Summary
Kanserli ve nonkanseröz yumurtalık dokularındaki bakterileri yerinde keşfetmek ve ayırt etmek amacıyla immünhistokimya lekelenme ve 16S ribozomal RNA geni (16S rRNA geni) dizilimi yapıldı. Bakterilerin bileşimsel ve fonksiyonel farklılıkları BugBase ve Göz ardı Edilmeyen Durumların Yeniden İnşası (PICRUSt) ile Toplulukların Filogenetik İncelemesi kullanılarak tahmin edildi.
Abstract
"Steril" kadın üst üreme yolu teorisi, bakteriyel tespitteki gelişmeler nedeniyle artan bir muhalefetle karşılaşmaktadır. Ancak yumurtalıkların bakteri içerip içermediği henüz doğrulanmadı. Burada yumurtalık dokularındaki bakterileri tespit etmek için bir deney tanıtıldı. Kanser grubunda yumurtalık kanseri hastalarını, kontrol grubunda ise nonkanseröz hastaları seçtik. Yumurtalık dokularındaki bakterileri kanser ve kontrol gruplarından ayırt etmek için 16S rRNA gen dizilimi kullanıldı. Ayrıca, BugBase ve PICRUSt kullanarak tanımlanan bakterilerin fonksiyonel bileşimini tahmin ettik. Bu yöntem diğer iç organlarda ve dokularda da kullanılabilir, çünkü son yıllarda birçok organın bakteri barındırdığı kanıtlanmıştır. İçerdeki ve dokulardaki bakterilerin varlığı, bilim adamlarının kanserli ve normal dokuları değerlendirmesine yardımcı olabilir ve kanser tedavisinde yardımcı olabilir.
Introduction
Son zamanlarda, böbrek, dalak, karaciğer ve yumurtalık1,2gibi abdominal katı visseradaki bakterilerin varlığını kanıtlayan giderek artan sayıda makale yayınlanmıştır. Geller ve arkeatik tümörlerde bakteri bulundu ve bu bakteriler bir kemoterapötik ilaç olan gemcitabine karşı dirençliydi2. S. Manfredo Vieira ve ark. Enterococcus gallinarum lenf düğümleri, karaciğer ve dalak için taşınabilir olduğu ve otoimmünite3.
Serviks bir savunucu olarak rol oynadığından, uterus, fallop tüpleri ve yumurtalıkları içeren üst kadın üreme sistemindeki bakteriler minimal olarak araştırılmıştır. Ancak son yıllarda bazı yeni teoriler ortaya atmıştır. Bakteriler, mücinlerdeki değişiklikler nedeniyle adet döngüsü sırasında rahim boşluğuna erişebilir4,5. Ek olarak, Zervomanolakis ve ark. uterusun fallop tüpleri ile birlikte yumurtalıkların endokrin sistemi tarafından kontrol edilen peristaltik bir pompa olduğunu doğruladı ve bu düzenleme bakterilerin endometriyum, fallop tüpleri ve yumurtalıklara girmesini sağlar6.
Bakteriyel tespit yöntemlerinin geliştirilmesi sayesinde üst üreme yolu artık bir gizem değil. Verstraelen ve ark., 16S RNA geni7'ninV1-2 hipervariable bölgesini hedef alarak rahim bakterilerini keşfetmek için barkodlu eşleştirilmiş uçlu bir dizileme yöntemi kullandı. Fang ve ark. endometriyal polipli hastalarda barkodlu dizileme kullanmış ve çeşitli rahim içi bakterilerin varlığını ortaya koymaktadır8. Ek olarak, 16S RNA geni kullanılarak, Miles ve arkadaşları salpingo-ophorektomi ve histerektomi geçirmiş kadınların genital sisteminde bakteri buldu, sırasıyla5,9.
Tümör dokularındaki bakteriler son yıllarda giderek daha fazla ilgi görmeye devam ediyor. Banerjee ve arkadaşları, mikrobiyom imzasının yumurtalık kanseri hastaları arasında farklılık olduğunu keşfetti ve10'unu kontrol etti. Noksinotinoz sibiricum tümör evresi ile ilişkiliydi ve Methanosarcina vakuolata yumurtalık kanserini teşhis etmek için kullanılabilir11. Yumurtalık kanserine ek olarak, mide, akciğer, prostat, meme, serviks ve endometrium gibi diğer kanserlerin12 , 13 , 14,15,16,17,18bakteri ile ilişkili olduğu kanıtlanmıştır. Poore ve arkadaşları, erken evre kanser taramasını öngören yeni bir mikrobiyal bazlı onkoloji tanı sınıfı önerdi19. Bu protokolde bu iki dokudaki bakterilerin bileşimini ve işlevini karşılaştırarak kanserli ve normal yumurtalık dokuları arasındaki farkları araştırdık.
