Summary
توفر هذه الورقة ثلاثة اختبارات سهلة ويمكن الوصول إليها لتقييم استقلاب الدهون في الفئران.
Abstract
تقييم التمثيل الغذائي للدهون هو حجر الزاوية في تقييم وظيفة التمثيل الغذائي، ويعتبر أساسيا لدراسات التمثيل الغذائي في الجسم الحي. الدهون هي فئة من العديد من الجزيئات المختلفة مع العديد من المسارات المشاركة في التوليف والتمثيل الغذائي. هناك حاجة إلى نقطة انطلاق لتقييم الهموستاسي الدهون للتغذية والسمنة البحوث. تصف هذه الورقة ثلاث طرق سهلة ويمكن الوصول إليها تتطلب القليل من الخبرة أو الممارسة لإتقانها ، ويمكن تكييفها من قبل معظم المختبرات لفحص تشوهات التمثيل الغذائي للدهون في الفئران. هذه الطرق هي (1) قياس العديد من جزيئات الدهون في مصل الصيام باستخدام مجموعات تجارية (2) القياس لقدرة على التعامل مع الدهون الغذائية من خلال اختبار التسامح داخل الدهون عن طريق الفم، و (3) تقييم الاستجابة لمجمع الصيدلانية، CL 316،243، في الفئران. معا، ستوفر هذه الطرق نظرة عامة عالية المستوى على قدرة التعامل مع الدهون في الفئران.
Introduction
الكربوهيدرات والدهون هما ركائز رئيسية لعملية التمثيل الغذائي للطاقة. يؤدي التمثيل الغذائي للدهون الشاذة إلى العديد من الأمراض البشرية، بما في ذلك داء السكري من النوع الثاني، وأمراض القلب والأوعية الدموية، وأمراض الكبد الدهنية، والسرطانات. يتم امتصاص الدهون الغذائية ، والدهون الثلاثية بشكل رئيسي ، من خلال الأمعاء في الجهاز اللمفاوي وتدخل الدورة الدموية الوريدية في chylomicrons بالقرب من القلب1. يتم حمل الدهون بواسطة جزيئات البروتين الدهني في مجرى الدم ، حيث يتم تحرير مويتات الأحماض الدهنية من خلال عمل ليباز البروتين الدهني في الأعضاء الطرفية مثل العضلات والأنسجة الدهنية2. يتم مسح الجسيمات المتبقية الغنية بالكوليسترول من الكبد3. وقد استخدمت الفئران على نطاق واسع في المختبرات كنموذج للبحوث لدراسة التمثيل الغذائي للدهون. مع مجموعة أدوات وراثية شاملة متاحة ودورة تربية قصيرة نسبيا ، فهي نموذج قوي لدراسة كيفية امتصاص الدهون وتوليفها واستقلابها.
نظرا لتعقيد عملية التمثيل الغذائي للدهون ، وعادة ما تستخدم دراسات الدهون المتطورة أو دراسات التتبع النظيري لتحديد مجموعات من أنواع الدهون أو التدفقات الأيضية ذات الصلة بالدهون والمصائر4،5. وهذا يخلق تحديا هائلا للباحثين دون معدات متخصصة أو خبرة. في هذه الورقة، نقدم ثلاثة اختبارات يمكن أن تكون بمثابة اختبارات أولية قبل استخدام التقنيات الصعبة تقنيا. وهي إجراءات غير نهائية للفئران ، وبالتالي مفيدة للغاية لتحديد الاختلافات المحتملة في قدرة التعامل مع الدهون وتضييق العمليات المتأثرة.
أولا، يمكن لقياس جزيئات الدهون في مصل الصيام أن يساعد المرء على التأكد من الملف الشخصي العام للدهون في الماوس. يجب صائم الفئران ، لأن العديد من أنواع الدهون ترتفع بعد الوجبات ، ويتأثر مدى الزيادة بشدة بتكوين النظام الغذائي. يمكن قياس العديد من جزيئات الدهون، بما في ذلك الكوليسترول الكلي والدهون الثلاثية والأحماض الدهنية غير الم استرضد (NEFA)، باستخدام عدة تجارية وقارئ لوحة التي يمكن قراءة امتصاص.
