Summary
Questo documento fornisce tre saggi facili e accessibili per valutare il metabolismo lipidico nei topi.
Abstract
La valutazione del metabolismo lipidico è una pietra miliare della valutazione della funzione metabolica ed è considerata essenziale per gli studi sul metabolismo in vivo. I lipidi sono una classe di molte molecole diverse con molti percorsi coinvolti nella loro sintesi e metabolismo. È necessario un punto di partenza per valutare l'emostasi lipidica per la ricerca sulla nutrizione e l'obesità. Questo documento descrive tre metodi facili e accessibili che richiedono poca esperienza o pratica per padroneggiare e che possono essere adattati dalla maggior parte dei laboratori per lo screening delle anomalie del metabolismo lipidico nei topi. Questi metodi sono (1) la misurazione di diverse molecole lipidiche sieriche a digiuno utilizzando kit commerciali (2) l'analisi della capacità di manipolazione dei lipidi nella dieta attraverso un test di tolleranza intralipidica orale e (3) la valutazione della risposta a un composto farmaceutico, CL 316.243, nei topi. Insieme, questi metodi forniranno una panoramica di alto livello della capacità di gestione dei lipidi nei topi.
Introduction
Carboidrati e lipidi sono due substrati principali per il metabolismo energetico. Il metabolismo lipidico aberrante provoca molte malattie umane, tra cui il diabete di tipo II, le malattie cardiovascolari, le malattie del fegato grasso e i tumori. I lipidi alimentari, principalmente trigliceridi, vengono assorbiti attraverso l'intestino nel sistema linfatico ed entrano nella circolazione venosa nei chilomicroni vicino al cuore1. I lipidi sono trasportati da particelle di lipoproteine nel flusso sanguigno, dove le parti di acidi grassi sono liberate dall'azione della lipoproteina lipasi negli organi periferici come il muscolo e il tessuto adiposo2. Le restanti particelle residue ricche di colesterolo vengono eliminate dal fegato3. I topi sono stati ampiamente utilizzati nei laboratori come modello di ricerca per studiare il metabolismo dei lipidi. Con set di strumenti genetici completi disponibili e un ciclo riproduttivo relativamente breve, sono un modello potente per studiare come i lipidi vengono assorbiti, sintetizzati e metabolizzati.
A causa della complessità del metabolismo lipidico, sofisticati studi di lipidomica o studi di traccianti isotopici vengono solitamente utilizzati per quantificare collezioni di specie lipidiche o flussi metabolici e destini correlati ai lipidi4,5. Ciò crea una sfida enorme per i ricercatori senza attrezzature o competenze specializzate. In questo documento, presentiamo tre saggi che possono servire come test iniziali prima di utilizzare tecniche tecnicamente impegnative. Sono procedure non terminali per i topi e quindi molto utili per identificare potenziali differenze nella capacità di gestione dei lipidi e restringere i processi interessati.
In primo luogo, misurare le molecole lipidiche sieriche a digiuno può aiutare ad accertare il profilo lipidico complessivo di un topo. I topi dovrebbero essere a digiuno, perché molte specie lipidiche aumentano dopo i pasti e l'entità dell'aumento è fortemente influenzata dalla composizione della dieta. Molte molecole lipidiche, tra cui colesterolo totale, trigliceridi e acido grasso non esterificato (NEFA), possono essere misurate utilizzando un kit commerciale e un lettore di piastre in grado di leggere l'assorbanza.
In secondo luogo, un test di tolleranza intralipidica orale valuta la capacità di manipolazione dei lipidi come effetto netto dell'assorbimento e del metabolismo. Un intralipide somministrato per via orale provoca un picco nei livelli circolanti di trigliceridi (1-2 ore), dopo di che i livelli sierici di trigliceridi ritornano ai livelli basali (4-6 ore). Questo test offre informazioni su quanto bene un topo può gestire i lipidi esogeni. Cuore, fegato e tessuto adiposo bruno sono consumatori attivi di trigliceridi, mentre il tessuto adiposo bianco lo immagazzina come riserva di energia. I cambiamenti in queste funzioni porteranno a differenze nei risultati del test.