Yumurtalıklarda bakteri varlığını doğrulamak için immünhistokinometri lekeleme ve 16S rRNA gen dizilimi yapıldı. Kanserli ve nonkanseröz yumurtalık dokularındaki yumurtalık bakterilerinin farklılıkları ve öngörülen fonksiyonları incelendi. Sonuçlar yumurtalık dokularında bakteri varlığını gösterdi. Anoxynatronum sibiricum ve Methanosarcina vakuolata sırasıyla yumurtalık kanseri evresi ve tanısı ile ilişkiliydi. Her iki grupta da bulunan 46 anlamlı farklı KEGG yolu karşılaştırıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma Xi'an Jiaotong Üniversitesi birinci bağlı hastanesinin Tıbbi Kurumsal Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (Hayır. XJTUIAF2018LSK-139). Kayıtlı tüm hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı.
1. Kanser grubuna ve kontrol grubuna girme kriterleri
- Kanser grubu için öncelikle yumurtalık kanseri tanısı alan hastaları kaydettirmek ve laparotomi sonrası patolojik bulgularla seröz yumurtalık kanserine sahip oldukları kanıtlanmıştır.
- Kontrol grubu için, öncelikle rahim miyomu veya rahim adenomyozu tanısı alan, herhangi bir yumurtalık durumu göstermeden, histerektomi ve salpingo-oophorektomi geçirmiş hastaları kaydettirin.
NOT: Bu standart kesin değildir. Histerektomi ve salpingo-ophorektomi uygulanan yumurtalıkları etkilemeyen hastalıkları olan hastalar da kayıt altına alınabilir. - Aşağıdaki kriterlerden bir veya daha fazlasına sahip hastaları hariç tutun:
Hamile veya emziren kadınlar.
Ameliyattan 2 ay önce antibiyotik almak.
Ateş veya yüksek inflamatuar belirteçlere sahip olmak.
Her türlü iltihabı var.
Neoadjuvan kemoterapi gördükten sonra.
2. Örnekleri toplayın
- Ameliyat sırasında, resected yumurtalıkları steril bir tüpe yerleştirin ve tüpü taşımak için sıvı nitrojene yerleştirin. Tüm prosedür boyunca başka bir şeye dokunmaktan kaçının.
- Yumurtalıkları laminer akış kabini altında bir çift yeni steril cımbızla yaklaşık 1 cm kalınlığında doku örneklerine ayırın. Ayırma işleminden sonra numuneleri -80 °C'de saklanın.
NOT: Yumurtalıkları ayırmak da dahil olmak üzere numune toplamak için tüm prosedürler aseptiktir.
3. 16S rRNA genini sıralayın
- DNA'yı çıkar.
- 2 mL santrifüj tüpüne 1,2 mL inhibit EX tamponu ekleyin. Daha sonra tüpe 180-220 mg numune ekleyin. Numuneyi tamamen karıştırın (5 dakika boyunca 70 °C su banyosu ve ardından 15 sn için girdap).
- Tüpü 600 x g'da 1 dakika santrifüj edin.
- Süpernatantın 550 μL'lik kısmını yeni bir 1,5 mL tüpe yerleştirin ve 600 x g'da 1 dakika santrifüj yerleştirin.
- 400 μL'lik süpernatant ile 30 μL proteinaz K'yi başka bir 1,5 mL tüpe aktarın.
- 400 μL tampon AL ekleyin ve 15 s için bir girdap karıştırıcı kullanın.
- 70 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatır.
- 400 μL% 96-100 alkol ekleyin. 15 sn için bir girdap karıştırıcı kullanın.
- 600 μL karışımı bir emilim sütununa ve santrifüje 13700 g'da 1 dakika aktarın. Alt tüpü değiştirin. Bu adımı 11 kez yineleyin.
- 500 μL tampon AW1 ekleyin, 13.700 x g'da 1 dakika santrifüj ekleyin ve alt tüpü değiştirin.
- 500 μL tampon AW2 ekleyin, 13.700 x g'da 3 dakika santrifüj ekleyin ve alt tüpü değiştirin.
- 13.700 x g'da 3 dakika santrifüj.
