Summary
Immunohistochemische kleuring en 16S ribosomale RNA-gen (16S rRNA-gen) sequencing werden uitgevoerd om bacteriën in kankerachtige en niet-kankerachtige eierstokweefsels in situ te ontdekken en te onderscheiden. De samenstellings- en functionele verschillen van de bacteriën werden voorspeld met behulp van BugBase en Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt).
Abstract
De theorie van een "steriel" vrouwelijk bovenste voortplantingskanaal stuit op toenemende weerstand als gevolg van vooruitgang in bacteriële detectie. Of eierstokken bacteriën bevatten, is echter nog niet bevestigd. Hierin werd een experiment geïntroduceerd om bacteriën in eierstokweefsels te detecteren. We kozen eierstokkankerpatiënten in de kankergroep en niet-kankerachtige patiënten in de controlegroep. 16S rRNA-gensequencing werd gebruikt om bacteriën in eierstokweefsels te onderscheiden van de kanker- en controlegroepen. Verder voorspelden we de functionele samenstelling van de geïdentificeerde bacteriën met behulp van BugBase en PICRUSt. Deze methode kan ook worden gebruikt in andere ingewanden en weefsels, omdat de afgelopen jaren is bewezen dat veel organen bacteriën herbergen. De aanwezigheid van bacteriën in ingewanden en weefsels kan wetenschappers helpen bij het evalueren van kankerachtige en normale weefsels en kan helpen bij de behandeling van kanker.
Introduction
Onlangs zijn er steeds meer artikelen gepubliceerd die het bestaan van bacteriën in abdominale vaste ingewanden bewijzen, zoals de nier, milt, lever en eierstok1,2. Geller et al. vonden bacteriën in pancreastumoren en deze bacteriën waren resistent tegen gemcitabine, een chemotherapeutisch medicijn2. S. Manfredo Vieira et al. concludeerden dat Enterococcus gallinarum draagbaar was naar de lymfeklieren, lever en milt, en het kon auto-immuniteitstimuleren 3.
Omdat de baarmoederhals een rol speelt als verdediger, zijn bacteriën in het bovenste vrouwelijke voortplantingskanaal, dat de baarmoeder, eileiders en eierstokken bevat, minimaal onderzocht. De laatste jaren zijn er echter enkele nieuwe theorieën gevestigd. Bacteriën kunnen toegang hebben tot de baarmoederholte tijdens de menstruatiecyclus als gevolg van veranderingen in mucines4,5. Bovendien bevestigden Zervomanolakis et al. dat de baarmoeder, samen met de eileiders, een peristaltische pomp is die wordt bestuurd door het endocriene systeem van de eierstokken, en deze opstelling stelt bacteriën in staat om het baarmoederslijmvlies, de eileiders en de eierstokken binnen te dringen6.
Het bovenste voortplantingskanaal is niet langer een mysterie meer dankzij de ontwikkeling van bacteriële detectiemethoden. Verstraelen et al. gebruikten een barcoded paired-end sequencing methode om baarmoederbacteriën te ontdekken door zich te richten op het V1-2 hypervariabele gebied van het 16S RNA gen7. Fang et al. gebruikten barcode-sequencing bij patiënten met endometriumpoliepen en onthulden de aanwezigheid van diverse intra-uteriene bacteriën8. Bovendien vonden Miles et al. en Chen et al. door het 16S RNA-gen te gebruiken bacteriën in het genitale systeem van vrouwen die salpingo-oöforectomie en hysterectomie hadden ondergaan, respectievelijk5,9.
Bacteriën in tumorweefsels hebben de laatste jaren steeds meer aandacht gekregen. Banerjee et al. ontdekten dat de microbioomsignatuur verschilde tussen eierstokkankerpatiënten en controles10. Eennoxynatronum sibiricum was geassocieerd met tumorstadium en Methanosarcina vacuolata kan worden gebruikt om eierstokkanker te diagnosticeren11. Naast eierstokkanker is bewezen dat andere kankers, zoals maag-, long-, prostaat-, borst-, baarmoederhals- en baarmoederslijmvlies, geassocieerd zijn met bacteriën12,13,14,15,16,17,18. Poore et al. stelden een nieuwe klasse van microbiële oncologische diagnostiek voor, met een vroeg stadium van kankerscreening19. In dit protocol onderzochten we de verschillen tussen kankerachtige en normale eierstokweefsels door de samenstelling en functie van bacteriën in deze twee weefsels te vergelijken.
