Summary
이 원고는 마우스의 frarearenal 복부 대어타에 배치 된 카테터를 통해 단일 신장에 표적 전달방법을 설명합니다.
Abstract
신장 연구 분야에서 약물 표적의 효율적인 평가를 위해 증가 되고 특정 신장 노출을 가능하게 하기 위하여 지시된 주사를 위한 필요가 있습니다. 특정 장기에 약물의 축적 불리 하 고 원치 않는 효과 발생할 수 있습니다., 주사의 특성에 따라. 본 명세서의 유출 및/또는 축적을 최소화하기 위해, 본 명세서의 방법은 신장 동맥에 카테터를 삽입하여 신장 동맥 혈류로 제형을 지시하고, 신장 동맥으로 분기하는 바로 아래, 신장 동맥 전체에 걸쳐 제제를 배포하는 것으로.
이 원고는 방법에 대한 자세한 설명뿐만 아니라 도전과 어려움을 제공합니다. 그것은 멸균 조건 하에서 정확도를 요구하는 미세 수술의 이 모형으로 숙련되기 위하여 실험자가 지도합니다. 속도는 허혈을 최소화 하 고 절차를 연습 불리 한 효과 없이 성공적인 주사의 기회를 증가 시킬 것 이다 에 대 한 중요 한. 주입및 재퍼퓨전 과 주입된 부피 사이의 시간을 조절함으로써 다른 장기로유출될 위험이 완화됩니다.
이 기술은 단일 투자 전략에 적합합니다.
Introduction
제약 산업 내의 전임상 연구 분야에서 모델 및 방법 개발은 일상 업무의 일부입니다. 특정 장기에 약물을 직접 하는 능력에 대 한 증가 관심이 있다, 또는 장기의 심지어 별도 구획, 주요 유출/함정 없이, 혈 류를 통해, 다른 조직으로. 이는 다른 질병 부위의 모델에서 약물 표적의 효율적인 평가를 위한 증가 및 특이적 노출을 가능하게 하기 위해 1,2,3,4.
물질을 전달하는 일반적인 방법은 이 원고에 기술된 방법보다 덜 침습적이기 때문에 전신 경로(예를 들어, 꼬리 정맥을 통해)에 의한 것입니다. 그러나, 전신 투여는 폐, 간 및 비장 2,3,5와같은 여과 기관을 통과할 때 의도된 표적 기관보다 다른 조직에서 화합물의 신진 대사 또는 축적위험이 증가한다. 운명적인 조직에 도달하지 않는 것 외에도, 이것은 잠재적으로 주입의 특성에 따라 불리한 및 /또는 원치 않는 효과를 초래할 수 있습니다. 아주 작은 분자만이 여과 기관의 모세혈관을 통과하고 그러므로 표적으로 한 납품은 더 큰 분자 6와함께 일하는 경우에 특히 중요합니다.
주입된 제제의 유출 및/또는 축적을 최소화하기 위해, 본 명세서에서, 본명 술의 방법은 복동맥에 삽입된 카테터를 통해 신장 동맥 혈류로 제형을 지시하여 신장 동맥으로 분기하여 신장동맥에 처음 도달한 신장을 초래한다. 이 유도 투여의 또 다른 장점은 전신 투여 3을통해 달성된 것과 동일한 노출 수준에 도달하기 위해 더 낮은 용량/부피를 사용할 수 있다는 것이다.
투여의 다른 경로는 탐구되었습니다, 예를 들어, 신장 동맥으로 직접 카테터를 통해 주사. 우리의 손에, 이것은 신장에 순환을 복원 하는 실패의 높은 위험을 제시 하기 위해 발견 되었다. 신장 동맥의 매우 작은 직경 (직경약 0.35-0.55 mm)은 절개를 상대적으로 크게 만들고 입구 구멍을 닫을 때 방해 및 / 또는 색전증의 위험을 제기합니다. 신장에 대한 허혈성 관련 손상에 따라 종종 이 방법을 사용할 때 발생하였고, 따라서 신장을 표적으로 하기 위해 더 큰 대어타의 절개를 통해 물질을 주입하여 신장을 성공적으로 표적으로 하는 새로운 방법을 개발했습니다.
또한 신장 동맥에 직접 주사로 작동하는 협착 /혈전증의 도전 그리고 리스크를 명시하는 쥐에서 개발되고 있는 유사한 기술이 있습니다 5. 이것은 마우스에 있는 혈관이 더 작기 때문에 우리의 사실 인정을 지원합니다.
