Summary
هنا ، نقدم بروتوكول تشريح مطلوب لتصوير الغدد التناسلية الذكرية ذبابة الفاكهة الجنينية المتأخرة . سيسمح هذا البروتوكول بمراقبة العمليات الخلوية الديناميكية في ظل الظروف العادية أو بعد التلاعب المعدل وراثيا أو الدوائي.
Abstract
يعد الغدد التناسلية الجنينية الذكرية ذبابة الفاكهة نموذجا مفيدا لدراسة الجوانب المختلفة لعلم الأحياء التنموي بما في ذلك ، على سبيل المثال لا الحصر ، تطور الخلايا الجرثومية ، وبيولوجيا piRNA ، وتكوين المتخصصة. هنا ، نقدم تقنية تشريح للتصوير الحي للغدد التناسلية خارج الجسم الحي خلال فترة يكون فيها التصوير الحي في الجسم الحي غير فعال للغاية. يحدد هذا البروتوكول كيفية نقل الأجنة إلى طبق تصوير، واختيار الأجنة الذكرية ذات المراحل المناسبة، وتشريح الغدد التناسلية من الأنسجة المحيطة بها مع الحفاظ على سلامتها الهيكلية. بعد التشريح ، يمكن تصوير الغدد التناسلية باستخدام مجهر متحد البؤرة لتصور العمليات الخلوية الديناميكية. يتطلب إجراء التشريح توقيتا دقيقا وبراعة ، لكننا نقدم نظرة ثاقبة حول كيفية منع الأخطاء الشائعة وكيفية التغلب على هذه التحديات. على حد علمنا ، هذا هو أول بروتوكول تشريح للغدد التناسلية الجنينية ذبابة الفاكهة ، وسوف يسمح بالتصوير الحي خلال نافذة زمنية يتعذر الوصول إليها بخلاف ذلك. يمكن دمج هذه التقنية مع التلاعب الدوائي أو الخلوي المحدد المعدل وراثيا لدراسة أي عمليات ديناميكية تحدث داخل أو بين الخلايا في بيئتها التناسلية الطبيعية.
Introduction
وقد خدم الخصية ذبابة الفاكهة melanogaster كنموذج لفهمنا للعديد من العمليات الخلوية الديناميكية. وقد ألقت الدراسات التي أجريت على هذا النموذج الضوء على تنظيم انقسام الخلايا الجذعية1،2،3 ، وتطوير الخلايا الجرثومية4،5 ، وبيولوجيا piRNA6،7،8 ، وأحداث إشارات الخلايا الجذعية المتخصصة9،10،11،12،13. هذا النموذج مفيد لأنه قابل للسحب وراثيا14,15 وهو واحد من القلائل الذين يمكننا من خلالها تصوير الخلايا الجذعية الحية في بيئتهم الطبيعية3,16,17,18. ومع ذلك ، فقد اقتصر التصوير الحي لهذا النموذج على الأنسجة البالغة والمراحل الجنينية المبكرة ، مما ترك فجوة في معرفتنا بديناميكيات الغدد التناسلية في الجنين المتأخر ، وهي المرحلة الدقيقة التي يتشكل فيها المكان لأول مرة ويبدأ في العمل.
الغدد التناسلية الجنينية في المرحلة المتأخرة هي كرة ، تتكون من خلايا متخصصة جسدية في الأمام ، وخلايا جرثومية تنشرها خلايا الغدد التناسلية الجسدية في جميع أنحاء المناطق الخلفية19. يمكن تصوير هذا العضو حيا في الجسم الحي حتى المرحلة الجنينية المبكرة 1717،20،21. يتم منع المزيد من التصوير بسبب بدء تقلصات العضلات على نطاق واسع. هذه الانقباضات شديدة لدرجة أنها تدفع الغدد التناسلية خارج إطار التصوير ، ولا يمكن تصحيح هذه الحركة باستخدام برنامج التصوير. يهتم مختبرنا بالكشف عن آليات التكوين المتخصصة ، والتي تحدث خلال هذه الفترة المراوغة للتصوير الحي. لذلك ، أنشأنا نهجا خارج الجسم الحي للتصوير الحي للغدد التناسلية بدءا من المرحلة الجنينية 16 ، مما يسهل دراسة ديناميكيات الخلية خلال هذه الفترة الحاسمة من تطور الغدد التناسلية. يظهر العمل السابق من مختبرنا أن هذا التصوير خارج الجسم الحي يلخص بأمانة في تطوير الغدد التناسلية في الجسم الحي 17. هذه التقنية هي الأولى والوحيدة من نوعها للغدد التناسلية الجنينية ذبابة الفاكهة .
هنا ، نقدم بروتوكول التشريح المطلوب للتصوير الحي خارج الجسم الحي للغدد التناسلية خلال المراحل الجنينية المتأخرة. يمكن دمج هذا البروتوكول مع العلاجات الدوائية ، أو التلاعب المعدل وراثيا لسلالات خلايا محددة داخل الغدد التناسلية. باستخدام هذه التقنية ، نجحنا في تصوير خطوات تكوين الخلايا الجذعية المتخصصة17. وبالتالي ، فإن نهج التصوير هذا مفيد في مجال بيولوجيا الخلايا الجذعية ، لأنه سيمكن من تصور المراحل الأولية من تكوين المتخصصة في الوقت الفعلي داخل بيئتها الطبيعية15,17. في حين أن هذه الطريقة مفيدة لمجال بيولوجيا الخلايا الجذعية ، إلا أنها قابلة للتطبيق أيضا لتصور أي عمليات ديناميكية تحدث في الغدد التناسلية خلال هذه النقطة الزمنية التنموية ، بما في ذلك إعادة الترتيب الخلوي 22 ، والتصاق الخلايا2،12،23 ، وهجرة الخلايا 23. وبالتالي فإن بروتوكول التشريح هذا سيعزز فهمنا للعديد من العمليات البيولوجية الأساسية للخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد اليوم السابق للتشريح
- شحذ كهربائيا إبرة التنغستن24 بحيث يكون القطر الناتج حوالي 0.03 ملم. اضبط الجهد الكهربائي المزود إلى 14 فولت تقريبا، واستخدم 3.3 مليون نيوتن كهربائي. يجب ألا يستغرق الشحذ أكثر من 1 أو 2 دقيقة.
تحذير: NaOH شديد التآكل وسيسبب حروقا عند ملامسة الجلد. ارتداء القفازات والنظارات الواقية أثناء التعامل ، والعمل داخل غطاء الدخان.
ملاحظة: بعد الاستخدام ، قم بتخزين NaOH في أنبوب صقر من البولي بروبيلين. - اصنع وسائط التصوير المعدة. في أنبوب مخروطي 15 مل ، اجمع 4.25 مل من وسائط شنايدر مع 750 ميكرولتر من مصل البقر الجنيني (FBS ، تركيز نهائي 15٪) و 27.5 ميكرولتر من البنسلين - ستربتومايسين (0.05 U / μL من البنسلين ، 0.05 ميكروغرام / ميكرولتر التركيز النهائي). قم بتخزين وسائط التصوير المعدة هذه على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- جعل محلول الهيبتان الغراء. أضف حوالي 0.5 مل من السباتان إلى قارورة قابلة للإغلاق سعة 20 مل محشوة بشريط على الوجهين يبلغ طوله حوالي 20 سم. صخر على المغذيات لمدة ساعة تقريبا ، أو حرك بطرف ماصة حتى يتم تحقيق اتساق بين الماء والجلسرين. سيستمر هذا المحلول من الغراء المذاب لعدة أيام قبل أن يتبخر الهيبتان. لإنعاش المحلول ، أضف 0.5 مل هيبتان إضافي ، وصخور.
ملاحظة: يمكن تحضير محلول فعال من غراء الهيبتان باستخدام نسب مختلفة من الهيبتان إلى الشريط ، بالإضافة إلى فترات مختلفة من الهزاز / التحريك. المواصفات المذكورة أعلاه هي مجرد اقتراحات لإعداد أو تحديث أحد هذه الحلول المناسبة.
