ラットにおける脱細胞化腎臓足場の調製

Summary

このプロトコルは、脱細胞化ラット腎臓を用いた足場を開発する方法を導入する。このプロトコルには、バイオアベイラビリティを確認するための脱細胞化および再細胞化プロセスが含まれます。脱細胞化は、トリトンX-100およびドデシル硫酸ナトリウムを用いて行われる。

Abstract

組織工学は、バイオメディシンの最先端の分野です。細胞培養技術は、疾患や損傷した臓器を置き換えるために機能組織および器官の再生に適用することができる。足場は、生体内で分化した幹細胞を用いて3次元の器官または組織の生成を容易にするために必要とされる。本報告では、脱細胞化ラット腎臓を用いた血管化足場の新しい開発方法について述べている。8週齢のスプレイグ・ドーリーラットがこの研究で使用され、ヘパリンを心臓に注入して腎血管への流入を促進し、ヘパリンが腎血管に浸透することを可能にした。腹腔を開き、左腎臓を採取した。採取した腎臓を、トリトンX-100やドデシル硫酸ナトリウムなどの洗剤を用いて9時間透過し、組織を脱細胞化した。脱細胞化された腎臓足場を1%ペニシリン/ストレプトマイシンとヘパリンで穏やかに洗浄し、細胞の破片および化学残渣を除去した。脱細胞化された血管足場を用いて幹細胞を移植することは、新しい臓器の生成を促進することが期待される。したがって、血管化足場は、将来的に臓器移植片の組織工学の基礎を提供し得る。

Introduction

細胞培養技術は、疾患や損傷した臓器を置き換えるために機能組織および器官の再生に適用される。アレルギー性臓器移植は、現在、不可逆的な臓器損傷のための最も一般的な治療法です。しかし、このアプローチでは、移植された臓器の拒絶反応を防ぐために免疫抑制を使用する必要があります。さらに、移植免疫学の進歩にもかかわらず、移植レシピエントの20%が5年以内に急性拒絶反応を経験することがあり、移植後10年以内に、レシピエントの40%が移植片を失うか、または1^を死ぬ可能性がある。

組織工学技術の進歩は、分化した幹細胞を用いた免疫拒絶反応を伴わない新しい臓器移植のための新しいパラダイムを生み出した。幹細胞分化後、合成細胞外マトリックスと呼ばれる足場は、3次元器官の生成を容易にし、新しい組織がレシピエント内で繁栄することを可能にするために必要とされる。脱細胞化された在来器官からの足場は、細胞の樹立および幹細胞増殖の増強のためのより効果的な環境を含む利点を有するが、これらのメカニズムは完全に解明されていない^2。特に、腎臓は、豊富な循環と幹細胞の確立のためのニッチを有するため、足場生成に適した器官である。さらに、腎臓の構造が複雑なため、臓器移植のために腎臓を人工的に再生することは困難である。

本報告では、組織工学の目的で将来の動物研究を容易にするために、ラットモデルで脱細胞化された臓器を用いて血管化足場を開発する方法を紹介する。

Protocol

この研究は釜山医科大学の投与によって承認され、動物の使用とケアのための倫理指針に従って行われました。(証明書第2017-119)。動物実験に先立ち、制度的承認を得る必要があります。
注:腹部臓器の外科手術および画像化を成功させるために推奨されるすべての外科および麻酔器具/装置および試薬は 表1に詳述されている。

1. ラット腎臓の採取のための準備手順

1. 手術の準備のために、8週齢のスプレイグ・ドーリーラット(体重200~250g)を温めパッドに置きます。直腸温度計プローブを直腸に置き、コア温度を監視します。
2. イソフルランガスの5%混合物でラットを麻酔(誘導:5%、メンテナンス:3%)。
3. 手術を開始するには、麻酔の投与後にラットをスピーヌ位置に置く。テープで操作テーブルにラットの4つの手足を取り付けます。
4. ドナーラットの腹部を殺菌石鹸で剃り、きれいにします。2%ベタジンを1~2分以上塗布し、70%エタノール溶液で拭いてください。このシーケンスを 3 回繰り返します。
5. 滅菌フェネストドレープで手術場を覆います。
6. 垂直腹部切開を行い、左腎臓、尿管、腹部大動脈、および下の大静脈を露出させる。
7. 左腎臓、尿管、腹部大動脈、下大静脈を視覚化し、ペディクルを切断する直前に解剖します。

