Summary
Este protocolo introduz um método para desenvolver um andaime usando rins descelularizados. O protocolo inclui processos de descelularização e recelularização para confirmar a biodisponibilidade. A descelularização é realizada utilizando-se triton X-100 e sulfato de dodecyl de sódio.
Abstract
Engenharia de tecidos é uma disciplina de ponta na biomedicina. Técnicas de cultura celular podem ser aplicadas para a regeneração de tecidos e órgãos funcionais para substituir órgãos doentes ou danificados. Andaimes são necessários para facilitar a geração de órgãos ou tecidos tridimensionais usando células-tronco diferenciadas in vivo. Neste relatório, descrevemos um novo método para o desenvolvimento de andaimes vascularizados usando rins descelularizados. Os ratos Sprague-Dawley de oito semanas de idade foram usados neste estudo, e a heparina foi injetada no coração para facilitar o fluxo para os vasos renais, permitindo que a heparina perfunde para os vasos renais. A cavidade abdominal foi aberta, e o rim esquerdo foi coletado. Os rins coletados foram perfundidos por 9h usando detergentes, como Tritão X-100 e sulfato de dodecyl de sódio, para descelularizar o tecido. Os andaimes renais descelularizados foram então lavados suavemente com penicilina/estreptomicina de 1% e heparina para remover detritos celulares e resíduos químicos. Espera-se que o transplante de células-tronco com os andaimes vasculares descelularizados facilite a geração de novos órgãos. Assim, os andaimes vascularizados podem fornecer uma base para a engenharia tecidual dos enxertos de órgãos no futuro.
Introduction
Técnicas de cultura celular são aplicadas para a regeneração de tecidos e órgãos funcionais para substituir órgãos doentes ou danificados. O transplante de órgãos aogênicos é atualmente o tratamento mais comum para danos irreversíveis aos órgãos; no entanto, essa abordagem requer o uso de imunossupressão para evitar a rejeição do órgão transplantado. Além disso, apesar dos avanços na imunologia do transplante, 20% dos transplantados podem sofrer rejeição aguda dentro de 5 anos, e dentro de 10 anos após o transplante, 40% dos receptores podem perder o enxerto transplantado ou morrer1.
Os avanços nas tecnologias de engenharia de tecidos têm rendido um novo paradigma para o transplante de novos órgãos sem rejeição imunológica usando células-tronco diferenciadas. Após a diferenciação de células-tronco, um andaime, chamado de matriz extracelular sintética, é necessário para facilitar a geração de órgãos tridimensionais e permitir que o novo tecido prospere dentro do receptor. Andaimes de órgãos nativos descelularizados têm vantagens, incluindo um ambiente mais eficaz para o estabelecimento de células e o aprimoramento da proliferação de células-tronco, embora esses mecanismos não tenham sido totalmente elucidados2. Em particular, o rim é um órgão adequado para a geração de andaimes porque tem circulação abundante e um nicho para o estabelecimento de células-tronco. Além disso, devido à complexa estrutura do rim, é difícil regenerar artificialmente os rins para transplante de órgãos.
Neste relatório, introduzimos um método de desenvolvimento de andaimes vascularizados utilizando órgãos descelularizados em um modelo de rato para facilitar futuros estudos em animais para fins de engenharia de tecidos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Este estudo foi aprovado pela administração da Universidade Nacional de Medicina de Pusan e foi conduzido de acordo com diretrizes éticas para o uso e cuidado dos animais. (certificado nº 2017-119). Antes de qualquer estudo em animais, deve-se obter aprovação institucional.
NOTA: Todos os instrumentos/equipamentos cirúrgicos e anestésicos recomendados para apresentação cirúrgica bem sucedida e imagem de órgãos abdominais estão detalhados na Tabela 1.
1. Procedimentos de preparação para a colheita de rins de rato
- Em preparação para a cirurgia, coloque ratos Sprague-Dawley de 8 semanas de idade (pesando 200-250 g) em uma almofada de aquecimento. Coloque uma sonda de termômetro retal no reto para monitorar a temperatura do núcleo.
- Anestesiar o rato com uma mistura de 5% de gás isoflurane (indução: 5%, manutenção: 3%).
- Para iniciar a operação, coloque o rato em uma posição supina após a administração da anestesia. Monte os quatro membros do rato na mesa de operação com fita adesiva.
- Raspe e limpe o abdômen do doador com sabão germicidal. Aplique 2% de betadina por pelo menos 1-2 min, e limpe com uma solução de 70% de etanol. Repita esta sequência três vezes.
- Cubra o campo operacional com uma cortina fenestrada estéril.
- Faça uma incisão abdominal vertical e exponha o rim esquerdo, ureter, aorta abdominal e veia cava inferior.