2. جمع الأجنة - 15-17 ساعة قبل التشريح
- أضف معجون الخميرة الطازج إلى طبق أجار عصير التفاح25. قم بإعداد قفص لجمع الأجنة عن طريق إضافة ذباب بالغ (أقل من 10 أيام) إلى زجاجة طعام فارغة ، مثقوبة بثقوب صغيرة26. قم بتغطية قفص التجميع باستخدام لوحة الآجار المخمرة ، والمسجلة على الزجاجة ، وضع القفص مع جانب اللوحة لأسفل في حاضنة داكنة 25 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
ملاحظة: يجب أن يعبر الذباب عن جين متحول من شأنه أن يميز الغدد التناسلية بشكل فلوري ، على سبيل المثال ، six4-eGFP::Moesin20 ، لأن تشريح الأجنة سيحدث تحت مجهر ستيريو فلورسنت. انظر جدول المواد للحصول على قائمة بالأنماط الجينية المستخدمة لوضع علامة على الغدد التناسلية. - قم بإزالة القفص من الحاضنة وتخلص من هذه المجموعة الأولى. استبدله بطبق أجار مخمر طازج وضع القفص مرة أخرى في الحاضنة لمدة 2 ساعة.
ملاحظة: يتم استخدام أول مجموعة أجنة لتطهير الإناث من الأجنة المخصبة النامية ، لتحقيق مجموعة ثانية من الأجنة في الوقت المناسب بإحكام. - قم بإزالة صفيحة الأجار من القفص وضعها (مع توجيه الجانب المخمر لأعلى) على منشفة ورقية رطبة داخل حاوية بلاستيكية قابلة للإغلاق. ضع هذه الغرفة الرطبة في حاضنة 25 درجة مئوية لعمر الأجنة لمدة 14.5 ساعة (الأعمار النهائية ، 14.5-16.5 ساعة بعد وضع البيض).
ملاحظة: مباشرة قبل بدء الخطوة 2.4، أكمل الخطوتين 3.1 و3.2. - قم بإزالة صفيحة الأجار من الحاضنة ، وباستخدام زجاجة بخاخ ، أضف ما يكفي من الماء إلى صفيحة الأجار لإذابة معجون الخميرة عن طريق تنظيف الأسنان بفرشاة الطلاء برفق. شطف الأجنة والخميرة المذابة في سلة شاشة شبكية صغيرة تجلس داخل قارب الوزن. اشطف السلة بزجاجة رش الماء حتى يتم ترشيح معظم عجينة الخميرة من خلال الشبكة.
- قم بإزالة الماء من قارب الوزن ووضع السلة مرة أخرى في الداخل. قم بإزالة الأجنة عن طريق غمرها في محلول تبييض بنسبة 50٪ ، باستخدام زجاجة بخاخ. يجب أن يكون عمق محلول التبييض 3-5 مم. حافظ على الأجنة مغمورة في المبيض لمدة 2 دقيقة تقريبا ، مع دوامة عرضية.
تحذير: المبيض قابل للتآكل ويمكن أن يهيج أو يتلف العينين والجهاز التنفسي. ارتداء القفازات والنظارات الواقية أثناء التعامل مع التبييض.
ملاحظة: خلال هذا الوقت، أكمل قدر الإمكان من الخطوة 3.3. يمكن التحقق من تقدم الانحراف عن طريق وضع السلة تحت مجهر ستيريو والتحقق من عدم وجود الزوائد الظهرية. غمر الأجنة في محلول التبييض لفترة إضافية ، إذا لزم الأمر. - تخلص من المبيض ، واشطف الأجنة جيدا داخل السلة بالماء من زجاجة بخاخ (لمدة ~ 3 ثوان ، ونشف السلة الشبكية بمناشف ورقية ؛ كرر 2-3 مرات).
3. إعداد يوم التشريح
- أضف 30 ميكرولتر من الأنسولين (10 ملغم/مل) إلى 1500 ميكرولتر من وسائط التصوير المحضرة (انظر الخطوة 1.2) في أنبوب إبندورف سعة 1.5 مل (التركيز النهائي 0.2 ملغم/مل). اخلطي جيدا واتركي الأنبوب على سطح الطاولة لتحقيق التوازن مع درجة حرارة الغرفة.
- إعداد شرائط coverslip المغلفة بالغراء.
- استخدم سكينا برأس ماسي لقطع غطاء مقاس 22 مم × 22 مم إلى أربعة شرائط متساوية الحجم (الشكل 1A).
- استخدم الملقط لالتقاط شريط واحد ونشر ما مجموعه حوالي 30 ميكرولتر من محلول غراء الهيبتان على جانبي الشريط (الشكل 1B). لتحقيق طبقة متساوية من بقايا الغراء ، قم بإمالة الشريط بزوايا مختلفة بينما يتبخر الهيبتان.
- تخزين الشريط المغطى بالغراء في فتحة فارغة من صندوق coverslip ؛ للحفاظ على لزوجته، ضع الشريط في وضع مائل، ولكن في وضع مستقيم، متكئا على حواف الصندوق لتقليل التلامس مع أسطح الصندوق (الشكل 1C). أغلق الصندوق حتى لا تغطي الجسيمات الموجودة في الهواء الغراء وتقلل من لزوجته.
- ضع العناصر التالية على سطح الطاولة: ماصة باستور زجاجية مقاس 6 بوصات ، وشريحة مجهرية ، وماصة P200 و P1000 مع أطراف الماصة المناسبة ، ومحلول Ringer27 (درجة الحموضة المعدلة إلى 7.3 مع NaOH) ، وطبق تصوير 35 مم مغلف ب Poly-D-Lysine.
- انقل الأجنة من سلة الشاشة الشبكية إلى زجاج ساعة صغير مملوء بالهيبتان 500-750 ميكرولتر.
- تجفف جوانب السلة وأسفلها بمسح المنديل. بلل فرشاة الطلاء في الهيبتان ، ولمس فرشاة الطلاء للأجنة (يجب أن يلتصق غشاء الفيتيلين الكارهة للماء بالشعيرات) ، واغمس فرشاة الطلاء مرة أخرى في الهيبتان في زجاج الساعة (يجب أن تغرق الأجنة إلى القاع).
ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات التالية في أسرع وقت ممكن لمنع الأجنة من الجفاف. يجب ألا تتعرض الأجنة للهواء لأكثر من 20 ثانية.
- تجفف جوانب السلة وأسفلها بمسح المنديل. بلل فرشاة الطلاء في الهيبتان ، ولمس فرشاة الطلاء للأجنة (يجب أن يلتصق غشاء الفيتيلين الكارهة للماء بالشعيرات) ، واغمس فرشاة الطلاء مرة أخرى في الهيبتان في زجاج الساعة (يجب أن تغرق الأجنة إلى القاع).
- انقل الأجنة إلى شريحة المجهر باستخدام ماصة باستور (الشكل 1D). اسحب الأجنة إلى الماصة ببطء وقصرها على الجزء الضيق من الماصة. أجنة الماصة على الشريحة ببطء، بحيث تتجمع داخل طرف الماصة مباشرة قبل أن تتدفق على الشريحة. قم بلف زاوية الأنسجة وامسحها إلى طرف ناعم ، وابتعد الهيبتان عن الأجنة الموجودة على الشريحة. سوف تتجمع وتغطي مساحة أصغر ، مما يجعل من السهل التقاطها على شريط مغطى بالغراء في الخطوة التالية.
- باستخدام الملقط ، التقط شريطا مغطى بالغراء ، ولمسه بلطف على الأجنة (الشكل 1E). ضع الشريط في طبق التصوير ، جانب الجنين ، وخارج المركز المطلي بالبولي دي ليسين مباشرة. اضغط على الشريط على الطبق باستخدام الملقط ، لضمان تثبيته في مكانه. إغراق الطبق على الفور بمحلول 2-3.5 مل من Ringer ؛ غمر الأجنة أولا لمنعها من الجفاف (الشكل 1F).
4. تشريح
ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوات تحت مجهر ستيريو فلورسنت.