2. 心筋灌流

1. 手術前に、灌流液を調製する。
   1. ラットあたり50mLの灌流溶液を作ります。
   2. 1x PBSを約10 U/mLヘパリン(1 25 kUバイアルはPBS +ヘップの2.5 Lになります)と混ぜます。
   3. 8%パラホルムアルデヒドの等量を1x PBSと混合し、4%PFA/1xPBS溶液を作ります。
      注:水で作られた8%のPFAは、最大2ヶ月間4°Cで保存することができます。しかし、PBSで希釈した4%PFAは、4°Cで1週間しか安定していない。 希釈を新鮮にします。
2. 垂直腹部切開を角膜的に伸ばす。内臓に損傷を与えないように切断するときは、必ず、はさみを臓器から引き離してください。
3. リブケージを通して切開を続け、胸骨を持ち上げて横隔膜を切り裂く。
4. 皮膚の緩いフラップを邪魔してピン留めし、鉗子で結合組織を引き裂くことによって心臓を解放する。
   注意: 心臓を解放するためにはさみを使用しないでください 、これは望ましくない出血につながる可能性があります。
5. リン酸緩衝生理食塩分(PBS)ラインを開き、針を左心室に入れる前にラインが流れていることを確認します。鈍い鉗子で心臓を優しく保持し、針を制御するために止止めを使用します。針は1/4インチ以下に挿入する必要があります。
   注:1/4インチより大きい挿入はティッシュの反対側に穿票を引き起こし得る。
6. 針と止止めで心臓を支えながら、右心房を見つけ、虹色の十二次はさみでそれを切り取ります。ラットの体に止まりを置き、針がまだ心臓の内側に配置されていることを確認します。
   注:切り傷が十分であれば、ラットに流れ込むPBSからの圧力が緩和されるため、体腔内に血液が存在するはずです。
7. 前足と皮膚フラップを慎重に固定解除します。
8. 腎臓と肝臓にまだ血液が見える場合は、4分間以上PBSを浸透させ続けます。

3. 腎臓の収穫と脱細胞化

1. 腹部大動脈と下の大静脈で左腎臓を収穫する。
2. 尿管、胸部大動脈、上大静脈、および腹部大動脈の枝をリゲートする。
3. ダルベッコのPBS(DPBS)で臓器を10cmのペトリ皿に入れ、水分補給してください。
4. 23ゲージカテーテルで腹部大動脈と下の大静脈をカヌレートする。残留血液を除去するには、カニューレを蠕動ポンプで接続し、DPBS(500 mL)と16 U/mLヘパリンを37°Cで5rpmの速度で90分間洗浄します。
5. 腎臓を脱細胞化するには、1%トリトンX-100(1 L)を3時間、0.75%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)溶液(2L)を40mmHgの一定圧力で6時間浸透させます。
   注:腎臓は8時間後に透明になります。
6. 残留SDSを除去するには、1%ペニシリンを蒸留水(6 L)で18時間(一晩)、滅菌DPBS(500 mL)、16 U/mLヘパリンを90分間浸透させます。

Representative Results

ラット腎臓の総形態は濃赤色であった(図1A)。脱細胞化後、腎臓は薄く半透明になった(図1D)。残留ゲノムDNAは、製造業者の指示に従って、脱細胞化された腎臓足場で、ネイティブ腎臓(対照)と比較して、市販キットで評価された。定量分析により、組織ゲノムDNAが脱細胞化後にほぼ排除されたことを確認した。14例から、DNAの平均内容物は、制御用に115.05 ng/μL、脱細胞化足場では1.96 ng/μLであった。合計で、DNAの98.3%が除去され(図2)、立体構造は維持されたが、細胞性グロメルリは皮質の形質に保存された(図3)。

