Summary
Detta dokument ger tre enkla och tillgängliga analyser för att bedöma lipidmetabolism hos möss.
Abstract
Att bedöma lipidmetabolism är en hörnsten i utvärderingen av metabolisk funktion, och det anses nödvändigt för in vivo metabolism studier. Lipider är en klass av många olika molekyler med många vägar involverade i deras syntes och ämnesomsättning. En utgångspunkt för utvärdering av lipid hemostas för närings- och fetmaforskning behövs. Detta dokument beskriver tre enkla och tillgängliga metoder som kräver lite expertis eller övning för att behärska, och som kan anpassas av de flesta laboratorier för att screena för lipidmetabolism avvikelser hos möss. Dessa metoder mäter (1) flera fasta serum lipidmolekyler med hjälp av kommersiella kit (2) analys för kost lipidhanteringsförmåga genom ett oralt intralipidtoleranstest och (3) utvärderar svaret på en farmaceutisk förening, CL 316,243, hos möss. Tillsammans kommer dessa metoder att ge en översikt på hög nivå över lipidhanteringsförmåga hos möss.
Introduction
Kolhydrater och lipider är två viktiga substrat för energimetabolism. Avvikande lipidmetabolism resulterar i många mänskliga sjukdomar, inklusive typ II-diabetes, hjärt-kärlsjukdomar, fettleversjukdomar och cancer. Dietlipider, främst triglycerider, absorberas genom tarmarna i lymfsystemet och kommer in i venös cirkulation i chylomicroner nära hjärtat1. Lipider bärs av lipoproteinpartiklar i blodomloppet, där fettsyramoietiesna frigörs genom verkan av lipoproteinlipas vid perifera organ som muskel- och fettvävnad2. De återstående kolesterolrika restpartiklarna rensas av levern3. Möss har använts i stor utsträckning i laboratorier som en forskningsmodell för att studera lipidmetabolism. Med omfattande genetiska verktygsuppsättningar tillgängliga och en relativt kort avelscykel är de en kraftfull modell för att studera hur lipider absorberas, syntetiseras och metaboliseras.
På grund av komplexiteten i lipidmetabolismen används sofistikerade lipidomicsstudier eller isotopiska spårstudier vanligtvis för att kvantifiera samlingar av lipidarter eller lipidrelaterade metaboliska flödet och öden4,5. Detta skapar en enorm utmaning för forskare utan specialiserad utrustning eller expertis. I detta dokument presenterar vi tre analyser som kan fungera som inledande tester innan tekniskt utmanande tekniker används. De är icke-terminala förfaranden för mössen, och därför mycket användbara för att identifiera potentiella skillnader i lipidhanteringskapacitet och begränsa de berörda processerna.
För det första kan mätning av fastande serumlipidmolekyler hjälpa en att fastställa en mus övergripande lipidprofil. Möss bör fastas, eftersom många lipidarter stiger efter måltiderna, och ökningens omfattning påverkas starkt av kostens sammansättning. Många lipidmolekyler, inklusive totalt kolesterol, triglycerid och icke-esterifierad fettsyra (NEFA), kan mätas med hjälp av ett kommersiellt kit och en plattläsare som kan läsa absorbans.
För det andra utvärderar ett oralt intralipidtoleranstest lipidhanteringsförmåga som en nettoeffekt av absorption och metabolism. En orally administrerad intralipid orsakar en spik i cirkulerande triglyceridnivåer (1-2 timmar), varefter serum triglyceridnivåerna återgår till basala nivåer (4-6 timmar). Denna analys ger information om hur väl en mus kan hantera de exogena lipiderna. Hjärta, lever och brun fettvävnad är aktiva konsumenter av triglycerider, medan vit fettvävnad lagrar den som en energireserv. Förändringar i dessa funktioner leder till skillnader i testresultaten.
Slutligen, främja lipolys för att mobilisera lagrade lipider anses vara en möjlig strategi för viktminskning. Den β3-adrenerga receptorn signaleringsväg i fettvävnaden spelar en viktig roll i adipocyte lipolys, och human genetik har identifierat en förlust av funktion polymorfism Trp64Arg i β3-adrenerga receptor korrelerad med fetma6. CL 316,243, en specifik och potent β3-adrenerga receptor agonist, stimulerar fettvävnad lipolys och frisättning av glycerol. Utvärdering av en mus svar på CL 316,243 kan ge värdefull information om utveckling, förbättring, och förståelse av föreningens effektivitet.