- Devitellinize 10-15 الأجنة.
ملاحظة: قد يتراوح هذا من جنينين ، للمبتدئين ، إلى خمسة عشر جنينا ، للخبراء.- حدد أجنة المرحلة 16 بناء على مورفولوجيا الأمعاء (الشكل 2). في هذه المرحلة ، يكون للأجنة ثلاثة انقباضات في الأمعاء تخلق أربعة أجزاء من الأمعاء مكدسة (الشكل 2 B ، B'). لبدء إزالة التلفظ ، اخترق الجنين المختار في نهاية واحدة ، ويفضل أن يكون الأمامي ، بإبرة التنغستن. قد يخرج الجنين من غشاء الفيتيلين ، ولكن إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بتقشير الغشاء من الجنين.
ملاحظة: الأجنة التي هي أصغر من أن تشريح لديها أمعاء غير إقليمية (الشكل 2C). تشريح أجنة المرحلة 17 ممكن ، ولكنه أكثر تحديا من تشريح أجنة المرحلة 16 لأن البشرة بدأت تتطور في هذه المرحلة. توجد أجنة المرحلة المبكرة 17 مع أربعة أجزاء من الأمعاء يتم نقلها بالنسبة لبعضها البعض (الشكل 2 D ، D'). - ربط الإبرة من خلال الجنين في منطقة بعيدة عن الغدد التناسلية. انقل الجنين المدمن على المخدرات إلى المنطقة المطلية بالبولي ليسين في الطبق (من هنا فصاعدا يشار إليها ببساطة باسم "زلة الغطاء") واسحبه إلى الأسفل حتى يلتصق. كرر هذه الخطوات، ورتب الأجنة المنزوعة الانحراف على التوالي على طول الجزء العلوي من زلة الغطاء المطلية بالبولي ليسين (الشكل 3A)، مع ترك مساحة كبيرة أدناه لمزيد من التشريح.
ملاحظة: تظهر الغدد التناسلية على شكل مجاميع كروية صغيرة من الخلايا التي يجب أن تتألق بشكل ساطع ، اعتمادا على العلامة المحددة المستخدمة وعدد نسخ الجينات المحورة. في هذه المرحلة ، توجد الغدد التناسلية أفقيا في الجزء A5 ، عند حوالي 70٪ -80٪ من طول الجنين من الأمام. خلال بروتوكول التشريح ، قد تلتصق الأنسجة بالإبرة. لتخليص الإبرة من الحطام ، ارفعها فوق سطح محلول Ringer مباشرة. يمكن أن يكون Devitellinization غير مرتب طالما أن الغدد التناسلية المناسبة منزعجة بأقل قدر ممكن.
- حدد أجنة المرحلة 16 بناء على مورفولوجيا الأمعاء (الشكل 2). في هذه المرحلة ، يكون للأجنة ثلاثة انقباضات في الأمعاء تخلق أربعة أجزاء من الأمعاء مكدسة (الشكل 2 B ، B'). لبدء إزالة التلفظ ، اخترق الجنين المختار في نهاية واحدة ، ويفضل أن يكون الأمامي ، بإبرة التنغستن. قد يخرج الجنين من غشاء الفيتيلين ، ولكن إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بتقشير الغشاء من الجنين.
- قم بإخراج الغدد التناسلية من الجنين إلى الطبق (الشكل 3C ، D).
- أولا ، قم بفيليه الجنين لفضح داخله (الشكل 3C). شريحة من خلال الجنين من مركزه ، وتحريك الإبرة في الخلف ، بين الغدد التناسلية. قم بإخراج بعض الأنسجة الداخلية ، لأن هذا سوف يلتصق بالطبق بشكل أفضل بكثير من البشرة الخارجية. سيمكن التصاق الأنسجة من التلاعب التالي من الكشف عن الغدد التناسلية والسماح لها بالالتصاق بزلة الغطاء.
ملاحظة: إذا لم تلتصق الأنسجة بالطبق، فحاول إقناعها بمنطقة غير ملوثة من الغطاء المطلي. ستكون المناطق الخارجية من زلة الغطاء لزجة بشكل خاص. كما هو مذكور في الخطوة 4.1.2 ، لا يهم ما إذا كانت عمليات التلاعب بالتشريح تؤدي إلى جثة جنينية مشوهة ، طالما بقيت الغدد التناسلية سالمة. - استخدم الإبرة لتقطيع حول الغدد التناسلية حتى يتم فصل قطعة من الأنسجة ، بما في ذلك الغدد التناسلية ، عن الذبيحة المتبقية. باستخدام الإبرة ، اسحب هذا النسيج إلى منطقة جديدة من الغطاء المطلي ، وأقنعه بالقاع حتى يلتصق بالطبق.
ملاحظة: سيتم تحقيق أفضل تصوير لتلك الحالات التي تعلق فيها الغدد التناسلية نفسها مباشرة على زلة الغطاء ، بدلا من التعلق غير المباشر عبر الأنسجة الفوقية. لذلك ، عندما يتم توجيه الأنسجة بعيدا عن الذبيحة ، حاول أن تجعل الغدد التناسلية تلمس الغطاء تنزلق أولا ، بدلا من الأنسجة الدخيلة. - قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة المحيطة من الغدد التناسلية (الشكل 3D) عن طريق سحب الأنسجة الملتصقة بلطف بعيدا عن الغدد التناسلية باستخدام الإبرة. تجنب لمس الغدد التناسلية مباشرة ، مما قد يؤدي إلى إتلافها (الشكل 4E). لضمان التصاق الغدد التناسلية بما فيه الكفاية بالطبق، حرك الإبرة في حركة دائرية لطيفة حول الغدد التناسلية - إذا تحركت، المس الإبرة إلى الأنسجة الملتصقة المتبقية، ووجه الغدد التناسلية نحو منطقة جديدة من الغطاء اللزج. كرر هذه العملية حتى لا تكون هناك حركة يمكن اكتشافها للغدد التناسلية.
- العودة إلى جثة الجنين وتشريح الغدد التناسلية الثانية. كرر هذه العملية على أكبر عدد ممكن من الأجنة ولكن لا تتجاوز 25 دقيقة. سيتم اختراق صلاحية الأنسجة في محلول Ringer بعد أكثر من 40-45 دقيقة.
- أولا ، قم بفيليه الجنين لفضح داخله (الشكل 3C). شريحة من خلال الجنين من مركزه ، وتحريك الإبرة في الخلف ، بين الغدد التناسلية. قم بإخراج بعض الأنسجة الداخلية ، لأن هذا سوف يلتصق بالطبق بشكل أفضل بكثير من البشرة الخارجية. سيمكن التصاق الأنسجة من التلاعب التالي من الكشف عن الغدد التناسلية والسماح لها بالالتصاق بزلة الغطاء.
- بعد اكتمال التشريح ، استخدم علامة لا تمحى لإضافة علامات تسجيل إلى الحافة الخارجية لطبق التصوير لتسجيل اتجاهه أثناء التشريح.
- قم بإزالة الشريط المطلي بالغراء من الطبق.
- أدخل بلطف الشق السفلي لزوج من الملقط أسفل الشريط ، وقم بتثبيته وإمالة الشريط ببطء لأعلى لتحريره من الطبق بأقل قدر ممكن من الانزلاق لمحلول الرنين لتقليل اضطراب الغدد التناسلية الملتصقة.
ملاحظة: يجب إمالة الشريط بعيدا عن الغدد التناسلية التي تم تشريحها.
- أدخل بلطف الشق السفلي لزوج من الملقط أسفل الشريط ، وقم بتثبيته وإمالة الشريط ببطء لأعلى لتحريره من الطبق بأقل قدر ممكن من الانزلاق لمحلول الرنين لتقليل اضطراب الغدد التناسلية الملتصقة.
- احمل الطبق برفق إلى المجهر التصويري بطريقة تتجنب انزلاق محلول رينجر.
