Summary
Ce manuscrit décrit une méthode pour la livraison ciblée à un rein simple par l’intermédiaire d’un cathéter placé dans l’aorte abdominale infrarenal dans la souris.
Abstract
Il est nécessaire d’avoir des injections dirigées pour permettre une exposition rénale accrue et spécifique pour une évaluation efficace des cibles de médicaments dans le domaine de la recherche rénale. L’accumulation de médicaments dans certains organes peut donner lieu à des effets indésirables et indésirables, selon la nature de l’injection. Pour minimiser les retombées et/ou l’accumulation dans d’autres tissus, la méthode décrite ci-dessous dirige la formulation dans le sang de l’artère rénale en insérant un cathéter dans l’aorte rénale infra, juste en dessous de l’endroit où elle se ramifie dans l’artère rénale, ce qui entraîne le rein comme organe atteint pour la première fois et la distribution de la formulation dans tout le rein.
Ce manuscrit fournit une description détaillée de la méthode, ainsi que de ses défis et difficultés. Il guide l’expérimentateur à devenir habile avec ce type de microchirurgie qui nécessite une précision dans des conditions stériles. La vitesse est cruciale pour minimiser l’ischémie et la pratique de la procédure augmentera les chances de succès des injections sans effets indésirables. En modulant le temps entre l’injection et la reperfusion ainsi que le volume injecté, le risque de débordement vers d’autres organes est atténué.
Notez que cette technique convient aux stratégies de dosage unique.
Introduction
Dans le domaine de la recherche préclinique au sein de l’industrie pharmaceutique, le développement de modèles et de méthodes fait partie du travail quotidien. Il y a un intérêt croissant pour la capacité de diriger des drogues aux organes spécifiques, ou même aux compartiments séparés d’un organe, sans débordement/piégeage important, par l’intermédiaire de la circulation sanguine, dans d’autres tissus. Ceci pour permettre une exposition accrue et spécifique pour une évaluation efficace des cibles médicamenteuses dans les modèles de différentes zones de la maladie 1,2,3,4.
Une façon courante de livrer des substances se fait par voies systémiques (p. ex., par la veine de la queue) puisqu’elles sont moins invasives que la méthode décrite dans ce manuscrit. Cependant, l’administration systémique augmente le risque d’augmentation du métabolisme ou de l’accumulation du composé dans d’autres tissus que l’organe cible prévu, en passant par des organes filtrants tels que le poumon, le foie et la rate 2,3,5. En plus de ne pas atteindre le tissu destiné, cela pourrait potentiellement donner lieu à des effets indésirables et / ou indésirables, selon la nature de l’injection. Seules les très petites molécules passent devant les capillaires des organes filtrants et donc la livraison ciblée est particulièrement importante si l’on travaille avec de plus grosses molécules 6.
Pour minimiser les retombées et/ou l’accumulation de la formulation injectée, dans d’autres tissus, la méthode décrite dans les herein dirige la formulation dans le sang de l’artère rénale par un cathéter inséré dans l’aorte abdominale juste en dessous de l’endroit où elle se ramifie dans l’artère rénale, ce qui entraîne le rein comme premier organe atteint. Un autre avantage avec cette administration guidée est qu’une dose/volume inférieur peut être employé afin d’atteindre le même niveau d’exposition que réalisé par l’administration systémique 3.
D’autres voies d’administration ont été explorées, par exemple, les injections par cathéter directement dans l’artère rénale. Dans nos mains, ceci s’est trouvé pour présenter un plus grand risque de défaut de reconstituer la circulation au rein. Le très petit diamètre de l’artère rénale (environ 0,35-0,55 mm de diamètre) rend l’incision relativement grande et présente un risque d’obstruction et/ou d’embolie lors de la fermeture du trou d’entrée. Selon notre expérience des dommages ischémiques liés au rein se sont souvent produits lors de l’utilisation de cette méthode, et nous avons donc développé cette nouvelle façon de cibler avec succès le rein en injectant des substances par incision de l’aorte plus grande pour cibler le rein.
Il existe des techniques similaires en cours de développement chez les rats qui manifeste également les défis et le risque de sténose / thrombose en travaillant avec des injections directement dans l’artère rénale 5. Ceci soutient nos résultats puisque les vaisseaux chez les souris sont encore plus petits.
Ce manuscrit et cette vidéo décrivent, en détail, comment les injections peuvent être dirigées dans l’artère rénale chez la souris par un cathéter inséré dans l’aorte infrarenale, ainsi que des conseils sur la façon de surmonter les difficultés communes dans la procédure, de travailler de la manière la plus sûre possible et ainsi augmenter la reproductibilité.