Infine, promuovere la lipolisi per mobilitare i lipidi immagazzinati è considerata una possibile strategia per la perdita di peso. La via di segnalazione del recettore β3-adrenergico nel tessuto adiposo svolge un ruolo importante nella lipolisi degli adipociti e la genetica umana ha identificato un polimorfismo di perdita di funzione Trp64Arg nel recettore β3-adrenergico correlato con l'obesità6. CL 316.243, uno specifico e potente agonista del recettore β3-adrenergico, stimola la lipolisi del tessuto adiposo e il rilascio di glicerolo. La valutazione della risposta di un topo a CL 316.243 può fornire preziose informazioni sullo sviluppo, il miglioramento e la comprensione dell'efficacia del composto.
Collettivamente, questi test possono essere utilizzati come schermo iniziale per i cambiamenti nello stato metabolico lipidico dei topi. Sono scelti per l'accessibilità degli strumenti e dei reagenti. Con i risultati derivati da questi test, i ricercatori possono formare un quadro generale dell'idoneità metabolica dei loro animali e decidere approcci più sofisticati e mirati.
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Protocol
Gli animali sono alloggiati in condizioni standardizzate seguendo la cura degli animali e protocolli sperimentali approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee del Baylor College of Medicine (BCM). Gli animali sono nutriti con una dieta standard o speciale, acqua ad libitum, e tenuti con un ciclo giorno / notte di 12 ore.
1. Misurazione dei lipidi sierici a digiuno
- Trasferisci i topi in una nuova gabbia dopo le 17:00 e velocemente con libero accesso all'acqua, durante la notte (con circa 16 ore di digiuno prima dell'esperimento). Il digiuno notturno assicura il completo svuotamento dei tratti gastrointestinali dei topi.
NOTA: I topi mangiano le loro feci durante il digiuno, quindi l'astinenza da cibo non può garantire che siano adeguatamente a digiuno. - La mattina dopo, afferra il topo per la coda e posizionalo su una superficie. Tirare indietro delicatamente la coda del mouse per posizionare il mouse nel freno. Posizionare il sistema di ritenuta del naso per riqualificare il movimento del mouse pur consentendo al mouse di respirare. Stringere la manopola del sistema di ritenuta del naso. Monitora i movimenti del torace per assicurarti che l'animale stia respirando normalmente e ridurre al minimo il tempo che un topo trascorre nei freni.
- Fare un'incisione superficiale (nick) nella vena della coda del topo che si muove liberamente e prelevare 25 μL di sangue dall'incisione in un capillare di vetro (riempiendo circa 1/3 del capillare) senza trattenere il topo. Soffiare rapidamente il sangue in un tubo di microcentrifuga.
- Fermare l'emorragia usando polveri stiptiche, riempire il mangime nella gabbia e assicurarsi che i topi non mostrino segni di stress.
- Completa il prelievo di sangue per tutti i topi.
- Lasciare coagulare il sangue lasciandolo indisturbato a temperatura ambiente per 1 ora. Ruotare i campioni di sangue coagulato a 2.000 x g a 4 °C per 10 minuti in una microcentrifuga refrigerata da banco e trasferire il surnatante (siero) per l'analisi.
NOTA: Il siero può essere conservato a -20 °C per diverse settimane fino all'analisi. Per la conservazione a lungo termine, mantenere il siero a -70 °C. - Analizzare ogni metabolita lipidico utilizzando il protocollo fornito dal produttore.
2. Test di tolleranza intralipide orale
- Dopo le 17:00, pesare i topi per il calcolo del volume intralipidico da dare loro il giorno successivo. Quindi, trasferire i topi in una nuova gabbia e velocitarli durante la notte (16 ore).
- La mattina dopo, segna le code dei topi alloggiati in una gabbia per aiutarli a identificarli nelle successive fasi di sanguinamento.
- Fai un nick nella vena della coda e prendi 15 μL di sangue dall'incisione in un capillare di vetro (riempiendo circa 1/5 del capillare) e soffia rapidamente il sangue in un tubo microcentrifuga per T = 0 siero.