- Visualize e disseque o rim esquerdo, ureter, aorta abdominal e veia cava inferior pouco antes de cortar o pedículo.
2. Perfusão transcárvia
- Antes da cirurgia, prepare a solução de perfusão.
- Faça 50 mL de solução de perfusão por rato.
- Misture 1x PBS com aproximadamente 10 U/mL de heparina (1 frasco de 25 kU fará 2,5 L de PBS+Hep).
- Misture volumes iguais de 8% de paraformaldeído com 1x PBS para fazer a solução PFA/1xPBS de 4%.
NOTA: 8% de PFA feito na água pode ser armazenado a 4 °C por até 2 meses. No entanto, 4% de PFA diluído em PBS só é estável por 1 semana a 4 °C. Faça a diluição fresca.
- Estenda a incisão abdominal vertical cranialmente. Certifique-se de retirar a tesoura dos órgãos ao cortar para evitar danificar os órgãos internos.
- Continue a incisão através da caixa torácica, e depois corte através do diafragma levantando o esterno.
- Tire o retalho solto da pele para fora do caminho, e liberte o coração rasgando qualquer tecido conjuntivo com as fórceps.
ATENÇÃO: Não use a tesoura para libertar o coração e isso pode resultar em sangramento indesejado. - Abra a linha salina tamponada com fosfato (PBS) e certifique-se de que a linha está fluindo antes de colocar a agulha no ventrículo esquerdo. Segure o coração suavemente com fórceps sem cortes, e use um hemostat para controlar a agulha. A agulha deve ser inserida não mais do que 1/4 polegada.
NOTA: A inserção superior a 1/4 polegada pode resultar em perfuração para o outro lado do tecido. - Enquanto sustenta o coração com a agulha e o hemostat, localize o átrio direito e corte-o com uma tesoura de iridectomia. Descanse o hemostat sobre o corpo do rato, e certifique-se de que a agulha ainda está posicionada dentro do coração.
NOTA: Se o corte for suficiente, deve haver sangue na cavidade corporal, pois a pressão do PBS que flui para o rato é aliviada. - Despreocupe cuidadosamente os pés dianteiros e a aba da pele.
- Continue perfundiando PBS por 4 minutos ou mais se ainda houver sangue visível no rim e fígado.
3. Colheita e descelularização de rins
- Colher o rim esquerdo com a aorta abdominal e veia cava inferior.
- Ligate o ureter, aorta torácica, veia cava superior, e ramos da aorta abdominal.
- Mantenha o órgão hidratado na PBS de Dulbecco (DPBS) em uma placa de Petri de 10 cm.
- Cannulate a aorta abdominal e a cava vena inferior com um cateter calibre 23. Para remover o sangue residual, conecte a cânula com uma bomba peristáltica e lave com DPBS (500 mL) e heparina de 16 U/mL por 90 min a uma taxa de 5 rpm a 37 °C.
- Para descelularizar o rim, perfunde o rim com 1% Triton X-100 (1 L) por 3 h e depois com solução de sulfato de dodecyl de sódio de 0,75% (SDS) solução (2 L) por 6h a uma pressão constante de 40 mmHg.
NOTA: O rim ficará transparente após 8h. - Para remover sds residuais, perfundir a amostra com penicilina de 1% em água destilada (6 L) por 18 h (durante a noite) e, em seguida, com DPBS estéreis (500 mL) e 16 U/mL heparina por 90 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A morfologia bruta dos rins de rato era vermelho escuro(Figura 1A). Após a descelularização, o rim ficou pálido e translúcido(Figura 1D). O DNA genômico residual foi avaliado com um kit comercial de acordo com as instruções do fabricante, em andaimes renais descelularizados e comparado com o dos rins nativos (controle). A análise quantitativa confirmou que o DNA genômico tecidual foi quase eliminado após a descelularização. De 14 casos, o conteúdo médio de DNA foi de 115,05 ng/μL para o controle e 1,96 ng/μL para o andaime descelularizado. No total, 98,3% do DNA foi removido(Figura 2),embora a estrutura tridimensional tenha sido mantida, e gromeruli acelular foram preservados no parênquim cortical(Figura 3).