ثانيا، يقوم اختبار التسامح داخل الدهون عن طريق الفم بتقييم القدرة على التعامل مع الدهون كأثر صافي للامتصاص والتمثيل الغذائي. يسبب الدهون الداخلية المدارة عن طريق الفم ارتفاعا في مستويات الدهون الثلاثية المتداولة (1-2 ساعة) ، وبعد ذلك تعود مستويات الدهون الثلاثية في المصل إلى المستويات القاعدية (4-6 ساعات). يقدم هذا المقايسة معلومات حول مدى تمكن الماوس من التعامل مع الدهون الخارجية. القلب والكبد والأنسجة الدهنية البنية هي المستهلكين النشطين من الدهون الثلاثية، في حين أن الأنسجة الدهنية البيضاء يخزن كاحتياطي للطاقة. ستؤدي التغييرات في هذه الوظائف إلى اختلافات في نتائج الاختبار.
وأخيرا، يعتبر تعزيز تحلل الدهون لتعبئة الدهون المخزنة استراتيجية محتملة لفقدان الوزن. مستقبل β3-adrenergic مسار الإشارات في الأنسجة الدهنية يلعب دورا هاما في انحلال الدهون الدهون, وعلم الوراثة البشرية قد حددت فقدان وظيفة تعدد الأشكال Trp64Arg في مستقبلات β3-الأدرينالية المرتبطة السمنة6. CL 316,243, محددة وقوية β3-adrenergic مستقبلات ناهض, يحفز تحلل الدهون الأنسجة الدهنية والإفراج عن الجلسرين. تقييم استجابة الماوس لCL 316,243 يمكن أن توفر معلومات قيمة عن تطوير, تحسين, وفهم فعالية المركب.
بشكل جماعي ، يمكن استخدام هذه الاختبارات كشاشة أولية للتغيرات في الحالة الأيضية للدهون للفئران. ويتم اختيارهم لسهولة الوصول إلى الأجهزة والكواشف. مع النتائج المستمدة من هذه المقايسات، يمكن للباحثين تشكيل صورة عامة للياقة الأيضية لحيواناتهم واتخاذ قرار بشأن نهج أكثر تطورا واستهدافا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتم إيواء الحيوانات في ظروف موحدة بعد رعاية الحيوانات والبروتوكولات التجريبية التي وافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه في كلية بايلور للطب (BCM). يتم تغذية الحيوانات بنظام غذائي قياسي أو خاص ، و libitum إعلان الماء ، ويتم الاحتفاظ بها مع دورة نهارية / ليلية لمدة 12 ساعة.
1. قياس الدهون مصل الصيام
- نقل الفئران إلى قفص جديد بعد الساعة 5 مساء وبسرعة مع حرية الوصول إلى الماء، بين عشية وضحاها (مع حوالي 16 ساعة من الصيام قبل التجربة). يضمن الصيام الليلي إفراغا كاملا لمسالك الجهاز الهضمي للفئران.
ملاحظة: تأكل الفئران برازها أثناء الصيام، لذلك لا يمكن لسحب الطعام ضمان صيامها بشكل كاف. - في صباح اليوم التالي، أمسك الماوس من الذيل ووضعه على السطح. سحب بلطف على ذيل الماوس لوضع الماوس في المقيد. ضع ضبط النفس الأنف لإعادة تدريب حركة الماوس في حين لا يزال يسمح الماوس للتنفس. شد مقبض الأنف. مراقبة حركات الصدر للتأكد من أن الحيوان يتنفس بشكل طبيعي وتقليل الوقت الذي يقضيه الفأر في التقييد.