5. التصوير
- ضع طبق التصوير في حامل المسرح ، باستخدام علامات التسجيل لوضع الطبق في الاتجاه التقريبي أثناء التشريح. باستخدام المجهر الساطع وهدف منخفض الطاقة (~ 10x) ، حدد وركز على أي قطعة من الأنسجة التي يتم الالتزام بها في زلة الغطاء. قم بتبديل إعدادات العدسة للكشف عن التألق ، وباستخدام النظارات ثنائية المنظار ، قم بمسح الطبق ضوئيا بشكل منهجي ، مع تحديد موضع كل غدد تناسلية داخل برنامج التصوير (انظر جدول المواد).
ملاحظة: تأكد من تمركز الغدد التناسلية في مجال الرؤية قبل وضع علامات على المراكز. - قم بإزالة مجموعة حامل المسرح بالكامل برفق ، مع وضع طبق التصوير في حاملها ، وضع التجميع على طاولة العمل.
- استبدل محلول Ringer بوسائط التصوير المعدة التي تحتوي على الأنسولين (انظر الخطوتين 1.2 و3.1).
- استخدم P1000 لإزالة جميع حلول Ringer من الحافة العلوية الداخلية لطبق التصوير (لا تقم بماصة Ringer من منطقة انزلاق الغطاء المركزي). بعد ذلك ، قم بالتبديل إلى P200 ، ووضع طرفه تحت سطح Ringer المتبقي في المنطقة الوسطى. إزالة بعناية 50-100 ميكرولتر من رينجر. لا تقم بإزالة الحل بأكمله.
- ارسم ~ 200 ميكرولتر من وسائط التصوير ، ومرة أخرى ضع طرف P200 تحت سطح Ringer المتبقي ، وأضف وسائط التصوير هذه ببطء. بعد ذلك ، أضف وسائط التصوير المتبقية (~ 1300 ميكرولتر) إلى الطبق ، بدءا من الحافة الخارجية للحافة العليا. أثناء السحب ، تحرك نحو القبة المركزية للسائل ، وفي النهاية ادمج الاثنين عن طريق تنظيف طرف الماصة عبرهما. ضع الغطاء على الطبق.
ملاحظة: يجب أن تغطي وسائط التصوير كامل القطر الداخلي للطبق، بعمق حوالي 2 مم، لمنع التبخر (الشكل 4D).
- قم بتبديل المجهر إلى هدف طاقة أعلى (63x ، 1.2 NA) ، وقم بتطبيق سائل الغمر المناسب بناء على الهدف المستخدم (نوع سائل الغمر ومعامل الانكسار الذي يتطلبه الهدف) ، ثم استبدل مجموعة حامل المرحلة. استخدم الفحص المجهري الساطع للتركيز على الأنسجة الملتصقة بالجزء السفلي من طبق التصوير.
ملاحظة: إذا لم يتم نقل المرحلة ، فيجب أن تظهر الغدد التناسلية الأخيرة بمجرد تركيز الهدف. - خطوة من خلال كل موضع الغدد التناسلية ملحوظ وضبط هذا الموقف ، حسب الضرورة. حدد الغدد التناسلية التي سيتم تصويرها بناء على وضوح الصورة وجنس الغدد التناسلية وما إلى ذلك. قم بتخصيص إعدادات التصوير (متعددة القنوات ، وأوقات التعرض ، وكثافة الليزر ، وزيادات السلسلة Z ، والفاصل الزمني مع الفواصل الزمنية المناسبة ، وما إلى ذلك). ابدأ التصوير.
ملاحظة: يمكن التعرف على الغدد التناسلية الذكرية من خلال وجود كل من مكان ، وفي الطرف الآخر من الغدد التناسلية ، مجموعة من الخلايا الجسدية الصغيرة الدائرية للغاية تسمى السلائف التناسلية الجسدية الخاصة بالذكور (msSGPs). إذا تم استخدام علامة الفلورسنت six4-eGFP::moesin ، فإن الخلايا المتخصصة هي ثاني ألمع الخلايا في الغدد التناسلية ، وألمع الخلايا هي msSGPs. في هذه المرحلة ، لا تحتوي الغدد التناسلية الأنثوية على مكانة ولا msSGPs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نوضح إعداد طبق التصوير في الشكل 1 ، كما هو موضح في "إعداد يوم التشريح". يجب أن تؤدي هذه الطرق في النهاية إلى التصاق أجنة رطبة جيدا بشريط انزلاق الغطاء ، والذي يتم تثبيته مؤقتا في قاع الطبق وغمره في محلول رينجر (الشكل 1F). تسمح السكين ذات الرؤوس الماسية للمرء بتقطيع غطاء مقاس 22 × 22 مم بشكل نظيف إلى ثلاثة إلى أربعة شرائط أصغر (الشكل 1A). أثناء التعامل مع هذه الشرائط باستخدام الملقط ، نستخدم ماصة لنقل ما يكفي من غراء الهيبتان لتغطية هذه الشرائط ، مما يمنحها سطحا لاصقا ومحكم (الشكل 1B). يتم تخزين الشرائط المطلية بسهولة في صندوق انزلاق غطاء فارغ للحفاظ على نظافة الأسطح اللاصقة لمدة تصل إلى 2 ساعة (الشكل 1C). بمجرد صنع هذه الشرائط المطلية ، يكون الهدف هو التصاق الأجنة بالشريط في مجموع ، بالقرب من الحافة الطويلة للشريط (الشكل 1E). من الضروري أولا نقل عدد قليل من الأجنة من زجاج الساعة إلى شريحة زجاجية نظيفة وتجفيفها (الشكل 1D). ثم ، استخدم الملقط بسرعة للمس الشريط المطلي بلطف إلى الأجنة بحيث تلتصق (الشكل 1E). ثم نضغط على الفور على الشريط إلى أسفل طبق التشريح مع الأجنة التي تتجه لأعلى ، ونغطي الأجنة بمحلول رينجر (الشكل 1F). إذا تم تحقيق هذا الهدف ، فإن مشاهدة الأجنة تحت المجهر المجسم التقليدي الساطع ستكشف عن أجنة رطبة وصحية بالكامل داخل أغشية الفيتالين (الشكل 1G). بدلا من ذلك ، إذا استغرقت عملية نقل هذه الأجنة إلى الشريط وتغطيتها بالمحلول أكثر من 30 ثانية تقريبا ، فإن الأجنة سوف تجف وتصبح رخوة (الشكل 1G'). الأجنة الرخوة ليست صحية ويصعب تشريحها بشكل لا يصدق ، لذا فإن العمل بكفاءة أثناء هذه العملية أمر حيوي.
