Summary
Aqui, fornecemos um protocolo de dissecção necessário para a imagem viva da gônada masculina Drosophila . Este protocolo permitirá a observação de processos celulares dinâmicos em condições normais ou após manipulação transgênica ou farmacológica.
Abstract
A gônada embrionária masculina Drosophila melanogaster é um modelo vantajoso para estudar vários aspectos da biologia do desenvolvimento, incluindo, mas não se limitando ao desenvolvimento de células germinativas, biologia piRNA e formação de nicho. Aqui, apresentamos uma técnica de dissecção ao vivo da gônada ex vivo durante um período em que a imagem ao vivo in vivo é altamente ineficaz. Este protocolo descreve como transferir embriões para um prato de imagem, escolher embriões masculinos adequadamente encenados e dissecar a gônada de seu tecido circundante, mantendo sua integridade estrutural. Após a dissecção, as gôngas podem ser imagens usando um microscópio confocal para visualizar processos celulares dinâmicos. O procedimento de dissecção requer tempo e destreza precisos, mas fornecemos informações sobre como prevenir erros comuns e como superar esses desafios. Pelo que sabemos, este é o primeiro protocolo de dissecção para a gônada embrionária Drosophila , e permitirá imagens vivas durante uma janela de tempo inacessível. Esta técnica pode ser combinada com manipulações transgênicas específicas do tipo farmacológico ou celular para estudar quaisquer processos dinâmicos que ocorram dentro ou entre as células em seu ambiente gonadal natural.
Introduction
O teste de melanogaster Drosophila tem servido de paradigma para nossa compreensão de muitos processos celulares dinâmicos. Estudos desse modelo lançaram luz sobre a regulação da divisão de células-tronco 1,2,3, desenvolvimento de células germinativas 4,5, biologia piRNA 6,7,8 e eventos de sinalização de células-tronco de nicho 9,10,11,12,13. Este modelo é vantajoso porque é geneticamente tratável14,15 e é um dos poucos onde podemos viver células-tronco em seu ambiente natural 3,16,17,18. No entanto, a imagem viva deste modelo tem sido limitada ao tecido adulto e aos estágios embrionários iniciais, deixando uma lacuna em nosso conhecimento da dinâmica gonadal no embrião tardio, o estágio preciso quando o nicho está se formando e começando a funcionar.
A gônada embrionária em estágio tardio é uma esfera, consistindo de células de nicho somáticas no anterior, e células germinativas enciontadas por células gândalos somáticas em todas as regiões mais posteriores19. Este órgão pode ser retratado ao vivo até o início do estágio 17 17,20,21. Novas imagens são evitadas devido ao início de contrações musculares em larga escala. Essas contrações são tão severas que empurram a gônada para fora do quadro de imagem, e tal movimento não pode ser corrigido com software de imagem. Nosso laboratório está interessado em desvendar os mecanismos de formação de nicho, que ocorre durante esse período indescritível para imagens ao vivo. Por isso, geramos uma abordagem ex vivo para imagem viva da gônada a partir do Estágio 16 embrionário, facilitando o estudo da dinâmica celular durante esse período crucial de desenvolvimento da gônada. Trabalhos anteriores do nosso laboratório mostram que essa imagem ex vivo recapitula fielmente o desenvolvimento da gônsia vivo 17. Esta técnica é a primeira e única do seu tipo para a gônus embrionária Drosophila.
Aqui, apresentamos o protocolo de dissecção necessário para ex vivo live-imaging da gônada durante estágios embrionários tardios. Este protocolo pode ser combinado com tratamentos farmacológicos, ou manipulação transgênica de linhagens celulares específicas dentro da gônada. Usando essa técnica, temos imagens com sucesso dos passos da formação do nicho de células-tronco17. Essa abordagem de imagem é, portanto, fundamental para o campo da biologia das células-tronco, pois permitirá a visualização dos estágios iniciais de formação de nicho em tempo real dentro de seu ambiente natural15,17. Embora este método seja benéfico para o campo da biologia das células-tronco, é adicionalmente aplicável para visualizar quaisquer processos dinâmicos que ocorram na gônada durante este ponto de tempo de desenvolvimento, incluindo rearranjos celulares22, adesão celular 2,12,23 e migração celular23. Esse protocolo de dissecção aumentará assim nossa compreensão de muitos processos biológicos celulares fundamentais.
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Protocol
1. Preparação do dia-anterior à dissecação
- Afie eletróticamente uma agulha de tungstênio24 para que o diâmetro resultante seja de aproximadamente 0,03 mm. Ajuste a tensão fornecida a aproximadamente 14 V e use 3,3 M NaOH. A nitidez não deve levar mais do que 1 ou 2 min.
ATENÇÃO: O NaOH é altamente corrosivo e causará queimaduras após o contato com a pele. Use luvas e óculos durante o manuseio, e trabalhe dentro de um capô de fumaça.
NOTA: Após o uso, armazene NaOH em um tubo Falcon de polipropileno. - Faça a mídia de imagem preparada. Em um tubo cônico de 15 mL, combine 4,25 mL da mídia de Schneider com 750 μL de Soro Bovino Fetal (FBS, 15% de concentração final) e 27,5 μL de penicilina-estreptomicina (0,05 U/μL de Penicilina, 0,05 μg/μL de concentração final). Armazene esta mídia de imagem preparada a 4 °C.
- Faça solução de cola de heptano. Adicione cerca de 0,5 mL de heptano a um frasco vedado de 20 mL recheado com cerca de 20 cm de fita dupla face. Arrase em um nutador por cerca de uma hora, ou mexa com uma ponta de pipeta até que se alcance uma consistência entre a água e o glicerol. Esta solução de cola dissolvida durará vários dias antes que o heptano evapore. Para refrescar a solução, adicione um heptano adicional de 0,5 mL e rocha.