- إجراء شق سطحي (نيك) في الوريد الذيل من الماوس حرة الحركة، ورسم 25 ميكرولتر من الدم من شق في الشعرية الزجاجية (ملء حوالي 1/3 من الشعرية) دون كبح جماح الماوس. بسرعة تفجير الدم في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
- وقف النزيف باستخدام مساحيق ستاستيك، وإعادة ملء الأعلاف في القفص، وتأكد من الفئران تظهر أي علامات الإجهاد.
- أكمل سحب الدم لجميع الفئران.
- السماح للدم لتجلط عن طريق تركها دون عائق في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. تدور عينات الدم المتخثر في 2000 x ز في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في جهاز الطرد الدقيق على مقاعد البدلاء المبردة، ونقل supernatant (المصل) للتحليل.
ملاحظة: يمكن تخزين المصل عند -20 درجة مئوية لعدة أسابيع حتى التحليل. للتخزين على المدى الطويل، والحفاظ على المصل في -70 درجة مئوية. - تحليل كل المستقلب الدهون باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة المقدمة.
2. اختبار التسامح داخل الدهون عن طريق الفم
- بعد الساعة 5 مساء، قم بوزن الفئران لحساب الحجم داخل الدهون الذي سيتم إعطاؤه لهم في اليوم التالي. ثم، نقل الفئران إلى قفص جديد وسريع لهم بين عشية وضحاها (16 ساعة).
- في صباح اليوم التالي، وضع علامة ذيول الفئران الموجودة في قفص واحد للمساعدة في التعرف عليها في خطوات النزيف اللاحقة.
- جعل في الوريد الذيل ورسم 15 ميكرولتر من الدم من شق في الشعيرات الدموية الزجاجية (ملء حوالي 1/5 من الشعرية)، وتفجير الدم بسرعة في أنبوب الطرد الدقيق لT = 0 المصل.
ملاحظة: ليست هناك حاجة لوقف النزيف أثناء الفحص ما لم تظهر الفئران النزيف الزائد. - فئران Gavage 20٪ داخل الدهون باستخدام إبرة غافاج 18G بنسبة 15 ميكرولتر لكل غرام من وزن الجسم، وذلك باستخدام وزن الجسم قبل الصيام. مكدس كل ماوس من قبل 1 دقيقة.
ملاحظة: وزن الحيوان وتحديد حجم إبرة gavage المناسبة. عموما، إبرة gavage قياس 18 مناسبة للفئران >25 غرام، وإبرة gavage قياس 20-22 سيكون أكثر ملاءمة للحيوانات الصغيرة. قف على الفأر، وأمسك الجلد على الكتفين لعقد رأس الحيوان في مكانه. ضع إبرة الغافاج في الفم ثم تقدم بلطف على طول الحنك العلوي ، حتى يتم الوصول إلى المريء. يجب أن يمر الأنبوب دون مقاومة. بمجرد الوصول إلى العمق المناسب ، يمكن إدارة Intralipid ببطء. إزالة بلطف الإبرة التالية نفس الزاوية أثناء إدخال إبرة بعد إدارة Intralipid. إعادة الحيوان إلى القفص ورصد لعلامات التنفس شاقة أو غيرها من الضيق.
ملاحظة: يمكن للباحثين الذين يفتقرون إلى الخبرة مع تقنيات نزيف الفم أو الذيل كومة كل فأر من قبل 2 دقيقة أو حتى لفترة أطول. - سحب الدم في T = 1 و 2 و 3 و 4 و 5 و 6 ساعات: ارسم 15 ميكرولتر من الدم (1/5 شعرية) لكل فأر من خلال نزيف الذيل ، وفجر الدم بسرعة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
- قم بتدفير عينات الدم عند 2000 × غرام في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق في جهاز طرد دقيق. نقل supernatant، بما في ذلك طبقة الدهون العائمة، إلى أنبوب PCR للتخزين. يمكن تخزين الناسخة الفائقة عند -20 درجة مئوية لعدة أسابيع حتى التحليل.
