Summary
В этой рукописи описывается метод целенаправленной доставки одной почки через катетер, помещенный в инфраренальной брюшной аорты в мыши.
Abstract
Существует необходимость в направленных инъекциях для обеспечения повышенного и специфического воздействия почек для эффективной оценки целевых показателей в области исследований почек. Накопление наркотиков в некоторых органах может привести к неблагоприятным и нежелательным последствиям, в зависимости от характера инъекций. Чтобы свести к минимуму побочные эффекты и/или накопление в других тканях, описанный метод направляет формулировку в кровоток почечной артерии, вставив катетер в инфра-почечную аорту, чуть ниже, где она ветвится в почечную артерию, в результате чего почка впервые достигла органа и распределение формулировки по всей почке.
В этой рукописи содержится подробное описание метода, а также его проблемы и трудности. Он направляет экспериментатора, чтобы стать умелым с этим типом микрохирургии, которая требует точности в стерильных условиях. Скорость имеет решающее значение для минимизации ишемии и практикующих процедура увеличит вероятность успешных инъекций без побочных эффектов. Путем модулировать время между впрыском и reperfusion также, как впрыснутый том, риск переливания к другим органам смягчен.
Обратите внимание, что этот метод подходит для одной стратегии досирования.
Introduction
В области доклинических исследований в фармацевтической промышленности разработка моделей и методов является частью повседневной работы. Растет интерес к способности направлять наркотики в конкретные органы или даже отдельные отсеки органа, без серьезных побочных эффектов/захватов, через кровоток, в другие ткани. Это позволит увеличить и специфическую экспозицию для эффективной оценки целевых показателей лекарственных средств в моделях различных областейзаболеваний 1, 2,3,4.
Распространенным способом доставки веществ являются системные маршруты (например, через хвостовую вену), поскольку они менее инвазивны, чем метод, описанный в этой рукописи. Тем не менее, системное введения увеличивает риск увеличения метаболизма или накопления соединения в других тканях, чем предполагаемый целевой орган, при прохождении через фильтрующие органы, такие как легкие, печень и селезенка 2,3,5. Помимо не достигнув суждено ткани, это потенциально может привести к неблагоприятным и / или нежелательных эффектов, в зависимости от характера инъекций. Только очень маленькие молекулы проходят капилляры фильтрующих органов и поэтому целевая доставка особенно важна при работе с более крупными молекулами 6.
Чтобы свести к минимуму побочные эффекты и/или накопление инъекционной формулировки, в других тканях описанный метод направляет формулировку в кровоток почечной артерии через катетер, вставленный в брюшную аорту чуть ниже, где она ветвей в почечную артерию, в результате чего почка, как впервые достиг органа. Еще одним преимуществом этого управляемого введения является то, что более низкая доза / объем может быть использован для того, чтобы достичь того же уровня воздействия, как достигнуто с помощью системного введения 3.
Исследованы и другие маршруты введения, например, инъекции через катетер непосредственно в почечную артерию. В наших руках было установлено, что это представляет более высокий риск неспособности восстановить кровообращение в почках. Очень небольшой диаметр почечной артерии (примерно 0,35-0,55 мм в диаметре) делает разрез относительно большим и создает риск обструкции и/или эмболии при закрытии входного отверстия. Согласно нашему опыту ишемических связанных повреждение почек часто происходило при использовании этого метода, и поэтому мы разработали этот новый способ успешно целевой почки путем введения веществ через разрез больших аорты для целевой почки.
Есть аналогичные методы разрабатываются у крыс, что также проявляется проблемы и риск стеноза / тромбоза, работающих с инъекциями непосредственно в почечной артерии 5. Это подтверждает наши выводы, так как сосуды у мышей еще меньше.
Эта рукопись и видео подробно описывают, как инъекции могут быть направлены в почечную артерию у мышей через катетер, вставленный в инфраренальной аорты, а также руководство в том, как преодолеть общие трудности в процедуре, работать самым безопасным способом и тем самым увеличить воспроизводимость.
Protocol
Экспериментальные процедуры были одобрены Региональным лабораторным комитетом по этике животных Гетеборга, Швеция.
1. Предоперационный уход
- Используйте стерильные методы, чтобы избежать инфекций.
- Под наркозом (например, изофлуран) и работая самым асептическим способом, побрите область операции и удалите мех кремом для удаления волос. Оставьте крем примерно на 1 минуту (максимум 2 минуты, чтобы избежать ожогов кожи). Тщательно промыть водой. Этот первый шаг предпочтительно можно сделать за 1-2 дня до операции, чтобы избежать дополнительного охлаждения животного прямо перед операцией.
- Нанесите офтальмологическую смазку на глаза, чтобы предотвратить сухость.