Protocol
Les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité régional d’éthique animale des laboratoires de Göteborg, en Suède.
1. Soins préopératoires
- Utilisez des techniques stériles pour éviter les infections.
- Sous anesthésie (p. ex., isoflurane) et en travaillant de la manière la plus aseptique possible, rasez la zone de chirurgie et retirez la fourrure avec une crème d’épilation. Laisser la crème environ 1 minute (maximum de 2 minutes pour éviter les brûlures cutanées). Laver soigneusement avec de l’eau. Cette première étape peut de préférence être faite 1-2 jours avant la chirurgie pour éviter le refroidissement supplémentaire de l’animal juste avant la chirurgie.
- Appliquer un lubrifiant ophtalmique sur les yeux pour éviter la sécheresse.
- Pour éviter les infections, lavez la zone chirurgicale avec un nettoyant antiseptique et essuyez la zone avec du désinfectant (chlorhexidine) juste avant la chirurgie.
- analgésie
- Pré-dose de l’animal avec des analgésiques s’il ne s’agit pas d’une procédure terminale: Buprénorphine (par exemple, temgesic) 0,05-0,1 mg/kg s.c.)
- Anticoagulants
- Utilisez des anticoagulants pour éviter les caillots sanguins : 10 UI d’héparine dans la veine de la queue juste avant la chirurgie (maximum 5 mL/kg).
2. Intervention chirurgicale
- Autoclavez les instruments et utilisez des cathéters stériles. Faites laver le surgent avec du savon et de l’hibiscrub et portez un masque facial, un filet à cheveux et une robe et des gants chirurgicaux stériles. Avoir une deuxième personne manipuler les animaux et toutes les tâches « sales ».
- Pour l’anesthésie, utiliser l’isoflurane. Induire l’anesthésie en plaçant la souris dans une boîte d’anesthésie avec 5% d’isoflurane. Après l’induction, vérifiez la profondeur de l’anesthésie en vérifiant les réflexes et la respiration.
- Pendant la chirurgie, placez un masque facial sur la souris pour donner une dose d’entretien de 2% d’isoflurane.
- Laver l’animal avec de l’hibiscrub et de la chlorhexidine avant de mettre sur la table chirurgicale.
- Après anesthésie, placez la souris sur un coussin chirurgical chauffé en position supine et fixez les membres supérieurs et inférieurs à la garniture à l’aide de ruban adhésif à faible punaise. Assurez-vous que les extrémités supérieures sont maintenues dans une position normale pour prévenir la compression pulmonaire. Si possible, utilisez une source de chaleur non électrique.
REMARQUE : Nous utilisons l’anesthésie par inhalation (p. ex., isoflurane) pour faciliter les ajustements pendant la chirurgie. - Draper la souris d’une pellicule plastique (p. ex., Press’n Seal) et effectuer le travail au microscope chirurgical.
- Protégez les tissus du séchage en ajoutant constamment de la solution saline dans la zone de chirurgie. Cela aide également à garder le tissu élastique et minimise le risque de dommages lors de l’exécution de la chirurgie. La solution saline doit être d’environ 37 °C pour éviter le refroidissement de l’animal.
- Après avoir ouvert la cavité abdominale avec une incision de midline avec des forceps et des ciseaux, utilisez un humide, plié, compresser pour pousser tous les autres organes de côté pour obtenir une bonne vue sur la zone de chirurgie.
- Utilisez des rétracteurs pour avoir une bonne vue d’ensemble de la zone de chirurgie (crochet contondant de 5 mm).
- Localiser l’aorte et le rein gauche.
- À l’aide de deux forceps de microchirurgie, nettoyez doucement l’aorte, à la fois cranially (voir 2.10.1) et caudally (voir 2.10.2) du rein, des tissus environnants et placez une ligature en dessous (6-0 Soie). Veillez à ne pincer aucune structure. Travaillez votre chemin en étirant doucement et en tirant les tissus, se rapprocher le plus possible de l’artère rénale. Autour des vaisseaux il ya plusieurs nerfs pas facile à découvrir. Gardez cela à l’esprit puisque les nerfs endommagés peuvent causer la paralysie ou d’autres problèmes postopératoirement.