الشكل 1: تركيب وترطيب الأجنة قبل التشريح. (أ-و) خطوات لإلصاق الأجنة بشريط من الغطاء المغلف بالغراء، وتثبيت الشريط في طبق تصوير. (أ) الانزلاق المغطى الذي تم تسجيله مرة واحدة بواسطة سكين ذو رأس الماس (سكين يشار إليه برأس السهم) لإنشاء شريط. (ب) تطبيق غراء الهيبتان على شريط الغطاء المقطوع ، الذي يتم تثبيته بزوج من الملقط. (ج) تجفيف أربعة شرائط مغلفة بالغراء في صندوق غطاء. (دال-هاء) تشير الأسهم إلى الأجنة. (د) الأجنة المنزوعة الشوريون التي تم جمعها في الهيبتان وطردها على حافة شريحة المجهر. تمت إزالة الهيبتان الزائد باستخدام الكيمويبي. (ه) شريط مغلف بالغراء مع الأجنة المرفقة. (و) الإعداد النهائي للطبق مباشرة قبل التشريح. لاحظ الطبقة الضحلة من محلول رينجر (رأس السهم) ووضع الشريط (السهم) فوق دائرة التشريح الداخلية. (G–G') التزمت الأجنة بالشريط في الطبق. (ز) الأجنة الرطبة بشكل صحيح، المتعرجة. (ز') الأجنة التي أصبحت مجففة بسبب التعرض للهواء لفترات طويلة ، ويتضح ذلك من خلال أغشية vitelline المنهارة. تشير العلامات النجمية إلى الأجنة الرخوة. أشرطة الميزان هي 0.5 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
إن رؤية الجنين تحت مجهر ستيريو فلورسنت يسمح بتصور واضح للأمعاء ، والتي تتألق تلقائيا في قناة GFP. يعمل مورفولوجيا الأمعاء كوكيل للعمر الجنيني عند اختيار الأجنة لتشريحها. نظرا لأن الأجنة الملتصقة بشريط الغطاء ستختلف قليلا في العمر ، فإنها ستقدم مجموعة متنوعة من مورفولوجيا الأمعاء (الشكل 2A). لتكوين الغدد التناسلية المتخصصة في الصورة الحية ، نقوم بتشريح أجنة المرحلة 16 المبكرة. تقدم هذه الأجنة أربعة أقسام إقليمية للأمعاء مكدسة في صف زوجي (الشكل 2ب ، خطوط منقطة). تقدم الأجنة الأصغر سنا أمعاء تشبه الكيس وغير إقليمية (الشكل 2C) ، وليس لديها حتى الآن مصفوفة خارج الخلية كافية (ECM) حول الغدد التناسلية للسماح بزراعة فعالة للعضو السليم. الأجنة القديمة التي بدأت بالفعل في الضغط المتخصص تقدم أربع مناطق معوية غير مكدسة بالتساوي ويتم نقلها بدلا من ذلك بالنسبة لبعضها البعض (الشكل 2D ، الخطوط المنقطة). تحتوي هذه الأجنة على بشرة أكثر سمكا ، مما يجعل عملية التشريح أكثر تحديا.
الشكل 2: اختيار الأجنة ذات العمر المناسب لتشريح الغدد التناسلية. التزمت الأجنة بغطاء مغلف بالغراء قبل التشريح. الأجنة تعبر عن six4-eGFP::moesin (أخضر) ، والذي يميز الغدد التناسلية وخلايا الجسم الدهنية. لاحظ أن الأمعاء تتألق تلقائيا باللون الأخضر. تشير الأسهم إلى الغدد التناسلية الذكرية (التي يتم تمييزها من خلال وجود msSGPs المتألقة بشكل مشرق) والتي تكون مرئية في كل لوحة. تشير أشرطة المقياس إلى 0.25 مم (أ) الأجنة من مراحل مختلفة. (ب–دال) أجنة من مراحل متميزة في وسط الصورة ، موجهة مع الأمامي إلى اليسار والظهرية لأعلى. (ب) جنين في مرحلة مبكرة من 16 يبلغ من العمر المناسب تشريحه. (ب') يشار إلى مناطق الأمعاء الأربعة المكدسة بخطوط بيضاء منقطة. (ج) جنين من المرحلة 15 أصغر من أن يتم تشريحه (الجنين السفلي). لاحظ أن كيس الأمعاء الفلورسنت الأمامي مباشرة للغدد التناسلية لا يحتوي بعد على مناطق منفصلة. (د) جنين متأخر من المرحلة 16 يصعب تشريحه بسبب نمو البشرة. لاحظ أن مناطق الأمعاء الأربع قد بدأت في الدوران بالنسبة لبعضها البعض استعدادا لحلقات الأمعاء. (د') يتم تحديد مناطق الأمعاء الأربعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
من المهم تشريح الأجنة التي تعبر عن علامة فلورسنت لا تمحى في الغدد التناسلية ، ويجب أن تكون هذه العلامة مرئية تحت مجهر ستيريو فلورسنت. هنا ، اخترنا استخدام six4-eGFP::moesin20 لوضع علامة على الغدد التناسلية (الشكل 2 والشكل 3 ، الأسهم) للتصور أثناء التشريح.
نوضح عملية تشريح الغدد التناسلية في الشكل 3. يسمح تشريح الأجنة ذات المراحل المناسبة على الطبق المغلف بالبولي ليسين بالعزل النظيف للغدد التناسلية عن هذه الأجنة (الشكل 3D). سوف تلتصق الأجنة التي يتم تفكيكها بالطبق ، ويمكن ترتيبها في صف مناسب قبل التشريح (الشكل 3A). إن إزالة الانحراف عن الجنين ونقله إلى البولي ليسين هي عملية غير دقيقة بحيث يمكن أن تصبح الأنسجة مقذوفة من حدود جسم الجنين (انظر قطعة من الأنسجة بين الجنين 1 والجنين 2 ، والجنين المشوه 4 ؛ الشكل 3 ألف). هذا عدم الدقة ليس له أهمية ، طالما بقيت الغدد التناسلية سالمة. يتيح المجهر الفلوري الاستريو القياسي تحديد الغدد التناسلية داخل جسم الجنين المشوه (الشكل 3B ، السهم). يجب أن تفصل التلاعبات القليلة الأولى بإبرة تشريح حادة الغدد التناسلية عن جثة الجنين ، على الرغم من أن بعض أنسجة الفلورسنت الذاتي ستظل ملتصقة (الشكل 3C). تؤدي عمليات التلاعب الإضافية إلى الغدد التناسلية المعزولة التي تلتصق مباشرة بالطبق المطلي (الشكل 3D).
الشكل 3: عملية التشريح. (أ – د) الأجنة التي تعبر عن six4-eGFP::moesin (أخضر) في مراحل متسلسلة في بروتوكول التشريح. (أ) أربعة أجنة منقوشة تم نقلها إلى منطقة التشريح المغلفة بالبولي ليسين في الطبق. لاحظ كيف تتم محاذاة الأجنة في صف أنيق لتسهيل التشريح التنازلي المتتالي في الطبق. قطعة صغيرة من الأنسجة بين الأجنة 1 و 2 هي جزء من الأمعاء من الجنين 2 ، مقذوف أثناء إزالة الانحراف اليدوي. (ب) عرض تكبير أعلى للجنين من (أ) ، مبين بالعلامة النجمية. (ج) الذبيحة المتبقية لجنين تم تقطيعه إلى أسفل خط الوسط. يشير رأس السهم إلى غدد غدد غدناية مسدودة ، لا تزال مدمجة بشكل كبير في الأنسجة الجنينية. (د) غدد تناسلية تشريحية تماما. لاحظ فقط الحد الأدنى من الأنسجة الدخيلة (رأس السهم) يبقى بالقرب من الغدد التناسلية. تشير الأسهم إلى الغدد التناسلية للذكور. أشرطة الميزان هي 0.25 ملم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
بمجرد تشريح الغدد التناسلية ، يمكن للمرء استبدال محلول Ringer بوسائط التصوير ، والغدد التناسلية المستزرعة مباشرة في نفس الطبق المستخدم في التشريح. نحن نستخدم المجهر البؤري القرص الغزل. يكشف تصور برايتفيلد للغدد التناسلية المعزولة على المجهر البؤري عن ظل داكن يحيط بمحيط الغدد التناسلية (الشكل 4 أ-ب ، الأسهم) ، وهو ECM الذي يحافظ على سلامة الغدد التناسلية أثناء التصوير. نقدم مثالا على غدد تناسلية صحية ومستزرعة جيدا تعبر عن F-actin المسمى GFP في خلايا الغدد التناسلية الجسدية20 وعلامة هيستون تحمل علامة RFP لتصور جميع النوى28 (الشكل 4C-C'). نظرا لأن جميع الخلايا الموجودة في هذا الجنين تعبر عن علامة هيستون RFP ، فإن كل من خلايا الغدد التناسلية وخلايا الأنسجة الملتصقة الأخرى لوحظت عند عرض الانبعاثات الحمراء. نحن نميز حدود الغدد التناسلية باستخدام علامة GFP الخاصة بالغدد التناسلية (الشكل 4C ، المخطط التفصيلي). من الواضح أن هذه الغدد التناسلية المستزرعة صحية لأن حدود الغدد التناسلية ناعمة ومستديرة (الشكل 4 C '، الخطوط العريضة) ، ولأن خلايا الغدد التناسلية لديها مستويات متساوية من تألق هيستون RFP في جميع أنحاء النوى (الشكل 4C '، السهم). بدلا من ذلك ، إذا لم يتم ترطيب الغدد التناسلية بشكل كاف أثناء التصوير ، يمكن أن تصبح النوى و six4-eGFP::moesin fluorescence مثقوبة (الشكل 4D ، السهم) مع تذبذب أنسجة الغدد التناسلية. علاوة على ذلك ، إذا تضررت ECM من الغدد التناسلية بشكل مفرط أثناء التشريح ، فإن حدود الغدد التناسلية تتعرض للخطر ، وهو ما يتضح من خلال وجود خلايا خاصة بالغدد التناسلية (الشكل 4E ، العلامات النجمية) خارج حدود الغدد التناسلية (الشكل 4E ، السهم).