Immunohistochemische kleuring en 16S rRNA-gensequencing werden uitgevoerd om de aanwezigheid van bacteriën in de eierstokken te bevestigen. De verschillen en voorspelde functies van de eierstokbacteriën in kankerachtige en niet-kankerachtige eierstokweefsels werden bestudeerd. De resultaten toonden het bestaan van bacteriën in eierstokweefsels. Anoxynatronum sibiricum en Methanosarcina vacuolata waren gerelateerd aan respectievelijk het stadium en de diagnose van eierstokkanker. Zesenveertig significant verschillende KEGG-routes die in beide groepen aanwezig waren, werden vergeleken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door de Medisch Institutionele Ethische Commissie van het Eerste Aangesloten Ziekenhuis van Xi'an Jiaotong University (Nr. XJTUIAF2018LSK-139). Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle ingeschreven patiënten.
1. Criteria voor het invoeren van de kankergroep en de controlegroep
- Voor de kankergroep, inschrijven patiënten die voornamelijk worden gediagnosticeerd met eierstokkanker, en na laparotomie is bewezen dat ze sereuze eierstokkanker hebben door pathologische bevindingen.
- Neem voor de controlegroep patiënten op die voornamelijk zijn gediagnosticeerd met baarmoeder myoma of baarmoederadenoom, zonder enige ovariële aandoening te vertonen, en die hysterectomie en salpingo-oöforectomie hebben ondergaan.
OPMERKING: Deze norm is niet definitief. Patiënten met ziekten die de eierstokken niet aantasten en die hysterectomie en salpingo-oöforectomie ondergaan, kunnen ook worden ingeschreven. - Sluit patiënten uit met een of meer van de volgende criteria:
Zwangere vrouwen of vrouwen die borstvoeding geven.
Het nemen van antibiotica 2 maanden voorafgaand aan de operatie.
Het hebben van koorts of verhoogde ontstekingsmarkers.
Het hebben van ontsteking van welke aard dan ook.
Na neoadjuvante chemotherapie te hebben ondergaan.
2. Verzamel monsters
- Plaats tijdens de operatie de gereseceerde eierstokken in een steriele buis en plaats de buis in vloeibare stikstof voor transport. Vermijd het aanraken van iets anders tijdens de hele procedure.
- Scheid de eierstokken in ongeveer 1 cm dikke weefselmonsters met een nieuw steriel pincet onder een laminaire stroomkast. Bewaar de monsters na scheiding bij -80 °C.
OPMERKING: Alle procedures voor het verzamelen van monsters zijn aseptisch, inclusief het scheiden van de eierstokken.
3. Sequentieer het 16S rRNA-gen
- Extract DNA.
- Voeg 1,2 ml inhibit EX-buffer toe aan een centrifugebuis van 2 ml. Voeg vervolgens 180-220 mg monsters toe aan de buis. Laat het monster volledig mengen (70 °C waterbad gedurende 5 minuten en vervolgens vortex gedurende 15 s).
- Centrifugeer de buis gedurende 1 min bij 600 x g.
- Plaats 550 μL van het supernatant in een nieuwe buis van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 600 x g.
- Breng 400 μL van het supernatant met 30 μL proteïnase K over in een andere buis van 1,5 ml.
- Voeg 400 μL buffer AL toe en gebruik een vortexmixer voor 15 s.
- Incubeer bij 70 °C gedurende 10 min.
- Voeg 400 μL 96-100% alcohol toe. Gebruik een vortex mixer voor 15 s.
- Breng 600 μL mengsel over in een absorptiekolom en centrifugeer gedurende 1 min bij 13700 g. Wissel de onderste buis om. Herhaal deze stap 11 keer.
- Voeg 500 μL buffer AW1 toe, centrifugeer gedurende 1 min bij 13.700 x g en vervang de onderste buis.
- Voeg 500 μL buffer AW2 toe, centrifugeer gedurende 3 minuten bij 13.700 x g en vervang de onderste buis.
- Centrifugeer gedurende 3 min bij 13.700 x g.
