هنا ، نقدم بروتوكول تشريح مطلوب لتصوير الغدد التناسلية الذكرية ذبابة الفاكهة الجنينية المتأخرة . سيسمح هذا البروتوكول بمراقبة العمليات الخلوية الديناميكية في ظل الظروف العادية أو بعد التلاعب المعدل وراثيا أو الدوائي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تشريح وتصوير حي للغدد التناسلية ذبابة الفاكهة الجنينية المتأخرة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يعد الغدد التناسلية الجنينية الذكرية ذبابة الفاكهة نموذجا مفيدا لدراسة الجوانب المختلفة لعلم الأحياء التنموي بما في ذلك ، على سبيل المثال لا الحصر ، تطور الخلايا الجرثومية ، وبيولوجيا piRNA ، وتكوين المتخصصة. هنا ، نقدم تقنية تشريح للتصوير الحي للغدد التناسلية خارج الجسم الحي خلال فترة يكون فيها التصوير الحي في الجسم الحي غير فعال للغاية. يحدد هذا البروتوكول كيفية نقل الأجنة إلى طبق تصوير، واختيار الأجنة الذكرية ذات المراحل المناسبة، وتشريح الغدد التناسلية من الأنسجة المحيطة بها مع الحفاظ على سلامتها الهيكلية. بعد التشريح ، يمكن تصوير الغدد التناسلية باستخدام مجهر متحد البؤرة لتصور العمليات الخلوية الديناميكية. يتطلب إجراء التشريح توقيتا دقيقا وبراعة ، لكننا نقدم نظرة ثاقبة حول كيفية منع الأخطاء الشائعة وكيفية التغلب على هذه التحديات. على حد علمنا ، هذا هو أول بروتوكول تشريح للغدد التناسلية الجنينية ذبابة الفاكهة ، وسوف يسمح بالتصوير الحي خلال نافذة زمنية يتعذر الوصول إليها بخلاف ذلك. يمكن دمج هذه التقنية مع التلاعب الدوائي أو الخلوي المحدد المعدل وراثيا لدراسة أي عمليات ديناميكية تحدث داخل أو بين الخلايا في بيئتها التناسلية الطبيعية.
المقدمة
وقد خدم الخصية ذبابة الفاكهة melanogaster كنموذج لفهمنا للعديد من العمليات الخلوية الديناميكية. وقد ألقت الدراسات التي أجريت على هذا النموذج الضوء على تنظيم انقسام الخلايا الجذعية1،2،3 ، وتطوير الخلايا الجرثومية4،5 ، وبيولوجيا piRNA6،7،8 ، وأحداث إشارات الخلايا الجذعية المتخصصة9،10،11،12،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد اليوم السابق للتشريح
- شحذ كهربائيا إبرة التنغستن24 بحيث يكون القطر الناتج حوالي 0.03 ملم. اضبط الجهد الكهربائي المزود إلى 14 فولت تقريبا، واستخدم 3.3 مليون نيوتن كهربائي. يجب ألا يستغرق الشحذ أكثر من 1 أو 2 دقيقة.
تحذير: NaOH شديد التآكل وسيسبب حروقا عند ملامسة الجلد. ارتداء القفازات والنظارات الواقية أثناء التعامل ، والعمل داخل غطاء الدخان.