- Чтобы избежать инфекций, мыть хирургическую область с антисептическим моющим средством кожи и протрите область дезинфицирующим средством (хлоргексидин) прямо перед операцией.
- обезболивание
- Предварительная доза животного с анальгетиками, если это не терминальная процедура: Бупренорфин (например, темгезик) 0,05-0,1 мг/кг с.c.)
- Антикоагулянтов
- Используйте антикоагулянты, чтобы избежать образования тромбов: 10 МЕ гепарина через хвостовую вену прямо перед операцией (максимум 5 мл/кг).
2. Хирургическая процедура
- Автоклав инструментов и использовать стерильные катетеры. Используйте возрождающуюся стирку с мылом и гибискрубом и наденьте в нее гиска, сеть для волос и стерильное хирургическое платье и перчатки. Иметь второй человек обрабатывать животных и все "грязные" задачи.
- Для анестезии используйте изофлюран. Индуцировать анестезию, поместив мышь в анестезию-коробку с 5% изофлюран. После индукции проверьте глубину анестезии, проверяя рефлексы и дыхание.
- Во время операции поместите лицевую клетку на мышь, чтобы дать поддерживаемую дозу 2% изофлюрана.
- Вымойте животное гибискрубом и хлоргексидином перед тем, как положить на хирургический стол.
- После анестезии поместите мышь на нагретую хирургическую площадку в положении на спине и закрените верхние и нижние конечности на площадку с помощью клейкой ленты с низким содержанием галса. Убедитесь, что верхние конечности поддерживаются в нормальном положении, чтобы предотвратить сжатие легких. Если возможно, используйте неэлектрийный источник тепла.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем ингаляционную анестезию (например, изофлуран) для облегчения корректировок во время операции. - Драпировать мышь полиэтиленовой пленкой (например, Печать Press'n) и выполнять работу с хирургическим микроскопом.
- Защитите ткани от высыхания, постоянно добавляя солевой раствор в область операции. Это также помогает сохранить эластичную ткань и сводит к минимуму риск повреждения при выполнении операции. Солевой раствор должен быть около 37 градусов по Цельсию, чтобы избежать охлаждения животного.
- После открытия брюшной полости с разрезом средней линии с типсами и ножницами, использовать влажный, сложенный, компресс, чтобы подтолкнуть все другие органы в сторону, чтобы получить хороший вид на область операции.
- Используйте втягиватели, чтобы иметь хороший обзор области операции (5 мм тупой крюк).
- Локализовать аорту и левую почку.
- Используя два микрохирургии типсы, аккуратно очистить аорту, как черепно (см. 2.10.1) и caudally (см. 2.10.2) от почки, от окружающих тканей и место лигатуры под ним (6-0 шелка). Будьте осторожны, чтобы не ущипнуть любые структуры. Работа ваш путь в мягко растяжения и потянув ткани, получая как можно ближе к почечной артерии, как это возможно. Вокруг сосудов есть несколько нервов не легко обнаружить. Имейте это в виду, так как поврежденные нервы могут вызвать паралич или другие вопросы после оперативно.
- Cranially (выше) почки, использовать эту лигатуру, чтобы поднять аорту на мгновение окклюдии кровотока во время выполнения инъекции. В этом положении, прямо над тем, где почечная артерия, аорта ветви в противоположном направлении (к кишечнику, см. Рисунок 1). Чтобы избежать нажатия инъекции таким образом, поместите лигатуру под эту ветку. Оставьте лигатуру без напряжения до начала процедуры инъекции.
- Caudally (ниже) почки, место разрез близко к где аорты ветви почек / почечной артерии, чтобы избежать других потенциальных ветвей. Caudally из почки аорты очень близко к брюшной вены. Будьте очень осторожны, чтобы не повредить вену.
- инъекция
- Когда все лигатуры на месте; во-первых растянуть нижнюю, а во-вторых, верхнюю лигатуру, чтобы окклюдить поток крови, чтобы направить вводили жидкость в почку.
- Используя иглоукалывание иглы (0,25 мм), прокол и руководство (округлые) кончик катетера (32GA) в аорту и закрепить его с одним узлом на лигатуре, так что он не будет двигаться или утечки во время инъекции. (Рисунок 1). Использование иглы иглоукалывания вместо ножниц позволяет сделать минимальное отверстие входа в сосуд.
- Ввись 50 МКЛ жидкостей. Почка должна поблестьеть, что указывает на то, что инъекция проникла в почку и оказалась в нужном месте.
- На данный момент возможны два различных сценария.