- Breng het mengsel over in een nieuwe buis van 1,5 ml, voeg 200 μL buffer-ATE toe, incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en centrifugeer gedurende 1 min bij 13.700 x g.
- Kwaliteitstesten. Gebruik 1% Sepharose gel elektroforese om de kwaliteit te testen. Voeg 400 ng monster, 120 V, 30 minuten toe. Ideaal resultaat: DNA-concentratie: ≥ 10 ng/μL, DNA-zuiverheid: A260/A280 = 1,8-2,0, bruto DNA: ≥ 300 ng.
- Bereid de bibliotheken voor met behulp van een 16S metagenomische sequencingkit volgens het protocol van de fabrikant.
- Voer PCR uit. Kortom, elke PCR-reactie van 25 μL bevat 12,5 ng monster-DNA als input, 12,5 μL 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix en 5 μL van elke primer bij 1 μM.
- Voer PCR uit met behulp van het volgende protocol: een eerste denaturatiestap uitgevoerd bij 95 °C gedurende 3 minuten, gevolgd door 25 cycli van denaturatie (95 °C, 30 s), gloeien (55 °C, 30 s) en extensie (72 °C, 30 s), en een laatste verlenging van 5 minuten bij 72 °C.
- Reinig het PCR-product van de reactiemix met magnetische kralen volgens de instructies van de fabrikant.
- Herhaal stap 3.3.1 en 3.3.2.
- Kwaliteitstesten. Raadpleeg stap 3.2.
- Herhaal stap 3.3.3.
- Kwaliteitstesten. Gebruik 1% Sepharose gel elektroforese om onzuiverheid te testen, een spectrofotometer om de zuiverheid te testen, een fluorometer om de concentratie te testen en een RNA-testkit om de integriteit te testen. Volg het protocol van de fabrikant. Normaliseren en poolen van de bibliotheken; vervolgens sequentie (2 x 300 bp paired-end leesinstelling) met behulp van 600 cyclus V3 standaard flowcellen, die ongeveer 100.000 paired-end 2 x 300 base reads produceren.
OPMERKING: De primersequenties over de volledige lengte: 16S Amplicon polymerasekettingreactie (PCR) Voorwaartse primer: 5' TCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGA GACAG-[CCTACGGGNGGCWGCAG] en 16S Amplicon PCR Reverse primer: 5' GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GACTACHVGGGTATCTAATCC].
4. Analyseer 16S rRNA-gensequencinggegevens
- Filter de onbewerkte reads van elk monster op basis van sequencingkwaliteit met het softwarepakket QIIME 2-20180220.
- Kopieer drie bestanden naar de map: emp-paired-end-sequences_01
één forward.fastq.gz bestand dat de forward sequence leest,
één reverse.fastq.gz bestand dat de omgekeerde volgorde bevat, leest,
één barcodes.fastq.gz bestand dat de bijbehorende barcode leest - Executeren
qiime tools importeren \
--type EMPPairedEndSequences \
--input-path emp-paired-end-sequences_01 \--output-path emp-paired-end-sequences_02.qza
- Kopieer drie bestanden naar de map: emp-paired-end-sequences_01
- Verwijder de primer- en adaptersequenties.
qiime cutadapt trim-paired \
--i-demultiplexed-sequences demultiplexed-seqs_02.qza \
--p-front-f GCTACGGGGGG \
--p-front-r GCTACGGGGGG \
--p-error-rate 0 \
--kwaliteit-cutoff 25 \
--o-trimmed-sequences trimmed-seqs_03.qza \
--breedsprakig - Verkorte reeks leest waarin beide gepaarde eindkwaliteiten lager zijn dan 25. Zie hierboven --quality-cutoff 25
- Analyseer de sequencinggegevens.
- Verzamel sequenties om operationele taxonomische eenheden (OO's) te vormen met een gelijkenis-cutoff bij 97%.
qiime vsearch dereplicate-sequences \
--i-sequences trimmed-seqs_03.qza \
--o-dereplicated-table table_04.qza \
--o-dereplicated-sequences rep-seqs_04.qza
qiime vsearch cluster-features-closed-reference \
--i-table table_04.qza \
--i-sequences rep-seqs_04.qza \
--i-reference-sequences 97_otus.qza \
--p-perc-identiteit 0,97 \
--o-clustered-table-cr-97.qza \
--o-clustered-sequences rep-seqs-cr-97.qza \
--o-unmatched-sequences unmatched-cr-97.qza - Bereken voor de OOTA's de relatieve abundantie in elk monster. Overvloed informatie is in tabel-cr-97.qza
- Verzamel sequenties om operationele taxonomische eenheden (OO's) te vormen met een gelijkenis-cutoff bij 97%.
