Summary
מאמר זה מספק שלוש גישות קלות ונגישות להערכת חילוף החומרים של השומנים בעכברים.
Abstract
הערכת חילוף החומרים של השומנים היא אבן יסוד בהערכת תפקוד חילוף החומרים, והיא נחשבת חיונית למחקרי חילוף החומרים של vivo. שומנים הם סוג של מולקולות רבות ושונות עם מסלולים רבים המעורבים בסינתזה שלהם ואת חילוף החומרים. נקודת התחלה להערכת hemostasis שומנים עבור תזונה ומחקר השמנת יתר יש צורך. מאמר זה מתאר שלוש שיטות קלות ונגישות הדורשות מעט מומחיות או תרגול כדי לשלוט, וזה יכול להיות מותאם על ידי רוב המעבדות כדי לסנן עבור חריגות חילוף החומרים השומנים בעכברים. שיטות אלה הן (1) מדידה מספר מולקולות שומנים בסרום צום באמצעות ערכות מסחריות (2) בדיקה ליכולת טיפול שומנים תזונתיים באמצעות בדיקת סובלנות תוך ליפיד אוראלי, ו -(3) הערכת התגובה לתרכובת תרופות, CL 316,243, בעכברים. יחד, שיטות אלה יספקו סקירה ברמה גבוהה של יכולת טיפול בשומנים בעכברים.
Introduction
פחמימות ושומנים הם שני מצעים עיקריים לחילוף חומרים של אנרגיה. חילוף חומרים חריג של שומנים בדם גורם למחלות אנושיות רבות, כולל סוכרת מסוג II, מחלות לב וכלי דם, מחלות כבד שומני וסרטן. שומנים תזונתיים, בעיקר טריגליצרידים, נספגים דרך המעי לתוך מערכת הלימפה ונכנסים למחזור הדם הוורי ב chylomicrons ליד הלב1. שומנים נישאים על ידי חלקיקי ליפופרוטאין במחזור הדם, שם moieties חומצת שומן משוחררים על ידי הפעולה של ליפופרוטאין ליפאז באיברים היקפיים כגון שריר ורקמתשומן 2. שאריות השרידים העשירות בכולסטרול מנוקות על ידי הכבד3. עכברים היו בשימוש נרחב במעבדות כמודל מחקר לחקר חילוף החומרים של השומנים. עם ערכות כלים גנטיות מקיפות זמינות ומחזור רבייה קצר יחסית, הם מודל רב עוצמה לחקר האופן שבו שומנים נספגים, מסונתזים ומטבוליזם.
בשל המורכבות של חילוף החומרים של השומנים, מחקרי lipidomics מתוחכמים או מחקרי מעקב איזוטופיים משמשים בדרך כלל כדי לכמת אוספים של מינים שומנים או שטפים מטבוליים הקשורים שומניםוגורלות 4,5. זה יוצר אתגר עצום לחוקרים ללא ציוד מיוחד או מומחיות. במאמר זה, אנו מציגים שלוש בדיקות שיכולות לשמש מבדיקות ראשוניות לפני שימוש בטכניקות מאתגרות מבחינה טכנית. הם נהלים שאינם סופניים עבור העכברים, ולכן שימושי מאוד לזיהוי הבדלים פוטנציאליים ביכולת טיפול בשומנים וצמצום התהליכים המושפעים.
ראשית, מדידת מולקולות השומנים בסרום בצום יכולה לעזור לוודא את פרופיל השומנים הכללי של העכבר. עכברים צריכים להיות צמים, כי מינים שומנים רבים לעלות לאחר הארוחות, ואת היקף הגידול מושפע מאוד על ידי הרכב הדיאטה. מולקולות שומנים רבים, כולל כולסטרול כולל, טריגליצריד וחומצת שומן לא אסטרית (NEFA), ניתן למדוד באמצעות ערכה מסחרית וקורא לוחות שיכול לקרוא ספיגה.
שנית, בדיקת סובלנות תוך ליפיד אוראלי מעריכה את יכולת הטיפול בשומנים כהשפעה נטו של ספיגה וחילוף חומרים. אינטרליפיד המנוהל בעל פה גורם לעלייה חדה ברמות הטריגליצריד במחזור (1-2 שעות), ולאחר מכן רמות הטריגליצריד בסרום חוזרות לרמות בזאליות (4-6 שעות). זה assay מציע מידע על כמה טוב עכבר יכול להתמודד עם שומנים אקסוגניים. רקמת שומן לב, כבד וחום הם צרכנים פעילים של טריגליצרידים, ואילו רקמת שומן לבנה מאחסנת אותה כמאגר אנרגיה. שינויים בפונקציות אלה יובילו להבדלים בתוצאות הבדיקה.