الشكل 4: تحديد موقع الغدد التناسلية الصحية أثناء التصوير المباشر. (أ) مناظر سطعة منخفضة و (ب) عالية التكبير لاثنين من الغدد التناسلية المشوهة الملتصقة بالغطاء. (C–C') إطار فيلم واحد من تصوير خارج الجسم الحي للضغط المتخصص في الغدد التناسلية الصحية. تعبر خلايا الغدد التناسلية الجسدية عن six4-eGFP::moesin (أخضر) ، وتعبر جميع الخلايا عن His2Av-mRFP (أحمر). (ج') حدود الغدد التناسلية المميزة بخط أبيض منقط. من المحتمل أن يكون His2Av-mRFP المرئي خارج حدود الغدد التناسلية جسما دهنيا لا يزال مرتبطا بالغدد التناسلية المشوهة. يشير السهم إلى نواة خلية جرثومية مع إشارة His2Av-mRFP موحدة ، مما يشير إلى أن الغدد التناسلية سليمة. (دال-هاء) النتائج السلبية التمثيلية لبروتوكول التشريح خارج الجسم الحي . (د) إطار من جلسة تصوير جفف فيها الغدد التناسلية بسبب تبخر الوسائط. لاحظ النوى البيكنوية كمكثفات His2Av-mRFP (سهم) ، وبقع متقطعة من six4-eGFP::moesin على طول حدود الغدد التناسلية. (ه) إطار التصوير خارج الجسم الحي الذي تعرضت فيه المصفوفة خارج الخلية للخطر أثناء التشريح. لاحظ أن بعض الخلايا الجرثومية (العلامات النجمية) تخرج من حدود الغدد التناسلية (السهم). يتم تصنيف الخلايا الجرثومية مع nos-lifeact::tdtomato (أرجواني) ، وخلايا الغدد التناسلية الجسدية مع six4-eGFP::moesin (الأخضر). تظهر أشرطة المقياس 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يمكن استزراع الغدد التناسلية لمدة 5 ساعات تقريبا باستخدام طريقة التصوير خارج الجسم الحي هذه ، مما يتيح الحصول على صورة لأحداث التشكل الديناميكي التي تحدث في أواخر تطور الغدد التناسلية الجنينية. في مختبرنا ، استخدمنا هذا البروتوكول بنجاح لتصوير ضغط وضع الخلايا الجذعية المشكلة17 (الشكل 5). قبل الضغط ، يكون المكان عبارة عن مجموعة فضفاضة من الخلايا الجسدية في الغدد التناسلية الأمامية (الشكل 5A ، أخضر) ، محاطة بخلايا جرثومية تحمل nos-lifeact::tdtomato29 (انظر جدول المواد) ، وستكون الطبقة الأولى منها خلايا جذعية جرثومية (الشكل 5A ، أرجواني). يقدم هذا المجموع المتخصص في البداية حدودا غير منتظمة (الشكل 5أ ، خط منقط). طوال فترة التصوير ، نلاحظ خلايا متخصصة فردية تعيد ترتيب مواقعها بينما يكتسب المجموع المتخصص حدودا أكثر سلاسة. وتؤدي عمليات إعادة الترتيب الخلوية هذه أيضا إلى انخفاض في المساحة المتخصصة (الشكل 5 جيم). إن ملاحظاتنا لإعادة ترتيب الخلايا ، وانقسامات الخلايا الجرثومية المجاورة التي تحدث بالتزامن مع هذه المرحلة من التطور قد أثرت على فهمنا للآليات الكامنة وراء الضغط المتخصص17. وبالتالي ، يوفر هذا البروتوكول القدرة على تصور إعادة ترتيب الخلايا ، وتغييرات الشكل ، والانقسامات ، والأحداث الخلوية الأخرى بالدقة المطلوبة لتحليل الأحداث المورفوجينية في الغدد التناسلية في المراحل المتأخرة.
الشكل 5: غدد تناسلية مستزرعة خارج الجسم الحي تخضع لضغط متخصص. لقطات من سلسلة تصوير تم الحصول عليها على الفور بعد تشريح الغدد التناسلية من أجنة المرحلة 16 المبكرة. (أ-ج) يتم تصنيف الخلايا الجرثومية (أرجوانية) بواسطة nos-lifeact::tdtomato ويتم تصنيف الخلايا التناسلية الجسدية (الخضراء) بواسطة six4-eGFP::moesin. يتم تحديد المكان المناسب (الخط الأبيض المنقط) في A'–C'. تظهر أشرطة المقياس 10 ميكرومتر. الأمامي إلى اليسار ، والخلفي إلى اليمين. (أ) في النقطة الزمنية الأولى (t = 0 min) في سلسلة التصوير ، انتهت الخلايا المتخصصة من التجميع في الغدد التناسلية الأمامية وهي في مرحلة مبكرة من الضغط. (ب) في منتصف سلسلة التصوير وعملية الضغط (t = 1 h 48 min) ، بدأ المكان في الدوران ، لكن حافته لا تزال غير منتظمة. (ج) بالقرب من نهاية سلسلة التصوير (t = 4 h 21 min) ، يحتوي الكوة على حدود دائرية ناعمة للغاية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أثناء تكوين الغدد التناسلية ، يخضع الغدد التناسلية الجنينية ، وخاصة مكانة الخلايا الجذعية داخل الغدد التناسلية الذكرية15 ، لتغيرات مورفولوجية سريعة. يتم فهم الآليات التنموية التي تكمن وراء هذه التغييرات الديناميكية بشكل أفضل من خلال تقنيات التصوير الحي. ومع ذلك ، في المرحلة الجنينية 17 ، يصبح التصوير في الجسم الحي للغدد التناسلية مستحيلا بسبب بداية تقلصات العضلات واسعة النطاق17. مع هذا البروتوكول ، نقدم بديلا ناجحا: تشريح الغدد التناسلية مباشرة على طبق تصوير للتصوير الحي خارج الجسم الحي . يقدم هذا البروتوكول الطريقة الوحيدة المتاحة لإنجاز التصوير الحي للغدد التناسلية الجنينية في المرحلة المتأخرة.
وينبغي تنفيذ الخطوات الحاسمة للبروتوكول مع التركيز الشديد على البراعة والتوقيت. قبل التشريح ، يعد التركيب السريع للأجنة أمرا بالغ الأهمية لضمان عدم جفاف الأجنة وبقائها بصحة جيدة ومتعرجة ، مما يسهل التفكيك والتشريح. أثناء التشريح ، من الضروري تجنب تعطيل المصفوفة خارج الخلية التناسلية ، والتي يتم إنجازها باستخدام عمليات معالجة دقيقة ودقيقة فقط. إن استخدام هذه البراعة سيضمن أيضا أن الغدد التناسلية على اتصال مباشر بطبق التصوير ، مما يتيح التصوير الواضح مباشرة من خلال الغطاء الزجاجي. بعد التشريح ، يجب تبديل محلول Ringer لوسائط التصوير باستخدام الشفط والطرد اللطيف فقط باستخدام ماصة لمنع إزاحة الغدد التناسلية. أخيرا ، من المهم تحديد وقت التشريح الإجمالي إلى 25 دقيقة. وهذا يضمن أن مقدار الوقت الذي يقضيه رينجر في محلول رينجر أثناء التشريح ، وموقع الأنسجة في الكونفوكال ، يقتصر على التعرض غير السام. مع زيادة الممارسة ، ستتحسن سرعة التشريح ، وسيحدث تخصيص تسلسل التشريح. في تجربتنا ، يمكن تحقيق تشريح كاف بعد حوالي أسبوع من الممارسة المنتظمة ، مع إتقان كامل للتشريح يمكن تحقيقه في حوالي 1 شهر. لتسهيل التعلم ، نوصي بممارسة الخطوات الفردية قبل تنفيذ البروتوكول بأكمله.
