Summary
פרוטוקול זה מציג שיטה לפיתוח פיגום באמצעות כליות חולדה decellularized. הפרוטוקול כולל תהליכי דקלולריזציה ורסקולריזציה כדי לאשר זמינות ביולוגית. Decellularization מבוצעת באמצעות טריטון X-100 ונתרן דודקיל סולפט.
Abstract
הנדסת רקמות היא משמעת חדשנית בביו-רפואה. טכניקות תרבות התא ניתן ליישם עבור התחדשות של רקמות ואיברים תפקודיים להחליף איברים חולים או פגומים. פיגומים נדרשים כדי להקל על הדור של איברים תלת מימדיים או רקמות באמצעות תאי גזע מובחנים vivo. בדו"ח זה, אנו מתארים שיטה חדשנית לפיתוח פיגומים וסקולריים באמצעות כליות חולדה decellularized. במחקר זה נעשה שימוש בחולדות ספראג-דולי בנות שמונה שבועות, והפרין הוזרק ללב כדי להקל על הזרימה לכלי הכליה, מה שאיפשר להפרין לחלחל לכלי הכליה. חלל הבטן נפתח והכליה השמאלית נאספה. הכליות שנאספו היו perfused במשך 9 שעות באמצעות חומרי ניקוי, כגון טריטון X-100 ונתרן דודקיל סולפט, כדי decellularize את הרקמה. פיגומים בכליות Decellularized נשטפו בעדינות עם 1% פניצילין / סטרפטומיצין והפרין כדי להסיר פסולת הסלולר ושאריות כימיות. השתלת תאי גזע עם פיגומי כלי דם decellularized צפוי להקל על הדור של איברים חדשים. לכן, פיגומים vascularized עשוי לספק בסיס להנדסת רקמות של שתלי איברים בעתיד.
Introduction
טכניקות תרבית תאים מיושמות עבור התחדשות של רקמות ואיברים תפקודיים להחליף איברים חולים או פגומים. השתלת איברים אלוגנית היא כיום הטיפול הנפוץ ביותר לנזק בלתי הפיך לאיברים; עם זאת, גישה זו דורשת שימוש בדיכוי המערכת החיסונית כדי למנוע דחייה של האיבר המושתל. יתר על כן, למרות ההתקדמות באימונולוגיה של ההשתלה, 20% ממקבלי ההשתלה עלולים לחוות דחייה חריפה בתוך 5 שנים, ובתוך 10 שנים לאחר ההשתלה, 40% מהמטופלים עלולים לאבד את השתל המושתל שלהם או למות1.
ההתקדמות בטכנולוגיות להנדסת רקמות הניבה פרדיגמה חדשה להשתלת איברים חדשים ללא דחייה חיסונית באמצעות תאי גזע מובחנים. לאחר בידול תאי גזע, יש צורך בפיגום, הנקרא מטריצה חוץ-תאית סינתטית, כדי להקל על יצירת איברים תלת מימדיים ולאפשר לרקמה החדשה לשגשג בתוך המטופל. פיגומים מאיברים מקומיים decellularized יש יתרונות, כולל סביבה יעילה יותר להקמת תאים ושיפור התפשטות תאי גזע, אם כי מנגנונים אלה לא הובהרו במלואם2. בפרט, הכליה היא איבר מתאים לייצור פיגומים כי יש לה זרימת דם בשפע נישה להקמת תאי גזע. בנוסף, בגלל המבנה המורכב של הכליה, קשה לחדש באופן מלאכותי כליות להשתלת איברים.
בדו"ח זה, אנו מציגים שיטה של פיתוח פיגומים vascularized באמצעות איברים decellularized במודל חולדה כדי להקל על מחקרים עתידיים בבעלי חיים למטרות הנדסת רקמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה אושר על ידי הנהלת האוניברסיטה הלאומית לרפואה של פוסאן ונערך בהתאם להנחיות אתיות לשימוש ולטיפול בבעלי חיים. (תעודה מס' 2017-119). לפני כל מחקר בבעלי חיים, יש לקבל אישור מוסדי.