- Gebruik een native Bayesiaanse classifier, die zich richt op de RDP-trainingsset (versie 9; http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/), om alle sequenties te sorteren. In kaart gebrachte taxoninformatie staat in table-cr-97.qza
- Wijs binnen de gegeven OTU een classificatie toe die de belangrijkste samenhang van de sequenties aan OTU's weerspiegelt. Lijn vervolgens de OTA's uit. Zie table-cr-97.qza en rep-seqs-cr-97.qza
- Voer op basis van de informatie van de steekproefgroep alfadiversiteit uit (inclusief de Chao 1-, ACE-, Shannon-, Simpson- en Evenness-indexen) en de uniFrac-gebaseerde hoofdcoördinatenanalyse (PCoA).
qiime tools exporteren \
--input-pad tabel-cr-97.qza \
--output-pad geëxporteerd-feature-tabel
exported-feature-tabel
qiime diversiteit alfa \
--i-table table-cr-97.qza \
--p-metrische observed_otus \
--o-alpha-diversiteit observed_otus_vector.qza
qiime diversiteit beta \
--i-table table-cr-97.qza \
--p-metrische braycurtis \
--o-afstand-matrix unweighted_unifrac_distance_matrix.qza
5. Voorspel de bacteriële functie
- Om de gerelateerde representatie van de kenmerken van de bacteriën te voorspellen, gebruikt u BugBase21. De OTU-invoertabel voor BugBase wordt voorbereid met behulp van de volgende opdrachten.
biom converteren -i otu_table.biom -o otu_table.txt --naar-tsv
biom convert -i otu_table.txt -o otu_table_json.biom --table-type="OTU table" --to-json
OPMERKING: De voorspelling is gebaseerd op zes fenotypecategorieën (Ward et al. ongepubliceerd) (https://bugbase.cs.umn.edu/): Gramkleuring, zuurstoftolerantie, vermogen om biofilms te vormen, inhoud van mobiele elementen, pathogeniciteit en oxidatieve stresstolerantie. - Voorspel de functionele samenstelling van een metagenoom door PICRUSt met het gebruik van markergengegevens en een database met referentiegenomen22.
make_otu_table.py -i microbiome_97/uclust_ref_picked_otus/test_paired_otus.txt -t /mnt/nas_bioinfo/ref/qiime2_ref/97_otu_taxonomy.txt -o otu_table.biom &
normalize_by_copy_number.py -i otu_table.biom -o normalized_otus.biom
predict_metagenomes.py -i normalized_otus.biom -o metagenome_predictions.biom
categorize_by_function.py -i metagenome_predictions.biom -c "KEGG_Pathways" -l 1 -o picrust_L1.biom
categorize_by_function.py -f -i metagenome_predictions.biom -c KEGG_Pathways -l 1 -o metagenome_predictions. L1.txt - Analyseer de verschillen in functies tussen elke groep met behulp van STAMP23,24. Raadpleeg de citaten om de software te bedienen.
6. Gegevens
- Gebruik statistische software om de significantie van de bevindingen te berekenen. De indicatie van de statistische significantie moet worden vastgesteld op P < 0,05.
- Beoordeel verschillen in leeftijd en pariteit door de t-test van student. Beoordeel verschillen in menopauzale status, geschiedenis van hypertensie en diabetes door de chi-kwadraattest. Beoordeel verschillen in het aantal ovariële bacteriële taxa door de Mann-Whitney U-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Patiënten
In totaal werden 16 gekwalificeerde patiënten geïncludeerd in de studie. De controlegroep omvatte 10 vrouwen met een diagnose van goedaardige baarmoedertumor (onder hen werden 3 patiënten gediagnosticeerd met baarmoeder myoma en 7 patiënten werden gediagnosticeerd met baarmoederadenoom). Ondertussen bevatte de kankergroep 6 vrouwen met een diagnose van sereuze eierstokkanker (onder hen werden 2 patiënten gediagnosticeerd met stadium II en 2 van hen werden gediagnosticeerd met stadium III). De volgende kenmerken vertoonden geen verschillen tussen patiënten in de controlegroep en de kankergroep: leeftijd, menopauzale status, pariteit, voorgeschiedenis van hypertensie en voorgeschiedenis van diabetes(tabel 1).