- Cranially (ci-dessus) le rein, utiliser cette ligature pour soulever l’aorte pour occluser momentanément le flux sanguin tout en effectuant l’injection. Dans cette position, juste au-dessus de l’endroit où l’artère rénale, l’aorte se ramifie dans la direction opposée (aux intestins, voir figure 1). Afin d’éviter de pousser l’injection de cette façon, mettre la ligature sous cette branche. Laissez la ligature sans tension jusqu’au début de la procédure d’injection.
- Caudally (ci-dessous) le rein, placer l’incision près de l’endroit où l’aorte se ramifie à l’artère rénale / rénale pour éviter d’autres branches potentielles. Caudally du rein l’aorte est très proche de la veine abdominale. Veillez à ne pas endommager la veine.
- injection
- Lorsque toutes les ligatures sont en place; d’abord étirer le bas et deuxièmement la ligature supérieure pour occluser le flux sanguin pour diriger le liquide injecté vers le rein.
- À l’aide d’une aiguille d’acupuncture (Ø 0,25 mm), perforez et guidez l’extrémité (arrondie) du cathéter (32GA) dans l’aorte et fixez-la avec un seul nœud sur la ligature afin qu’elle ne bouge pas ou ne fuit pas pendant l’injection. (Figure 1). L’utilisation d’une aiguille d’acupuncture au lieu d’un ciseaux permet de faire un trou d’entrée minimal dans le navire.
- Injecter 50 μL de liquides. Le rein doit pâlir, ce qui indique que l’injection a perfusé le rein et s’est retrouvée à l’endroit destiné.
- À ce stade, il existe deux scénarios différents possibles.
- Redonner un peu de circulation au rein en desserrant soigneusement la tension dans la ligature supérieure avant de fermer le trou d’entrée. De cette façon, l’ischémie est améliorée, mais sachez que le liquide injecté peut potentiellement être dégagé rapidement via la veine rénale et donc ne pas permettre suffisamment de temps de vie.
- Ou procéder à la chirurgie sans donner le flux sanguin en retour.
- Après avoir serré la ligature supérieure à nouveau, retirer le cathéter, suture de l’aorte et redonner la pleine circulation.
- Retirer la ligature en tenant le cathéter.
- Retirer le cathéter.
- Suture le trou d’entrée avec un seul point (ethilon 11-0, aiguille arrondie).
- D’abord desserrer la ligature inférieure, puis très lentement desserrer la partie supérieure. S’il y a fuite serrer la ligature à nouveau, attendre quelques secondes et essayer à nouveau. Gardez le temps total d’ischémie à un maximum de 5-10 minutes pour éviter les dommages ischémiques.
- Testez la solidité en poussant la zone et recherchez les pulsations et assurez-vous que le rein revient à la « coloration normale » pour s’assurer que la recirculation est établie.
- Couper les fils et enlever les ligatures sous l’aorte.
- Retirer la compresse et remettre les intestins en place. Redonner quelques liquides, en ajoutant de la solution saline dans la cavité abdominale et en suturant la péritoine (Vicryl 6-0) avant de fermer la peau avec des clips métalliques.
- Avant de se réveiller, les animaux reçoivent 0,7-1 mL de Rehydrex sous-cutanée.
REMARQUE : L’ensemble de la procédure prend environ 30-45 minutes pour un surgent bien formé.
3. Soins postopératoires
- Laissez les animaux se réveiller dans un environnement chaud en plaçant un coussin chauffant (environ 38 °C) sous une partie de la cage pendant 2 à 3 jours après l’opération.
- Continuer à fournir de l’analgésie (buprénorphine, p. ex., tégésique 0,05-0,1 mg/kg s.c.) 2 à 3 fois par jour pendant 3 jours après l’opération.
- Donnez 10 mL/kg de Réhydrex s.c. occasionnellement si les animaux présentent des signes de déshydratation.
Representative Results
Le film est un mélange de vidéos de différentes chirurgies pour présenter ceux avec la meilleure qualité vidéo. Certaines séquences ont été prises à partir de séances d’entraînement où la souris n’est pas censée se réveiller. Par conséquent, la souris n’est pas toujours correctement drapée. Quand un animal est censé se réveiller, nous travaillons toujours d’une manière aseptique.
Les analyses histologiques ont indiqué que l’exécution des injections directement dans l’artère rénale a donné lieu à des dommages de rein, probablement dus à la recirculation insuffisante du flux sanguin avec l’ischémie irréversible en conséquence (figure 2). L’injection par l’aorte abdominale, d’autre part, n’a pas causé de blessure ischémique (Figure 3).