לבסוף, קידום lipolysis לגייס שומנים מאוחסנים נחשב אסטרטגיה אפשרית לירידה במשקל. מסלול איתות קולטן β3-adrenergic ברקמת השומן ממלא תפקיד חשוב בליפוליזה אדיפוזיט, והגנטיקה האנושית זיהתה פולימורפיזם Trp64Arg אובדן תפקוד ב β3-קולטן adrenergic בקורלציה עם השמנת יתר6. CL 316,243, אגוניסט קולטן β3-adrenergic ספציפי וחזק, מגרה ליפוליזה של רקמת שומן ושחרור של גליסול. הערכה של תגובת העכבר CL 316,243 יכול לספק מידע בעל ערך על הפיתוח, שיפור, והבנה של היעילות של המתחם.
באופן קולקטיבי, בדיקות אלה יכולות לשמש כמסך ראשוני לשינויים במצב חילוף החומרים של השומנים של עכברים. הם נבחרים לנגישות של המכשירים והריגנטים. עם התוצאות הנגזרות מבדים אלה, החוקרים יכולים ליצור תמונה כוללת של הכושר המטבולי של בעלי החיים שלהם ולהחליט על גישות מתוחכמות וממוקדמות יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
בעלי חיים שוכנים בתנאים סטנדרטיים בעקבות טיפול בבעלי חיים ופרוטוקולים ניסיוניים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש במכללת ביילור לרפואה (BCM). בעלי חיים מקבלים תזונה סטנדרטית או מיוחדת, מים ad libitum, ונשמר עם מחזור יום / לילה 12 שעות ביממה.
1. מדידת שומנים בסרום צום
- מעבירים עכברים לכלוב חדש אחרי השעה 17:00 ומהר עם גישה חופשית למים, לילה (עם כ -16 שעות של צום לפני הניסוי). צום הלילה מבטיח ריקון מלא של מערכת העיכול של העכברים.
הערה: עכברים אוכלים את הצואה שלהם במהלך הצום, ולכן גמילה ממזון אינה יכולה להבטיח שהם צמים כראוי. - למחרת בבוקר, לתפוס את העכבר בזנב ולהניח אותו על משטח. משוך לאחור בעדינות על זנב העכבר כדי למקם את העכבר במרסן. הנח את ריסון האף כדי לאמן מחדש את תנועת העכבר תוך מתן אפשרות לעכבר לנשום. הדק את הידית של ריסון האף. נטר את תנועות החזה כדי לוודא שבעל החיים נושם כרגיל ולמזער את הזמן שעכבר מבלה באזיקים.
- לעשות חתך שטחי (ניק) בווריד הזנב של העכבר הנע חופשי, ולמשוך 25 μL של דם מן החתך לתוך נימי זכוכית (מילוי על 1/3 של נימי) מבלי לרסן את העכבר. לפוצץ במהירות את הדם לתוך צינור microcentrifuge.
- להפסיק את הדימום באמצעות אבקות styptic, למלא את ההזנה בכלוב, ולוודא העכברים להראות שום סימנים של מתח.
- להשלים את נסיגת הדם לכל העכברים.
- אפשר לדם להישרש על ידי השארתו ללא הפרעה בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. סובבו את דגימות הדם הקרישו ב-2,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות במיקרוצנטריפוגה בקירור, והעבירו את הסופר-נטינט (סרום) לניתוח.
הערה: סרום ניתן לאחסן ב -20 °C (70 °F) במשך מספר שבועות עד ניתוח. לאחסון לטווח ארוך, יש לשמור על הסרום ב-70°C. - לנתח כל מטבוליט שומנים באמצעות הפרוטוקול שסופק על ידי היצרן.
2. בדיקת סובלנות תוך ליפידית אוראלי
- לאחר השעה 17:00, שקול את העכברים לחישוב הנפח התוך-ליפידי שיינתן להם למחרת. לאחר מכן, להעביר את העכברים לתוך כלוב חדש לצום אותם לילה (16 שעות).