هناك عدد من أفضل الممارسات التي تخفف من التحديات المرتبطة بهذا البروتوكول ، بدءا من النمط الوراثي للأجنة المستخدمة في التشريح. إن دمج نسخ متعددة من الجين المحور المستخدم لوضع علامة على الغدد التناسلية سيجعل الغدد التناسلية أكثر إشراقا ، وبالتالي يسهل تصورها وتشريحها. يعمل التشريح نفسه بشكل أفضل مع إبرة حادة ، على الرغم من أنه لا ينبغي شحذه بشكل مفرط ، لأنه سوف ينحني ضد الجزء السفلي من طبق التصوير ويصبح مثقلا بأنسجة غريبة. تتألق وسائط التصوير من شنايدر تلقائيا في طيف الانبعاثات الخضراء، مما يجعل من الصعب تحديد موقع الغدد التناسلية التي تحمل علامة GFP بمجرد إضافة الوسائط. لذلك ، من الأهمية بمكان استخدام برنامج التصوير البؤري لتحديد موقع الغدد التناسلية أثناء وجودها في حل Ringer. إذا كان تحديد موقع الغدد التناسلية في البؤرة لا يزال صعبا ، فبعد التشريح التالي نقترح رسم أو التقاط صورة للموضع النسبي للغدد التناسلية في الطبق بينما لا يزال في مجهر التشريح. ثم ضع علامة على الجزء الخارجي من الطبق للإشارة إلى اتجاهه أثناء التشريح ، وتطابق هذا الاتجاه عند الانتقال إلى المجهر البؤري. بمجرد أن تقع في الكونفوكال ، إذا بدا أن الغدد التناسلية معطلة أو مشوهة ، في التشريح التالي ، حاول ترك أنسجة أكثر التصاقا تحيط بالغدد التناسلية. على العكس من ذلك ، إذا كان الغدد التناسلية موجودا ولكنه يبدو ضبابيا في جميع المستويات ، فمن المحتمل أن يكون هناك نسيج بين الغطاء والغدد التناسلية ، ويجب أن يسعى التشريح المستقبلي إلى عزل الغدد التناسلية بشكل أفضل عن الأنسجة الملتصقة. ومن واقع تجربتنا، فإن اعتماد هذه الممارسات قد يسر تعلم وتنفيذ هذا البروتوكول.
أثناء تشكيل هذا البروتوكول ، حددنا العديد من التعديلات التي يمكن تطبيقها. بالنسبة لدراسات الضغط المتخصصة ، نهدف إلى تشريح الأجنة في المرحلة 16. في هذه المرحلة ، لم يطور الجنين بعد كميات كبيرة من البشرة ، ويلتصق بسهولة بالطبق المطلي بالبولي ليسين. ومع ذلك ، يمكن تعديل هذه التقنية لتشريح الأجنة الأكبر سنا ببشرة عن طريق إلصاقها بالجدار الداخلي للمنطقة المطلية بالبولي ليسين للشق الأول. بمجرد تعرض الأنسجة الداخلية ، سوف تلتصق جثة الجنين بالبولي ليسين ، ويمكن أن يستمر التشريح كالمعتاد. بالإضافة إلى التعديلات لعمر الجنين ، نجحنا في تعديل هذه التقنية لتشريح أنماط وراثية متعددة في نفس الطبق. على سبيل المثال ، يمكن فصل الطفرات متماثلة الزيجوت عن الزيجوت المتغايرة الشقيقة باستخدام علامة يمكن تمييزها بسهولة مثل YFP المشوهة على كروموسوم الموازن. بعد إزالة الانحراف ، يجب نقل الأجنة إلى جانبي الغطاء بناء على وجود أو عدم وجود العلامة. يجب أن يستمر التشريح إلى أسفل في الطبق كما هو موضح في البروتوكول ، مع إيلاء عناية إضافية للحفاظ على الفصل بين الأنماط الجينية المختلفة. أيضا ، يمكن تعديل هذا البروتوكول لاستخدام وسيط ثقافي آخر غير شنايدر ، على الرغم من أن التحقيق السطحي في Shields و Sang M3 Insect Media أسفر عن الغدد التناسلية غير القابلة للحياة (البيانات غير معروضة). بالإضافة إلى ذلك ، يقترن هذا البروتوكول بشكل جيد مع التلاعب الدوائي ببساطة عن طريق الجمع بين الدواء ووسائط التصوير. على مدى فترة 5 ساعات من التصوير ، قد تكون إعادة إضافة الدواء ضرورية للحفاظ على تركيز فعال. أخيرا ، على الرغم من أن هذا البروتوكول تم تطويره بقصد تصور الضغط المتخصص ، وهي ظاهرة خاصة بالغدد التناسلية الذكرية ، إلا أنه من الناحية النظرية يمكن أيضا تنفيذ هذا البروتوكول لتصوير المبيض النامي عن طريق تشريح وتصوير الغدد التناسلية التي تفتقر إلى مكانة و msSGPs.
تتعلق القيود المرتبطة بهذه التقنية بطول وقت الزراعة ، وطبيعة الثقافة خارج الجسم الحي. كما هو الحال مع غرف بيض ذبابة الفاكهة في منتصف المرحلة30 ، تبدأ الغدد التناسلية المستزرعة في الموت بعد حوالي 5 ساعات من التصوير الحي خارج الجسم الحي ، كما يتضح من فقدان سلامة الأنسجة (تصبح النوى pyknotic وأغشية الخلايا تذبل). وبالتالي ، إذا رغب المرء في استكشاف أحداث المرحلة اللاحقة في الغدد التناسلية الذكرية ، فسيحتاج المرء إلى تشريح الغدد التناسلية من 1st instar أو اليرقات الأكبر سنا عن طريق إجراء تعديلات على البروتوكول المعروض هنا ، ثم تصوير تلك الموجودة في ظل ظروف مماثلة لتلك المعروضة هنا. ومع ذلك ، فإننا لا نستبعد إمكانية التصوير الحي خارج الجسم الحي بعد خمس ساعات إذا تم تطوير ظروف زراعة محسنة ، على الرغم من أنه قد يكون هناك حد إذا كانت الإشارات الميكانيكية من داخل الجنين ضرورية لتطوير الغدد التناسلية. ربما يرجع العيب الأكثر حدة في هذه التقنية إلى طبيعتها المتأصلة خارج الجسم الحي . عندما يتم استزراعها خارج الجسم الحي ، يمكن أن يكون للخلايا إمكانات غير طبيعية لا تمثل في بيولوجيا الجسم الحي 31. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكون للتفاصيل الدقيقة لبيئات الزراعة ، بما في ذلك محتوى الوسائط وصلابة المصفوفة ، تأثير كبير على سلوك الخلية32. مع وضع هذه الحساسية في الاعتبار ، من الضروري التأكد من أن ظروف الزراعة تنعكس بدقة في بيولوجيا الجسم الحي . لقد اتخذنا تدابير للشهادة على أن التطوير والإشارات المتخصصة في الجسم الحي يتم تلخيصها خارج الجسم الحي17. باختصار ، تأكدنا من الحفاظ على مصير الخلايا المتخصصة وأن عدد الخلايا المتخصصة لم يتغير باستخدام علامات Fasciclin-III و E-cadherin. أيضا ، توجد إشارات STAT وتنقسم الخلايا الجذعية الجرثومية بشكل متعامد ، مما يشير إلى الحفاظ على الوظائف المتخصصة. ومع ذلك ، لم نتحقق من أن بيولوجيا الجسم الحي ذات الصلة لا تزال سليمة في الأنسجة الأخرى غير المتخصصة داخل الغدد التناسلية. يجب أن تشمل التحقيقات المستقبلية خارج الجسم الحي لهذه الأنسجة الأخرى تحليلا شاملا لضمان أن هذا هو الحال بالفعل.