Sammantaget kan dessa tester användas som en första skärm för förändringar i mössens lipidmetaboliska tillstånd. De väljs för tillgängligheten av instrumenten och reagenserna. Med resultaten från dessa analyser kan forskare bilda sig en helhetsbild av sina djurs metaboliska kondition och besluta om mer sofistikerade och riktade metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djur inhysas under standardiserade förhållanden efter djurvårds- och försöksprotokoll som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee vid Baylor College of Medicine (BCM). Djur matas en standard eller speciell diet, vatten ad libitum, och hålls med en 12-timmars dag / nattcykel.
1. Mätning av fastande serumlipider
- Överför möss till en ny bur efter 17:00 och snabbt med fri tillgång till vatten, över natten (med cirka 16 timmars fasta före experimentet). Den över natten fasta säkerställer fullständig tömning av mössens mag-tarmkanalen.
OBS: Möss äter sin avföring under fasta, så matuttag kan inte säkerställa att de är tillräckligt fastade. - Nästa morgon, ta tag i musen vid svansen och placera den på en yta. Dra försiktigt tillbaka på musens svans för att placera musen i fasthållningsdelen. Placera nosstödet för att träna om musens rörelse samtidigt som musen kan andas. Dra åt nässtödets ratt. Övervaka bröströrelser för att se till att djuret andas normalt och minimera den tid en mus spenderar i fasthållningsapparater.
- Gör ett ytligt snitt (nick) i svansen på den frirörliga musen och dra 25 μL blod från snittet i en glas kapillär (fyller ca 1/3 av kapillären) utan att hålla musen fastspänd. Blås snabbt blodet i ett mikrocentrifugrör.
- Stoppa blödningen med stypiska pulver, fyll på matningen i buret och se till att mössen inte visar några tecken på stress.
- Slutför bloduttaget för alla möss.
- Låt blodet koagisera genom att lämna det ostört vid rumstemperatur i 1 timme. Snurra de koagulationsblodproverna vid 2 000 x g vid 4 °C i 10 minuter i en kyld bänkskiva mikrocentrifug och överför supernatant (serum) för analys.
OBS: Serum kan förvaras vid –20 °C i flera veckor fram till analys. För långtidslagring, håll serumet på –70°C. - Analysera varje lipidmetabolit med hjälp av tillverkarens medföljande protokoll.
2. Oralt intralipidtoleranstest
- Efter 17:00, väg mössen för beräkningen av intralipidvolymen som ska ges till dem nästa dag. Överför sedan mössen till en ny bur och snabb dem över natten (16 timmar).
- Nästa morgon, markera svansar på mössen inrymda i en bur för att hjälpa till att identifiera dem i de efterföljande blödningsstegen.
- Gör ett hack i svans venen och dra 15 μL blod från snittet i en glas kapillär (fyller ca 1/5 av kapillären), och blås snabbt blodet i ett mikrocentrifugrör för T = 0 serum.
OBS: Det finns inget behov av att stoppa blödningen under analysen om inte mössen visar överskott av blödning. - Gavagemöss 20% intralipid med en 18G gavagenål med ett förhållande på 15 μl per gram kroppsvikt, med hjälp av den försydd kroppsvikten. Stapla varje mus med 1 minut.
OBS: Väg djuret och bestäm lämplig gavagenålstorlek. I allmänhet är en 18 gauge gavage nål lämplig för möss >25 g, och en 20-22 gauge sondmatningsnål skulle vara lämpligare för mindre djur. Scruff musen, greppar huden över axlarna för att hålla djurets huvud på plats. Placera sondagenålen i munnen och för sedan försiktigt fram längs den övre gommen tills matstrupen nås. Röret ska passera utan motstånd. När rätt djup har uppnåtts kan Intralipid långsamt administreras. Ta försiktigt bort nålen i samma vinkel under nålinsättningen efter administrering av Intralipid. Återvänd djuret till buret och övervaka för tecken på mödosam andning eller annan nöd.