- למחרת בבוקר, סמנו זנבות של העכברים השוכן בכלוב אחד כדי לסייע בזיהוים בשלבי הדימום הבאים.
- לעשות ניק בווריד הזנב ולשאוב 15 μL של דם מן החתך לתוך נימי זכוכית (מילוי על 1/5 של נימי), במהירות לפוצץ את הדם לתוך צינור microcentrifuge עבור T = 0 סרום.
הערה: אין צורך לעצור את הדימום במהלך ההסתה אלא אם כן העכברים מראים דימום עודף. - עכברי Gavage 20% תוך ליפיד באמצעות מחט gavage 18G ביחס של 15 מיקרול לגרם של משקל גוף, באמצעות משקל הגוף טרום הצום. עורמים כל עכבר בדקה אחת.
הערה: שקול את החיה ולקבוע את גודל מחט gavage המתאים. בדרך כלל, מחט gavage 18 מד מתאים לעכברים >25 גרם, ומחט 20-22 מד gavage יהיה מתאים יותר לבעלי חיים קטנים יותר. קשקוש העכבר, אוחז בעור מעבר לכתפיים כדי להחזיק את ראשו של החיה במקומו. מניחים את מחט הגאבג'י בפה ולאחר מכן מתקדמים בעדינות לאורך החיך העליון, עד להגעה לוושט. הצינור צריך לעבור ללא התנגדות. ברגע שמגיעים לעומק הנכון, ניתן לנהל לאט לאט את העומק האינטרליפידי. הסר בעדינות את המחט בעקבות אותה זווית במהלך החדרת מחט לאחר ניהול Intralipid. החזר את החיה לכלוב ולפקח על סימנים של נשימה מאומצת או מצוקה אחרת.
הערה: חוקרים שאינם מנוסים עם gavage או טכניקות דימום זנב או זנב יכול לערום כל עכבר על ידי 2 דקות או אפילו יותר. - משוך דם ב- T = 1, 2, 3, 4, 5 ו- 6 שעות: צייר 15 μL של דם (1/5 נימי) לעכבר באמצעות דימום בזנב, ופוצץ במהירות את הדם לתוך צינור microcentrifuge.
- סובבו את דגימות הדם ב-2,000 על גרם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות במיקרו-צנטריפוגה. העבר את supernatant, כולל שכבת השומן הצפה, לצינור PCR לאחסון. Supernatant ניתן לאחסן ב -20 °C (70 °F) במשך מספר שבועות עד ניתוח.
הערה: סופר-נט צריך להיות פלזמה. אם כמה דגימות כבר קרישה על ידי זמן צנטריפוגה, זה לא משפיע על מדידת טריגליצריד. - לאחר איסוף הדם האחרון, לעצור את הדימום באמצעות אבקות styptic, למלא את ההזנה בכלוב, ולוודא העכברים להראות שום סימנים של מתח קיצוני.
- טען 2 μL של תקן טריגליצריד ואסף supernatants לתוך צלחת 96 טוב.
- הוסף 200 μL של ריאגנט טריגליצריד ולתת את הצלחת לדגור במשך 5 דקות ב 37 °C (77 °F) להתפתחות צבע.
- מדוד את הספיגה ב 500 ננומטר עם אורך גל התייחסות של 660 ננומטר בקורא לוחות מעבדה, ולחשב את ריכוז המדגם.
3. β3 קולטן אדראנג'י אגוניסט CL 316,243 ליפוזיס מגורה
- הכן CL 316,243 כתמיסת מלאי של 5 מ"ג /מ"ל (50x) מלוחים סטריליים, ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- בבוקר, לשקול את העכברים כדי לחשב את כמות CL מדולל 316,243 פתרון הדרוש לניסוי. העכבר יקבל 10 μL לגרם של משקל גוף של CL מדולל 316,243, עבור מנה סופית של 1 מ"ג / קילוגרם משקל גוף.
- מעבירים את העכברים לכלוב חדש עם גישה חופשית למים, ומהר אותם במשך 4 שעות.
- הפוך מספיק 1x CL 316,243 פתרון מתוך 50x מלאי באמצעות מלוחים. הריכוז הסופי של 1x CL 316,243 פתרון הוא 0.1 מ"ג / מ"ל. השתמש מלוחים עבור קבוצת הטיפול בקרה.
- סמן את זנבות העכברים השוכן באותו כלוב לזיהוי קל במהלך שלבי הדימום.