NOTA: Uma solução eficaz de heptano-cola pode ser preparada usando várias proporções de heptano para fita, bem como diferentes durações de balanço/agitação. As especificações acima são apenas sugestões para preparar ou refrescar uma solução tão adequada.
2. Coleta de embriões — 15-17 h antes da dissecação
- Adicione pasta de levedura fresca a um prato de ágar de suco de maçã25. Configure uma gaiola de coleta de embriões adicionando moscas adultas (com menos de 10 dias de idade) a uma garrafa de comida vazia, perfurada com pequenos buracos26. Tampe a gaiola de coleta usando a placa de ágar leveasted, colada na garrafa, e coloque a gaiola com o lado da placa para baixo em uma incubadora escura de 25 °C por 1h.
NOTA: As moscas devem expressar um transgene que marcará fluorescentemente a gônada, por exemplo, seis eGFP::Moesin20, porque a dissecção dos embriões ocorrerá sob um microscópio estéreo-fluorescente. Consulte Tabela de Materiais para obter uma lista de genótipos usados para marcar a gônego. - Retire a gaiola da incubadora e descarte esta primeira coleção. Substitua-o por uma placa de ágar recém-leveasted e coloque a gaiola de volta na incubadora por 2h.
NOTA: A primeira coleção de embriões é usada para limpar fêmeas de embriões fertilizados e em desenvolvimento, para alcançar uma segunda coleção de embriões bem cronometrados. - Retire a placa de ágar da gaiola e coloque-a (com o lado levemente voltado para cima) em uma toalha de papel úmida dentro de um recipiente de plástico vedado. Coloque esta câmara úmida em uma incubadora de 25 °C para envelhecer os embriões por 14,5 h (idades finais, 14,5-16,5 h após a colocação do ovo).
NOTA: Imediatamente antes do início da etapa 2.4, complete as etapas 3.1 e 3.2. - Retire a placa de ágar da incubadora e, usando uma garrafa de esguicho, adicione água suficiente à placa de ágar para dissolver a pasta de levedura escovando levemente com um pincel. Enxágüe os embriões e levedura dissolvida em uma pequena cesta de tela de malha sentada dentro de um barco de pesagem. Enxágüe a cesta com a garrafa de esguicho de água até que a maioria da pasta de levedura tenha filtrado através da malha.
- Retire a água do barco de pesagem e coloque a cesta de volta dentro. Descoro os embriões imergindo-os em uma solução de alvejante de 50%, usando uma garrafa de esguicho. A solução de alvejante deve ter uma profundidade de 3-5 mm. Mantenha os embriões submersos em alvejante por ~2 min, com redemoinhos ocasionais.
ATENÇÃO: Alvejante é corrosivo e pode irritar ou danificar os olhos e o trato respiratório. Use luvas e óculos enquanto manuseia alvejante.
NOTA: Durante este tempo, complete o máximo possível da etapa 3.3. O progresso da descorção pode ser verificado colocando a cesta sob um microscópio estéreo e verificando a ausência dos apêndices dorsais. Submergir os embriões na solução de alvejante por mais tempo, se necessário. - Descarte o alvejante e enxágue bem os embriões dentro da cesta com água de uma garrafa de esguicho (por ~3 s, manchando a cesta de malha com toalhas de papel; repita 2-3 vezes).
3. Preparação do dia da dissecação
- Adicione 30 μL de insulina (10 mg/mL) a 1.500 μL de mídia de imagem preparada (ver passo 1.2) em um tubo Eppendorf de 1,5 mL (concentração final de 0,2 mg/mL). Misture bem e deixe o tubo no banco para equilibrar a temperatura ambiente.
- Prepare as tiras de deslizamento revestidas com cola.
- Use uma faca com ponta de diamante para cortar uma tampa de 22 mm x 22 mm em quatro tiras de tamanho igual (Figura 1A).
- Use fórceps para pegar uma tira e espalhar um total de aproximadamente 30 μL de solução de cola de heptano em ambos os lados da tira (Figura 1B). Para obter uma camada uniforme de resíduo de cola, incline a tira em vários ângulos enquanto o heptano evapora.
- Armazene a tira coberta de cola em um entalhe vazio de uma caixa de deslizamento de tampas; para manter sua pegajosa, coloque a tira em uma posição inclinada, mas vertical, encostada nas bordas da caixa para minimizar o contato com superfícies da caixa (Figura 1C). Feche a caixa para que as partículas no ar não vestem a cola e diminuam sua pegajosa.
- Coloque os seguintes itens na bancada: uma pipeta Pasteur de vidro de 6 polegadas, um slide de microscópio, um P200 e um pipeteiro P1000 com as pontas de pipeta apropriadas, a soluçãoringer 27 (pH ajustada a 7,3 com NaOH) e um prato de imagem de 35 mm revestido de Poli-D-Lysine.
- Transfira embriões da cesta de tela de malha para um pequeno vidro de relógio cheio de heptano de 500 a 750 μL.
- Borrihe as laterais e o fundo da cesta secos com uma limpeza de tecido. Umedeça um pincel no heptano, toque o pincel nos embriões (a membrana de vitellina hidrofóbica deve aderir às cerdas), e mergulhe o pincel de volta no heptano no vidro do relógio (embriões devem afundar até o fundo).
NOTA: Os próximos passos devem ser realizados o mais rápido possível para evitar que os embriões sequem. Embriões não devem ser expostos ao ar por mais de 20 anos.