ملاحظة: يجب أن يكون الناتسخة الفائقة البلازما. إذا كانت بعض العينات قد تخثرت بالفعل بحلول وقت الطرد المركزي ، فإنه لا يؤثر على قياس الدهون الثلاثية. - بعد جمع الدم الأخير، وقف النزيف باستخدام مساحيق ستاستيك، إعادة ملء الأعلاف في القفص، وتأكد من الفئران تظهر أي علامات الإجهاد الشديد.
- تحميل 2 ميكرولتر من معيار الدهون الثلاثية وجمع الفلورات في لوحة 96 جيدا.
- إضافة 200 ميكرولتر من كاشف الدهون الثلاثية والسماح للوح حضانة لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية لتطوير اللون.
- قياس الامتصاص في 500 نانومتر مع الطول الموجي المرجعي من 660 نانومتر في قارئ لوحة المختبر، وحساب تركيز العينة.
3. β3 مستقبلات الأدرينالية ناهض CL 316,243 حفز تحلل الدهون المقايسة
- إعداد CL 316,243 كمحلول مخزون من 5 ملغم/مل (50x) في المالحة المعقمة، وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- في الصباح ، وزن الفئران لحساب كمية محلول CL 316243 المخفف اللازم للتجربة. سوف يتلقى الماوس 10 ميكرولتر لكل غرام من وزن الجسم من CL المخفف 316,243، لجرعة نهائية من 1 ملغم/ كجم وزن الجسم.
- نقل الفئران إلى قفص جديد مع حرية الوصول إلى الماء، وبسرعة لهم لمدة 4 ساعات.
- جعل ما يكفي من محلول 1x CL 316,243 من المخزون 50x باستخدام المالحة. التركيز النهائي لل1x CL 316,243 الحل هو 0.1 ملغم/ مل. استخدام المالحة لمجموعة العلاج السيطرة.
- وضع علامة على ذيول الفئران الموجودة في نفس القفص لسهولة التعرف عليها أثناء خطوات النزيف.
- جعل في الوريد الذيل، ورسم 15 ميكرولتر من الدم من شق في الشعيرات الدموية الزجاجية (ملء حوالي 1/5 من الشعيرات الدموية)، وتفجير الدم بسرعة في أنبوب الطرد الدقيق لT = 0 عينة.
ملاحظة: ليست هناك حاجة لوقف النزيف أثناء الفحص ما لم تظهر الفئران النزيف الزائد. - حقن محلول CL 316,243 المخفف (أو التحكم إذا تم تضمينه في التجربة) intraperitoneally بحجم 10 ميكرولتر / غرام من وزن الجسم. مكدس كل ماوس من قبل 1 دقيقة. استخدم 5 فئران كحد أقصى لكل تجربة مدتها 60 دقيقة، أو 10 فئران لفريق من شخصين.
- سحب الدم في T = 5، 15، 30، 60 دقيقة: رسم 15 ميكروغرام من الدم (1/5 الشعيرات الدموية) لكل فأر من خلال نزيف الذيل.
- بعد جمع الدم الأخير، وقف النزيف باستخدام مساحيق ستاستيك، إعادة ملء الأعلاف في القفص، وتأكد من الفئران تظهر أي علامات الإجهاد الشديد.
- تدور عينات الدم في 2000 x ز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في جهاز الطرد المركزي المبردة. نقل supernatant إلى أنبوب PCR للتخزين. يمكن تخزين الناسخة الفائقة عند -20 درجة مئوية لعدة أسابيع حتى التحليل.
- تحميل 1 ميكرولتر من 2x معايير الجلسرين المخففة تسلسليا (0.156, 0.312, 0.625, 1.25, و 2.5 ملغ / مل تركيزات مكافئ Trioleine) وجمعت الفلورات في لوحة 96 جيدا. إضافة 100 ميكرولتر من كاشف الجلسرين مجانا، والسماح للوح حضانة لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية للون لتطوير.