הערה: כל המכשירים/ציוד/ציוד/ריאגנטים הכירורגיים וההרדמה המומלצים להצגה כירורגית מוצלחת והדמיה של איברי בטן מפורטים בטבלה 1.
1. נהלי הכנה לקצירת כליות חולדה
- כהכנה לניתוח, מניחים חולדות ספראג-דוולי בנות 8 שבועות (במשקל 200-250 גרם) על כרית חימום. מניחים בדיקה מדחום רקטלי בפי הטבעת כדי לפקח על טמפרטורת הליבה.
- יש למרדים את החולדה עם תערובת של 5% של גז isoflurane (אינדוקציה: 5%, תחזוקה: 3%).
- כדי להתחיל את הניתוח, למקם את החולדה בעמדה על-חושית לאחר ניהול הרדמה. הר את ארבעת הגפיים של החולדה על שולחן הניתוחים עם קלטת.
- לגלח ולנקות את הבטן של החולדה התורם עם סבון germicidal. החל 2% betadine לפחות 1-2 דקות, ולנגב עם פתרון 70% אתנול. חזור על רצף זה שלוש פעמים.
- כסה את השדה האופרטיבי עם וילון סטרילי.
- בצע חתך בטן אנכי ולחשוף את הכליה השמאלית, שופך, בטן כאבי העורקים, ו vena קאווה נחות.
- דמיינו ונתחו את הכליה השמאלית, השופכן, אתאבי הבטן ואת הווריד הנחות רגע לפני חיתוך הפדיקל.
2. זלוף טרנסקרדיאלי
- לפני הניתוח, הכינו את פתרון הזלוף.
- הפוך 50 מ"ל של פתרון זלוף לכל חולדה.
- יש לערבב 1x PBS עם הפרין 10 U/mL בקירוב (בקבוקון 1 25 קילוואט-ואט יעשה 2.5 ליטר של PBS+Hep).
- לערבב כמויות שוות של 8% paraformaldehyde עם 1x PBS כדי להפוך את פתרון 4% PFA/1xPBS.
הערה: 8% PFA המיוצר במים יכול להיות מאוחסן ב 4 °C (70 °F) עד 2 חודשים. עם זאת, 4% PFA מדולל PBS הוא יציב רק במשך שבוע אחד ב 4 מעלות צלזיוס. הפוך את הדילול לרענן.
- מאריכים את החתך הבטן האנכי בגולגולת. הקפד למשוך את המספריים מן האיברים בעת חיתוך, כדי למנוע פגיעה באיברים הפנימיים.
- המשך את החתך דרך כלוב הצלעות, ולאחר מכן לחתוך דרך הסרעפת על ידי הרמת עצם החזה.
- הצמד את דש העור הרופף מהדרך, ושחרר את הלב על ידי קריעת כל רקמת חיבור עם המלקחיים.
התראה: אין להשתמש במספריים כדי לשחרר את הלב והדבר עלול לגרום לדימום לא רצוי. - פתח את קו מלוחים אגירת פוספט (PBS) ולהבטיח כי הקו זורם לפני הנחת המחט לתוך החדר השמאלי. החזק את הלב בעדינות עם מלקחיים קהים, ולהשתמש hemostat כדי לשלוט על המחט. המחט צריכה להיות מוכנסת לא יותר מ 1/4 אינץ '.
הערה: הכנסה הגדולה מ- 1/4 אינץ' עלולה לגרום לניקוב לצד השני של הרקמה. - תוך תמיכה בלב עם המחט והמוסטט, לאתר את האטריום הנכון לצלוח דרכו עם מספריים iridectomy. הניחו את ההמוסטט על גופו של החולדה, וודאו שהמחט עדיין ממוקמת בתוך הלב.
הערה: אם החתך מספיק, צריך להיות דם בחלל הגוף כמו הלחץ של PBS זורם לתוך החולדה הוא הקלה. - בזהירות לבטל את הצמדת הרגליים הקדמיות ואת דש העור.
- המשך perfusing PBS במשך 4 דקות או יותר אם יש עדיין דם גלוי בכליות ובכבד.
3. קצירת כליות ודקלולריזציה
- לקצור את הכליה השמאלית עם כאבי העורקים הבטן ורידים נחותים.