- Borrihe as laterais e o fundo da cesta secos com uma limpeza de tecido. Umedeça um pincel no heptano, toque o pincel nos embriões (a membrana de vitellina hidrofóbica deve aderir às cerdas), e mergulhe o pincel de volta no heptano no vidro do relógio (embriões devem afundar até o fundo).
- Transfira os embriões para o slide do microscópio usando uma pipeta Pasteur (Figura 1D). Desenhe embriões na pipeta lentamente e limite-os à porção estreita da pipeta. Embriões pipetas no slide lentamente, de tal forma que eles se agregam apenas dentro da ponta da pipeta antes de fluir para o slide. Torça o canto de uma limpeza de tecido em uma ponta fina, e afaste o heptano dos embriões na lâmina. Eles agregarão e cobrirão uma área menor, facilitando a captura deles em uma tira coberta de cola na próxima etapa.
- Com fórceps, pegue uma tira coberta de cola e toque suavemente nos embriões (Figura 1E). Coloque a tira no prato de imagem, embrião lado para cima, e fora do centro revestido de Poli-D-Lysine. Pressione a tira sobre o prato usando fórceps, para garantir que ela esteja fixada no lugar. Inundar imediatamente o prato com solução ringer de 2-3,5 mL; submergir os embriões primeiro para evitar que eles sequem (Figura 1F).
4. Dissecção
NOTA: Estas etapas devem ser realizadas sob um microscópio estéreo-fluorescente.
- Devitellinize 10-15 embriões.
NOTA: Isso pode variar de dois embriões, para iniciantes, até quinze embriões, para especialistas.- Selecione os embriões do Estágio 16 com base na morfologia intestinal (Figura 2). Nesta fase, os embriões possuem três constrições intestinais que criam quatro segmentos intestinais empilhados (Figura 2B,B'). Para iniciar a devitellinização, fure o embrião selecionado em uma extremidade, de preferência o anterior, com a agulha de tungstênio. O embrião pode sair de sua membrana vitelline, mas se não, retire a membrana do embrião.
NOTA: Embriões muito jovens para dissecar têm tripas não regionalizadas (Figura 2C). A dissecção dos embriões estágio 17 é possível, mas mais desafiadora do que a dissecção dos embriões estágio 16 porque a cutícula está começando a se desenvolver nesta fase. Os embriões do Estágio Inicial 17 apresentam quatro segmentos intestinais que são deslocados em relação um ao outro (Figura 2D,D'). - Enganchar a agulha através do embrião em uma região longe das gôndas. Transfira o embrião fisgado para a região revestida de poli-lise do prato (a partir de agora referido como simplesmente "deslizamento de cobertura") e arraste-o contra o fundo até que ele adere. Repita esses passos e organize embriões devitellinizados em uma fileira ao longo do topo do deslizamento de cobertura revestido de poli-lise (Figura 3A), deixando muito espaço abaixo para dissecção posterior.
NOTA: As gônadas aparecem como pequenos agregados esféricos de células que devem fluoretar brilhantemente, dependendo do marcador específico usado e do número da cópia transgênica. Nesta fase, as gônadas estão localizadas lateralmente no segmento A5, a aproximadamente 70%-80% do comprimento do embrião do anterior. Durante todo o protocolo de dissecação, o tecido pode grudar na agulha. Para livrar a agulha dos detritos, elevá-la logo acima da superfície da solução do Ringer. A devitellinização pode ser desarrumada desde que a gônada adequada seja perturbada o mínimo possível.
- Selecione os embriões do Estágio 16 com base na morfologia intestinal (Figura 2). Nesta fase, os embriões possuem três constrições intestinais que criam quatro segmentos intestinais empilhados (Figura 2B,B'). Para iniciar a devitellinização, fure o embrião selecionado em uma extremidade, de preferência o anterior, com a agulha de tungstênio. O embrião pode sair de sua membrana vitelline, mas se não, retire a membrana do embrião.
- Finesse as gônnas para fora do embrião e para o prato (Figura 3C,D).
- Primeiro, filé do embrião para expor seu interior (Figura 3C). Corte o embrião do centro, movendo a agulha posteriormente, entre as gôndas. Provoque algum tecido interno, pois isso vai grudar no prato muito melhor do que a cutícula externa. A pegajosa do tecido permitirá que as próximas manipulações revelem a gônda e permitam que ela adere ao deslizamento da tampa.
NOTA: Se o tecido não estiver grudado no prato, tente persuadi-lo a uma região não contaminada do deslizamento de cobertura revestido; as regiões externas do deslizamento de cobertura serão particularmente pegajosas. Como dito na etapa 4.1.2, não importa se as manipulações de dissecção resultam em uma carcaça de embrião mutilada, desde que as gônadas permaneçam ilesas. - Use a agulha para cortar em torno de uma gônada até que um pedaço de tecido, incluindo a gônada, seja separado da carcaça restante. Com a agulha, desenhe este tecido para uma região fresca de deslizamento de cobertura revestido, e persuada-o contra o fundo até que ele adere ao prato.
NOTA: A melhor imagem será obtida para os casos em que a gônus se prende diretamente ao deslizamento da tampa, em vez de fixação indireta através de tecido sobrelado. Portanto, como o tecido é guiado para longe da carcaça, tente fazer com que a gônada toque primeiro na tampa, em vez de tecido ínteo. - Remova o máximo possível de tecido circundante da gônada (Figura 3D) arrastando suavemente tecido aderente para longe da gônada com a agulha. Evite tocar diretamente na gônda, o que a danificaria (Figura 4E). Para garantir que a gônada esteja suficientemente aderida ao prato, mova a agulha em um movimento circular suave ao redor da gônada — se ela se mover, toque a agulha no tecido aderente restante e direcione a gônada em direção a uma região fresca de deslizamento de cobertura pegajosa. Repita este processo até que não haja movimento detectável da gônus.