- قياس الامتصاص في 540 نانومتر باستخدام قارئ لوحة المختبر، وحساب تركيز العينة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نظهر مع ثلاثة مقتطفات أن كل مقايسة تقدم معلومات قيمة حول التمثيل الغذائي للدهون الفئران. بالنسبة للفئران الذكور C57BL/6J ، التي تواجه تحديا من ثمانية أسابيع من التغذية الغنية بالدهون (HFD) بدءا من عمر ثمانية أسابيع ، كانت مستويات الكوليسترول الإجمالي مرتفعة بشكل كبير ، في حين أن ثلاثي الدهون في الدم وNEFA لم تكن(الجدول 1)، مما يشير إلى أن الدهون الثلاثية وNEFA في الدم لا ينظمها في الغالب تحدي الدهون الغذائية. وفي الفوج الثاني من الفئران، تم تغذية السلالات الفرعية C57BL/6J وC57BL6/N من C57BL6 بHFD لمدة ثمانية أسابيع، بدءا من عمر ثمانية أسابيع. تمت مقارنة مستويات الدهون الثلاثية في المصل بعد تحدي داخل الدهون عن طريق الفم. وأظهرت النتائج فرقا مذهلا بين 6N و 6J السلالات الفرعية، مع 6J وجود ذروة أعلى بكثير في مستويات الدهون الثلاثية المصل بعد الإدارة داخل الدهون، مما يدل على امتصاص معززة أو إزالة الدهون الثلاثية أبطأ بكثير (الشكل 1). وأخيرا، بالنسبة للفئران C57BL/6J الذكور البالغ من العمر ثمانية أسابيع التي تتغذى على الطعام العادي (NC)، أدى علاج CL 316,243 واحد (1 ملغم/كجم من وزن الجسم) إلى زيادة كبيرة في الجلسرين المصلي. ومع ذلك، أدى المعالجة اليومية داخل الصفاق للفئران مع 1 ملغم/كغ وزن الجسم CL 316,243 لمدة أسبوع واحد إلى رد فعل حاد على CL 316,243، مما يشير إلى تطور المقاومة لCL 3116,263 في تلك الفئران(الشكل 2).
| معلمات المصل | NC | HFD | قيمة P |
| الكوليسترول (ملغم/ ديسيلتر) | 132.7±10.3 | 202.3±8.4 | 0.0002 |
| الدهون الثلاثية (ملغم/ديسيلت) | 91.7±9.1 | 79.3±4.5 | 0.26 |
| الأحماض الدهنية غير المهترة (ملليمول/لتر) | 1.47±0.12 | 1.48±0.08 | 0.73 |
الجدول 1: أنواع الدهون الصيام في الفئران تتغذى على الطعام العادي (NC) أو النظام الغذائي الغني بالدهون (HFD) لمدة ثمانية أسابيع. يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط القيم ± SEM. N = 6 لمجموعة NC، n = 12 لمجموعة HFD. تم تحديد قيمة Pباستخدام اختبار Tللطالب ذو الذيلين.
الشكل 1: مثال على النتائج التي تظهر الفرق في الدهون الثلاثية المصل من السلالات الفرعية C57BL/6 بعد تحدي داخل الدهون عن طريق الفم. يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط القيم ± SEM. N = 5 لكل مجموعة. تم تحديد قيمة Pباستخدام اختبار tللطالب ذو الذيلين في كل نقطة زمنية. * ع <.05 ، ** ع <.01. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مثال على النتائج التي تظهر تطور المقاومة للعلاج CL 316,243 في الفئران C57BL/6J بعد أسبوع واحد من العلاج اليومي CL 316,243. يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط القيم ± SEM. N = 5 لكل مجموعة. تم تحديد قيمة Pباستخدام اختبار tللطالب ذو الذيلين في كل نقطة زمنية. ** ص <.01. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تعمل المقايسات الثلاثة الموصوفة بقوة في المختبر ، مع بعض الاعتبارات الحرجة. الصيام بين عشية وضحاها مطلوب لتحديد مستويات الدهون في مصل الصيام واختبار التسامح داخل الدهون عن طريق الفم. لاختبار التسامح داخل الدهون عن طريق الفم، فمن الأهمية بمكان أن تدور الدم في درجة حرارة الغرفة لتقليل تشكيل طبقة الدهون، وخاصة في 1- و 2 ساعة نقطة زمنية. من المهم عدم تجاهل هذه الطبقة الدهنية إذا كانت تتشكل. تأكد من نقل supernatant مع طبقة الدهون، وماصة بلطف لخلطها معا لتحديد الدهون الثلاثية.