이 원고와 비디오는, 구체적으로, 주사가 부관 대동맥에 삽입 된 카테터를 통해 마우스의 신장 동맥으로 지시 될 수있는 방법을 설명하고, 절차의 일반적인 어려움을 극복하는 방법에 대한 지침뿐만 아니라, 가능한 가장 안전한 방법으로 작동하고 따라서 재현성을 증가.
Protocol
실험 절차는 스웨덴 예테보리의 지역 실험실 동물 윤리 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 수술 전 치료
- 감염을 피하기 위해 멸균 기술을 사용합니다.
- 마취(예: 이소플루란)에서 가능한 가장 무균적인 방식으로 작업하여 수술 부위를 면도하고 제모 크림으로 털을 제거합니다. 크림을 약 1분(피부 화상을 피하기 위해 최대 2분)을 둡니다. 물로 조심스럽게 씻으시다. 이 첫 번째 단계는 바람직하게는 수술 직전에 동물의 추가 냉각을 피하기 위해 수술 1-2 일 전에 수행 할 수 있습니다.
- 건조를 방지하기 위해 눈에 안과 윤활유를 바르십시오.
- 감염을 피하기 위해 수술 부위를 방부제 피부 클렌저로 씻고 수술 직전에 소독제 (클로르헤시딘)로 부위를 닦아냅니다.
- 무 통
- 말단 절차가 아닌 경우 진통제로 동물을 사전 투여하십시오: Buprenorphine (예를 들어, 템게식) 0.05-0.1 mg/kg s.c.)
- 항응고제
- 혈전을 피하기 위해 항응고제를 사용하십시오: 수술 직전 꼬리 정맥을 통해 헤파린의 10 IU (최대 5 mL/kg).
2. 외과 적 절차
- 악기를 자동 복제하고 멸균 카테터를 사용합니다. 비누와 히비스크스크로 긴급하게 씻고 얼굴 마스크, 헤어넷, 멸균 수술 가운과 장갑을 착용하십시오. 두 번째 사람이 동물과 모든 "더러운"작업을 처리해야합니다.
- 마취의 경우 이소플루란을 사용하십시오. 5% 이소플루란으로 마취 상자에 마우스를 배치하여 마취를 유도합니다. 유도 후 반사 신경과 호흡을 확인하여 마취의 깊이를 확인하십시오.
- 수술 중, 마우스에 얼굴 마스크를 배치 2% 이소플루란의 유지 보수 복용량을 제공.
- 수술 대에 넣기 전에 히비스크와 클로레식시딘으로 동물을 씻으시다.
- 마취 후, 마우스를 가열 수술 패드에 놓아 수핀 위치에 놓고 저압 접착 테이프를 사용하여 상반신과 하반신을 패드에 고정시하십시오. 상부 사지가 폐 압축을 방지하기 위해 정상 위치에서 유지되도록 하십시오. 가능하면 전기가 아닌 열원을 사용하십시오.
참고: 우리는 흡입 마취 (예 : 이소플루란)를 사용하여 수술 중에 쉽게 조정할 수 있습니다. - 플라스틱 랩(예: Press'n Seal)으로 마우스를 드레이프하고 수술 현미경으로 작업을 수행합니다.
- 수술 부위에 식염수를 지속적으로 추가하여 건조로부터 조직을 보호하십시오. 이것은 또한 조직을 탄성 유지하는 것을 돕고 수술을 수행하는 동안 손상의 위험을 최소화합니다. 식염수는 동물의 냉각을 피하기 위해 약 37 °C여야합니다.
- 집게와 가위를 가진 중간선 절개로 복강을 여은 후에, 습한, 접힌, 수술 부위를 통해 좋은 전망을 얻기 위하여 옆으로 다른 모든 기관을 밀어 압축을 사용합니다.
- 리트랙터를 사용하여 수술 영역 (5mm 무딘 후크)에 대한 좋은 개요를 갖습니다.
- 대자와 왼쪽 신장을 국소화합니다.