Tabel 1: Patiëntenstatistieken Klik hier om deze tabel te downloaden.
De rijkdom en verscheidenheid van ovariële bacteriesoorten in beide groepen
De aanwezigheid van bacteriën die immunohistochemische kleuring gebruiken, werd getoond in figuur 1. De alfadiversiteit van de microben werd geanalyseerd als een methode om de rijkdom en verscheidenheid van ovariële bacteriesoorten te detecteren. Het aantal soorten waargenomen in de eierstokkankerweefsels was kleiner dan dat van de controlegroep, zonder significant verschil. De rijkdom (vertegenwoordigd door de Chao 1- en ACE-index) en de diversiteit (vertegenwoordigd door de Shannon-, Simpson- en Evenness-index) van de bacteriesoorten verschilden beide niet significant tussen de kankergroep en de controlegroep(figuur 2).
Figuur 2: 16S rRNA-gensequencing toont verschillen tussen de kanker- en controlegroepen in bacteriële rijkdom en diversiteit. (A) Waargenomen soortenindex (P = 0,06, Mann-Whitney U-test); (B) Chao 1 index (P = 0,06, Mann-Whitney U test); (C) ACE-index (P = 0,06, Mann-Whitney U-test); (D) Shannon index (P = 0,32, Mann-Whitney U test; E. Gelijkmatigheidsindex (P = 0,48, Mann-Whitney U-test); (F) Simpson index (P = 0,46, Mann-Whitney U test). We hebben toestemming gekregen voor herdruk van eerdere uitgevers. Dit cijfer is aangepast van Wang et al.11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Beschrijving van eierstokbacteriën
Diepe sequencing van het V3-V4 16S rRNA-gengebied werd uitgevoerd op alle monsters om een beter begrip van de eierstokbacteriën te verkrijgen. De resultaten toonden aan dat Proteobacteria het meest voorkomende phylum was (67,10% in de controlegroep en 67,20% in de kankergroep), Firmicutes was het tweede meest voorkomende phylum (23,77% in de controlegroep en 23,82% in de kankergroep), en het derde meest voorkomende fylum was Bacteroidetes (3,26% in de controlegroep en 3,41% in de kankergroep). Bij het analyseren van soorten van de controlegroep bestond de hoofdsamenstelling uit Halobacteroides halobios (14,53%), gevolgd door Gemmata obscuriglobus (11,07%) en Methyloprofundus sedimenti (10,69%). Voor de kankergroep was Gemmata obscuriglobus de rijkste in de cluster (13,89%), gevolgd door Halobacteroides halobius (11,99%) en Methyloprofundus sedimenti (11,12%)(figuur 3).
Figuur 3: Relatieve abundantie van phyla (> 1%) en van de top 12 soorten in ovariële monsters. (A) De relatieve abundantie van de phyla (> 1%) in de eierstokken van de patiënten in de controlegroep. (B) De relatieve abundantie van de phyla (> 1%) in de eierstokken van patiënten met eierstokkanker. (C) De relatieve abundanties van de 12 meest voorkomende bacteriesoorten in de eierstokken van de controlepatiënten. (D) De relatieve abundanties van de 12 meest voorkomende bacteriesoorten in de eierstokken van patiënten met eierstokkanker. We hebben toestemming gekregen voor herdruk van eerdere uitgevers. Dit cijfer is aangepast van Wang et al.11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Verschillende samenstellingen van ovariële bacteriën tussen de twee groepen
Een vergelijking van verschillende bacteriële gemeenschappen werd uitgevoerd door PCoA met behulp van PERMANOVA. De resultaten toonden aan dat de bacteriën in de controlegroep verschilden van die in de kankergroep, P < 0,05(figuur 4).