Evans colorant bleu a été utilisé pour visualiser que la perfusion par l’intermédiaire de l’aorte se traduira par le rein étant le premier organe atteint (Figure 4). Aucun autre organe n’est devenu bleu jusqu’à ce qu’après le passage par la veine rénale.
Nous avons également montré que l’utilisation de cette méthode, nous pouvons augmenter l’engraftment des formulations injectées au rein perfusé à l’aide de cellules souches mésenchymiques (Figure 5).
Figure 1 :Placement des sutures et du cathéter. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Image du haut: Décrire où placer la première ligature, cranially du rein gauche. Image du milieu : Vue d’ensemble sur la zone de chirurgie juste avant le placement du cathéter (2,11 dans le protocole). Image du bas: Vue d’ensemble sur la zone de chirurgie juste avant l’injection (2,10 dans le protocole)
Figure 2: Injections directement dans l’artère rénale. Conception, et les résultats de l’IHC à partir, une étude avec injection de NaCl directement dans l’artère rénale S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 :Résultats de l’IHC au jour 7 après l’administration de l’aorte. Résultats de l’IHC d’une étude avec injection de NaCl dans l’artère rénale via l’aorte abdominale, 7 jours après l’injection S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Injection de colorant bleu Evans. Image supérieure montrant une vue sérielle d’une injection par l’intermédiaire de l’aorte du colorant bleu d’Evans. Image inférieure montrant une coupe transversale d’un rein après injection par l’intermédiaire de l’aorte du colorant bleu d’Evans. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5: L’infusion artérielle abdominale a augmenté de manière significative l’engraftment des cellules souches mésenchymales dans le rein gauche comparé au rein droit. Les cellules souches mésenchymales dérivées de la moelle osseuse humaine ont été étiquetées avec CM-Dil (fluorescence rouge) en suspension. Un million de MSCs étiquetés ont été infusés par artère abdominale chez trois souris. Trois heures après infusion de TMS, les souris ont été terminées. Les reins gauche et droit ont été récoltés et incorporés dans oct pour cryosectioning. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Discussion
Cette méthode a réussi à fournir des formulations au rein sans causer de dommages rénaux. Il peut être utilisé pour la livraison de n’importe quel type de formulations (p. ex., petites molécules, cellules souches/progénitrices ou microvesicles). La méthode peut être appliquée chez les animaux en bonne santé ou dans les modèles de maladies rénales.
Dans la figure 2 et la figure 3,l’histologie est présentée. La figure 2 montre l’histologie 180 minutes après la perfusion, tandis que la figure 3 montre l’histoire 7 jours après l’infusion. La raison en est que les expériences avec l’artère rénale n’ont été que de 180 minutes. Pour être sûr que nous n’avions pas de dommages chroniques avec cette nouvelle méthode, nous avons délibérément attendu 7 jours pour les évaluer. Le n-nombre est petit, mais ce n’est qu’un exemple.
Notez que cette nouvelle méthode d’administration d’aorte pour cibler le rein est une méthode invasive avec un débit relativement faible et convient aux stratégies de dosage unique seulement. Le dosage répété n’est pas possible avec cette méthode.
Avec des ajustements mineurs des emplacements de ligature cette méthode pourrait éventuellement être employée pour infuser les deux reins simultaniously5,7. Avec le risque accru de débordement par ramification aortique nous avons décidé de maintenir la ligature occluding aussi près du rein que possible, menant l’injection au rein gauche seulement. Il peut également être utilisé en plus d’autres modèles ou techniques comme l’uninephrectomy ou peut-être même simultanément des lésions rénales de reperfusion d’ischémie (IRI). À notre avis, faire l’injection seulement 24 heures après la chirurgie IRI3 est trop sévère et affectera le rétablissement de l’animal considérablement.
Lors de l’utilisation de nouvelles souches de souris, il faut toujours effectuer une expérience pilote sur certains animaux de cette souche pour s’assurer que la méthode n’a pas besoin d’être ajustée d’une manière ou d’une autre. Par exemple, dans certaines souches, la ramification du navire de l’aorte peut être positionnée un peu différemment. La position des ligatures peut changer quelque peu pour s’assurer que la formulation se retrouve au bon endroit.
déshydratation
L’ouverture de la cavité abdominale pose un grand risque de déshydratation. Il est donc impératif d’ajouter des liquides (environ 37 °C) pendant et après la chirurgie pour assurer une bonne base pour la récupération postopératoire. Nous donnons habituellement 1 mL/souris .c. post-chirurgie.