- 두 개의 미세 수술 집게를 사용하여, 부드럽게 대동맥을 청소, 둘 다 cranially (참조 2.10.1) 및 caudally (참조 2.10.2 참조) 신장에서, 주변 조직에서 그 아래에 합자를 배치 (6-0 실크). 구조물을 꼬집지 않도록 주의하십시오. 조직을 부드럽게 스트레칭하고 당겨 서 가능한 한 신장 동맥에 가까워지십시오. 혈관 주변에는 쉽게 발견되지 않는 여러 신경이 있습니다. 손상된 신경이 수술 후 마비 또는 기타 문제를 일으킬 수 있기 때문에 이 점을 염두에 두십시오.
- 신장을 cranially (위) 신장, 주사를 수행하는 동안 순간적으로 혈류를 폐색대 대자를 들어 올리기 위해이 합자를 사용합니다. 이 위치에서, 신장 동맥, 반대 방향으로 대동맥 가지 (창자에, 그림 1참조). 이런 식으로 주입을 밀어 방지 하기 위해, 이 분기 아래 합자를 넣어. 주사 절차를 시작할 때까지 긴장없이 합자를 둡니다.
- Caudally (아래) 신장, 다른 잠재적인 분기를 피하기 위해 신장/신장 동맥에 대동맥 분기 가까이 절개를 배치. 신장에서 caudally 대어는 복부 정맥에 매우 가깝습니다. 정맥을 손상시키지 않도록 주의하십시오.
- 주사
- 모든 합자가 제자리에 있을 때; 먼저 주입된 액을 신장으로 유도하기 위해 혈류를 가리키기 위해 상부 합자 하부 및 둘째를 스트레칭한다.
- 침술 바늘(Ø 0.25 mm)을 사용하여, 카테터(32GA)의 (둥근) 끝을 대오르타로 안내하고 주사 중에 이동하거나 누출되지 않도록 합자에 단일 매듭으로 고정합니다. (그림1). 가위 대신 침술 바늘을 사용하면 용기에 최소한의 엔트리 구멍을 만들 수 있습니다.
- 50 μL의 유체를 주입합니다. 신장은 창백하게 바뀌어야 하며, 이는 주사가 신장을 perfused하고 운명적인 장소에서 끝났음을 나타냅니다.
- 이 시점에서 가능한 두 가지 시나리오가 있습니다.
- 입구 구멍을 닫기 전에 상부 합자의 긴장을 조심스럽게 풀어 신장에 다시 혈액 순환을 주십시오. 이 방법으로 허혈은 개량하지만 주입 된 유체는 잠재적으로 신장 정맥을 통해 신속하게 지울 수 있으므로 충분한 거주 시간을 허용하지 않을 수 있음을 유의하십시오.
- 또는 혈액 흐름을 다시 주지 않고 수술을 진행합니다.
- 상부 합자를 다시 조인 한 후, 카테터를 철회하고 대자를 봉합하고 전체 순환을 돌려줍니다.
- 카테터를 들고 있는 합자를 제거합니다.
- 카테터를 철회하십시오.
- 단일 스티치 (에틸론 11-0, 둥근 바늘)로 엔트리 홀을 봉합합니다.
- 먼저 하부 합자를 느슨하게 한 다음 매우 천천히 상부를 느슨하게합니다. 누출이 있으면 합자를 다시 조여몇 초 동안 기다렸다가 다시 시도하십시오. 허혈성 손상을 피하기 위해 총 허혈 시간을 최대 5-10분까지 유지하십시오.
- 지역을 밀어 내고 맥동을 찾아서 견고성을 테스트하고 신장이 "정상적인 착색"으로 돌아와 재순환이 확립된다는 것을 확신시키는 것을 확인하십시오.
- 스레드를 잘라 대오르타 아래 합자를 제거합니다.
- 압축을 제거하고 내장을 제자리에 다시 밀어 넣습니다. 복강에 식염수를 추가하고 복막 (Vicryl 6-0)을 봉합하여 금속 클립으로 피부를 닫습니다.
- 깨어나기 전에 동물은 0.7-1 mL의 리하이드렉스가 피하된다.
참고: 전체 절차는 잘 훈련된 긴급한 경우 약 30-45분이 소요됩니다.
3. 수술 후 치료
- 동물은 수술 후 2-3 일 동안 케이지의 일부 아래에 가열 패드 (약 38 °C)를 배치하여 따뜻한 환경에서 깨어 날 수 있도록합니다.
- 항성게증(예를 들어, temgesic 0.05-0.1 mg/kg s.c.) 수술 후 3일 동안/일 2-3회 제공.
- 10mL/kg의 Rehydrex s.c.