- Volte para a carcaça do embrião e disseca a segunda gônada. Repita este processo no maior número possível de embriões, mas NÃO exceda 25 min. A viabilidade tecidual será comprometida na solução de Ringer após mais de ~40-45 min.
- Primeiro, filé do embrião para expor seu interior (Figura 3C). Corte o embrião do centro, movendo a agulha posteriormente, entre as gôndas. Provoque algum tecido interno, pois isso vai grudar no prato muito melhor do que a cutícula externa. A pegajosa do tecido permitirá que as próximas manipulações revelem a gônda e permitam que ela adere ao deslizamento da tampa.
- Após a conclusão das dissecções, use um marcador indelével para adicionar marcas de registro à borda externa da placa de imagem para registrar sua orientação durante a dissecção.
- Retire a tira revestida de cola do prato.
- Insira suavemente o pino inferior de um par de fórceps sob a tira, fecho e lentamente incline a tira para cima para libertá-la do prato com o menor sloshing da solução do Ringer possível para minimizar a perturbação das gôndas aderidas.
NOTA: A tira deve ser inclinada para longe das gônadas dissecadas.
- Insira suavemente o pino inferior de um par de fórceps sob a tira, fecho e lentamente incline a tira para cima para libertá-la do prato com o menor sloshing da solução do Ringer possível para minimizar a perturbação das gôndas aderidas.
- Leve suavemente o prato para o microscópio de imagem de uma maneira que evite a inclinação da solução do Ringer.
5. Imagem
- Coloque o prato de imagem no suporte do palco, utilizando as marcas de inscrição para colocar o prato na orientação aproximada como durante a dissecção. Usando microscopia de campo brilhante e um objetivo de baixa potência (~10x), identifique e coloque em foco qualquer pedaço de tecido que seja aderido ao deslizamento da tampa. Alterne as configurações da ocular para revelar fluorescência, e usando as oculares binóculos, digitalize sistematicamente o prato, marcando a posição de cada gônada dentro do software de imagem (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Certifique-se de que as gônadas estão centradas no campo de visão antes de marcar posições. - Retire suavemente toda a montagem do suporte do palco, com o prato de imagem em seu suporte, e coloque a montagem na bancada de trabalho.
- Substitua a solução do Ringer pela mídia de imagem preparada contendo insulina (ver passos 1.2 e 3.1).
- Use um P1000 para remover toda a solução de Ringer da borda superior interna do prato de imagem (não pipete Ringer's da região central de deslizamento de cobertura). Em seguida, mude para um P200, e coloque sua ponta logo abaixo da superfície do Ringer restante na região central. Remova cuidadosamente 50-100 μL de Ringer;; NÃO remova toda a solução.
- Elasenhe ~200 μL de mídia de imagem e, novamente colocando a ponta P200 logo abaixo da superfície do Ringer restante, adicione lentamente esta mídia de imagem. Em seguida, adicione a mídia de imagem restante (~1.300 μL) ao prato, começando na borda mais externa da borda superior. Enquanto pipeta, mova-se em direção à cúpula central do fluido, e eventualmente mescle os dois escovando a ponta da pipeta através de ambos. Coloque a tampa no prato.
NOTA: A mídia de imagem deve cobrir todo o diâmetro interno do prato, com uma profundidade de cerca de 2 mm, para evitar a evaporação (Figura 4D).
- Mude o microscópio para um objetivo de maior potência (63x, 1.2 NA), aplique o fluido de imersão adequado com base no objetivo utilizado (tipo de fluido de imersão e índice de refração exigido pelo objetivo) e, em seguida, substitua o conjunto do suporte de palco. Use microscopia brightfield para se concentrar no tecido aderido à parte inferior da placa de imagem.
NOTA: Se a etapa não foi movida, a última gôndama deve ser vista assim que o objetivo estiver focado. - Passe por cada posição de gôngeia marcada e ajuste essa posição, conforme necessário. Selecione quais gôndas à imagem com base na clareza de imagem, sexo gôndado, etc. Personalize as configurações de imagem (multicanal, tempos de exposição, intensidades de laser, incrementos da série Z, lapso de tempo com intervalos apropriados, etc.). Comece a imagem.
NOTA: As gôngas masculinas podem ser identificadas pela presença de um nicho, e na extremidade oposta da gônada, um aglomerado de pequenas células somáticas altamente circulares chamadas precursores gândalos somáticos específicos do sexo masculino (msSGPs). Se o marcador fluorescente de seis eGFP::moesin for usado, as células de nicho são as segundas células mais brilhantes na gônada, sendo a mais brilhante os msSGPs. Nesta fase, as gôndas femininas não têm um nicho nem msSGPs.