ومن بين الاتجاهات المستقبلية التي قد يتخذها المرء مع هذا البروتوكول دمج حاجز داخل طبق التصوير، بحيث يمكن أن تحتوي جلسة تشريح واحدة على مجموعة تحكم وكذلك مجموعة علاج بالعقاقير. ومن شأن هذا التحسين أن يسمح بالتقليل إلى أدنى حد من الخطأ بين النسخ المتماثلة التقنية، وبالتالي تحسين الدقة العلمية.
لا توجد بدائل حقيقية أخرى لهذا البروتوكول ، لأنه الطريقة الوحيدة المتاحة لفحص الأحداث الحية لهذا العضو أثناء التطور الجنيني المتأخر. على هذا النحو ، يمكن الآن الوصول إلى الأسئلة التي لم تكن قابلة للإجابة سابقا حول مورفوجينيا الغدد التناسلية مع هذا التقدم. وتشمل هذه الأسئلة تعقيدات انقسامات الخلايا، والتغيرات الهيكلية الخلوية، وأحداث تداخل الخلايا التي تحكم تكوين الخلايا المتخصصة وتكوين الغدد التناسلية. لا يمكن اكتشاف أي من هذه الأحداث في الصور الثابتة لهذه العمليات التي تم الحصول عليها باستخدام تقنية الإصلاح والبقع. بشكل عام ، تفتح هذه الطريقة إمكانية التحقيق في الديناميكيات في الغدد التناسلية ذبابة الفاكهة الجنينية المتأخرة ، ومثل هذا الاختراق له آثار قوية على تقدم عدد لا يحصى من المجالات البيولوجية ، بما في ذلك بيولوجيا الخلايا الجذعية المتخصصة ، وبيولوجيا piRNA ، والتكوين العضوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
ونود أن نشكر ليندسي دبليو بلاسخارت وجاستن سوي على إسهاماتهما الكبيرة في التطوير المبكر لهذا البروتوكول. المؤلفون ممتنون لمجتمع الذباب على كرمهم مع الكواشف ، وخاصة لروث ليمان وبنيامين لين على هديتهم لخط nos 5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' قبل نشره. تم استخدام المخزونات التي تم الحصول عليها من مركز بلومنغتون لذبابة الفاكهة (NIH P40OD018537) في هذه الدراسة. تم دعم هذا العمل من قبل NIH RO1 GM060804 و R33AG04791503 و R35GM136270 (S.D) بالإضافة إلى منح التدريب T32GM007229 (B.W.) و F32GM125123 (L.A).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alfa Aesar Tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | 0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis) |
| D. melanogaster: His2Av::mRFP1 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | FBtp0056035 | Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007 |
| D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato | Gift from Ruth Lehmann Lab | Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' | |
| D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin | FBtp0083398 | Sano et al., PLoS One, 2012 | |
| Diamond-tipped knife | |||
| Double-sided tape | Scotch | 665 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082 | |
| Imaging dish | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| Imaging software | Molecular Devices | MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0 | |
| Insulin, bovine | Sigma | l0516 | Store aliquots at 4 °C |
| Needle holder | Fisher Scientific | 08-955 | |
| Nytex basket | |||
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Ringer's solution | 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved | ||
| Schneider's Insect Media | GIBCO | 21720-024 |
References
- Yamashita, Y. M., Jones, D. L., Fuller, M. T. Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome. Science. 301, 1547-1550 (2003).
- Inaba, M., Yuan, H., Salzmann, V., Fuller, M. T., Yamashita, Y. M. E-Cadherin is required for centrosome and spindle orientation in Drosophila male germline stem cells. PLoS One. 5, 1-7 (2010).
- Lenhart, K. F., DiNardo, S. Somatic cell encystment promotes abscission in germline stem cells following a regulated block in cytokinesis. Developmental Cell. 34, 192-205 (2015).
- Hardy, R. W., Tokuyasu, K. T., Lindsley, D. L., Garavito, M. The Germinal Proliferation Center in the Testis of Drosophila melanogaster. Journal of Ultrastructure Research. 69, 180-190 (1979).
- Fuller, M. T. Spermatogenesis. The Development of Drosophila Melanogaster. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).
- Lin, H., Spradling, A. C. A novel group of pumilio mutations affects the asymmetric division of germline stem cells in the Drosophila ovary. Development. 124, 2463-2476 (1997).
- Emilie, Q., Amit, A., Kai, T. The piRNA pathway is developmentally regulated during spermatogenesis in Drosophila. RNA. 22, 1044-1054 (2016).
- Marie, P. P., Ronsseray, S., Boivin, A. From embryo to adult: PiRNA-mediated silencing throughout germline development in Drosophila. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7, 505-516 (2017).
- Michel, M., Raabe, I., Kupinski, A. P., Pérez-Palencia, R., Bökel, C. Local BMP receptor activation at adherens junctions in the Drosophila germline stem cell niche. Nature Communications. 2, (2011).
- Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis. Nature. 523, 329-332 (2015).
- Leatherman, J. L., Dinardo, S. Zfh-1 controls somatic stem cell self-renewal in the Drosophila testis and nonautonomously influences germline stem cell self-renewal. Cell Stem Cell. 3, 44-54 (2008).
- Leatherman, J. L., DiNardo, S. Germline self-renewal requires cyst stem cells, while stat regulates niche adhesion in Drosophila testes. Nature Cell Biology. 12, (2010).
- Tulina, N., Matunis, E. Control of stem cell self-renewal in Drosophila Spermatogenesis by JAK-STAT signaling. Science. 294, 2546-2549 (2001).
- Gonczy, P., Viswanathan, S., Dinardo, S. Probing spermatogenesis in Drosophila with P-element enhancer detectors. Development. 114, 89-98 (1992).
- Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Developmental Biology. 294, 92-103 (2006).
- Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse live imaging of stem cells in drosophila testis. Current Protocols in Stem Cell Biology. 0331, 1-9 (2009).
- Anllo, L., Plasschaert, L. W., Sui, J., DiNardo, S. Live imaging reveals hub cell assembly and compaction dynamics during morphogenesis of the Drosophila testis niche. Developmental Biology. 446, 102-118 (2019).
- Rebecca Sheng, X., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138, 3367-3376 (2011).
- Aboim, A. N. Developpement embryonnaire et post-embryonnaire des gonades normales et agametiques de Drosophila melanogaster. Revue Suisse De Zoologie. 52, 53 (1945).
- Sano, H., et al. The Drosophila actin regulator ENABLED regulates cell shape and orientation during gonad morphogenesis. PLoS One. 7, (2012).
- Clark, I. B. N., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Devlopmental Biology. 7, 1-9 (2007).
- Sheng, X. R., Brawley, C. M., Matunis, E. L. Dedifferentiating spermatogonia outcompete somatic stem cells for niche occupancy in the Drosophila testis. Cell Stem Cell. 5, 191-203 (2009).
- Tanentzapf, G., Devenport, D., Godt, D., Brown, N. H. Europe PMC Funders Group integrin-dependent anchoring of a stem cell niche. Nature Cell Biology. 9, 1413-1418 (2007).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically a motorized molluscicide dispenser. Bulletin of the World Health Organization. , 105-106 (1960).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).
- JoVE. Embryo and Larva Harvesting and Preparation. JoVE Science Education Database. , (2020).
- Cold Spring Harbor Protocols. Ringer's solution for Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. , (2011).
- Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into Centromeres during Early Embryonic Anaphase. Current Biology. 17, 237-243 (2007).
- Lin, B., Luo, J., Lehmann, R. Collectively stabilizing and orienting posterior migratory forces disperses cell clusters in vivo. Nature Communications. 11, 1-16 (2020).
- Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
- Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro. Neuron. 40, 485-499 (2003).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