Representative Results
이 영화는 최고의 비디오 품질로 사람을 제시하는 다른 수술에서 비디오의 혼합이다. 일부 시퀀스는 마우스가 깨어나지 않아야하는 연습 세션에서 촬영되었습니다. 따라서 마우스가 항상 제대로 드레이프되는 것은 아닙니다. 동물이 깨어나야 할 때, 우리는 항상 무균 방식으로 일합니다.
조직학적 분석은 신장 동맥에 직접 주사를 수행하면 신장 손상을 초래한 것으로 나타났습니다, 그 결과로 돌이킬 수없는 허혈과 혈액 흐름의 불충분 한 재순환으로 인해 가능성이(그림 2). 반면 복부 대어를 통한 주사는 허혈성 상해를 일으키지않았다(도 3).
에반스 블루 염료는 대마를 통해 관류가 신장이 첫 번째 도달 기관(도 4)인귀착될 것이라는 점을 시각화하는 데 사용되었다. 다른 장기는 신장 정맥을 통해 통과 될 때까지 파란색으로 설정되지 않았습니다.
우리는 또한 이 방법을 사용하여 중간엽 줄기 세포를 사용하여 인폰드 신장에 주입된 제형의 이식을 증가시킬 수 있음을보여주었다(도 5).
그림 1: 봉합사 및 카테터의 배치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
상단 사진: 왼쪽 신장의 두개골, 첫 번째 합자를 배치 할 위치를 설명. 중간 그림: 카테터 배치 직전 수술 영역에 대한 개요(프로토콜 2.11). 하단 사진: 주사 직전 수술 영역에 대한 개요(프로토콜 2.10)
그림 2: 신장 동맥에 직접 주사. 신장 동맥에 직접 NaCl을 주입하는 연구에서 IHC의 설계 및 IHC의 결과에서 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 대마 투여 후 7일째IHC 결과. IHC는 복부 대동맥을 통해 신장 동맥에 NaCl을 주입한 연구에서 결과, 주사 후 7일 후에 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 에반스 블루 염료의 주입. 에반스 블루 염료의 대어를 통해 주입의 직렬 보기를 보여주는 상단 사진. 에반스 블루 염료의 대동맥을 통해 주사 후 신장의 단면을 보여주는 하단 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 복부 동맥 주입은 오른쪽 신장에 비해 왼쪽 신장에 있는 중간엽 줄기 세포의 이식을 현저하게 증가시다. 인간 골수 유래 중간엽 줄기 세포는 현탁액에서 CM-딜(적색 형광)으로 표지되었다. 100만 개의 레이블이 붙은 MSC가 3마리의 마우스에 있는 복부 동맥을 통해 주입되었습니다. MSD 주입 후 3시간 후, 마우스는 종료되었다. 왼쪽과 오른쪽 신장은 수확하고 냉동 절전을 위해 OCT에 내장되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 방법은 신장 손상을 일으키지 않고 신장에 제형을 전달하는 데 성공했습니다. 그것은 모든 종류의 제형 (예를 들어, 작은 분자, 줄기 /전구 세포, 또는 마이크로베실)의 전달을 위해 사용될 수 있다. 이 방법은 건강한 동물이나 신장 질환 모델에 적용될 수 있다.
도 2 및 도 3에서,히스토로지가 제시된다. 도 2는 관류 후 180분, 도 3은 주입 후 7일 의 역사를 나타낸다. 그 이유는 신장 동맥실험이 180분밖에 걸리지 않았다는 것입니다. 이 새로운 방법으로 만성 손상이 없었음을 확인하기 위해, 우리는 의도적으로 7 일을 기다렸다. n-번호는 작지만 이것은 단지 예일 뿐입니다.
신장을 표적으로 하는 대르타 투여의 이 새로 개발된 방법은 상대적으로 낮은 처리량을 가진 침습적인 방법이며 단 하나 투약 전략에만 적합합니다. 이 방법으로반복 된 도징은 불가능합니다.
합자 배치의 사소한 조정으로이 방법은 아마도 두 신장을 동시적으로 주입하는 데 사용할 수있습니다 5,7. 대동맥 분지를 통해 유출위험이 증가함에 따라 우리는 폐색 합자를 가능한 한 신장에 가깝게 유지하여 왼쪽 신장에만 주사를 맡기기로 결정했습니다. 또한 유닌절제술이나 심지어 동시 신장 허혈 재관류 손상(IRI)과 같은 다른 모델이나 기술 이외에 사용할 수 있습니다. 우리의 의견으로는, IRI3 수술 후 24 시간 만 주사를하는 것은 너무 가혹하고 동물의 회복에 실질적으로 영향을 미칠 것입니다.