- Karışımı yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın, 200 μL tampon ATE ekleyin, oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın ve 13.700 x g'da 1 dakika santrifüjleyin.
- Kalite testi. Kaliteyi test etmek için% 1 Sepharose jel elektroforez kullanın. 400 ng örnek, 120 V, 30 dakika ekleyin. İdeal sonuç: DNA konsantrasyonu: ≥ 10 ng/μL, DNA saflığı: A260/A280 = 1.8-2.0, brüt DNA: ≥ 300 ng.
- Kütüphaneleri üreticinin protokolüne göre 16S metayejemik sıralama kiti kullanarak hazırlayın.
- PCR gerçekleştirin. Kısaca, her 25 μL PCR reaksiyon, giriş olarak 12,5 ng örnek DNA, 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix'in 12,5 μL'si ve 1 μM'deki her astarın 5 μL'si içerir.
- PCR'yi aşağıdaki protokolü kullanarak gerçekleştirin: 95°C'de 3 dakika boyunca gerçekleştirilen ilk denatürasyon adımı ve ardından 25 denatürasyon döngüsü (95°C, 30 s), tavlama (55°C, 30 s) ve uzatma (72°C, 30 s) ve 72°C'de 5 dakikalık son uzama.
- Üreticinin talimatlarını kullanarak PCR ürününü reaksiyon karışımından manyetik boncuklarla temizleyin.
- 3.3.1 ve 3.3.2 adımlarını yineleyin.
- Kalite testi. Lütfen 3.2 adımına bakın.
- 3.3.3 adımlarını yineleyin.
- Kalite testi. Safsızlığı test etmek için % 1 Sepharose jel elektroforezi, saflığı test etmek için bir spektrofotometre, konsantrasyonu test etmek için bir florometre ve bütünlüğü test etmek için bir RNA test kiti kullanın. Üreticinin protokolünü izleyin. Kütüphaneleri normalleştirin ve birleştirin; daha sonra 600 döngü V3 standart akış hücresi kullanarak sıra (2 x 300 bp eşleştirilmiş uç okuma ayarı) yaklaşık 100.000 eşleştirilmiş uçlu 2 x 300 taban okuma üretir.
NOT: Tam uzunlukta astar dizileri: 16S Amplicon polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) İleri astar: 5' TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTAAGA GACAG-[CCTACGGGNGGCWGCAG] ve 16S Amplicon PCR Ters astar: 5' GTCTCGTGGGCTCGGAGATGGTAAGAGACAG-[GACTACHVGGGTATCTAATCC].
4. 16S rRNA gen dizileme verilerini analiz edin
- QIIME 2-201802 20 yazılım paketi ile sıralama kalitesine göre her numunenin ham okumalarınıfiltreleyin.
- Dizine üç dosya kopyalama: emp-paired-end-sequences_01
forward.fastq.gz ileri sırasını içeren dosya,
ters sırayı içeren bir reverse.fastq.gz dosyası,
ilişkili barkodu içeren bir barkod.fastq.gz dosyası okur - Yürütmek
qiime araçları alma \
--EMPPairedEndSequences \ yazın
--giriş yolu emp-eşleştirilmiş-bitiş-sequences_01 \--çıkış-yol emp-eşleştirilmiş-uç-sequences_02.qza
- Dizine üç dosya kopyalama: emp-paired-end-sequences_01
- Astar ve adaptör dizilerini çıkarın.
qiime cutadapt trim-paired \
--i-demultiplexed-diziler demultiplexed-seqs_02.qza \
--p-front-f GCTACGGGG \
--p-front-r GCTACGGGG \
--p-hata oranı 0 \
--kalite kesme 25 \
--o-kırpılmış sıralar kırpılmış-seqs_03.qza \
--ayrıntılı - Her iki eşleştirilmiş uç niteliğin de 25'ten düşük olduğu sıra okumalarını kısaltın. Yukarıya bakın --kalite kesme 25
- Sıralama verilerini çözümleme.