- לעשות ניק בווריד הזנב, ולשאוב 15 μL של דם מן החתך לתוך נימי זכוכית (מילוי על 1/5 של נימי), במהירות לפוצץ את הדם לתוך צינור microcentrifuge עבור T = 0 מדגם.
הערה: אין צורך לעצור את הדימום במהלך ההסתה אלא אם כן העכברים מראים דימום עודף. - הזרקת תמיסה מדוללת CL 316,243 (או שליטה אם כלול בניסוי) תוך-איטרא-אקריטונית בנפח של 10 μL/g משקל גוף. עורמים כל עכבר בדקה אחת. השתמש לכל היותר 5 עכברים עבור כל ניסוי של 60 דקות, או 10 עכברים עבור צוות של שני אנשים.
- להקיז דם ב T = 5, 15, 30, 60 דקות: לצייר 15 μL של דם (1/5 נימי) לכל עכבר דרך דימום הזנב.
- לאחר איסוף הדם האחרון, לעצור את הדימום באמצעות אבקות styptic, למלא את ההזנה בכלוב, ולוודא העכברים להראות שום סימנים של מתח קיצוני.
- ספין דגימות דם ב 2,000 x g ב 4 °C (5 °F) במשך 5 דקות ב microcentrifuge בקירור. העבר את supernatant לצינור PCR לאחסון. ניתן לאחסן את הסופר-נט ב-20 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות עד לניתוח.
- טען 1 μL של 2x תקנים גלילסול מדולל באופן סדרתי (0.156, 0.312, 0.625, 1.25, ו 2.5 מ"ג / מיליליטר טריאולאין שווה ערך) ואסף supernatants לתוך צלחת 96 טוב. הוסף 100 μL של ריאגנט גליצ'רול חינם, ולתת את הצלחת לדגור במשך 5 דקות ב 37 °C (77 °F) עבור הצבע לפתח.
- מדוד את הספיגה ב 540 ננומטר באמצעות קורא לוחות מעבדה, ולחשב את ריכוז המדגם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנו מראים עם שלושה קטעים כי כל מטען מציע מידע בעל ערך על חילוף החומרים של השומנים של העכברים. עבור עכברים זכרים C57BL/6J, מאותגרים על ידי שמונה שבועות של תזונה עתירת שומן (HFD) האכלה החל משמונה שבועות של גיל, רמות הכולסטרול הכולל היו גבוהות באופן משמעותי, בעוד טריגליצריד סרום ו- NEFA לא היו (טבלה 1), דבר המצביע על כך טריגליצריד ו- NEFA בדם אינם מוסדרים בעיקר על ידי אתגר שומן תזונתי. בחבורה השנייה של עכברים, C57BL / 6J ו C57BL6 / N תת-מעצורים של C57BL6 הוזנו HFD במשך שמונה שבועות, החל בגיל שמונה שבועות. רמות הטריגליצריד בסרום שלהם הושוו לאחר אתגר תוך ליפיד אוראלי. התוצאות הראו הבדל בולט בין תת-מעצורי 6N ו-6J, כאשר ל-6J יש שיא גבוה משמעותית ברמות הטריגליצריד בסרום לאחר ניהול תוך-ליפידי, מה שמצביע על ספיגה משופרת או על אישור טריגליצירידים איטי בהרבה (איור 1). לבסוף, עבור עכברי C57BL/6J זכרים בני שמונה שבועות שניזונו מצ'או רגיל (NC), טיפול CL 316,243 יחיד עושה (1 מ"ג/ק"ג משקל גוף) הוביל לעלייה משמעותית בגליצריול בסרום. עם זאת, טיפול יומי תוך-פריטוני של עכברים עם 1 מ"ג/ק"ג CL במשקל גוף 316,243 במשך שבוע הוביל לתגובה קהה ל- CL 316,243, דבר המצביע על התפתחות ההתנגדות ל- CL 3116,263 בעכברים אלה (איור 2).
| פרמטרי סרום | NC | HFD | ערך P |
| כולסטרול (מ"ג/ד"ל) | 132.7±10.3 | 202.3±8.4 | 0.0002 |
| טריגליצריד (מ"ג/ד"ל) | 91.7±9.1 | 79.3±4.5 | 0.26 |
| חומצות שומן לא אסטריות (mmol/L) | 1.47±0.12 | 1.48±0.08 | 0.73 |
טבלה 1: מינים שומנים בצום בעכברים הניזונים מצ'או רגיל (NC) או דיאטה עתירת שומן (HFD) במשך שמונה שבועות. הנתונים מבוטאים כערכים ממוצעים ± SEM. N = 6 עבור קבוצת NC, n = 12 עבור קבוצת HFD. P-ערךנקבע באמצעות דו זנב של סטודנט t-מבחן.