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Representative Results
Ilustramos a preparação do prato de imagem na Figura 1, como descrito na "preparação do dia da dissecação". Esses métodos devem, em última análise, resultar em embriões bem hidratados aderidos a uma tira de deslizamento de cobertura, que é temporariamente fixada na parte inferior do prato e submersa na solução de Ringer (Figura 1F). Uma faca de ponta de diamante permite que se corte limpamente uma tampa de 22 x 22 mm em três a quatro tiras menores (Figura 1A). Ao manusear essas tiras com fórceps, usamos uma pipeta para transferir cola heptane suficiente para revestir essas tiras, o que lhes dá uma superfície adesiva e texturizada (Figura 1B). As tiras revestidas são facilmente armazenadas em uma caixa de deslizamento de cobertura vazia para manter as superfícies adesivas limpas por até 2 h (Figura 1C). Uma vez feitas essas tiras revestidas, o objetivo é aderir embriões à tira em um agregado, perto da borda longa da tira (Figura 1E). É necessário primeiro transferir alguns embriões do vidro do relógio para um escorregador de vidro limpo e secá-los (Figura 1D). Em seguida, use rapidamente fórceps para tocar suavemente a tira revestida para os embriões para que eles aderam (Figura 1E). Em seguida, pressionamos imediatamente a tira para o fundo do prato de dissecção com embriões voltados para cima, e cobrimos os embriões com a solução de Ringer (Figura 1F). Se esse objetivo for alcançado, então a visualização de embriões sob um estereótipo tradicional de campo brilhante revelará embriões totalmente hidratados e saudáveis dentro de suas membranas vitelline (Figura 1G). Se, em vez disso, o processo de transferência desses embriões para a tira e cobri-los com solução leva mais de 30 anos, os embriões desidratarão e ficarão flácidos (Figura 1G'). Embriões flácidos não são saudáveis e são incrivelmente desafiadores de dissecar, por isso trabalhar eficientemente durante esse processo é vital.
Figura 1: Montagem e hidratação de embriões antes da dissecção. (A-F) Passos para aderir embriões a uma tira de tampa revestida de cola, e fixar a tira em um prato de imagem. (A) Coverlip marcado uma vez por faca de ponta de diamante (faca indicada pela ponta da flecha) para criar uma tira. (B) Aplicação de heptano-cola na tira de deslizamento de cobertura cortada, mantida com um par de fórceps. (C) Quatro tiras revestidas de cola secando em uma caixa de deslizamento de tampa. (D-E) Flechas apontam para embriões. (D) Embriões desobriados que foram coletados em heptano e expelidos na borda de um slide de microscópio. Excesso de heptano foi removido com um kimwipe. (E) Tira revestida de cola com embriões ligados. (F) A configuração final do prato imediatamente antes da dissecação. Observe a camada rasa da solução de Ringer (ponta de seta) e colocação da tira (seta) acima do círculo de dissecção interna. (G-G') Embriões aderiram à tira no prato. (G) Embriões devidamente hidratados e turvas. (G') Embriões que ficaram desidratados devido à exposição prolongada do ar, evidentes por membranas vitelline colapsadas. Asteriscos indicam embriões flácidos. As barras de escala são de 0,5 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A visualização de um embrião sob um microscópio estéreo-fluorescente permite uma visualização clara do intestino, que se multiplica automaticamente no canal GFP. A morfologia intestinal serve como proxy para a idade embrionária ao escolher embriões para dissecar. Como os embriões aderidos à faixa de deslizamento de cobertura variam ligeiramente na idade, eles apresentarão uma variedade diversificada de morfologias intestinais (Figura 2A). Para a morfogênese de nicho gônds, dissecamos os embriões do estágio 16. Esses embriões apresentam quatro seções intestinais regionalizadas que são empilhadas em uma linha uniforme (Figura 2B', linhas pontilhadas). Os embriões mais jovens apresentam um intestino não regionalizado (Figura 2C) e ainda não possuem matriz extracelular suficiente (ECM) em torno de suas gônadas para permitir uma cultura eficiente do órgão intacto. Embriões mais antigos que já iniciaram a compactação de nicho apresentam quatro regiões intestinais que não são uniformemente empilhadas e são, em vez disso, deslocadas em relação umas às outras (Figura 2D', linhas pontilhadas). Esses embriões têm cutícula mais grossa, o que torna o processo de dissecção mais desafiador.
Figura 2: Selecionando embriões apropriadamente envelhecidos para dissecção de gônada. Os embriões aderiram a um deslizamento revestido de cola antes da dissecção. Os embriões expressam seis eGFP::moesin (verde), que marca as células do corpo de gônada e de gordura. Note que o intestino se fluoresce em verde. As setas indicam gônadas masculinas (discernidas pela presença de msSGPs brilhantemente fluorescentes) que são visíveis em cada painel. As barras de escala indicam 0,25 mm. (A) Embriões de vários estágios. (B-D) Embriões de estágios distintos no centro da imagem, orientados com anterior à esquerda e dorsal para cima. (B) Um embrião estágio 16 que é envelhecido adequadamente para dissecção. (B') As quatro regiões intestinais empilhadas são indicadas com linhas brancas pontilhadas. (C) Um embrião estágio 15 muito jovem para dissecar (embrião inferior). Note que o saco intestinal fluorescente apenas antes da gônada ainda não tem regiões discretas. (D) Um embrião estágio 16 tardio que é difícil de dissecar devido ao desenvolvimento de cutícula. Note que as quatro regiões do intestino começaram a girar em relação umas às outras em preparação para looping intestinal. (D') As quatro regiões do intestino estão delineadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
É importante dissecar embriões que expressem um marcador fluorescente indelével na gônada, e este marcador deve ser visível sob um microscópio estéreo-fluorescente. Aqui, optamos por usar seis eGFP::moesin20 para marcar a gônada (Figura 2 e Figura 3, setas) para visualização durante a dissecção.
Ilustramos o processo de dissecção da gônada na Figura 3. A dissecção de embriões apropriadamente encenados no prato revestido de poli-lysina permite o isolamento limpo das gônadas desses embriões (Figura 3D). Embriões devitellinizados aderirão ao prato, podendo ser dispostos em uma linha conveniente antes da dissecção (Figura 3A). A devitellinização do embrião e a transferência para a poli-lise é um processo impreciso de tal forma que o tecido pode ser extrudido dos limites do corpo embrião (ver pedaço de tecido entre o Embrião 1 e o Embrião 2, e o Embrião mutilado 4; Figura 3A). Esta imprecisão não é importante, desde que as gônadas permaneçam ilesas. Um microscópio estéreo-fluorescente padrão permite a identificação da gônada dentro do corpo de embrião devitellinizado (Figura 3B, seta). As primeiras manipulações com uma agulha de dissecção afiada devem separar as gôndas da carcaça do embrião, embora algum tecido auto-fluorescente permaneça aderido (Figura 3C). Manipulações adicionais resultam em gônadas isoladas que aderem diretamente ao prato revestido (Figura 3D).