- %97'lik benzerlik kesintisi ile operasyonel taksonomik birimler (OTU' lar) oluşturmak için dizileri toplayın.
qiime vsearch dereplicate dizileri \
--i-sequences kırpılmış-seqs_03.qza \
--o-dereplicated-tablo table_04.qza \
--o-dereplicated-diziler rep-seqs_04.qza
qiime vsearch küme özellikleri-kapalı başvuru \
--i-tablo table_04.qza \
--i-sequences rep-seqs_04.qza \
--i-başvuru dizileri 97_otus.qza \
--p-perc-kimlik 0.97 \
--o-kümelenmiş tablo tablosu-cr-97.qza \
--o-kümelenmiş sıralar rep-seqs-cr-97.qza \
--o-eşsiz-diziler eşsiz-cr-97.qza - ATU'lar için, her örnekteki göreli bolluğu hesaplayın. Bolluk bilgileri table-cr-97.qza'da
- %97'lik benzerlik kesintisi ile operasyonel taksonomik birimler (OTU' lar) oluşturmak için dizileri toplayın.
- Tüm dizileri sıralamak için RDP eğitim kümesini (sürüm 9; http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/) hedefleyen yerel bir Bayes sınıflandırıcısı kullanın. Eşlenen takson bilgileri table-cr-97.qza'da
- Verilen OTU içinde, OTU'lara dizilerin ana tutarlılığını yansıtan bir sınıflandırma atayın. Ardından, OTU'ları hizalayın. Bkz. tablo-cr-97.qza ve rep-seqs-cr-97.qza
- Örnek grup bilgilerine dayanarak alfa çeşitliliği (Chao 1, ACE, Shannon, Simpson ve Evenness indeksleri dahil) ve UniFrac tabanlı ana koordinat analizi (PCoA) gerçekleştirin.
qiime araçları verme \
--giriş yolu tablosu-cr-97.qza \
--çıktı-yol dışa aktarılan-özellik-tablo
dışa aktarılan özellik tablosu
qiime çeşitlilik alfa \
--i-tablo tablo-cr-97.qza \
--p-metrik observed_otus \
--o-alfa-çeşitlilik observed_otus_vector.qza
qiime çeşitlilik beta \
--i-tablo tablo-cr-97.qza \
--p-metrik braycurtis \
--o-mesafe matrisi unweighted_unifrac_distance_matrix.qza
5. Bakteri işlevini tahmin edin
- Bakterilerin özelliklerinin ilgili temsilini tahmin etmek için BugBase21. BugBase için giriş OTU tablosu aşağıdaki komutlar kullanılarak hazırlanmıştır.
biom dönüştürme -i otu_table.biom -o otu_table.txt --to-tsv
biom dönüştürme -i otu_table.txt -o otu_table_json.biom --tablo-type="OTU tablosu" --to-json
NOT: Tahmin altı fenotip kategorisine dayanmaktadır (Ward ve ark. yayınlanmamış) (https://bugbase.cs.umn.edu/): Gram boyama, oksijen toleransı, biyofilm oluşturma yeteneği, mobil element içeriği, patojeniklik ve oksidatif stres toleransı. - İşaretçi gen verilerinin kullanımı ve referans genomları içeren bir veritabanı ile PICRUSt tarafından bir metagenom fonksiyonel bileşimini tahmin edin22.
make_otu_table.py -i microbiome_97/uclust_ref_picked_otus/test_paired_otus.txt -t /mnt/nas_bioinfo/ref/qiime2_ref/97_otu_taxonomy.txt -o otu_table.biom .
normalize_by_copy_number.py -i otu_table.biom -o normalized_otus.biom
predict_metagenomes.py -i normalized_otus.biom -o metagenome_predictions.biom
categorize_by_function.py -i metagenome_predictions.biom -c "KEGG_Pathways" -l 1 -o picrust_L1.biom
categorize_by_function.py -f -i metagenome_predictions.biom -c KEGG_Pathways -l 1 -o metagenome_predictions. L1.txt - STAMP23,24yardımıyla her grup arasındaki işlev farklılıklarını analiz edin. Yazılımı çalıştırmak için lütfen alıntılara bakın.
6. Veriler
- Bulguların önemini hesaplamak için istatistiksel yazılım kullanın. İstatistiksel önemin göstergesi P < 0.05 olarak ayarlanmalıdır.
- Yaş ve parite farklılıklarını Öğrencinin t-test'ine göre değerlendirin. Ki-kare testi ile menopoz durumu, hipertansiyon ve diyabet öyküsündeki farklılıkları değerlendirin. Mann-Whitney U testi ile yumurtalık bakteriyel takson sayısındaki farklılıkları değerlendirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hasta
Çalışmaya toplam 16 nitelikli hasta dahil edildi. Kontrol grubunda iyi huylu rahim tümörü tanısı alan 10 kadın yer aldı (bunlar arasında 3 hastaya rahim miyomu, 7 hastaya rahim adenomiyozu tanısı konuldu). Bu arada kanser grubunda seröz yumurtalık kanseri tanısı alan 6 kadın vardı (bunların arasında 2 hastaya evre II, 2'sine evre III tanısı konuldu). Aşağıdaki özellikler kontrol grubundaki hastalar ile kanser grubu arasında hiçbir fark göstermedi: yaş, menopoz durumu, parite, hipertansiyon öyküsü ve diyabet öyküsü (Tablo 1).