- Дайте некоторую циркуляцию обратно в почку, тщательно ослабить напряжение в верхней лигатуре перед закрытием входного отверстия. Таким образом, ишемия очищается, но имейте в виду, что инъекционная жидкость потенциально может быть быстро очищена через почечную вену и, таким образом, не позволяя достаточно времени на проживание.
- Или приступить к операции, не давая кровотока обратно.
- После ужесточения верхней лигатуры снова, снять катетер, шов аорты и вернуть полную циркуляцию.
- Удалите лигатуру, держащую катетер.
- Свяй катетер.
- Шов входного отверстия с одним стежком (этилон 11-0, округлая игла).
- Сначала ослабьте нижнюю лигатуру, а затем очень медленно ослабьте верхнюю. Если есть утечка затянуть лигатуру снова, подождите несколько секунд и попробуйте еще раз. Держите общее время ишемии максимум 5-10 минут, чтобы избежать ишемического повреждения.
- Проверьте прочность, нажав области и искать пульсации и посмотреть, что почка возвращается к "нормальной окраски", чтобы вновь, что рециркуляция установлена.
- Вырежьте нити и удалите лигатуры под аортой.
- Снимите компресс и нажмите кишечник обратно на место. Верните некоторые жидкости, добавив солевой раствор в брюшную полость и шов брюшной полости (Vicryl 6-0) перед закрытием кожи с металлическими зажимами.
- Перед пробуждением животным дают 0,7-1 мл регидратов подкожно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура занимает около 30-45 минут для хорошо обученных возрождающихся.
3. Послеоперационный уход
- Разрешить животным просыпаться в теплой среде, поместив грелку (около 38 градусов по Цельсию) под часть клетки в течение 2-3 дней после оперативно.
- Продолжить предоставление анальгезии (бупренорфин, например, темгезий 0,05-0,1 мг/кг с.c.) 2-3 раза в день в течение 3 дней после оперативно.
- Дайте 10 мл/кг s.c. иногда, если животные проявляют признаки обезвоживания.
Representative Results
Фильм представляет собой смесь видео из различных операций, чтобы представить те, с лучшим качеством видео. Некоторые последовательности были взяты из практических занятий, где мышь не должна просыпаться. Таким образом, мышь не всегда должным образом драпированные. Когда животное должно проснуться, мы всегда работаем асептическим образом.
Гистологические анализы показали, что выполнение инъекций непосредственно в почечную артерию приводит к травме почек, вероятно, из-за недостаточной рециркуляции кровотока с необратимой ишемией в результате(рисунок 2). Инъекция брюшной аорты, с другой стороны, не вызывает ишемической травмы(рисунок 3).
Эванс синий краситель был использован для визуализации, что перфузия через аорту приведет к почки является первым достигнутым органом (Рисунок 4). Никакие другие органы не побленели до тех пор, пока после прохождения через почечную вену.
Мы также показали, что с помощью этого метода мы можем увеличить engraftment инъекционных формулировок для пролитой почки с помощью мезенхимальных стволовых клеток(рисунок 5).
Рисунок 1: Размещение швов и катетера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Верхнее изображение: Описание, где разместить первую лигатуру, черепно левой почки. Средняя картина: Обзор области операции прямо перед размещением катетера (2.11 в протоколе). Нижняя картина: Обзор области операции прямо перед инъекцией (2.10 в протоколе)
Рисунок 2: Инъекции непосредственно в почечную артерию. Дизайн, и IHC результаты исследования с инъекцией NaCl непосредственно в почечной артерии Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: IHC результаты в день 7 после администрации аорты. IHC результаты исследования с инъекцией NaCl в почечной артерии через брюшную аорту, 7 дней после инъекции Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Инъекция эванс синий краситель. Верхнее изображение показывая серийный взгляд впрыска через аорту голубого красителя Evans. Нижняя картина, показывающая поперечное сечение почки после инъекции через аорту Эванс синий краситель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Брюшной артериальной инфузии значительно увеличилось engraftment мезенхимальных стволовых клеток в левой почке по сравнению с правой почки. Человеческий костный мозг производных мезенхимальных стволовых клеток были помечены CM-Dil (красная флуоресценция) в подвеске. Один миллион помеченных MSCs были проникнуты через брюшную артерию у трех мышей. Через три часа после вливания MSD, мыши были прекращены. Левые и правые почки были собраны и встроены в OCT для криозирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
Этот метод был успешным в доставке составов в почку, не вызывая повреждения почек. Он может быть использован для доставки любых формулировок (например, небольших молекул, стволовых/прародителя клеток, или микровесяк). Метод может быть применен у здоровых животных или в моделях заболеваний почек.