Figura 3: O processo de dissecção. (A-D) Embriões que expressam seis eGFP::moesin (verde) em estágios sequenciais no protocolo de dissecção. (A) Quatro embriões devitellinizados que foram transferidos para a região de dissecção revestida de poli-lise do prato. Observe como os embriões estão alinhados em uma linha limpa para facilitar sucessivas dissecções descendentes no prato. O pequeno pedaço de tecido entre os Embriões 1 e 2 faz parte do intestino do Embrião 2, extrudado durante a devitellinização manual. (B) Maior visão de ampliação do embrião de (A), indicado pelo asterisco. (C) A carcaça restante de um embrião que foi preenchido na linha média. A ponta da flecha indica uma gôndio ocluída, ainda fortemente embutida em tecidos embrionários. (D) Uma gônada completamente dissecada. Note apenas o tecido mínimo íntento (ponta de flecha) permanece perto da gônus. Flechas apontam para gôndas masculinas. As barras de escala são de 0,25 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Uma vez que as gônadas são dissecadas, pode-se substituir a solução do Ringer por mídia de imagem, e gônadas cultivadas por imagem diretamente no mesmo prato usado para dissecção. Usamos um microscópio confocal de disco giratório. A visualização de brightfield de uma gônada isolada em um microscópio confocal revela uma sombra escura ao redor da periferia gônada (Figura 4A-B, setas), que é o ECM que mantém a integridade da gônada durante a imagem. Apresentamos um exemplo de uma gnad saudável e bem cultivada que expressa F-actin rotulado por GFP em células gnadalsomáticas 20 e um marcador de histona rotulado por RFP para visualizar todos os núcleos28 (Figura 4C-C'). Como todas as células deste embrião expressam o marcador de histona RFP, tanto as células gonadal, quanto as células de outros tecidos aderentes são observadas na visualização da emissão vermelha. Discernimos os limites da gnad usando o marcador GFP específico da gnad (Figura 4C', contorno). É claro que esta gônada cultivada é saudável porque o limite da gônada é suave e redondo (Figura 4C', contorno), e porque as células gonadal têm mesmo níveis de fluorescência de histona RFP em todos os núcleos (Figura 4C', seta). Se, em vez disso, as gônadas não forem suficientemente hidratadas durante a imagem, núcleos e seis eGFP::fluorescência de moesina pode se tornar pontual (Figura 4D, seta) à medida que o tecido gôndado murcha. Além disso, se o ECM gôndado for danificado excessivamente durante a dissecção, o limite da gônada fica comprometido, o que é evidente pela presença de células específicas da gônada (Figura 4E, asteriscos) fora dos limites da gônada (Figura 4E, seta).
Figura 4: Localização de gôndas saudáveis durante a imagem ao vivo. (A) Vistas baixas e (B) de alta ampliação de duas gônadas dissecadas aderidas ao deslizamento de tampas. (C–C') Um quadro de filme de imagem ex vivo de compactação de nicho em uma gônada saudável. As células gonadal somáticas expressam seis eGFP:::moesin (verde) e todas as células expressam His2Av-mRFP (vermelho). (C') Limite gonad marcado com uma linha pontilhada branca. Seu 2Av-mRFP visível fora do limite da gônada é provavelmente corpo gordo que ainda está ligado à gônada dissecada. A seta aponta para um núcleo de células germinativas com sinal uniforme His2Av-mRFP, indicando que a gônada é saudável. (D-E) Resultados negativos representativos do protocolo de dissecação ex vivo . (D) Um quadro de uma sessão de imagem na qual a gônada se desidratou por causa da evaporação da mídia. Observe núcleos pyknotic como condensadores his2Av-mRFP (seta), e pontos descontínuos de seis eGFP::moesin ao longo do limite da gônada. (E) Quadro de imagem ex vivo no qual a matriz extracelular foi comprometida durante a dissecção. Observe que algumas células germinativas (asteriscos) estão saindo do limite da gônada (seta). As células germinativas são rotuladas com na-lifeact::tdtomato (magenta) e células gândalos somáticas com seis eGFP:::moesin (verde). Barras de escala mostram 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
As gonads podem ser cultivadas por cerca de 5 h usando este método de imagem ex vivo , permitindo a aquisição de imagens dos eventos dinâmicos de morfogênese que ocorrem no desenvolvimento tardio da gônnad embrionária. Em nosso laboratório, usamos com sucesso este protocolo para imaginar a compactação do nicho de células-troncoformadoras 17 (Figura 5). Antes da compactação, o nicho é um agregado frouxo de células somáticas na gônada anterior (Figura 5A, verde), cercada por células germinais rotuladas com na-lifeact::tdtomato29 (ver Tabela de Materiais), a primeira camada das quais serão células-tronco germinais (Figura 5A, magenta). Este nicho agregado apresenta inicialmente um limite irregular (Figura 5A', linha pontilhada). Ao longo do curso da imagem, observamos células de nicho individuais reorganizando suas posições enquanto o nicho agregado adquire bordas mais suaves. Esses rearranjos celulares também resultam em uma diminuição na área de nicho (Figura 5C). Nossas observações de rearranjos celulares e divisões de células germinativas vizinhas que ocorrem simultaneamente com esta fase de desenvolvimento informaram nossa compreensão dos mecanismos subjacentes à compactaçãode nicho 17. Este protocolo permite, assim, a capacidade de visualizar rearranjos celulares, mudanças de forma, divisões e outros eventos celulares com a resolução necessária para analisar eventos morfogenéticos em gônadas em estágio final.