Tablo 1: Hasta istatistikleri Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Her iki gruptaki yumurtalık bakteri türlerinin zenginliği ve çeşitliliği
İmmünohistokimiytri boyama kullanan bakterilerin varlığı Şekil 1'degösterilmiştir. Mikropların alfa çeşitliliği, yumurtalık bakteri türlerinin zenginliğini ve çeşitliliğini tespit etmek için bir yöntem olarak analiz edildi. Yumurtalık kanseri dokularında gözlenen türlerin sayısı, önemli bir fark olmadan kontrol grubundan daha azdı. Bakteri türlerinin zenginliği (Chao 1 ve ACE indeksi ile temsil edilir) ve çeşitliliği (Shannon, Simpson ve Eşitlik indeksi ile temsil edilir) kanser grubu ve kontrol grubu arasında önemli ölçüde farklı değildi (Şekil 2).
Şekil 2: 16S rRNA gen dizilimi, bakteri zenginliği ve çeşitliliğinde kanser ve kontrol grupları arasındaki farklılıkları göstermektedir. (A) Gözlenen tür indeksi(P = 0.06, Mann-Whitney U testi); (B) Chao 1 endeksi (P = 0.06, Mann-Whitney U testi); (C) ACE indeksi (P = 0.06, Mann-Whitney U testi); (D) Shannon indeksi (P = 0.32, Mann-Whitney U testi; E. Eşitlik indeksi(P = 0.48, Mann-Whitney U testi); (F) Simpson indeksi (P = 0.46, Mann-Whitney U testi). Önceki yayıncılardan yeniden baskı izni aldık. Bu rakam Wang ve ark.11'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Yumurtalık bakterilerinin tanımı
Yumurtalık bakterilerinin daha iyi anlaşılması için tüm örnekler üzerinde V3-V4 16S rRNA gen bölgesinin derin dizilimi yapıldı. Sonuçlar, Proteobacteria'nın en bol fitülar (kontrol grubunda% 67.10 ve kanser grubunda% 67.20), Firmicutes'in en bol ikinci fitüar olduğunu göstermiştir (23.). %77'si kontrol grubunda, %23,82'si kanser grubunda), üçüncü en bol fitil ise Bakterioides (kontrol grubunda %3,26, kanser grubunda %3,41) oldu. Kontrol grubunun türleri analiz edilirken, ana bileşim Halobacteroides halobios'tan (%14,53) oluşurken, onu Gemmata obscuriglobus (%11,07) ve Methyloprofundus sedimenti (%10,69) izledi. Kanser grubu için Gemmata obscuriglobus kümenin en zenginiydi (%13,89), onu Halobacteroides halobius (%11,99) ve Methyloprofundus sedimenti (%11,12)(Şekil 3).
Şekil 3: Phyla (%> 1) ve yumurtalık örneklerinde ilk 12 türün göreceli bolluğu. (A) Kontrol grubundaki hastaların yumurtalıklarında phyla'nın (%> 1) nispi bolluğu. (B) Yumurtalık kanseri olan hastaların yumurtalıklarında phyla'nın (%> 1) göreceli bolluğu. (C) Kontrol hastalarının yumurtalıklarındaki en bol bakteri türü olan 12 türün göreceli bollukları. (D) Yumurtalık kanseri hastalarının yumurtalıklarındaki en bol bakteri türü olan 12'nin göreceli bollukları. Önceki yayıncılardan yeniden baskı izni aldık. Bu rakam Wang ve ark.11'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
İki grup arasında yumurtalık bakterilerinin farklı bileşimleri
Permanova kullanılarak PCoA tarafından farklı bakteri topluluklarının karşılaştırılması gerçekleştirildi. Sonuçlar, kontrol grubundaki bakterilerin kanser grubundakilerden farklı olduğunu göstermiştir, P < 0.05 (Şekil 4).