- ליגייט השופרן, פי העורקים החזה, vena קאווה מעולה, וענפים שלאבי העורקים הבטן.
- שמור על האיבר hydrated PBS של Dulbecco (DPBS) בצלחת פטרי 10 ס"מ.
- ניתן לתמצת אתאבי הבטן ואת הווריד הנבוב הנחות עם קטטר 23 מד. כדי להסיר שאריות דם, לחבר את הצינורית עם משאבה peristaltic, ולשטוף עם DPBS (500 מ"ל) ו 16 U / mL הפרין במשך 90 דקות בקצב של 5 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס.
- כדי decellularize את הכליה, לחלחל הכליה עם 1% טריטון X-100 (1 L) עבור 3 שעות ולאחר מכן עם 0.75% נתרן דודקיל סולפט (SDS) פתרון (2 L) עבור 6 שעות בלחץ מתמיד של 40 מ"מ היג.
הערה: הכליה תהפוך שקופה לאחר 8 שעות. - כדי להסיר SDS שיורית, לעיין במדגם עם 1% פניצילין במים מזוקקים (6 L) במשך 18 שעות (לילה) ולאחר מכן עם DPBS סטרילי (500 מ"ל) ו 16 U / mL הפרין במשך 90 דקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המורפולוגיה הגולמית של כליות חולדה הייתה אדומה כהה (איור 1A). לאחר דקלולריזציה, הכליה הפכה חיוורת ושקוף (איור 1D). שאריות DNA גנומי הוערך עם ערכה מסחרית על פי הוראות היצרן, בפיגומים כליות decellularized לעומת זה בכליות מקומיות (שליטה). ניתוח כמותי אישר כי DNA גנומי רקמה כמעט בוטל לאחר decellularization. מ-14 מקרים, תכולת הדנ"א הממוצעת הייתה 115.05 ננוגרם/μL לבקרה ו-1.96 ננוגרם/μL לפיגום הנקוב. בסך הכל הוסרו 98.3% מהדנ"א (איור 2),אם כי המבנה התלת מימדי נשמר, וגומרולי תאי השתמר בפרנצ'ימה הקורטיקלית(איור 3).
איור 1: כליות עכברושים הכפופות לדלקת כליות עורקית decellularization. (א)מיד לאחר תחילת הדקלולריזציה. (B)לאחר טיפול טריטון X-100. (C)לאחר טיפול במאגר SDS. (ד)לאחר שטיפת פיגומים למשך הלילה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ריכוזי דנ"א בשליטה ובכליות חולדה דקלולריות, המציגים תכולת דנ"א מופחתת לאחר דקלולריזציה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: כתמי המטוקסילין ואאוסין של שליטה ודגימות כליות דקולריות. (A) שליטה בקליפת המוח (A') קליפת המוח decellularized (B) שליטה medulla (B ') decellularized medulla (C) וריד שליטה (C ') decellularized. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקולים שונים שימשו decellularization של איברים ורקמות אחרות. פרוטוקול decellularization האופטימלי צריך לשמר את הארכיטקטורה התלת מימדית של המטריצה החוץ תאית (ECM). באופן כללי, פרוטוקולים כאלה מורכבים lysing קרום התא על ידי עיבוד פיזי או פתרונות יוניים, ניתוק הציטופלסמה והגרעין מן ECM על ידי עיבוד אנזימטי או חומרי ניקוי, ולאחר מכן הסרת פסולת הסלולר מן הרקמה3. תהליכים פיזיקליים כוללים גירוד, עצבנות פתרון, שיפוע לחץ, הצמדה הקפאה, electroporation קבוע לאthermal, ונוזלים סופר קריטיים2. תאים על פני השטח החיצוניים של רקמה או איבר, כגון העור או המעי הדק, ניתן להסיר ביעילות על ידי תהליכים מכניים בשילוב עםאנזימים 4. חומרי ניקוי יוניים או לא יוניים ממיסים אינטראקציות DNA/חלבון, שומנים וליפופרוטאינים, אך עלולים לגרום נזק למבנה ה- ECM5. אנזימים להסיר את ציטופלסמה מנותק וחומר גרעיני, אבל להשאיר את החומרים האלה ECM, אשר יכול לגרום לתגובה חיסונית6. הסוכנים האופטימליים עבור decellularization נקבעים על ידי עובי רקמות וצפיפות או שימוש קליני של רקמה decellularized.