איור 1: דוגמה לתוצאות הממחישות את ההבדל בטריגליצריד בסרום של תת-מעצורי C57BL/6 לאחר אתגר תוך-ליפיד אוראלי. הנתונים מבוטאים כערכים ממוצעים ± SEM. N = 5 עבור כל קבוצה. P-valueנקבע באמצעות מבחן t-סטודנטדו-זנבי בכל נקודת זמן. * p < .05, ** p < .01. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דוגמה לתוצאות הממחישה את התפתחות ההתנגדות לטיפול CL 316,243בעכברים C57BL/6J לאחר שבוע של טיפול CL 316,243 יומי. הנתונים מבוטאים כערכים ממוצעים ± SEM. N = 5 עבור כל קבוצה. P-valueנקבע באמצעות מבחן t-סטודנטדו-זנבי בכל נקודת זמן. ** p < .01. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שלושת הבדיקות המתוארות מתפקדות היטב במעבדה, עם כמה שיקולים קריטיים. צום בן לילה נדרש לקביעת רמות השומנים בסרום הצום ובדיקת סובלנות תוך ליפיד דרך הפה. עבור בדיקת סובלנות תוך ליפיד אוראלי, זה קריטי לסובב את הדם בטמפרטורת החדר כדי למזער את היווצרות שכבת השומן, במיוחד בנקודות זמן של שעה ו 2 שעות; חשוב לא להשליך שכבת שומן זו אם היא נוצרת. הקפידו להעביר את הסופר-נט עם שכבת השומנים, וצרפו בעדינות כדי לערבב אותם יחד לקביעת טריגליצריד.
פרשנות של רמות השומנים בסרום הצום
צום הוכח כדי להוריד את רמות הכולסטרול הכולל בעכברים7, בעוד באופן כרוני צריכת דיאטות תוכן שומן גבוה מגביר את רמות הכולסטרול הכולל8. ישנם שני סוגים עיקריים של כולסטרול: ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה - כולסטרול (HDL-C) וכולסטרול ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL-C). HDL-C נחשב "טוב" שומנים בבני אדם. הוא נושא כולסטרול ומעביר אותו לכבד כדי להיות שטוף מתוך המערכת. LDL-Cs מהווים את רוב הכולסטרול בסרום האנושי, והם יכולים להצטבר בעורקים, מה שמוביל למחלות עורקים עיקריות. עם זאת, עכברים חסרים אנזים חשוב, חלבון העברת אסתר כולסטר (CETP)9, המתווך את חילופי הטריגליצרידים עבור כולסטרול אסטריטרי בין HDL ו apoB-lipoproteins10. זה נותן לעכברים פרופיל חלקיקי ליפופרוטאין שונה לחלוטין, כאשר HDL הוא המין העיקרי. כתוצאה מכך, שינוי ברמות הכולסטרול בסרום הכולל משקף בעיקר שינויים ברמות HDL-C.
הן בעכברים והן בבני אדם, רמות טריגליצריד בסרום גבוהות יכולות להגביר דלקת בדרגה נמוכה ועלולות לפגוע בתפקוד הלב11,12. עם זאת, HFD אינו מגביר את רמות הטריגליצריד בסרום. גורמים גנטיים עשויים לשחק תפקיד דומיננטי ברמות הטריגליצריד בסרום על פני תנאים מטבוליים13. NEFA בדם יכול להיספג בלהט מנוצל על ידי איברים רבים, מדוכא על ידי אינסולין והאכלה, ומוגבר על ידי אפינפרין14. האכלת HFD אינה משנה את רמת ה- NEFA בסרום, דבר המצביע על כך שהסימן ההורמונלי שולט ברגולציה של רמות ה- NEFA בסרום.