Şekil 4: PCoA, topluluk kümelerini ve Anoxynatronum sibiricum ve Methanosarcina vacuolata'nın göreceli bolluklarını tespit eder. (A) Topluluklar PCoA kullanılarak kümelenmiştir. PC1 ve PC2 x ve y eksenlerine çizilir. Kırmızı blok yumurtalık kanseri grubunda bir örnek olduğunu gösteriyor. Mavi daire, denetim grubundaki bir örneği gösterir. Yumurtalık kanseri grubundan alınan örnekler kontrol grubundaki diğer örneklerden ayrıldı. (B) PCoA kullanılarak kümelenmiş topluluklar. PC1 ve PC2 x ve y eksenlerine çizilir. Kırmızı blok yumurtalık kanseri grubunda bir örnek olduğunu gösteriyor. Mavi düz daire rahim miyomu olan bir hastadan alınan bir örneği gösterir ve mavi içi boş daire rahim adenomiyozu olan bir hastanın örneğine eşittir. (C) Anoxynatronum sibiricum'un göreceli bolluğu (kontrol grubu: n = 10, kanser grubu: n = 6, P = 0.034, Mann-Whitney U testi). (D) Metanosarcina vakuolata'nın göreceli bolluğu (kontrol grubu: n = 10, kanser grubu: n = 6, P = 0.001, Mann-Whitney U testi). Önceki yayıncılardan yeniden baskı izni aldık. Bu rakam Wang ve ark.11'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Kanser ve kontrol gruplarında farklı açılardan yumurtalık bakteri bileşimi
Tanımlanan yumurtalık bakterisindeki farklılıkları daha fazla tespit etmek için yumurtalık bakteri bileşiminin analizi farklı açılardan gerçekleşmiştir. Tablo 2'defitil, sınıf, düzen, aile, cins ve tür düzeyleri dikkate alındı ve istatistikler grafikte sağlandı. Özellikle, Anoxynatronum sibiricum'un göreceli bolluğu ile tümörün evresi arasında bir ilişki vardı ve Methanosarcina vakuolata yumurtalık kanseri tanısında spesifik bir işaretti(Tablo 2).
Tahmin edilen fonksiyonlara göre iki gruptaki yumurtalık bakterilerinin fenotipik korunması
Kanser grubunda, potansiyel patojenik ve oksidatif strese dayanıklı fenotiplerle ilişkili genlerin ekspresyonu kontrol grubununkine göre artmıştır (Wilcoxon imzalı derece testi, P =0.02 ve P =0.002). Yumurtalık kanseri ve kontrol grupları arasında aşağıdaki yönlerden anlamlı bir fark bulunmadı: aerobik, anaerobik, öğretimsel olarak anaerobik, gram-pozitif ve gram negatif bakterilerin fenotipleri; mobil elemanlar; ve yumurtalık bakterilerinin biyofilm oluşumu (Şekil 5). Kanser ve kontrol gruplarındaki yumurtalıklardaki bakteriler arasında kırk altı varyant KEGG yolu belirlendi. Kanser grubundaki yumurtalıklarda 26 yol artışı görüldü. Bunlar arasında en çok ilişkili yollar taşıyıcılardı. Öte yandan, yumurtalık kanseri dokusundaki bakteriler 20 azalmış yol gösterdi. En alakalı işlevler şunlardı: salgı sistemi, bilinmeyen işlevler ve iki bileşenli sistem. Yolların geri kalanı Şekil 6'da gösterilmiştir.
Şekil 1: Yumurtalıklarda LPS immünohistokimyasal ekspresyoz. (A) Kontrol grubu (10 x). Ölçek çubukları, 200 μm. (B) Kontrol grubu (40 x). Ölçek çubukları, 50 μm. (C) Kanser grubu (10x). Ölçek çubukları, 200 μm. (D) Kanser grubu (40 x). Ölçek çubukları, 50 μm. Oklar yumurtalık dokusunda LPS lekelerine işaret eder. Önceki yayıncılardan yeniden baskı izni aldık. Bu rakam Wang ve ark.11'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: BugBase tarafından analiz edilen tahmini metagenomlar. Kanser grubundaki bazı genlerin ekspresyoyu kontrol grubundakine göre artmıştır. Bu genler potansiyel patojenik (Wilcoxon imzalı derece testi, P = 0.02) ve yumurtalıkların oksidatif strese dayanıklı fenotipleri ile ilişkiliydi. (Wilcoxon imzalı derece testi, P = 0.002). Önceki yayıncılardan yeniden baskı izni aldık. Bu rakam Wang ve ark.11'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Kanser ve kontrol grupları arasındaki farklı KEGG yollarının PICRUSt analizi. Önceki yayıncılardan yeniden baskı izni aldık. Bu rakam Wang ve ark.11'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 2: Zenginlik (Chao 1 ve ACE indeksi ile temsil edilir) ve bakteri türlerinin çeşitliliği (Shannon, Simpson ve Eşitlik indeksi ile temsil edilir) Lütfen bu Tabloyu indirmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yumurtalık kanserinin kadınların doğurganlığı üzerinde önemli bir etkisi vardır25. Yumurtalık kanseri hastalarının çoğu geç evrelerde teşhis edilir ve 5 yıllık sağkalım oranı% 30'dan azdır18. Karaciğer, pankreas ve dalak da dahil olmak üzere abdominal katı visseradaki bakterilerin teyidi yayınlanmıştır. Üst kadın üreme sisteminde bakteri varlığı, serviksin 2,3,4,5kapalı olmaması nedeniyle ortaya çıkar. Ancak abdominal katı vissera olan yumurtalıkların steril olup olmadığı henüz belirlenmemiştir. Ayrıca yumurtalıklardaki bakterilerin yumurtalık kanseri ile ilişkili olup olmadığı da önemli bir sorudur.
