G., Sarov, M. CRISPR/Cas9-based knockout pipeline for reverse genetics in mammalian cell culture. Methods. 164-165, 49-58 (2019).
- Suzuki, T., Kazuki, Y., Oshimura, M., Hara, T. A novel system for simultaneous or sequential integration of multiple gene-loading vectors into a defined site of a human artificial chromosome. PLoS One. 9, 110404 (2014).
- Bak, R. O., Porteus, M. H. CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors. Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).
- Shirley, J. L., de Jong, Y. P., Terhorst, C., Herzog, R. W. Immune responses to viral gene therapy vectors. Molecular Therapy. 28 (3), 709-722 (2020).
- Martino, A. T., Markusic, D. M. Immune response mechanisms against AAV vectors in animal models. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 198-208 (2020).