ischémie
Le temps prolongé de chirurgie ou si l’échec d’atteindre la recirculation complète aura comme conséquence l’ischémie. Il est important d’enregistrer le temps réel d’ischémie et de s’assurer que la circulation vers le rein (et les pattes arrière) sont restaurées. La formation constante et la fraîcheur des compétences sont, comme toujours, importantes. Effectuer la procédure plus rapidement réduit le temps que le rein est exposé à l’ischémie. Garder le temps ischémie (ligature de l’aorte) à environ 5 min (10 min max) a été montré pour ne pas nuire au rein.
retombée
Compte tenu du risque de débordement vers d’autres organes lorsque la formulation injectée est de nouveau entrer dans la circulation par la veine rénale, le volume injecté doit être maintenu au minimum. Nous recommandons un volume maximum de 50 μL. Dosage a également été trouvé, par d’autres, pour être un facteur critique pour l’efficacité3.
Effets indésirables (thrombose et paralysie)
Initialement, lors de la mise en place du modèle, nous avons connu des problèmes non cohérents avec la paralysie dans les jambes arrière. Après dose pertinente d’anticoagulant (10 UI d’héparine dans la veine de queue) preoperatively, cet effet défavorable a été sensiblement diminué. Après avoir consulté des experts dans le domaine, nous avons également commencé à être encore plus prudents dans le travail avec la chirurgie atraumatique, ce qui signifie pas de pincement dans les tissus et toucher aussi peu de zones que possible. Ces mesures prises ensemble ont réduit la fréquence de la paralysie d’environ 50 % à pratiquement aucune.
Au commencement pendant le développement de méthode, nous avons appliqué le tissu d’anticoagulant sur l’artère rénale pour fermer le trou d’incision. Cela n’a pas été possible lors des injections dans l’aorte puisque la pression est tellement plus élevée dans l’aorte. L’anticoagulant augmente également le risque de thrombose s’il entre dans le lumen de navire.
Assurez-vous de ne pas avoir adventitia exposés dans le lumen de l’aorte lors de la suture depuis adventitia est très thrombogénique. Évitez également d’inverser les bords des plaies ou de rétrécir l’aorte en suturant à la cuisse.
Nous avons maintenant une méthode établie pour fournir des formulations directement au rein.
Disclosures
L’auteur n’a rien à divulguer.
Acknowledgments
Merci à René Remie du RRSSC de m’avoir aidé à affiner la technique et aux laboratoires Instech pour leur collaboration dans la production d’un cathéter spécialement conçu. Un grand merci également à tous les collègues d’AstraZeneca R&D pour des discussions productives avec des trucs et astuces ainsi que Xerox pour avoir terminé la vidéo avec du son.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt hook 5mm 8/pack | Cooper surgical | 3316-8G | |
| ETHILON Nylon Suture 11/0 | Ethicon | W2881 | For vessel |
| Microsurgery forceps curved | Karo Pharma | FRC-15 RM-8 | |
| Microsurgery forceps straight | Karo Pharma | FRS-15 RM-8 | |
| Mouse renal artery cannula, 3mm 32ga stainless steel, 10cm 2Fr PU, fits 25ga | Instech | C07SS-MRA1813 | |
| Vicryl, 6-0, BV-1 needle | Angthos | W9575 | For abdominal cavity |
References
- Porvasnik, S. L., Mah, C., Polyak, S. Targeting Murine Small Bowel and Colon Through Selective Superior Mesenteric Artery Injection. Microsurgery. 30 (6), 487-493 (2010).
- Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study. Gene Therapy. 21 (6), 618-628 (2014).
- Cai, J., et al. Maximum efficacy of mesenchymal stem cells in rat model of renal ischemia-reperfusion injury: renal artery administration with optimal numbers. PLoS One. 9 (3), 92347 (2014).
- Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery. Journal of Visualized Experiments. (119), e54804 (2017).
- Monteiro Carvalho Mori da Cunha, M. G., et al. A Surgical Technique for Homogenous Renal Distribution of Substances in Rats. European Surgical Research. 51, 58-65 (2013).
- De Jong, W. H., et al. Particle size-dependent organ distribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Biomaterials. 29 (12), 1912-1919 (2008).
- Ullah, M., et al. A Novel Approach to Deliver Therapeutic Extracellular Vesicles Directly into the Mouse Kidney via Its Arterial Blood Supply. Cells. 9 (4), 937 (2020).