Bulduğumuz bakterilerdeki önemli farklılıklar farklı gruplar arasında karşılaştırıldı. Yukarıda belirtilen tüm prosedürler, aletler, reaktifler, ekipmanlar ve tüm protokolün çalışması da dahil olmak üzere kesinlikle mikropludu. Daha da önemlisi, olası kontaminasyona karşı kontrol grubu olarak iyi huylu rahim hastalığı olan hastalardan yumurtalıklar kullandık. Ancak, bu protokolde kontaminasyon önlenemez. Böylece kanser grubu ve kontrol grubu aynı deneysel ortamda analiz edildiğinden, sadece bu iki grup arasındaki farkları karşılaştırarak yumurtalık kanserinin mikrobiyolojik kökeni hakkında birincil kanıtlar elde edebiliriz.
Yumurtalık dokusundaki bakteri bulguları, yumurtalık kanserini etkileyen bakterileri araştıran yeni bir alan başlatabilir. Ek olarak, kanserli yumurtalık dokularındaki bakterilerin benzersiz varlığı ve bileşimi, yumurtalık kanserinin karsinogenezini ve bakterilerin terapötik ve prognostik hedeflerini yönlendirebilir. 46 KEGG yolu arasında vankomasin grubu antibiyotiklerin biyosentezi ile ilgili fonksiyonlar özellikle dikkat çekmektedir. Bu, yumurtalık kanseri için daha fazla tedavi seçeneği sağlayabilir.
Ancak, protokolün bazı sınırlamaları vardı. İlk olarak, örnekler etik nedenlerle sağlıklı insanlardan toplanamadı. Kontrol grubu iyi huylu rahim hastalığı olan hastaların yumurtalıklarıydı (rahim miyomu ve adenomyozis dahil). İkincisi, numune sayısı daha büyük olmalıdır. Çalışmanın sınırlı örneklem boyutu sonuçların doğruluğunu engelleyebilir. Üçüncüsü, kanser grubu ve kontrol grubu aynı koşullarda olmasına rağmen, olumsuz veya pozitif kontroller yapılmadı. Ek olarak, kontaminasyon önlenemedi. Bugüne kadar yumurtalık kanseri olan hastalarda yumurtalık bakterilerinin incelenmesi henüz erken evrededir. Daha fazla örneklem içeren daha büyük ölçekli bir çalışmaya ihtiyaç vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Xi'an Jiaotong Üniversitesi'nin İlk Bağlı Hastanesi Klinik Araştırma Ödülü (XJTU1AF-2018-017, XJTU1AF-CRF-2019-002), Shaanxi İl Bilim ve Teknoloji Bölümü Doğa Bilimi Ana Temel Araştırma Projesi (2018JM7073, 2017ZDJC-11), Shaanxi İl Bilim ve Teknoloji Bölümü'nün Önemli Araştırma ve Geliştirme Projesi (2017ZDXM-SF-068, 2019QYPY-138), Shaanxi İl İşbirlikçi Teknoloji İnovasyon Projesi (2 017XT-026, 2018XT-002) ve Xi'an Sosyal Gelişim Rehberlik Planı Tıbbi Araştırma Projesi (2017117SF/YX011-3). Fon sağlayıcılar çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rol oynamamışlardır.