Figura 5: Uma gônus ex vivo cultivada em fase de compactação de nicho. Imagens de uma série de imagens adquiridas prontamente após dissecação de gônadas dos embriões do estágio 16 inicial. (A-C) As células germinativas (magenta) são rotuladas por na-lifeact::tdtomato e células gândalos somáticas (verde) são rotuladas por six4-eGFP::moesin. O nicho (linha branca pontilhada) é delineado em A'-C'. Barras de escala mostram 10 μm. Anterior é para a esquerda, e posterior é para a direita. (A) No primeiro ponto de tempo (t = 0 min) na série de imagens, as células de nicho terminaram a montagem na gônada anterior e estão em estágio inicial de compactação. (B) No meio da série de imagens e do processo de compactação (t = 1 h 48 min), o nicho começou a circularizar, mas sua borda permanece irregular. (C) Perto do final da série de imagens (t = 4 h 21 min), o nicho tem um limite altamente suavizado e circularizado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Durante a gonadogênese, a gônada embrionária, e particularmente o nicho de células-tronco dentro da gônada masculina15, sofre rápidas alterações morfológicas. Mecanismos de desenvolvimento que fundamentam essas mudanças dinâmicas são melhor compreendidos através de técnicas de imagem ao vivo. No entanto, no estágio 17 embrionário, a imagem in vivo da gônada torna-se impossível pelo início das contrações musculares em larga escala17. Com este protocolo, fornecemos uma alternativa bem sucedida: dissecção das gôndas diretamente em um prato de imagem para ex vivo live-imaging. Este protocolo apresenta o único método disponível para realizar imagens ao vivo da gônus embrionária em estágio final.
As etapas críticas do protocolo devem ser executadas com um foco agudo na destreza e no tempo. Antes da dissecção, a rápida montagem dos embriões é primordial para garantir que os embriões não desidratem e permaneçam saudáveis e turvas, o que facilita a desvitellinização e dissecção. Durante a dissecção, é vital evitar a interrupção da matriz extracelular gonadal, que é realizada usando apenas manipulações delicadas e precisas. O uso dessa destreza também garantirá que a gônia esteja em contato direto com a folha de imagem, permitindo assim imagens claras diretamente através da mancha de cobertura. Após a dissecção, a solução de Ringer deve ser trocada por mídia de imagem usando apenas sucção suave e expulsão com uma pipeta para evitar o desalojamento da gônada. Por fim, é importante limitar o tempo total de dissecção a 25 min. Isso garante que o tempo gasto na solução de Ringer durante a dissecção, e a localização do tecido no confocal, esteja limitado a uma exposição não tóxica. Com o aumento da prática, a velocidade de dissecção melhorará e a personalização da sequência de dissecção ocorrerá. Em nossa experiência, a dissecção suficiente pode ser alcançada após cerca de uma semana de prática regular, com domínio total da dissecção atingível em cerca de 1 mês. Para facilitar o aprendizado, recomendamos praticar etapas individuais antes de executar todo o protocolo.
Existem uma série de melhores práticas que amenizam os desafios associados a este protocolo, começando pelo genótipo dos embriões utilizados para dissecção. A incorporação de múltiplas cópias do transgene usado para marcar a gônada tornará a gônada mais brilhante e, portanto, mais fácil de visualizar e dissecar. A dissecação em si funciona melhor com uma agulha afiada, embora não deva ser excessivamente afiada, pois se curvará contra a parte inferior do prato de imagem e ficará sobrecarregada com tecido estranho. A mídia de imagem de Schneider se torna auto-fluoresces no espectro de emissões verdes, o que torna desafiador localizar gnads marcados com GFP uma vez que a mídia é adicionada. Portanto, é fundamental usar o software de imagem confocal para marcar a localização das gôndas enquanto elas ainda estão na solução do Ringer. Se localizar gôndas no confocal permanece difícil, após a próxima dissecação sugerimos esboçar ou tirar uma imagem do posicionamento relativo das gôndas no prato enquanto ainda está no microscópio de dissecção. Em seguida, marque o lado de fora do prato para indicar sua orientação durante a dissecção, e combine essa orientação ao fazer a transição para o microscópio confocal. Uma vez localizada no confocal, se uma gônada aparecer interrompida ou mutilada, na próxima dissecção tente deixar mais tecido aderente ao redor da gônada. Pelo contrário, se uma gônada está presente, mas parece embaçada em todos os planos, há provável tecido entre o deslizamento de tampa e a gônada, e futuras dissecções devem se esforçar para melhor isolamento da gônada do tecido aderente. Em nossa experiência, a adoção dessas práticas facilitou o aprendizado e a execução desse protocolo.