NOTA: Non è necessario interrompere l'emorragia durante il test a meno che i topi non mostrino sanguinamento in eccesso. - Topi Gavage 20% intralipidi utilizzando un ago gavage 18G ad un rapporto di 15 μl per grammo di peso corporeo, utilizzando il peso corporeo pre-digiuno. Impila ogni mouse di 1 minuto.
NOTA: Pesare l'animale e determinare la dimensione appropriata dell'ago del gavage. Generalmente, un ago gavage calibro 18 è appropriato per topi >25 g, e un ago gavage calibro 20-22 sarebbe più appropriato per gli animali più piccoli. Scruff il topo, afferrando la pelle sopra le spalle per tenere la testa dell'animale in posizione. Posizionare l'ago gavage in bocca e poi avanzare delicatamente lungo il palato superiore, fino a raggiungere l'esofago. Il tubo dovrebbe passare senza resistenza. Una volta raggiunta la giusta profondità, l'Intralipid può essere somministrato lentamente. Rimuovere delicatamente l'ago seguendo lo stesso angolo durante l'inserimento dell'ago dopo aver somministrato l'intralipide. Riportare l'animale nella gabbia e monitorare i segni di respiro affannoso o altro disagio.
NOTA: I ricercatori che non sono esperti con tecniche di gavage orale o sanguinamento della coda possono impilare ogni topo di 2 minuti o anche di più. - Prelevare sangue a T = 1, 2, 3, 4, 5 e 6 ore: prelevare 15 μL di sangue (1/5 capillare) per topo attraverso il sanguinamento della coda e soffiare rapidamente il sangue in un tubo di microcentrifuga.
- Ruotare i campioni di sangue a 2.000 x g a temperatura ambiente per 10 minuti in una microcentrifuga. Trasferire il surnatante, incluso lo strato di grasso galleggiante, in un tubo PCR per la conservazione. Il surnatante può essere conservato a -20 °C per diverse settimane fino all'analisi.
NOTA: Il surnatante deve essere plasma. Se alcuni campioni si sono già coagulati al momento della centrifugazione, ciò non influisce sulla misurazione dei trigliceridi. - Dopo l'ultima raccolta di sangue, fermare l'emorragia usando polveri stiptiche, riempire il mangime nella gabbia e assicurarsi che i topi non mostrino segni di stress estremo.
- Caricare 2 μL di trigliceridi standard e raccogliere supernatanti in una piastra a 96 pozzetti.
- Aggiungere 200 μL di reagente trigliceridi e lasciare incubare la piastra per 5 minuti a 37 °C per lo sviluppo del colore.
- Misurare l'assorbanza a 500 nm con una lunghezza d'onda di riferimento di 660 nm in un lettore di piastre da laboratorio e calcolare la concentrazione del campione.
3. β3 Agonista del recettore adrenergico CL 316,243 Test di lipolisi stimolata
- Preparare CL 316.243 come soluzione stock da 5 mg/mL (50x) in soluzione salina sterile e conservare a -20°C fino all'uso.
- Al mattino, pesare i topi per calcolare la quantità di soluzione diluita di CL 316.243 necessaria per l'esperimento. Il topo riceverà 10 μL per grammo di peso corporeo di CL 316.243 diluito, per una dose finale di 1 mg/kg di peso corporeo.
- Trasferisci i topi in una nuova gabbia con libero accesso all'acqua e veloci per 4 ore.
- Produrre abbastanza 1x CL 316,243 soluzione da 50x stock usando soluzione salina. La concentrazione finale di 1 soluzione di CL 316.243 è di 0,1 mg/ml. Utilizzare soluzione salina per il gruppo di trattamento di controllo.
- Segna le code dei topi alloggiati nella stessa gabbia per una facile identificazione durante le fasi di sanguinamento.
- Fai un nick nella vena della coda e prendi 15 μL di sangue dall'incisione in un capillare di vetro (riempiendo circa 1/5 del capillare) e soffia rapidamente il sangue in un tubo di microcentrifuga per T = 0 campione.
NOTA: Non è necessario interrompere l'emorragia durante il test a meno che i topi non mostrino sanguinamento in eccesso. - Iniettare la soluzione diluita di CL 316,243 (o il controllo se incluso nell'esperimento) per via intraperitoneale ad un volume di 10 μL/g di peso corporeo. Impila ogni mouse di 1 minuto. Usa un massimo di 5 topi per ogni esperimento di 60 minuti o 10 topi per un team di due persone.