図1:腎動脈灌流脱細胞化を行ったラット腎臓。(A) 脱細胞化開始直後。(B) トリトンX-100治療後。(C) SDSバッファ処理後。(D)一晩足場洗浄後。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:ラット腎臓の制御および脱細胞化におけるDNA濃度は、脱細胞化後のDNA内容物の低下を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:ヘマトキシリンおよびエオシン染色のコントロールおよび脱細胞化腎臓サンプル。(A)対照皮質(A')脱細胞化皮質(B)コントロール髄質(B')脱細胞化髄質(C)対照静脈(C'))脱細胞化静脈。スケールバー、100 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

臓器や組織の脱細胞化には、さまざまなプロトコルが用いられてきた。最適な脱細胞化プロトコルは、細胞外マトリックス(ECM)の3次元アーキテクチャを維持する必要があります。一般に、このようなプロトコルは、物理的な処理またはイオン溶液によって細胞膜を融解し、細胞質および核を酵素処理または洗剤によってECMから分離し、次いで組織³から細胞の破片を除去することから成っている。物理的プロセスには、スクレーピング、溶液攪拌、圧力勾配、スナップ凍結、非熱永久エレクトロポレーション、超臨界流体²が含まれる。組織または器官の外表面上の細胞は、皮膚または小腸などの、酵素⁴と結合した機械的プロセスによって効率的に除去することができる。イオン性または非イオン性の洗剤は、DNA/タンパク質相互作用、脂質、およびリポタンパク質を溶解するが、ECM構造⁵を損傷する可能性がある。酵素は解離された細胞質と核物質を除去するが、これらの物質をECMに残し、免疫応答を引き起こす可能性^{がある6。}脱細胞化のための最適な薬剤は、組織の厚さおよび密度または脱細胞化組織の臨床使用によって決定される。

脱細胞化には、非イオン性およびイオン性洗剤の組み合わせを使用しました: トリトンX-100とSDS.トリトンX-100は、非イオン性洗剤として、脂質/脂質および脂質/タンパク質相互作用を効果的に破壊する。しかしながら、トリトンX-100はまた、グリコサミノグリカン(GAG)、ラミニン、およびフィブロネクチン内容物の損失のためにECMの超構造を破壊し得る。SDSは、イオン性洗剤として、核残膜および細胞質タンパク質を効果的に除去するが、GAGおよびコラーゲン³の喪失によってECMの超構造を破壊する。これらの薬剤はECMの微細構造を破壊するが、SDSおよびトリトンX-100は、すべてのDNA内容物^7,8を正常に除去する。足場内に残っているDNA含有量は免疫拒絶反応を引き起こす可能性があるため、これは不可欠です。適切に脱細胞化された組織では、DNA含有量は50 ng /mg^9、10未満である必要があります。

この方法では、脱細胞化灌流の圧力は40mmHgであった。脱細胞化灌流には圧力制御が必要です。最適な灌流圧力は臓器によって異なり、60mmHgはヒトおよびブタ腎臓または心臓脱細胞化¹¹に最適な圧力である。ラットにおいて、40mmHgは、脱細胞化灌流¹²に十分であると考えられる。

同種移植を置き換えるための1つの有望な治療法は、血管化足場を用いた幹細胞の移植である。この臓器脱細胞化のプロトコルが、将来の組織工学研究の基礎となると期待しています。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions	Becton Dickinson	305217
10-0 ethilon for vessel anastomosis	Ethicon	9032G
25 gauge inch guide needle(for vascular catheters)	Becton Dickinson	305145
3-0 PDS incision closure rat	Ethicon	Z316H
3-0 Prolene incision closure rat	Ethicon	8832H
3-0 silk spool vascular access/ligation in rat	Braintree Scientific	SUT-S 110
4-0 PDS incision closure mouse	Ethicon	Z773D
4-0 Prolene incision closure mouse	Ethicon	8831H
5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse	Braintree Scientific	SUT-S 106
Fine Scissors to cut fascia/connective tissue	Fine Science Tools	14058-09
Halsey needle holder	Fine Science Tools	12001-13
Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut	Fine Science Tools	13018-14
Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft	Braintree Scientific	.023" × .038”
Schwartz microserrefine vascular clamps	Fine Science Tools	18052-01 (straight)
		18052-03 (curved)
Surgical Scissors to cut skin	Fine Science Tools	14002-12
Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy	Fine Science Tools	15003-08