OBS: Forskare som är oerfarna med oral sondmatning eller svansblödning tekniker kan stapla varje mus med 2 minuter eller ännu längre. - Dra blod vid T = 1, 2, 3, 4, 5 och 6 timmar: Dra 15 μL blod (1/5 kapillär) per mus genom svansblödning och blås snabbt blodet i ett mikrocentrifugrör.
- Snurra blodproverna vid 2 000 x g vid rumstemperatur i 10 minuter i en mikrocentrifug. Överför supernaten, inklusive det flytande fettskiktet, till ett PCR-rör för lagring. Supernatanten kan förvaras vid –20 °C i flera veckor fram till analys.
OBS: Supernatanten ska vara plasma. Om vissa prover redan har koagulerats vid tidpunkten för centrifugation påverkar det inte triglyceridmätningen. - Efter den senaste blodsamlingen, stoppa blödningen med stypiska pulver, fyll på foderet i buret och se till att mössen inte visar några tecken på extrem stress.
- Ladda 2 μL triglyceridstandard och samla supernatanter i en 96-brunnsplatta.
- Tillsätt 200 μL triglyceridreagens och låt plattan inkubera i 5 minuter vid 37 °C för färgutveckling.
- Mät absorbansen vid 500 nm med en referensvåglängd på 660 nm i en laboratorieplattaläsare och beräkna provets koncentration.
3. β3 Adrenerga receptoragonist CL 316 243 Stimulerad lipolysanalys
- Förbered CL 316 243 som en stamlösning på 5 mg/ml (50x) i steril saltlösning och förvara vid –20°C tills den används.
- På morgonen, väg mössen för att beräkna mängden utspädd CL 316,243-lösning som behövs för experimentet. Musen får 10 μL per gram kroppsvikt av utspädd CL 316 243, för en slutlig dos på 1 mg/kg kroppsvikt.
- Överför mössen till en ny bur med fri tillgång till vatten och snabb dem i 4 timmar.
- Gör tillräckligt med 1x CL 316,243 lösning från 50x lager med saltlösning. Den slutliga koncentrationen av 1x CL 316,243-lösning är 0,1 mg/ml. Använd saltlösning för kontrollbehandlingsgruppen.
- Markera svansarna på mössen som är inrymda i samma bur för enkel identifiering under blödningsstegen.
- Gör ett hack i svans venen och dra 15 μL blod från snittet i en glas kapillär (fyller ca 1/5 av kapillären), och blås snabbt blodet i ett mikrocentrifugrör för T = 0 prov.
OBS: Det finns inget behov av att stoppa blödningen under analysen om inte mössen visar överskott av blödning. - Injicera utspädd CL 316,243-lösning (eller kontrollera om den ingår i försöket) intraperitoneally med en volym av 10 μL/g kroppsvikt. Stapla varje mus med 1 minut. Använd högst 5 möss för varje 60-minuters experiment, eller 10 möss för ett team på två personer.
- Dra blod vid T = 5, 15, 30, 60 minuter: dra 15 μL blod (1/5 kapillär) per mus genom svansblödning.
- Efter den senaste blodsamlingen, stoppa blödningen med stypiska pulver, fyll på foderet i buret och se till att mössen inte visar några tecken på extrem stress.
- Snurra blodproverna vid 2 000 x g vid 4 °C i 5 minuter i en kyld mikrocentrifug. Överför supernaten till ett PCR-rör för lagring. Supernatanten kan förvaras vid –20°C i flera veckor fram till analys.
- Belastning 1 μL 2x seriellt utspädda glycerolstandarder (0,156, 0,312, 0,625, 1,25 och 2,5 mg/ml Trioleine-ekvivalenta koncentrationer) och uppsamlade supernatanter i en 96-brunnsplatta. Tillsätt 100 μL fritt glycerolreagens och låt plattan inkubera i 5 minuter vid 37 °C för att färgen ska utvecklas.