- Prelevare sangue a T = 5, 15, 30, 60 minuti: prelevare 15 μL di sangue (1/5 capillare) per topo attraverso il sanguinamento della coda.
- Dopo l'ultima raccolta di sangue, fermare l'emorragia usando polveri stiptiche, riempire il mangime nella gabbia e assicurarsi che i topi non mostrino segni di stress estremo.
- Far girare i campioni di sangue a 2.000 x g a 4 °C per 5 minuti in una microcentrifuga refrigerata. Trasferire il surnatante in un tubo PCR per la conservazione. Il surnatante può essere conservato a -20°C per diverse settimane fino all'analisi.
- Caricare 1 μL di 2x standard di glicerolo diluiti in serie (0,156, 0,312, 0,625, 1,25 e 2,5 mg / ml di concentrazioni equivalenti di trioleina) e sovranatanti raccolti in una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 100 μL di reagente di glicerolo libero e lasciare incubare la piastra per 5 minuti a 37 °C affinché il colore si sviluppi.
- Misurare l'assorbanza a 540 nm utilizzando un lettore di piastre da laboratorio e calcolare la concentrazione del campione.
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Representative Results
Mostriamo con tre estratti che ogni test offre preziose informazioni sul metabolismo lipidico dei topi. Per i topi maschi C57BL / 6J, sfidati da otto settimane di alimentazione con dieta ricca di grassi (HFD) a partire da otto settimane di età, i livelli di colesterolo totale erano significativamente elevati, mentre i trigliceridi sierici e neFA non lo erano (Tabella 1), suggerendo che trigliceridi e NEFA nel sangue non sono prevalentemente regolati da una sfida alimentare dei grassi. Nella seconda coorte di topi, i sottotreni C57BL / 6J e C57BL6 / N di C57BL6 sono stati alimentati con HFD per otto settimane, a partire da otto settimane di età. I loro livelli sierici di trigliceridi sono stati confrontati dopo una sfida intralipide orale. I risultati hanno dimostrato una notevole differenza tra i sottostraini 6N e 6J, con 6J che ha un picco significativamente più alto nei livelli sierici di trigliceridi dopo somministrazione intralipide, indicando un assorbimento migliorato o una clearance dei trigliceridi molto più lenta (Figura 1). Infine, per i topi maschi C57BL/6J di otto settimane nutriti con chow normale (NC), un singolo trattamento con CL 316.243 (1 mg / kg di peso corporeo) ha portato ad un aumento significativo del glicerolo sierico. Tuttavia, il pretrattamento intraperitoneale giornaliero di topi con 1 mg/kg di peso corporeo CL 316.243 per una settimana ha portato a una reazione attenuata a CL 316.243, suggerendo lo sviluppo di resistenza a CL 3116.263 in quei topi (Figura 2).
| Parametri del siero | NC | HFD · | Valore P |
| Colesterolo (mg/dL) | 132,7±10,3 | 202,8±3,4 | 0.0002 |
| Trigliceridi (mg/dL) | 91,7±9,1 | 79,3±4,5 | 0.26 |
| Acidi grassi non esterificati (mmol/L) | 1.47±0.12 | 1.48±0.08 | 0.73 |
Tabella 1: Specie lipidiche a digiuno in topi nutriti con chow normale (NC) o dieta ricca di grassi (HFD) per otto settimane. I dati sono espressi come valori medi ± SEM. N = 6 per il gruppo NC, n = 12 per il gruppo HFD. Ilvalore P è stato determinato utilizzando il t-test diStudent a due code.