Durante a formação deste protocolo, foram identificadas várias alterações que poderiam ser aplicadas. Para estudos de compactação de nicho, pretendemos dissecar embriões no Estágio 16. Nesta fase, o embrião ainda não desenvolveu quantidades significativas de cutícula, e facilmente gruda no prato revestido de poli-lysina. No entanto, essa técnica pode ser modificada para dissecar embriões mais antigos com cutícula, colocando-os na parede interna da região revestida de poli-lise para a primeira incisão. Uma vez expostos os tecidos internos, a carcaça do embrião grudará na poli-lise, e a dissecção pode continuar normalmente. Além dos ajustes para a idade do embrião, ajustamos com sucesso esta técnica para dissecar vários genótipos no mesmo prato. Por exemplo, mutantes homozigos podem ser separados de heterozygotes irmãos pelo uso de um marcador facilmente discernível, como deformado-YFP no cromossomo balanceador. Após a devitellinização, os embriões devem ser transferidos para ambos os lados do deslizamento de cobertura com base na presença ou ausência do marcador. A dissecção deve proceder para baixo no prato como descrito no protocolo, com cuidado extra para manter a segregação de diferentes genótipos. Além disso, este protocolo poderia potencialmente ser modificado para usar meio de cultura diferente do de Schneider, embora uma investigação superficial de Shields e Sang M3 Insect Media produziu gônadas inviáveis (dados não mostrados). Além disso, este protocolo combina bem com manipulações farmacológicas simplesmente combinando a droga com a mídia de imagem. Durante um período de 5h de imagem, a re-adição da droga pode ser necessária para manter uma concentração eficaz. Finalmente, embora este protocolo tenha sido desenvolvido com a intenção de visualizar a compactação de nichos, um fenômeno específico para gônus masculino, em teoria esse protocolo também poderia ser implementado para live-image o ovário em desenvolvimento, simplesmente dissecando e imagens gônus que carecem de nicho e msSGPs.
As limitações associadas a essa técnica relacionam-se com o tempo de cultivo e a natureza ex vivo da cultura. Como é o caso das câmaras de ovos Drosophila 30, gônds cultivados começam a morrer após cerca de 5 h de ex vivo live-imaging, evidenciados pela perda de integridade tecidual (núcleos tornam-se pyknotic e membranas celulares murcham). Assim, se alguém quisesse explorar eventos de estágio posterior na gônada masculina, seria necessário dissecar gônadas da 1ª instar ou larvas mais antigas, fazendo modificações no protocolo aqui apresentado, e então imaginar aquelas em condições semelhantes às apresentadas aqui. No entanto, não descartamos a possibilidade de ex vivo live-imaging além de cinco horas se melhores condições de cultura forem desenvolvidas, embora possa haver um limite se pistas mecânicas de dentro do embrião forem necessárias para o desenvolvimento da gônada. Talvez a desvantagem mais severa da técnica seja devido à sua natureza ex vivo inerente. Quando cultivadas ex vivo, as células podem ter um potencial não natural que não representa a biologia in vivo 31. Além disso, as sutilezas dos ambientes de cultivo, incluindo conteúdo de mídia e rigidez matricial, podem ter influência drástica sobre o comportamento celular32. Com essa sensibilidade em mente, é vital garantir que as condições de cultivo reflitam com precisão a biologia in vivo . Tomamos medidas para atestar que o desenvolvimento e sinalização do nicho in vivo é recapitulado ex vivo17. Resumidamente, verificamos que o destino das células de nicho é mantido e o número de células de nicho é inalterado usando os marcadores Fasciclin-III e E-cadherin. Além disso, a sinalização STAT está presente e as células-tronco germinais se dividem ortogonalmente, sugerindo que a funcionalidade do nicho é mantida. No entanto, não verificamos que a biologia in vivo relevante permanece intacta em outros tecidos não-nicho dentro da gônada. Futuras investigações ex vivo desses outros tecidos devem incluir uma análise abrangente para garantir que este seja realmente o caso.
Uma direção futura que se poderia tomar com este protocolo incluiria a incorporação de uma barreira dentro do prato de imagem, de modo que uma sessão de dissecção pode conter tanto um grupo de controle como um grupo de tratamento de drogas. Esse aprimoramento permitiria minimizar o erro entre as réplicas técnicas, melhorando assim o rigor científico.
Não há outras alternativas verdadeiras a este protocolo, pois é o único método disponível para examinar os eventos ao vivo deste órgão durante o desenvolvimento embrionário tardio. Como tal, perguntas anteriormente irrespondíveis sobre morfogênese gônusa são agora acessíveis com esse avanço. Essas questões incluem os meandros das divisões celulares, mudanças citoesqueléticas e eventos de intercalação celular que regem a formação de nichos de células-tronco e a gonadogênese. Nenhum desses eventos é detectável nas imagens estádas desses processos adquiridos usando uma técnica de correção e mancha. No geral, este método desbloqueia a possibilidade de investigar a dinâmica da gônada drosophila embrionária tardia, e tal avanço tem fortes implicações para o avanço de uma miríade de campos biológicos, incluindo biologia de nicho de células-tronco, biologia piRNA e organogênese.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Lindsey W. Plasschaert e Justin Sui por suas contribuições substanciais para o desenvolvimento precoce deste protocolo. Os autores são gratos à comunidade de moscas por sua generosidade com reagentes, e particularmente a Ruth Lehmann e Benjamin Lin por seu dom da linha no5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' antes de sua publicação. Foram utilizados no estudo os estoques obtidos no Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537). Este trabalho foi apoiado pelo NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 e R35GM136270 (S.D), bem como bolsas de treinamento T32GM007229 (B.W.) e F32GM125123 (L.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alfa Aesar Tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | 0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis) |
| D. melanogaster: His2Av::mRFP1 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | FBtp0056035 | Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007 |
| D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato | Gift from Ruth Lehmann Lab | Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' | |
| D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin | FBtp0083398 | Sano et al., PLoS One, 2012 | |
| Diamond-tipped knife | |||
| Double-sided tape | Scotch | 665 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082 | |
| Imaging dish | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| Imaging software | Molecular Devices | MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0 | |
| Insulin, bovine | Sigma | l0516 | Store aliquots at 4 °C |
| Needle holder | Fisher Scientific | 08-955 | |
| Nytex basket | |||
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Ringer's solution | 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved | ||
| Schneider's Insect Media | GIBCO | 21720-024 |
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