- Mät absorbansen vid 540 nm med hjälp av en laboratorieplattaläsare och beräkna provets koncentration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi visar med tre utdrag att varje analys erbjuder värdefull information om mössens lipidmetabolism. För C57BL/6J manliga möss, utmanade av åtta veckors fettrik kost (HFD) utfodring från åtta veckors ålder, var totala kolesterolnivåer signifikant förhöjda, medan serum triglyycerid och NEFA inte var (Tabell 1), vilket tyder på att triglycerid och NEFA i blodet inte huvudsakligen regleras av en kostfett utmaning. I den andra kohorten av möss matades C57BL/6J och C57BL6/N underträningar av C57BL6 HFD i åtta veckor, med början vid åtta veckors ålder. Deras serum triglycerid nivåer jämfördes efter en muntlig intralipid utmaning. Resultaten visade en slående skillnad mellan 6N och 6J underträning, med 6J har en betydligt högre topp i serum triglycerid nivåer efter intralipid administration, vilket indikerar en förbättrad absorption eller en mycket långsammare triglycerid clearance (Figur 1). Slutligen, för åtta veckor gammal manliga C57BL/6J möss som matas på normal chow (NC), en enda CL 316,243 behandling gör (1 mg/kg kroppsvikt) ledde till en betydande ökning av serum glycerol. Daglig intraperitoneal förbehandling av möss med 1 mg/kg kroppsvikt CL 316,243 under en vecka ledde dock till en trubbig reaktion på CL 316,243, vilket tyder på utvecklingen av resistens mot CL 3116,263 hos dessa möss (Figur 2).
| Serum parametrar | NC | HFD (HFD) | P-värde |
| Kolesterol (mg/dL) | 132.7±10.3 | 202.3±8.4 | 0.0002 |
| Triglycerid (mg/dL) | 91.7±9.1 | 79.3±4.5 | 0.26 |
| Icke-föresmörkta fettsyror (mmol/L) | 1.47±0.12 | 1.48±0.08 | 0.73 |
Tabell 1: Fasta lipidarter hos möss som utfodrats med normal mat (NC) eller fettrik kost (HFD) i åtta veckor. Uppgifterna uttrycks som medelvärden ± SEM. N = 6 för NC-gruppen, n = 12 för HFD-gruppen. P-värdetfastställdes med hjälp av tvåstjärtad elevst-test.
Figur 1: Ett exempel på resultat som visar skillnaden i serum triglycerid av C57BL/6 substrains efter en oral intralipid utmaning. Data uttrycks som medelvärden ± SEM. N = 5 för varje grupp. P-värdetfastställdes med hjälp av tvåstjärtad elevs t-testvid varje tidpunkt. * p < .05, ** p < .01. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Ett exempel på resultat som visar utvecklingen av resistens mot CL 316 243 behandling hos C57BL/6J möss efter en veckas daglig CL 316 243-behandling. Data uttrycks som medelvärden ± SEM. N = 5 för varje grupp. P-värdetfastställdes med hjälp av tvåstjärtad elevs t-testvid varje tidpunkt. ** p < .01. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De tre analyserna beskrev funktionen robust i labbet, med några kritiska överväganden. Fasta över natten krävs för att bestämma faste-serum lipidnivåer och oral intralipidtoleranstest. För oral intralipidtoleranstest är det viktigt att snurra blodet vid rumstemperatur för att minimera bildandet av ett fettskikt, särskilt vid 1- och 2-timmars tidpunkterna; det är viktigt att inte kassera detta fettskikt om det bildas. Se till att överföra supernatanten med lipidskiktet och rör försiktigt för att blanda dem för triglyceridbestämning.
Tolkning av de fasta serum lipidnivåerna
Fasta har visat sig sänka totala kolesterolnivåer hos möss7, medan kroniskt konsumerar fetthalt dieter ökar totala kolesterolnivåer8. Det finns två huvudtyper av kolesterol: high-density lipoprotein -kolesterol (HDL-C) och low-density lipoprotein kolesterol (LDL-C). HDL-C betraktas som den "goda" lipiden hos människor. Den bär kolesterol och transporterar den till levern för att spolas ut ur systemet. LDL-Cs utgör det mesta av kolesterolet i det mänskliga serumet, och de kan byggas upp i artärer, vilket leder till stora arteriella sjukdomar. Möss saknar dock ett viktigt enzym, kolesteryl ester överföring protein (CETP)9, som förmedlar utbytet av triglycerider mot esterifierat kolesterol mellan HDL och apoB-lipoproteiner10. Detta ger möss en helt annan lipoproteinpartikelprofil, där HDL är huvudarten. Som ett resultat återspeglar en förändring av totala serumkolesterolnivåer främst förändringar i HDL-C nivåer.