Figura 1: Un esempio di risultati che dimostrano la differenza nei trigliceridi sierici dei sottofilanti C57BL/6 dopo una sfida intralipide orale. I dati sono espressi come valori medi ± SEM. N = 5 per ciascun gruppo. Ilvalore P è stato determinato utilizzando il t-test dellostudente a due code in ogni punto temporale. * p < .05, ** p < .01. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Un esempio di risultati che dimostrano lo sviluppo della resistenza al trattamento con CL 316.243 nei topi C57BL/6J dopo una settimana di trattamento giornaliero con CL 316.243. I dati sono espressi come valori medi ± SEM. N = 5 per ciascun gruppo. Ilvalore P è stato determinato utilizzando il t-test dellostudente a due code in ogni punto temporale. ** p < .01. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I tre saggi descritti funzionano in modo robusto in laboratorio, con alcune considerazioni critiche. Il digiuno notturno è necessario per determinare i livelli di lipidi sierici a digiuno e il test di tolleranza intralipidica orale. Per il test di tolleranza intralipide orale, è fondamentale far girare il sangue a temperatura ambiente per ridurre al minimo la formazione di uno strato di grasso, specialmente nei punti temporali di 1 e 2 ore; è importante non scartare questo strato di grasso se si forma. Assicurarsi di trasferire il surnatante con lo strato lipidico e pipettare delicatamente per mescolarli insieme per la determinazione dei trigliceridi.
Interpretazione dei livelli sierici di lipidi a digiuno
Il digiuno ha dimostrato di abbassare i livelli di colesterolo totale nei topi7,mentre il consumo cronico di diete ad alto contenuto di grassi aumenta i livelli di colesterolo totale8. Esistono due tipi principali di colesterolo: lipoproteine ad alta densità -colesterolo (HDL-C) e colesterolo lipoproteico a bassa densità (LDL-C). HDL-C è considerato il lipide "buono" negli esseri umani. Trasporta il colesterolo e lo trasporta al fegato per essere espulso dal sistema. Le LDL-C costituiscono la maggior parte del colesterolo nel siero umano e possono accumularsi nelle arterie, portando a importanti malattie delle arterie. Tuttavia, i topi mancano di un enzima importante, la proteina di trasferimento dell'estere colesterile (CETP)9, che media lo scambio di trigliceridi per il colesterolo esterificato tra HDL e apoB-lipoproteine10. Questo dà ai topi un profilo di particelle lipoproteiche completamente diverso, con HDL che è la specie principale. Di conseguenza, un cambiamento nei livelli di colesterolo sierico totale riflette principalmente i cambiamenti nei livelli di HDL-C.
Sia nei topi che nell'uomo, alti livelli sierici di trigliceridi possono aumentare l'infiammazione di basso grado e possono compromettere la funzione cardiaca11,12. Tuttavia, l'HFD non aumenta i livelli sierici di trigliceridi. I fattori genetici possono svolgere un ruolo dominante nei livelli sierici di trigliceridi rispetto alle condizioni metaboliche13. Il NEFA nel sangue può essere avidamente assorbito e utilizzato da molti organi, soppresso dall'insulina e dall'alimentazione e aumentato dall'epinefrina14. L'alimentazione con HFD non modifica il livello sierico di NEFA, suggerendo che il segnale ormonale domina la regolazione dei livelli sierici di NEFA.
Interpretazione del test di clearance intralipide orale
Un intralipide somministrato per via orale viene assorbito dalle cellule epiteliali intestinali e trasportato in particelle di lipoproteine nel flusso sanguigno, dove viene liberato e utilizzato dagli organi periferici. I cambiamenti nell'attività della lipoproteina lipasi, l'assorbimento dei trigliceridi nei tessuti periferici e l'ossidazione influenzeranno la dinamica dei livelli sierici di trigliceridi. Ad esempio, gli adipociti marroni e beige ossidano avidamente gli acidi grassi per la produzione di calore. L'esposizione al freddo aumenta significativamente l'attività degli adipociti marroni e beige, accelerando la clearance plasmatica dei trigliceridi15. Il test di clearance della tolleranza intralipide orale è stato fondamentale per valutare gli effetti dell'esposizione al freddo sul metabolismo dei trigliceridi, come dimostrato nell'articolo15.