마우스의 새로운 긴장을 사용하는 경우, 방법은 어떤 식으로든 조정할 필요가 없도록 항상 그 변형에서 일부 동물에 파일럿 실험을 수행해야합니다. 예를 들어, 일부 균주에서 대어타로부터의 선박 분진은 약간 다른 위치에 배치될 수 있다. 합자의 위치는 제형이 올바른 위치에서 끝나도록 다소 변경될 수 있다.
탈수
복강을 여는 것은 탈수에 대한 큰 위험을 제기. 따라서 수술 후 회복에 좋은 기초를 보장하기 위해 수술 중 및 수술 후 유체 (약 37 °C)를 추가하는 것이 필수적입니다. 우리는 일반적으로 1 mL / 마우스 s.c. 수술 후.
허 혈
장기간 수술 시간 또는 전체 재순환에 도달하지 못하면 허혈이 발생할 수 있습니다. 실제 허혈 시간을 기록하고 신장 (및 허리 다리)에 혈액 순환이 복원되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 끊임없는 훈련과 기술의 상쾌한 것은 언제나 처럼 중요합니다. 절차를 더 빨리 수행하면 신장이 허혈에 노출되는 시간을 줄일 수 있습니다. 허혈 시간(대어타의 결찰)을 약 5분(최대 10분)으로 유지하는 것은 신장에 해를 끼치지 않는 것으로 나타났다.
유출
주입된 제형이 신장 정맥을 통해 순환을 재입력할 때 다른 장기로 의 유출의 위험을 고려할 때, 주입된 부피는 최소한으로 유지되어야 한다. 우리는 50 μL의 최대 볼륨을 권장합니다. 투여량은 또한 다른 사람에 의해, 효율성 에 대한 중요한 요인이 될 발견되었습니다3.
부작용 (혈전증 및 마비)
처음에 모델을 설정할 때 우리는 뒷다리의 마비에 대한 일관되지 않은 문제를 경험했습니다. 항응고제(10IU 의 꼬리 정맥)의 관련 투여 후 수술 전, 이러한 부작용은 현저히 감소하였다. 현장에서 전문가와 상의한 후, 우리는 또한 어떤 조직에꼬집어들고 가능한 한 작은 부위를 만지지 않는다는 것을 의미하는 외상 수술로 일하는 데 더욱 신중하기 시작했습니다. 함께 취한 이 행동은 마비의 주파수를 약 50%에서 사실상 없음으로 감소했습니다.
처음에 방법 개발 중, 우리는 절개 구멍을 닫기 위해 신장 동맥에 항응고조직을 적용했습니다. 이것은 대어타에 주사를 할 때 압력이 대어타에서 훨씬 더 높기 때문에 가능하지 않았습니다. 항응고제는 또한 혈관 루멘에 들어가면 혈전증의 위험을 증가시킵니다.
모험이 매우 혈전성이기 때문에 봉합 할 때 대자의 루멘에 노출 된 모험이없는지 확인하십시오. 또한 허벅지에 봉합하여 반전 상처 모서리또는 대어타를 좁히는 것을 피하십시오.
우리는 지금 신장에 직접 제형을 전달하기 위한 확립된 방법이 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
RRSSC의 르네 레미(René Remie)에게 특별한 디자인의 카테터를 제작하는 데 있어 기술을 정교하게 조정하고 Instech 연구소를 개발해 주었습니다. 또한 AstraZeneca R&D의 모든 동료들에게 팁과 트릭뿐만 아니라 사운드로 비디오를 완료하기위한 Xerox와 생산적인 토론을한 것에 대해 큰 감사를 드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt hook 5mm 8/pack | Cooper surgical | 3316-8G | |
| ETHILON Nylon Suture 11/0 | Ethicon | W2881 | For vessel |
| Microsurgery forceps curved | Karo Pharma | FRC-15 RM-8 | |
| Microsurgery forceps straight | Karo Pharma | FRS-15 RM-8 | |
| Mouse renal artery cannula, 3mm 32ga stainless steel, 10cm 2Fr PU, fits 25ga | Instech | C07SS-MRA1813 | |
| Vicryl, 6-0, BV-1 needle | Angthos | W9575 | For abdominal cavity |
References
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