Hos både möss och människor kan höga serum triglyceridnivåer öka låggradig inflammation och kan försämra hjärtfunktionen11,12. HFD ökar dock inte serum triglyceridnivåerna. Genetiska faktorer kan spela en dominerande roll i serum triglycerid nivåer över metaboliska villkor13. NEFA i blodet kan absorberas och användas av många organ, undertryckas av insulin och utfodring och ökas med adrenalin14. HFD utfodring ändrar inte serum NEFA nivå, vilket tyder på hormonella cue dominerar regleringen av serum NEFA nivåer.
Tolkning av oralt intralipidfrigångstest
En orally administrerad intralipid absorberas av tarmepitela celler och transporteras i lipoproteinpartiklar i blodomloppet, där det frigörs och används av perifera organ. Förändringar i lipoprotein lipas aktivitet, perifera-vävnad triglycerid upptag och oxidation kommer att påverka dynamiken i serum triglycerid nivåer. Till exempel oxiderar bruna och beige adipocyter ivrigt fettsyror för värmeproduktion. Kall exponering ökar signifikant brun och beige adipocytaktivitet, vilket påskyndar plasmafrigången av triglycerider15. Testet för oral intralipidtolerans var avgörande för att utvärdera effekterna av kall exponering på triglyceridmetabolismen, vilket framgår avpapperet 15.
Utvärdering av föreningar som är inriktade på fettvävnad lipolys
Aktivering av lipolys förmedlas av det sympatiska nervsystemet, endokrina faktorer och olika metaboliter. Många föreningar har satts i utveckling av läkemedelsföretag för att främja fettvävnad lipolys16,17. Att bedöma deras effekt i prekliniska djurmodeller som möss är avgörande för att underlätta utvecklingsprocessen. Här använder vi en β3- avisningsreceptor agonist, CL 316,243, som ett exempel för att illustrera hur vi kan bedöma hur en mus svarar på föreningen och om musen visar olika nivåer av känslighet för föreningen i olika metaboliska tillstånd. Som ses i de exemplariska resultaten orsakade upprepad användning av CL 316,243 desensibilisering till behandlingen hos mössen. Vi använde CL 316,243 för att illustrera hur vi kunde bedöma en mus svar på akut behandling; ännu viktigare, detta koncept och design kan enkelt tillämpas på andra molekyler som riktar sig till fettvävnad lipid metabolism.
Begränsningar
Några utvalda lipidarter erbjuder begränsad information om lipidmetabolism hos möss. På grund av den lilla mängden serum som finns tillgängligt från svansblödning mäter detta protokoll endast totalt kolesterol och skiljer inte HDL-C och LDL-C, eftersom dessa analyser kräver betydande mängder blod. Eftersom möss är unika på det sätt de saknar CETP, är totalt kolesterol en bra approximation, och mer HDL-C hos möss indikerar inte en hälsosam lipidprofil, så den ytterligare information som erhålls genom att skilja kolesterolet i olika lipoproteinpartiklar är begränsad.
Serum lipidnivåer, inklusive triglyceridnivåer, är vanligtvis en nettoeffekt av absorption och utflykt av många organ som verkar på ett mycket dynamiskt sätt. Tolkning av resultaten kräver vanligtvis en experimentell inställning med endast en variabel. Som framgår av det föredömliga resultatet kan ingen specifik slutsats göras om lipidabsorptionen eller utflykten mellan C57BL/6J och C57BL/6N-underträning av C57BL/6-möss. Men i den citerade kallexponeringsstudien15kan förkunskaper och ibland antaganden användas för att utesluta bidrag från andra variabler, och författare kunde fästa ner till en specifik vävnad och upptäckte att brun fettvävnad bidrog till den förbättrade triglycerid clearance.
Slutligen är ämnesomsättningen en dynamisk process. Förändringen av en metabolit i en lipidmetabolisk väg ger bara en ögonblicksbild av det övergripande tillståndet. För att förstå flödet krävs en mer sofistikerad flödesstudie med isotopspårningstekniker.