פרשנות מבחן אישור תוך ליפיד אוראלי
אינטראליפיד המנוהל בעל פה נספג על ידי תאי האפיתל במעיים ונשא חלקיקי ליפופרוטאין במחזור הדם, שם הוא משוחרר ומשמש על ידי איברים היקפיים. שינויים בפעילות הליפאז של ליפופרוטאין, ספיגת טריגליצרידים של רקמה היקפית וחמצון ישפיעו על הדינמיקה של רמות הטריגליצרידים בסרום. לדוגמה, חום ובז 'adipocytes מתחמצן בלהט חומצות שומן לייצור חום. חשיפה לקור מגדילה באופן משמעותי את פעילות אדיפוציטים חומים ובז ', מאיצה את פינוי הפלזמה של טריגליצרידים15. בדיקת הסיבולת התוך ליפידית האוראלית הייתה חיונית להערכת ההשפעות של חשיפה לקור על חילוף החומרים של הטריגליצריד, כפי שהודגם במאמר15.
הערכה של תרכובות מיקוד ליפוזיס רקמת שומן
הפעלת ליפוזיס מועברת על ידי מערכת העצבים הסימפתטית, גורמים אנדוקריניים, ומטבוליטים שונים. תרכובות רבות הוכנסו לפיתוח על ידי חברות תרופות כדי לקדם ליפוזיזיס רקמתשומן 16,17. הערכת יעילותם במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים כגון עכברים היא קריטית להקלה על תהליך הפיתוח. כאן אנו משתמשים אגוניסט קולטן adrenergic β3, CL 316,243, כדוגמה כדי להמחיש כיצד אנו יכולים להעריך כיצד עכבר מגיב לתרכובת והאם העכבר מציג רמות שונות של רגישות לתרכובת במצבים מטבוליים שונים. כפי שניתן לראות בתוצאות למופת, שימוש חוזר ונשנה ב- CL 316,243 גרם לירידה ב הרגישות לטיפול בעכברים. השתמשנו ב- CL 316,243 כדי להמחיש כיצד אנו יכולים להעריך את תגובת העכבר לטיפול חריף; חשוב מכך, מושג זה ועיצוב ניתן ליישם בקלות על מולקולות אחרות מיקוד חילוף החומרים של רקמת השומן.
מגבלות
כמה מינים שומנים שנבחרו מציעים מידע מוגבל על חילוף החומרים שומנים בעכברים. בשל הכמות הקטנה של סרום זמין מדימום הזנב, פרוטוקול זה מודד רק כולסטרול הכולל ואינו מבחין HDL-C ו LDL-C, כמו בדיקות אלה דורשים כמויות משמעותיות של דם. מכיוון לעכברים ייחודיים באופן שבו הם חסרים את ה- CETP, הכולסטרול הכולל הוא קירוב טוב, ויותר HDL-C בעכברים אינו מצביע על פרופיל שומנים בריא, ולכן המידע הנוסף המתקבל על ידי הבחנה בין הכולסטרול בחלקיקי ליפופרוטאין שונים מוגבל.
רמות השומנים בסרום, כולל רמות הטריגליצריד, הן בדרך כלל השפעה נטו של ספיגה וטיול על ידי איברים רבים הפועלים בצורה דינמית מאוד. פרשנות התוצאות דורשת בדרך כלל התקנה ניסיונית עם משתנה אחד בלבד. כפי שמוצג בתוצאה המופתית, אין מסקנה ספציפית לגבי ספיגת השומנים או טיול יכול להיעשות בין C57BL / 6J ו C57BL / 6N של עכברי C57BL / 6. עם זאת, במחקר חשיפה לקורמצוטט 15, ידע מוקדם ולפעמים הנחות ניתן להשתמש כדי לא לכלול תרומות ממשתנים אחרים, המחברים הצליחו להצמיד לרקמה ספציפית וגילו כי רקמת שומן חומה תרמה לאישור הטריגליצריד המשופר.
לבסוף, חילוף החומרים הוא תהליך דינמי. השינוי של מטבוליט אחד במסלול חילוף החומרים השומנים מספק רק תמונה של המצב הכללי. כדי להבין את הזרימה, נדרש מחקר שטף מתוחכם יותר באמצעות טכניקות מעקב איזוטופים.