Valutazione di composti mirati alla lipolisi del tessuto adiposo
L'attivazione della lipolisi è trasmessa dal sistema nervoso simpatico, dai fattori endocrini e da vari metaboliti. Molti composti sono stati messi in sviluppo dalle aziende farmaceutiche per promuovere la lipolisi del tessuto adiposo16,17. Valutare la loro efficacia in modelli animali pre-clinici come i topi è fondamentale per facilitare il processo di sviluppo. Qui usiamo un agonista del recettore β3-adrenergico, CL 316.243, come esempio per illustrare come possiamo valutare come un topo risponde al composto e se il topo mostra diversi livelli di sensibilità al composto in diversi stati metabolici. Come si è visto nei risultati esemplari, l'uso ripetuto di CL 316.243 ha causato desensibilizzazione al trattamento nei topi. Abbiamo usato CL 316.243 per illustrare come potremmo valutare la risposta di un topo al trattamento acuto; ancora più importante, questo concetto e design possono essere facilmente applicati ad altre molecole che mirano al metabolismo lipidico del tessuto adiposo.
Limitazioni
Alcune specie lipidiche selezionate offrono informazioni limitate sul metabolismo dei lipidi nei topi. A causa della piccola quantità di siero disponibile dal sanguinamento della coda, questo protocollo misura solo il colesterolo totale e non distingue HDL-C e LDL-C, poiché tali test richiedono quantità significative di sangue. Poiché i topi sono unici nel modo in cui mancano del CETP, il colesterolo totale è una buona approssimazione e più HDL-C nei topi non indica un profilo lipidico sano, quindi le informazioni aggiuntive ottenute distinguendo il colesterolo in diverse particelle di lipoproteine sono limitate.
I livelli sierici di lipidi, compresi i livelli di trigliceridi, sono di solito un effetto netto di assorbimento ed escursione da parte di molti organi che agiscono in modo molto dinamico. L'interpretazione dei risultati di solito richiede una configurazione sperimentale con una sola variabile. Come mostrato nel risultato esemplare, nessuna conclusione specifica riguardante l'assorbimento o l'escursione lipidica può essere fatta tra i sottotreni C57BL / 6J e C57BL / 6N dei topi C57BL / 6. Tuttavia, nello studio citato sull'esposizione al freddo15, le conoscenze precedenti e talvolta le ipotesi possono essere utilizzate per escludere contributi da altre variabili, e gli autori sono stati in grado di fissare un tessuto specifico e hanno scoperto che il tessuto adiposo bruno ha contribuito alla maggiore clearance dei trigliceridi.
Infine, il metabolismo è un processo dinamico. Il cambiamento di un metabolita in una via metabolica lipidica fornisce solo un'istantanea dello stato generale. Per comprendere il flusso, è necessario uno studio del flusso più sofisticato che utilizzi tecniche di tracciamento degli isotopi.
In sintesi, la semplicità è sia la potenza che la debolezza di questo protocollo. I tre saggi qui presentati non sono progettati per lo studio di specifiche vie del metabolismo lipidico, ma piuttosto per fornire uno screening iniziale o un punto di partenza per valutare il metabolismo lipidico nella nutrizione generale e nella ricerca sull'obesità.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato dal National Institutes of Health (NIH), grant R00-DK114498, e dal Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti (USDA), grant CRIS: 3092-51000-062 a Y. Z.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20% Intralipid | Sigma Aldrich | I141 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes 1ml | Shaotong | B07F1KRMYN | |
| CL 316,243 Hydrate | Sigma-Aldrich | C5976 | |
| Curved Feeding Needles (18 Gauge) | Kent Scientific | FNC-18-2-2 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma | G7793 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT A | Fujifilm Wako Diagnostics | 999-34691 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT B | Fujifilm Wako Diagnostics | 991-34891 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT A | Fujifilm Wako Diagnostics | 995-34791 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT B | Fujifilm Wako Diagnostics | 993-35191 | |
| Matrix Plus Chemistry Reference Kit | Verichem | 9500 | |
| Micro Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-222-168 | |
| Microhematrocrit Capillary Tube, Not Heparanized | Fisher Scientific | 22-362-574 | |
| NEFA STANDARD SOLUTION | Fujifilm Wako Diagnostics | 276-76491 | |
| Phosphate Buffered Saline | Boston Bioproducts | BM-220 | |
| Thermo Scientific Triglycerides Reagent | Fisher Scientific | TR22421 | |
| Total Cholesterol Reagents | Thermo Scientifi | TR13421 |
References
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