تفسير مستويات الدهون المصل الصيام
وقد ثبت الصيام لخفض مستويات الكولسترول الكلي في الفئران7, في حين تستهلك بشكل مزمن الوجبات الغذائية عالية المحتوى من الدهون يزيد من مستويات الكوليسترول الكلي8. هناك نوعان رئيسيان من الكوليسترول: البروتين الدهني عالي الكثافة -الكوليسترول (HDL-C) والكوليسترول البروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL-C). ويعتبر HDL-C والدهون "جيدة" في البشر. فإنه يحمل الكولسترول وينقله إلى الكبد ليتم مسحها من النظام. LDL-Cs تشكل معظم الكوليسترول في مصل الدم البشري، وأنها يمكن أن تتراكم في الشرايين، مما يؤدي إلى أمراض الشرايين الرئيسية. ومع ذلك، الفئران تفتقر إلى إنزيم مهم، cholesteryl استر نقل البروتين (CETP)9،أن يتوسط تبادل الدهون الثلاثية لالكوليسترول استرified بين HDL ويبوب-البروتيناتالدهنية 10. وهذا يعطي الفئران ملف تعريف جسيمات البروتين الدهني مختلفة تماما، مع HDL كونها الأنواع الرئيسية. ونتيجة لذلك، فإن التغيير في مستويات الكوليسترول في الدم الكلي يعكس في المقام الأول التغيرات في مستويات HDL-C.
في كل من الفئران والبشر، يمكن أن تزيد مستويات الدهون الثلاثية عالية المصل التهاب منخفض الدرجة وقد يضعف وظيفة القلب11،12. ومع ذلك، لا يزيد HFD مستويات الدهون الثلاثية المصل. العوامل الوراثية قد تلعب دورا مهيمنا في مستويات الدهون الثلاثية المصل على شروط التمثيل الغذائي13. NEFA في الدم يمكن استيعابها بشغف واستخدامها من قبل العديد من الأجهزة, قمعها عن طريق الأنسولين والتغذية, وزيادة الادرينالين14. تغذية HFD لا يغير مستوى NEFA المصل، مما يشير إلى جديلة الهرمونية تهيمن على تنظيم مستويات NEFA المصل.
تفسير اختبار إزالة الدهون عن طريق الفم
يتم امتصاص داخل الدهون تدار شفويا من قبل الخلايا الظهارية المعوية ويحمل في جزيئات البروتين الدهني في مجرى الدم، حيث يتم تحريرها واستخدامها من قبل الأعضاء الطرفية. التغيرات في نشاط ليباز البروتين الدهني, امتصاص الدهون الثلاثية الأنسجة الطرفية, والأكسدة سوف تؤثر على ديناميات مستويات الدهون الثلاثية المصل. على سبيل المثال، الخلايا الدهنية البني والبيج تتأكسد بشغف الأحماض الدهنية لإنتاج الحرارة. التعرض للبرد يزيد بشكل كبير من نشاط الخلايا الدهنية البني والبيج ، وتسريع إزالة البلازما من الدهون الثلاثية15. كان اختبار إزالة التحمل داخل الدهون الفموية حاسما لتقييم آثار التعرض للبرد على استقلاب الدهون الثلاثية ، كما هو موضح في الورقة15.