Figuur 4: PCoA detecteert clusters van gemeenschappen en de relatieve abundanties van Anoxynatronum sibiricum en Methanosarcina vacuolata. (A) Gemeenschappen werden geclusterd met behulp van PCoA. PC1 en PC2 zijn uitgezet op de x- en y-as. Het rode blok duidt op een monster in de groep eierstokkanker. De blauwe cirkel geeft een steekproef in de controlegroep aan. De monsters van de eierstokkankergroep werden gescheiden van andere monsters in de controlegroep. (B) Gemeenschappen geclusterd met behulp van PCoA. PC1 en PC2 zijn uitgezet op de x- en y-as. Het rode blok duidt op een monster in de groep eierstokkanker. De blauwe ononderbroken cirkel geeft een monster aan van een patiënt met baarmoeder myoma en de blauwe holle cirkel is gelijk aan een monster van een patiënt met baarmoederadenoomcose. (C) De relatieve abundantie van Anoxynatronum sibiricum (controlegroep: n = 10, kankergroep: n = 6, P = 0,034, Mann-Whitney U-test). (D) De relatieve abundantie van Methanosarcina vacuolata (controlegroep: n = 10, kankergroep: n = 6, P = 0,001, Mann-Whitney U-test). We hebben toestemming gekregen voor herdruk van eerdere uitgevers. Dit cijfer is aangepast van Wang et al.11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Bacteriële samenstelling van de eierstokken bij kanker en controlegroepen vanuit verschillende perspectieven
Een analyse van de bacteriële samenstelling van de eierstokken werd vanuit verschillende perspectieven uitgevoerd om de verschillen in de geïdentificeerde eierstokbacteriën verder te detecteren. In tabel 2werden fylum-, klasse-, orde-, familie-, genus- en soortniveaus overwogen en statistieken zijn in de grafiek opgenomen. In het bijzonder was er een verband tussen de relatieve abundantie van Anoxynatronum sibiricum en het stadium van de tumor, en Methanosarcina vacuolata was een specifiek teken bij het diagnosticeren van eierstokkanker (tabel 2).
Fenotypische conservering van eierstokbacteriën in de twee groepen op basis van voorspelde functies
In de kankergroep was de expressie van genen gerelateerd aan potentieel pathogene en oxidatieve stresstolerante fenotypes verhoogd in vergelijking met die van de controlegroep (Wilcoxon signed-rank test, P =0,02 en P =0,002). Er werd geen significant verschil gevonden tussen de eierstokkanker- en controlegroepen in de volgende aspecten: de fenotypen van aerobe, anaërobe, facultatief anaerobe, grampositieve en gramnegatieve bacteriën; mobiele elementen; en biofilmvorming van de eierstokbacteriën (figuur 5). Zesenveertig varianten KEGG-routes tussen de bacteriën in eierstokken in de kanker- en controlegroepen werden bepaald. De eierstokken in de kankergroep vertoonden 26 verhoogde routes. Onder hen waren de meest verwante trajecten transporteurs. Aan de andere kant vertoonden de bacteriën in eierstokkankerweefsel 20 verminderde routes. De meest relevante functies waren als volgt: secretiesysteem, onbekende functies en tweecomponentensysteem. De rest van de paden zijn weergegeven in figuur 6.
Figuur 1: LPS immunohistochemische expressie in de eierstokken. (A) Controlegroep (10 x). Schaalbalken, 200 μm. (B) Controlegroep (40 x). Schaalstaven, 50 μm. (C) Kankergroep (10x). Schaalstaven, 200 μm. (D) Kankergroep (40 x). Schaalbalken, 50 μm. Pijlen wijzen op LPS-kleuring in het eierstokweefsel. We hebben toestemming gekregen voor herdruk van eerdere uitgevers. Dit cijfer is aangepast van Wang et al.11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Voorspelde metagenomen geanalyseerd door BugBase. De expressie van sommige genen in de kankergroep was verhoogd in vergelijking met die in de controlegroep. Deze genen waren gerelateerd aan potentieel pathogene (Wilcoxon signed-rank test, P = 0,02) en oxidatieve stresstolerante fenotypes van de eierstokken. (Wilcoxon signed-rank test, P = 0,002). We hebben toestemming gekregen voor herdruk van eerdere uitgevers. Dit cijfer is aangepast van Wang et al.11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: PICRUSt analyse van verschillende KEGG pathways tussen de kanker- en controlegroepen. We hebben toestemming gekregen voor herdruk van eerdere uitgevers. Dit cijfer is aangepast van Wang et al.11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 2: Rijkdom (vertegenwoordigd door de Chao 1- en ACE-index) en de diversiteit (vertegenwoordigd door de Shannon-, Simpson- en Evenness-index) van de bacteriesoorten Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eierstokkanker heeft een opmerkelijke invloed op de vruchtbaarheid van vrouwen25. De meeste patiënten met eierstokkanker worden in een laat stadium gediagnosticeerd en de 5-jaarsoverleving is minder dan 30%18. Bevestiging van bacteriën in de abdominale vaste ingewanden, waaronder de lever, pancreas en milt, is gepubliceerd. Het bestaan van bacteriën in het bovenste vrouwelijke voortplantingskanaal treedt op omdat de baarmoederhals niet is ingesloten2,3,4,5. Of eierstokken, die abdominale vaste ingewanden zijn, steriel zijn of niet, is echter nog niet vastgesteld. Daarnaast is ook de vraag of bacteriën in de eierstokken gerelateerd zijn aan eierstokkanker.