Figura 1: Rins de ratos submetidos à descelularização da perfusão arterial renal. (A) Imediatamente após o início da descelularização. (B) Após o tratamento tritão X-100. (C) Após o tratamento do buffer SDS. (D) Após a lavagem do andaime durante a noite. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: concentrações de DNA no controle e rins descelularizados de ratos, mostrando redução do conteúdo de DNA após a descelularização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Hemaoxilina e eosina colorindo amostras de controle e descelularizados. (A) córtex de controle (A') córtex descelularizado(B) controle medulla(B)medulla descelularizada(C) veia de controle(C') veia descelularizada. Barra de escala, 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vários protocolos têm sido utilizados para a descelularização de órgãos e outros tecidos. O protocolo ideal de descelularização deve preservar a arquitetura tridimensional da matriz extracelular (ECM). Em geral, tais protocolos consistem em lise da membrana celular por meio de processamento físico ou soluções iônicas, dissociando o citoplasma e o núcleo do ECM por processamento enzimático ou detergentes, e, em seguida, removendo detritos celulares do tecido3. Os processos físicos incluem raspagem, agitação da solução, gradientes de pressão, congelamento de snap, eletroporação permanente nãotémal e fluidos supercríticos2. As células na superfície externa de um tecido ou órgão, como a pele ou o intestino delgado, podem ser removidas eficientemente por processos mecânicos combinados com enzimas4. Detergentes iônicos ou noniônicos dissolvem interações de DNA/proteína, lipídios e lipoproteínas, mas podem danificar a estrutura ECM5. Enzimas removem o citoplasma dissociado e o material nuclear, mas deixam esses materiais no ECM, o que pode causar uma resposta imune6. Os agentes ideais para a descelularização são determinados pela espessura e densidade do tecido ou pelo uso clínico do tecido descelularizado.
Para descelularização, utilizamos uma combinação de detergentes noniônicos e iônicos: Triton X-100 e SDS. Tritão X-100, como detergente noniônico, efetivamente interrompe as interações lipídicas/lipídicas e lipídicas/proteínas. No entanto, triton X-100 também pode destruir a ultraestrutura ECM devido à perda de conteúdo de glicosaminoglicano (GAG), laminina e fibronectina. A SDS, como detergente iônico, remove efetivamente os remanescentes nucleares e proteínas citoplasmáticas, mas também interrompe a ultraestrutura ECM pela perda de GAG e colágeno3. Embora esses agentes destruam a microestrutura do ECM, SDS e Triton X-100 removam com sucesso todo o conteúdo de DNA7,8. Isso é essencial porque o conteúdo restante do DNA dentro de um andaime pode causar rejeição imunológica. Em tecido devidamente descelularizado, o conteúdo de DNA deve ser inferior a 50 ng/mg9,10.
No método, a pressão da perfusão da descelularização foi de 40 mmHg. O controle de pressão é necessário para a perfusão da descelularização. A pressão ideal de perfusão varia de órgão para órgão, e 60 mmHg é a pressão ideal para a descelularização renal ou cardíaca humana e suína11. Em ratos, 40 mmHg é considerado suficiente para descelularização perfusão12.
Um tratamento promissor para a substituição do transplante de alóxe é o transplante de células-tronco usando um andaime vascularizado. Esperamos que este protocolo de descelularização de órgãos possa fornecer uma base para futuros estudos de engenharia de tecidos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado por uma bolsa do Instituto de Pesquisa Biomédica do Hospital Nacional universitário de Pusan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions | Becton Dickinson | 305217 | |
| 10-0 ethilon for vessel anastomosis | Ethicon | 9032G | |
| 25 gauge inch guide needle(for vascular catheters) | Becton Dickinson | 305145 | |
| 3-0 PDS incision closure rat | Ethicon | Z316H | |
| 3-0 Prolene incision closure rat | Ethicon | 8832H | |
| 3-0 silk spool vascular access/ligation in rat | Braintree Scientific | SUT-S 110 | |
| 4-0 PDS incision closure mouse | Ethicon | Z773D | |
| 4-0 Prolene incision closure mouse | Ethicon | 8831H | |
| 5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse | Braintree Scientific | SUT-S 106 | |
| Fine Scissors to cut fascia/connective tissue | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut | Fine Science Tools | 13018-14 | |
| Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft | Braintree Scientific | .023" × .038” | |
| Schwartz microserrefine vascular clamps | Fine Science Tools | 18052-01 (straight) | |
| 18052-03 (curved) | |||
| Surgical Scissors to cut skin | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy | Fine Science Tools | 15003-08 |
References
- Kawai, T., et al. Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).
- Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M. Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (4), 942-965 (2017).
- Fu, R. H., et al. Decellularization and recellularization technologies in tissue engineering. Cell Transplantation. 23 (4-5), 621-630 (2014).
- Hopkinson, A., et al. Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 14 (4), 371-381 (2008).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6 (2), 134-136 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
- Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels. Scientific Reports. 9 (1), 14933 (2019).
- Naik, A., Griffin, M., Szarko, M., Butler, P. E. Optimizing the decellularization process of an upper limb skeletal muscle; implications for muscle tissue engineering. Artificial Organs. 44 (2), 178-183 (2020).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Mason, C., Dunnill, P. A brief definition of regenerative medicine. Regenerative Medicine. 3 (1), 1-5 (2008).
- Guyette, J. P., et al.
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