تقييم المركبات التي تستهدف انحلال الدهون في الأنسجة الدهنية
يتم نقل تنشيط تحلل الدهون عن طريق الجهاز العصبي المتعاطف وعوامل الغدد الصماء ومختلف الأيض. وقد وضعت العديد من المركبات في التنمية من قبل شركات الأدوية لتعزيز انحلال الدهون الأنسجة الدهنية16,17. تقييم فعاليتها في النماذج الحيوانية قبل السريرية مثل الفئران أمر بالغ الأهمية لتسهيل عملية التنمية. هنا نستخدم ناهض مستقبلات الأدرينالية β3- CL 316,243 ، كمثال لتوضيح كيف يمكننا تقييم كيفية استجابة الماوس للمجمع وما إذا كان الماوس يعرض مستويات مختلفة من الحساسية للمجمع في حالات التمثيل الغذائي المختلفة. كما رأينا في النتائج المثالية ، تسبب الاستخدام المتكرر ل CL 316243 في إزالة الحساسية للعلاج في الفئران. استخدمنا CL 316,243 لتوضيح كيف يمكننا تقييم استجابة الفأر للعلاج الحاد. والأهم من ذلك، يمكن تطبيق هذا المفهوم والتصميم بسهولة على جزيئات أخرى تستهدف التمثيل الغذائي للدهون الدهنية الأنسجة الدهنية.
القيود
وهناك عدد قليل من أنواع الدهون المختارة تقدم معلومات محدودة حول التمثيل الغذائي للدهون في الفئران. نظرا لكمية المصل الصغيرة المتاحة من نزيف الذيل ، يقيس هذا البروتوكول الكوليسترول الكلي فقط ولا يميز HDL-C و LDL-C ، لأن تلك المقايسات تتطلب كميات كبيرة من الدم. لأن الفئران فريدة من نوعها في الطريقة التي تفتقر إلى CETP، والكوليسترول الكلي هو تقريب جيد، وأكثر HDL-C في الفئران لا يشير إلى ملف الدهون صحية، وبالتالي فإن المعلومات الإضافية التي تم الحصول عليها من خلال التمييز بين الكوليسترول في جزيئات البروتين الدهني المختلفة محدودة.
مستويات الدهون في الدم، بما في ذلك مستويات الدهون الثلاثية، وعادة ما تكون تأثير صافي من امتصاص ورحلة من قبل العديد من الأجهزة التي تعمل بطريقة ديناميكية جدا. تفسير النتائج عادة ما يتطلب إعداد تجريبي مع متغير واحد فقط. كما هو مبين في النتيجة المثالية، لا يمكن إجراء استنتاج محدد بشأن امتصاص الدهون أو رحلة بين C57BL/6J وC57BL/6N السلالات الفرعية من الفئران C57BL/6. ومع ذلك ، في دراسة التعرض للبرد المذكورة15، يمكن استخدام المعرفة السابقة والافتراضات في بعض الأحيان لاستبعاد المساهمات من متغيرات أخرى ، وتمكن المؤلفون من تثبيت أنسجة محددة واكتشفوا أن الأنسجة الدهنية البنية ساهمت في إزالة الدهون الثلاثية المعززة.
وأخيرا، التمثيل الغذائي هو عملية ديناميكية. تغيير مستقلب واحد في مسار التمثيل الغذائي الدهون يوفر سوى لقطة من الحالة العامة. ولفهم التدفق، يلزم إجراء دراسة تدفق أكثر تطورا باستخدام تقنيات تتبع النظائر.