De significante verschillen in de bacteriën die we vonden, werden vergeleken tussen verschillende groepen. Alle hierboven genoemde procedures waren strikt kiemvrij, inclusief instrumenten, reagentia, apparatuur en de werking van het hele protocol. Wat nog belangrijker is, we gebruikten eierstokken van patiënten met goedaardige baarmoederziekte als controlegroep om mogelijke besmetting tegen te gaan. In dit protocol kan besmetting echter niet worden vermeden. Dus, aangezien de kankergroep en de controlegroep in dezelfde experimentele omgeving werden geanalyseerd, alleen door de verschillen tussen deze twee groepen te vergelijken, konden we primair bewijs verkrijgen over de microbiologische oorsprong van eierstokkanker.
De bevindingen van bacteriën in eierstokweefsel kunnen een nieuw veld starten dat de bacteriën onderzoekt die eierstokkanker beïnvloeden. Bovendien kan de unieke aanwezigheid en samenstelling van bacteriën in kankerweefsels van de eierstokken de carcinogenese van eierstokkanker en de therapeutische en prognostische doelen van bacteriën sturen. Onder de 46 KEGG-routes trokken functies die verband houden met de biosynthese van antibiotica van de vancomycinegroep bijzondere aandacht. Dit kan verdere behandelingsopties bieden voor eierstokkanker.
Het protocol had echter enkele beperkingen. Ten eerste konden de monsters om ethische redenen niet worden verzameld bij gezonde mensen. De controlegroep bestond uit eierstokken van patiënten met goedaardige baarmoederziekte (waaronder baarmoeder myoma en adenomyose). Ten tweede moet het aantal monsters groter zijn. De beperkte steekproefomvang van het onderzoek kan de nauwkeurigheid van de resultaten belemmeren. Ten derde, hoewel de kankergroep en de controlegroep onder dezelfde omstandigheden waren, waren er geen negatieve of positieve controles. Bovendien kon besmetting niet worden vermeden. Tot op heden bevindt de studie van de eierstokbacteriën bij patiënten met eierstokkanker zich nog in een vroeg stadium. Een grootschaliger onderzoek met meer monsters is nodig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Clinical Research Award van het First Affiliated Hospital van Xi'an Jiaotong University, China (XJTU1AF-2018-017, XJTU1AF-CRF-2019-002), het Major Basic Research Project of Natural Science of Shaanxi Provincial Science and Technology Department (2018JM7073, 2017ZDJC-11), het Key Research and Development Project van Shaanxi Provincial Science and Technology Department (2017ZDXM-SF-068, 2019QYPY-138), het Shaanxi Provincial Collaborative Technology Innovation Project (2 017XT-026, 2018XT-002), en het medisch onderzoeksproject van Xi'an Social Development Guidance Plan (2017117SF /YX011-3). De financiers hadden geen rol in het ontwerp van de studie, het verzamelen en analyseren van gegevens, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.