לסיכום, הפשטות היא גם הכוח וגם החולשה של פרוטוקול זה. שלוש הבדיקות המוצגות כאן אינן מיועדות לחקר מסלולי חילוף חומרים ספציפיים של שומנים בדם, אלא כדי לספק הקרנה ראשונית או נקודת התחלה להערכת חילוף החומרים של השומנים במחקר תזונה והשמנת יתר כללית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH), מענק R00-DK114498, ומשרד החקלאות של ארצות הברית (USDA), מענק CRIS: 3092-51000-062 ל- Y. Z.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20% Intralipid | Sigma Aldrich | I141 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes 1ml | Shaotong | B07F1KRMYN | |
| CL 316,243 Hydrate | Sigma-Aldrich | C5976 | |
| Curved Feeding Needles (18 Gauge) | Kent Scientific | FNC-18-2-2 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma | G7793 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT A | Fujifilm Wako Diagnostics | 999-34691 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT B | Fujifilm Wako Diagnostics | 991-34891 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT A | Fujifilm Wako Diagnostics | 995-34791 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT B | Fujifilm Wako Diagnostics | 993-35191 | |
| Matrix Plus Chemistry Reference Kit | Verichem | 9500 | |
| Micro Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-222-168 | |
| Microhematrocrit Capillary Tube, Not Heparanized | Fisher Scientific | 22-362-574 | |
| NEFA STANDARD SOLUTION | Fujifilm Wako Diagnostics | 276-76491 | |
| Phosphate Buffered Saline | Boston Bioproducts | BM-220 | |
| Thermo Scientific Triglycerides Reagent | Fisher Scientific | TR22421 | |
| Total Cholesterol Reagents | Thermo Scientifi | TR13421 |
References
- Dixon, J. B. Mechanisms of chylomicron uptake into lacteals. Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, Suppl 1 52-57 (2010).
- Nuno, J., de Oya, M.
- Williams, K. J. Molecular processes that handle -- and mishandle -- dietary lipids. Journal of Clinical Investigation. 118 (10), 3247-3259 (2008).
- Burla, B., et al. MS-based lipidomics of human blood plasma: a community-initiated position paper to develop accepted guidelines. Journal of Lipid Research. 59 (10), 2001-2017 (2018).
- Umpleby, A. M. Hormone measurement guidelines: Tracing lipid metabolism: the value of stable isotopes. Journal of Endocrinology. 226 (3), 1-10 (2015).
- Mitchell, B. D., et al. A paired sibling analysis of the beta-3 adrenergic receptor and obesity in Mexican Americans. Journal of Clinical Investigation. 101 (3), 584-587 (1998).
- Mahoney, L. B., Denny, C. A., Seyfried, T. N. Caloric restriction in C57BL/6J mice mimics therapeutic fasting in humans. Lipids in Health and Disease. 5, 13 (2006).
- Hayek, T., et al. Dietary fat increases high density lipoprotein (HDL) levels both by increasing the transport rates and decreasing the fractional catabolic rates of HDL cholesterol ester and apolipoprotein (Apo) A-I. Presentation of a new animal model and mechanistic studies in human Apo A-I transgenic and control mice. Journal of Clinical Investigation. 91 (4), 1665-1671 (1993).
- Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats. Comparative Biochemistry and Physiology - Part B: Biochemistry & Molecular Biology. 135 (2), 219-229 (2003).
- Tall, A. R. Functions of cholesterol ester transfer protein and relationship to coronary artery disease risk. Journal of Clinical Lipidology. 4 (5), 389-393 (2010).
- Singh, A. K., Singh, R. Triglyceride and cardiovascular risk: A critical appraisal. Indian Journal of Endocrinology and Metabolism. 20 (4), 418-428 (2016).
- Miller, M., et al. Triglycerides and cardiovascular disease: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 123 (20), 2292-2333 (2011).
- Dron, J. S., Hegele, R. A.
- Dole, V. P. A relation between non-esterified fatty acids in plasma and the metabolism of glucose. Journal of Clinical Investigation. 35 (2), 150-154 (1956).
- Bartelt, A., et al. Brown adipose tissue activity controls triglyceride clearance. Nature Medicine. 17 (2), 200-205 (2011).
- de Souza, C. J., Burkey, B. F. Beta 3-adrenoceptor agonists as anti-diabetic and anti-obesity drugs in humans. Current Pharmaceutical Design. 7 (14), 1433-1449 (2001).
- Braun, K., Oeckl, J., Westermeier, J., Li, Y., Klingenspor, M. Non-adrenergic control of lipolysis and thermogenesis in adipose tissues. Journal of Experimental Biology. 221, Pt Suppl 1 (2018).