ملاحظة: بعد الاستخدام ، قم بتخزين NaOH في أنبوب صقر من البولي بروبيلين. - اصنع وسائط التصوير المعدة. في أنبوب مخروطي 15 مل ، اجمع 4.25 مل من وسائط شنايدر مع 750 ميكرولتر من مصل البقر الجنيني (FBS ، تركيز نهائي 15٪) و 27.5 ميكرولتر من البنسلين - ستربتومايسين (0.05 U / μL من ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
نوضح إعداد طبق التصوير في الشكل 1 ، كما هو موضح في "إعداد يوم التشريح". يجب أن تؤدي هذه الطرق في النهاية إلى التصاق أجنة رطبة جيدا بشريط انزلاق الغطاء ، والذي يتم تثبيته مؤقتا في قاع الطبق وغمره في محلول رينجر (الشكل 1F). تسمح السكين ذات الرؤوس الماسية للمرء بتقطيع غطاء مقاس 22 × 22 مم بشكل نظيف إلى ثلاثة إلى أربعة شرائط أصغر (الشكل 1A). أثناء التعامل مع هذه الشرائط باستخدام الملقط ، نستخدم ماصة لنقل ما يكفي من غراء الهيبتان لتغطية .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
أثناء تكوين الغدد التناسلية ، يخضع الغدد التناسلية الجنينية ، وخاصة مكانة الخلايا الجذعية داخل الغدد التناسلية الذكرية15 ، لتغيرات مورفولوجية سريعة. يتم فهم الآليات التنموية التي تكمن وراء هذه التغييرات الديناميكية بشكل أفضل من خلال تقنيات التصوير الحي. ومع ذلك ، في المرحلة الجنينية 17 ، يصبح التصوير في الجسم الحي للغدد التناسلية مستحيلا بسبب بداية تقلصات العضلات واسعة النطاق17. مع هذا البروتوكول ، نقدم بديلا ناجحا: تشريح الغدد التناسلية مباشرة على طبق تصوير للتصوي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
ونود أن نشكر ليندسي دبليو بلاسخارت وجاستن سوي على إسهاماتهما الكبيرة في التطوير المبكر لهذا البروتوكول. المؤلفون ممتنون لمجتمع الذباب على كرمهم مع الكواشف ، وخاصة لروث ليمان وبنيامين لين على هديتهم لخط nos 5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' قبل نشره. تم استخدام المخزونات التي تم الحصول عليها من مركز بلومنغتون لذبابة الفاكهة (NIH P40OD018537) في هذه الدراسة. تم دعم هذا العمل من قبل NIH RO1 GM060804 و R33AG04791503 و R35GM136270 (S.D) بالإضافة إلى منح التدريب T32GM007229 (B.W.) و F32GM125123 (L.A).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ألفا إيسار سلك التنغستن | فيشر Scientific | AA10408G6 | 0.25 مم (0.01 بوصة) قطر ، 99.95٪ (أساس المعادن) |
| D. melanogaster: < / em> His2Av :: mRFP1 | مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة (BDSC) | FBtp0056035 | Schuh ، Lehner ، & amp Heidmann ، علم الأحياء الحالي ، 2007 |
| D. melanogaster: nos< / em>-lifeact:: tdtomato | هدية من Ruth Lehmann Lab | Lin و Luo و amp ليمان ، نيتشر كوميونيكيشنز ، 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' | |
| D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP :: Moesin < / em> | FBtp0083398 | Sano et al. ، PLoS One ، 2012 | |
| سكين | |||
| ماسي شريط على الوجهين | سكوتش | 665 | |
| مصل الأبقار الجنيني | GIBCO | 10082 | |
| طبق التصوير | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| برنامج التصوير | الأجهزة الجزيئية | أتمتة الفحص المجهري MetaMorph وبرنامج تحليل الصور v7.8.4.0 | |
| الأنسولين ، البقر | سيجما | l0516 | تخزين الكميات عند 4 درجات ؛ حامل |
| إبرة | فيشر ساينتفيك | 08-955 | |
| سلة | |||
| البنسلين / الستربتومايسين | Corning | 30-002-Cl | |
| محلول | 2 ملي ملي MgCl2 ، 2 ملي CaCl2 ، 130 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملم KCl ، 36 ملي سكروز ، 5 ملم هيبي s عازلة. تم تعديله باستخدام هيدروكسيد الصوديوم حتى يتم تحقيق الرقم الهيدروجيني 7.3 | ||
| شنايدر إنسايد ميديا | جيبكو | 21720-024 |
المراجع
- Yamashita, Y. M., Jones, D. L., Fuller, M. T. Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome. Science. 301, 1547-1550 (2003).
- Inaba, M., Yuan, H., Salzmann, V., Fuller, M. T., Yamashita, Y. M. E-Cad....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