לצורך דקלולריזציה, השתמשנו בשילוב של חומרי ניקוי לא יוניים ויוניים: טריטון X-100 ו- SDS. טריטון X-100, כגורם ניקוי לא-איוני, משבש ביעילות אינטראקציות של שומנים/שומנים ושומנים/חלבונים. עם זאת, טריטון X-100 עשוי גם להרוס את מבנה אולטרה-מבנה ECM בשל אובדן גליקוזאמינוגליקן (GAG), למין, ותכולת פיברונקטין. SDS, כגורם ניקוי יוני, מסיר ביעילות שרידים גרעיניים וחלבונים ציטופלזמיים, אך גם משבש את מבנה ה- ECM על ידי אובדן GAG וקולגן3. למרות סוכנים אלה להרוס את המיקרו מבנה של ECM, SDS ו טריטון X-100 בהצלחה להסיר את כל תוכן ה-DNA7,8. זה חיוני כי תוכן DNA שנותר בתוך פיגום יכול לגרום לדחייה חיסונית. ברקמה כי כבר decellularized כראוי, תוכן ה-DNA צריך להיות פחות מ 50 ng/mg9,10.
בשיטה, הלחץ של זלוף decellularization היה 40 מ"מ-היג. בקרת לחץ נדרשת עבור זלוף decellularization. לחץ הזלוף האופטימלי משתנה מאיבר לאיבר, ו 60 מ"מ ח"ג הוא הלחץ האופטימלי עבור כליות אדם ופורצין או decellularization הלב11. בחולדות, 40 מ"מ היג נחשב מספיק עבור זלוף decellularization12.
טיפול מבטיח אחד להחלפת השתלת אלוגרפט הוא השתלת תאי גזע באמצעות פיגום וסקולרי. אנו מקווים כי פרוטוקול זה עבור decellularization איברים עשוי לספק בסיס למחקרים הנדסת רקמות בעתיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענק מכון מחקר ביו-רפואי מבית החולים האוניברסיטאי הלאומי פוסאן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions | Becton Dickinson | 305217 | |
| 10-0 ethilon for vessel anastomosis | Ethicon | 9032G | |
| 25 gauge inch guide needle(for vascular catheters) | Becton Dickinson | 305145 | |
| 3-0 PDS incision closure rat | Ethicon | Z316H | |
| 3-0 Prolene incision closure rat | Ethicon | 8832H | |
| 3-0 silk spool vascular access/ligation in rat | Braintree Scientific | SUT-S 110 | |
| 4-0 PDS incision closure mouse | Ethicon | Z773D | |
| 4-0 Prolene incision closure mouse | Ethicon | 8831H | |
| 5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse | Braintree Scientific | SUT-S 106 | |
| Fine Scissors to cut fascia/connective tissue | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut | Fine Science Tools | 13018-14 | |
| Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft | Braintree Scientific | .023" × .038” | |
| Schwartz microserrefine vascular clamps | Fine Science Tools | 18052-01 (straight) | |
| 18052-03 (curved) | |||
| Surgical Scissors to cut skin | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy | Fine Science Tools | 15003-08 |
References
- Kawai, T., et al. Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).
- Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M. Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (4), 942-965 (2017).
- Fu, R. H., et al. Decellularization and recellularization technologies in tissue engineering. Cell Transplantation. 23 (4-5), 621-630 (2014).
- Hopkinson, A., et al. Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 14 (4), 371-381 (2008).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6 (2), 134-136 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
- Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels. Scientific Reports. 9 (1), 14933 (2019).
- Naik, A., Griffin, M., Szarko, M., Butler, P. E. Optimizing the decellularization process of an upper limb skeletal muscle; implications for muscle tissue engineering. Artificial Organs. 44 (2), 178-183 (2020).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Mason, C., Dunnill, P. A brief definition of regenerative medicine. Regenerative Medicine. 3 (1), 1-5 (2008).
- Guyette, J. P., et al.
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