وباختصار، فإن البساطة هي قوة وضعف هذا البروتوكول. لا يتم تصميم المقايسات الثلاثة المعروضة هنا لدراسة مسارات استقلاب الدهون المحددة ، ولكن بدلا من ذلك لتوفير فحص أولي أو نقطة انطلاق لتقييم استقلاب الدهون في أبحاث التغذية والسمنة العامة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
ويدعم هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة(NIH)، ومنحة R00-DK114498، ووزارة الزراعة في الولايات المتحدة (وزارة الزراعة الأمريكية)، منحة CRIS: 3092-51000-062 إلى Y. Z.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20% Intralipid | Sigma Aldrich | I141 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes 1ml | Shaotong | B07F1KRMYN | |
| CL 316,243 Hydrate | Sigma-Aldrich | C5976 | |
| Curved Feeding Needles (18 Gauge) | Kent Scientific | FNC-18-2-2 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma | G7793 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT A | Fujifilm Wako Diagnostics | 999-34691 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT B | Fujifilm Wako Diagnostics | 991-34891 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT A | Fujifilm Wako Diagnostics | 995-34791 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT B | Fujifilm Wako Diagnostics | 993-35191 | |
| Matrix Plus Chemistry Reference Kit | Verichem | 9500 | |
| Micro Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-222-168 | |
| Microhematrocrit Capillary Tube, Not Heparanized | Fisher Scientific | 22-362-574 | |
| NEFA STANDARD SOLUTION | Fujifilm Wako Diagnostics | 276-76491 | |
| Phosphate Buffered Saline | Boston Bioproducts | BM-220 | |
| Thermo Scientific Triglycerides Reagent | Fisher Scientific | TR22421 | |
| Total Cholesterol Reagents | Thermo Scientifi | TR13421 |
References
- Dixon, J. B. Mechanisms of chylomicron uptake into lacteals. Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, Suppl 1 52-57 (2010).
- Nuno, J., de Oya, M.
- Williams, K. J. Molecular processes that handle -- and mishandle -- dietary lipids. Journal of Clinical Investigation. 118 (10), 3247-3259 (2008).
- Burla, B., et al. MS-based lipidomics of human blood plasma: a community-initiated position paper to develop accepted guidelines. Journal of Lipid Research. 59 (10), 2001-2017 (2018).
- Umpleby, A. M. Hormone measurement guidelines: Tracing lipid metabolism: the value of stable isotopes. Journal of Endocrinology. 226 (3), 1-10 (2015).
- Mitchell, B. D., et al. A paired sibling analysis of the beta-3 adrenergic receptor and obesity in Mexican Americans. Journal of Clinical Investigation. 101 (3), 584-587 (1998).
- Mahoney, L. B., Denny, C. A., Seyfried, T. N. Caloric restriction in C57BL/6J mice mimics therapeutic fasting in humans. Lipids in Health and Disease. 5, 13 (2006).
- Hayek, T., et al. Dietary fat increases high density lipoprotein (HDL) levels both by increasing the transport rates and decreasing the fractional catabolic rates of HDL cholesterol ester and apolipoprotein (Apo) A-I. Presentation of a new animal model and mechanistic studies in human Apo A-I transgenic and control mice. Journal of Clinical Investigation. 91 (4), 1665-1671 (1993).
- Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats. Comparative Biochemistry and Physiology - Part B: Biochemistry & Molecular Biology. 135 (2), 219-229 (2003).
- Tall, A. R. Functions of cholesterol ester transfer protein and relationship to coronary artery disease risk. Journal of Clinical Lipidology. 4 (5), 389-393 (2010).
- Singh, A. K., Singh, R. Triglyceride and cardiovascular risk: A critical appraisal. Indian Journal of Endocrinology and Metabolism. 20 (4), 418-428 (2016).
- Miller, M., et al. Triglycerides and cardiovascular disease: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 123 (20), 2292-2333 (2011).
- Dron, J. S., Hegele, R. A.
- Dole, V. P. A relation between non-esterified fatty acids in plasma and the metabolism of glucose. Journal of Clinical Investigation. 35 (2), 150-154 (1956).
- Bartelt, A., et al. Brown adipose tissue activity controls triglyceride clearance. Nature Medicine. 17 (2), 200-205 (2011).
- de Souza, C. J., Burkey, B. F. Beta 3-adrenoceptor agonists as anti-diabetic and anti-obesity drugs in humans. Current Pharmaceutical Design. 7 (14), 1433-1449 (2001).
- Braun, K., Oeckl, J., Westermeier, J., Li, Y., Klingenspor, M. Non-adrenergic control of lipolysis and thermogenesis in adipose tissues. Journal of Experimental Biology. 221, Pt Suppl 1 (2018).