Sammanfattningsvis är enkelheten både kraften och svagheten i detta protokoll. De tre analyser som presenteras här är inte utformade för studier av specifika lipidmetabolismvägar, utan snarare för att ge en första screening eller en utgångspunkt för utvärdering av lipidmetabolism i allmän närings- och fetmaforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av National Institutes of Health (NIH), grant R00-DK114498, och United States Department of Agriculture (USDA), bevilja CRIS: 3092-51000-062 till Y. Z.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20% Intralipid | Sigma Aldrich | I141 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes 1ml | Shaotong | B07F1KRMYN | |
| CL 316,243 Hydrate | Sigma-Aldrich | C5976 | |
| Curved Feeding Needles (18 Gauge) | Kent Scientific | FNC-18-2-2 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma | G7793 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT A | Fujifilm Wako Diagnostics | 999-34691 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT B | Fujifilm Wako Diagnostics | 991-34891 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT A | Fujifilm Wako Diagnostics | 995-34791 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT B | Fujifilm Wako Diagnostics | 993-35191 | |
| Matrix Plus Chemistry Reference Kit | Verichem | 9500 | |
| Micro Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-222-168 | |
| Microhematrocrit Capillary Tube, Not Heparanized | Fisher Scientific | 22-362-574 | |
| NEFA STANDARD SOLUTION | Fujifilm Wako Diagnostics | 276-76491 | |
| Phosphate Buffered Saline | Boston Bioproducts | BM-220 | |
| Thermo Scientific Triglycerides Reagent | Fisher Scientific | TR22421 | |
| Total Cholesterol Reagents | Thermo Scientifi | TR13421 |
References
- Dixon, J. B. Mechanisms of chylomicron uptake into lacteals. Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, Suppl 1 52-57 (2010).
- Nuno, J., de Oya, M.
- Williams, K. J. Molecular processes that handle -- and mishandle -- dietary lipids. Journal of Clinical Investigation. 118 (10), 3247-3259 (2008).
- Burla, B., et al. MS-based lipidomics of human blood plasma: a community-initiated position paper to develop accepted guidelines. Journal of Lipid Research. 59 (10), 2001-2017 (2018).
- Umpleby, A. M. Hormone measurement guidelines: Tracing lipid metabolism: the value of stable isotopes. Journal of Endocrinology. 226 (3), 1-10 (2015).
- Mitchell, B. D., et al. A paired sibling analysis of the beta-3 adrenergic receptor and obesity in Mexican Americans. Journal of Clinical Investigation. 101 (3), 584-587 (1998).
- Mahoney, L. B., Denny, C. A., Seyfried, T. N. Caloric restriction in C57BL/6J mice mimics therapeutic fasting in humans. Lipids in Health and Disease. 5, 13 (2006).
- Hayek, T., et al. Dietary fat increases high density lipoprotein (HDL) levels both by increasing the transport rates and decreasing the fractional catabolic rates of HDL cholesterol ester and apolipoprotein (Apo) A-I. Presentation of a new animal model and mechanistic studies in human Apo A-I transgenic and control mice. Journal of Clinical Investigation. 91 (4), 1665-1671 (1993).
- Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats. Comparative Biochemistry and Physiology - Part B: Biochemistry & Molecular Biology. 135 (2), 219-229 (2003).
- Tall, A. R. Functions of cholesterol ester transfer protein and relationship to coronary artery disease risk. Journal of Clinical Lipidology. 4 (5), 389-393 (2010).
- Singh, A. K., Singh, R. Triglyceride and cardiovascular risk: A critical appraisal. Indian Journal of Endocrinology and Metabolism. 20 (4), 418-428 (2016).
- Miller, M., et al. Triglycerides and cardiovascular disease: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 123 (20), 2292-2333 (2011).
- Dron, J. S., Hegele, R. A.
- Dole, V. P. A relation between non-esterified fatty acids in plasma and the metabolism of glucose. Journal of Clinical Investigation. 35 (2), 150-154 (1956).
- Bartelt, A., et al. Brown adipose tissue activity controls triglyceride clearance. Nature Medicine. 17 (2), 200-205 (2011).
- de Souza, C. J., Burkey, B. F. Beta 3-adrenoceptor agonists as anti-diabetic and anti-obesity drugs in humans. Current Pharmaceutical Design. 7 (14), 1433-1449 (2001).
- Braun, K., Oeckl, J., Westermeier, J., Li, Y., Klingenspor, M. Non-adrenergic control of lipolysis and thermogenesis in adipose tissues. Journal of Experimental Biology. 221, Pt Suppl 1 (2018).