We bedanken de collega's van de afdeling Gynaecologie van het First Affiliated Hospital van de Xi'an Jiaotong University voor hun bijdragen aan het verzamelen van monsters.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2200 TapeStation Software | Agilgent United States |
||
| AmpliSeq for Illumina Library Prep, Indexes, and Accessories | Illumina | ||
| Image-pro plus 7 | Media Cybernetics | ||
| Leica ASP 300S | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| Leica EG 1150 | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| Leica RM2235 | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| LPS Core monoclonal antibody, clone WN1 222-5 | Hycult Biotech | ||
| Mag-Bind RxnPure Plus magnetic beads | Omega Biotek | M1386-00 | |
| Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit | Omega Biotek | M4029-01 | |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | |
| Silva database | Max Planck Institute for Marine Microbiology and Jacobs University | ||
| the QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | |
| Trimmomatic | Björn Usadel | ||
| ZytoChem Plus (HRP) Anti-Rabbit (DAB) Kit | Zytomed Systems | HRP008DAB-RB |
References
- Manfredo Vieira, S., et al. Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans. Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).
- Geller, L. T., et al. Potential role of intratumor bacteria in mediating tumor resistance to the chemotherapeutic drug gemcitabine. Science. 357 (6356), 1156-1160 (2017).
- Manfredo, V. S., et al. Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans. Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).
- Brunelli, R., et al. Globular structure of human ovulatory cervical mucus. FASEB J. 21 (14), 3872-3876 (2007).
- Chen, C., et al. The microbiota continuum along the female reproductive tract and its relation to uterine-related diseases. Nature Communications. 8 (1), 875 (2017).
- Zervomanolakis, I., et al. Physiology of upward transport in the human female genital tract. Annals of the New York Academy of Sciences. 1101, 1-20 (2007).
- Verstraelen, H., et al. Characterisation of the human uterine microbiome in non-pregnant women through deep sequencing of the V1-2 region of the 16S rRNA gene. PeerJ. 4, 1602 (2016).
- Fang, R. L., et al. Barcoded sequencing reveals diverse intrauterine microbiomes in patients suffering with endometrial polyps. American Journal of Translational Research. 8 (3), 1581-1592 (2016).
- Miles, S. M., Hardy, B. L., Merrell, D. S. Investigation of the microbiota of the reproductive tract in women undergoing a total hysterectomy and bilateral salpingo-oopherectomy. Fertil Steril. 107 (3), 813-820 (2017).
- Banerjee, S., et al.
- Wang, Q., et al. The differential distribution of bacteria between cancerous and noncancerous ovarian tissues in situ. Journal of Ovarian Research. 13 (1), 8 (2020).
- Wang, L., et al. Bacterial overgrowth and diversification of microbiota in gastric cancer. European Journal of Gastroenterology & Hepatology. 28 (3), 261-266 (2016).
- Hosgood, H. D., et al. The potential role of lung microbiota in lung cancer attributed to household coal burning exposures. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 643-651 (2014).
- Kwon, M., Seo, S. S., Kim, M. K., Lee, D. O., Lim, M. C. Compositional and Functional Differences between Microbiota and Cervical Carcinogenesis as Identified by Shotgun Metagenomic Sequencing. Cancers. 11 (3), 309 (2019).
- Urbaniak, C., et al. The Microbiota of Breast Tissue and Its Association with Breast Cancer. Applied and Environmental Microbiology. 82 (16), 5039-5048 (2016).
- Feng, Y., et al. Metagenomic and metatranscriptomic analysis of human prostate microbiota from patients with prostate cancer. BMC Genomics. 20 (1), 146 (2019).
- Walsh, D. M., et al. Postmenopause as a key factor in the composition of the Endometrial Cancer Microbiome (ECbiome). Scientific Reports. 9 (1), 19213 (2019).
- Walther-Antonio, M. R., et al. Potential contribution of the uterine microbiome in the development of endometrial cancer. Genome Medicine. 8 (1), 122 (2016).
- Poore, G. D., et al. Microbiome analyses of blood and tissues suggest cancer diagnostic approach. Nature. 579 (7800), 567-574 (2020).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Ward, T., et al. BugBase predicts organism-level microbiome phenotypes. bioRxiv. , (2017).
- Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
- Langille, M. G. I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814 (2013).
- Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. STAMP: statistical analysis of taxonomic and functional profiles. Bioinformatics. 30 (21), 3123 (2014).
- Leranth, C., Hamori, J. 34;Dark" Purkinje cells of the cerebellar cortex. Acta Biologica Hungarica. 21 (4), 405-419 (1970).