Xi'an Jiaotong Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi Jinekoloji Bölümü'ndeki meslektaşlarımıza numunelerin toplanmasına katkılarından dolayı teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2200 TapeStation Software | Agilgent United States |
||
| AmpliSeq for Illumina Library Prep, Indexes, and Accessories | Illumina | ||
| Image-pro plus 7 | Media Cybernetics | ||
| Leica ASP 300S | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| Leica EG 1150 | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| Leica RM2235 | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| LPS Core monoclonal antibody, clone WN1 222-5 | Hycult Biotech | ||
| Mag-Bind RxnPure Plus magnetic beads | Omega Biotek | M1386-00 | |
| Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit | Omega Biotek | M4029-01 | |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | |
| Silva database | Max Planck Institute for Marine Microbiology and Jacobs University | ||
| the QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | |
| Trimmomatic | Björn Usadel | ||
| ZytoChem Plus (HRP) Anti-Rabbit (DAB) Kit | Zytomed Systems | HRP008DAB-RB |
References
- Manfredo Vieira, S., et al. Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans. Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).
- Geller, L. T., et al. Potential role of intratumor bacteria in mediating tumor resistance to the chemotherapeutic drug gemcitabine. Science. 357 (6356), 1156-1160 (2017).
- Manfredo, V. S., et al. Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans. Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).
- Brunelli, R., et al. Globular structure of human ovulatory cervical mucus. FASEB J. 21 (14), 3872-3876 (2007).
- Chen, C., et al. The microbiota continuum along the female reproductive tract and its relation to uterine-related diseases. Nature Communications. 8 (1), 875 (2017).
- Zervomanolakis, I., et al. Physiology of upward transport in the human female genital tract. Annals of the New York Academy of Sciences. 1101, 1-20 (2007).
- Verstraelen, H., et al. Characterisation of the human uterine microbiome in non-pregnant women through deep sequencing of the V1-2 region of the 16S rRNA gene. PeerJ. 4, 1602 (2016).
- Fang, R. L., et al. Barcoded sequencing reveals diverse intrauterine microbiomes in patients suffering with endometrial polyps. American Journal of Translational Research. 8 (3), 1581-1592 (2016).
- Miles, S. M., Hardy, B. L., Merrell, D. S. Investigation of the microbiota of the reproductive tract in women undergoing a total hysterectomy and bilateral salpingo-oopherectomy. Fertil Steril. 107 (3), 813-820 (2017).
- Banerjee, S., et al.
- Wang, Q., et al. The differential distribution of bacteria between cancerous and noncancerous ovarian tissues in situ. Journal of Ovarian Research. 13 (1), 8 (2020).
- Wang, L., et al. Bacterial overgrowth and diversification of microbiota in gastric cancer. European Journal of Gastroenterology & Hepatology. 28 (3), 261-266 (2016).
- Hosgood, H. D., et al. The potential role of lung microbiota in lung cancer attributed to household coal burning exposures. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 643-651 (2014).
- Kwon, M., Seo, S. S., Kim, M. K., Lee, D. O., Lim, M. C. Compositional and Functional Differences between Microbiota and Cervical Carcinogenesis as Identified by Shotgun Metagenomic Sequencing. Cancers. 11 (3), 309 (2019).
- Urbaniak, C., et al. The Microbiota of Breast Tissue and Its Association with Breast Cancer. Applied and Environmental Microbiology. 82 (16), 5039-5048 (2016).
- Feng, Y., et al. Metagenomic and metatranscriptomic analysis of human prostate microbiota from patients with prostate cancer. BMC Genomics. 20 (1), 146 (2019).
- Walsh, D. M., et al. Postmenopause as a key factor in the composition of the Endometrial Cancer Microbiome (ECbiome). Scientific Reports. 9 (1), 19213 (2019).
- Walther-Antonio, M. R., et al. Potential contribution of the uterine microbiome in the development of endometrial cancer. Genome Medicine. 8 (1), 122 (2016).
- Poore, G. D., et al. Microbiome analyses of blood and tissues suggest cancer diagnostic approach. Nature. 579 (7800), 567-574 (2020).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Ward, T., et al. BugBase predicts organism-level microbiome phenotypes. bioRxiv. , (2017).
- Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
- Langille, M. G. I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814 (2013).
- Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. STAMP: statistical analysis of taxonomic and functional profiles. Bioinformatics. 30 (21), 3123 (2014).
- Leranth, C., Hamori, J. 34;Dark" Purkinje cells of the cerebellar cortex. Acta Biologica Hungarica. 21 (4), 405-419 (1970).