На рисунке 2 и рисунке 3представлена гистология. Рисунок 2 показывает гистологию через 180 минут после перфузии, в то время как рисунок 3 показывает историю через 7 дней после инфузии. Причина этого в том, что эксперименты с почечной артерией длили всего 180 минут. Чтобы убедиться, что у нас не было хронических повреждений с этим новым методом, мы намеренно ждали 7 дней, чтобы оценить их. N-число невелико, но это всего лишь пример.
Обратите внимание, что этот недавно разработанный метод администрации аорты для целевой почки является инвазивным методом с относительно низкой пропускной способностью и подходит только для одной стратегии досирования. Повторная досирование не возможно с помощью этого метода.
При незначительных корректировках перевязочного размещения этот метод можно было бы использовать, чтобы наполнить обе почкиодновременно 5,7. С повышенным риском побочных эффектов через аорты ветвление мы решили сохранить окклюдирование лигатуры как можно ближе к почкам, как это возможно, что привело к инъекции только в левую почку. Он также может быть использован в дополнение к другим моделям или методам, как ненефэктомия или, возможно, даже одновременной почечной ишемии травмы реперфузии (IRI). На наш взгляд, делать инъекцию только через 24 часа после операции IRI3 слишком жестко и существенно повлияет на выздоровление животного.
При использовании новых штаммов мышей, всегда следует выполнить экспериментальный эксперимент на некоторых животных из этого штамма, чтобы убедиться, что метод не нуждается в корректировке в некотором роде. Например, в некоторых штаммах сосуд-ветвь от аорты может быть расположен немного иначе. Положение лигатур может несколько измениться, чтобы убедиться, что формулировка попадает в нужное место.
обезвоживание
Открытие брюшной полости представляет большой риск обезвоживания. Поэтому крайне важно добавлять жидкости (около 37 градусов по Цельсию) как во время, так и после операции, чтобы обеспечить хорошую основу для восстановления после оперативно. Мы обычно даем 1 мл / мыши s.c. после операции.
ишемия
Длительное время операции или если не достичь полной рециркуляции приведет к ишемии. Важно зафиксировать фактическое время ишемии и убедиться, что кровообращение почек (и задних ног) восстанавливаются. Постоянное обучение и обновление навыков, как всегда, важны. Выполнение процедуры быстрее сокращает время воздействия ишемии на почки. Сохранение времени ишемии (перевязка аорты) около 5 мин (10 мин макс) было показано, не повредить почку.
Разлив
Учитывая риск распространения на другие органы при повторном вводе инъекционной формулировки через почечную вену, инъекционный объем следует сведен к минимуму. Мы рекомендуем максимальный объем 50 йл Дозировка также было установлено, другими, чтобы быть критическим фактором для эффективности3.
Неблагоприятные эффекты (тромбоз и паралич)
Первоначально при настройке модели мы испытывали несопоследовательных проблем с параличом в задних ногах. После предварительной дозы антикоагулянта (10 МЕ гепарина в хвостовой вене) этот побочный эффект был значительно снижен. После консультаций с экспертами в этой области, мы также начали быть еще более осторожными в работе с атрауматической хирургии, то есть не щипать в любых тканях и касаясь как можно меньше областей, как это возможно. Эти действия вместе сократили частоту паралича примерно с 50% до практически ни одного.
Первоначально во время разработки метода, мы применили антикоагулянт ткани на почечной артерии, чтобы закрыть отверстие разреза. Это было невозможно при выполнении инъекций в аорту, так как давление намного выше в аорте. Антикоагулянт также увеличивает риск тромбоза, если он попадает в люмен сосуда.
Убедитесь, что не иметь adventitia подвергаются в люмен аорты при забое с adventitia очень тромбогенным. Также избегайте инвертирования края раны или сужения аорты, засовывав на бедро.
Теперь у нас есть установленный метод доставки составов непосредственно в почку.
Disclosures
Автору нечего разглашать.
Acknowledgments
Благодаря Рене Реми в RRSSC за помощь мне тонкой техники и Instech лабораторий для сотрудничества в производстве специального разработанного катетера. Большое спасибо также всем коллегам в АстраЗенека НИОКР для продуктивных дискуссий с советами и приемами, а также Xerox для завершения видео со звуком.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt hook 5mm 8/pack | Cooper surgical | 3316-8G | |
| ETHILON Nylon Suture 11/0 | Ethicon | W2881 | For vessel |
| Microsurgery forceps curved | Karo Pharma | FRC-15 RM-8 | |
| Microsurgery forceps straight | Karo Pharma | FRS-15 RM-8 | |
| Mouse renal artery cannula, 3mm 32ga stainless steel, 10cm 2Fr PU, fits 25ga | Instech | C07SS-MRA1813 | |
| Vicryl, 6-0, BV-1 needle | Angthos | W9575 | For abdominal cavity |
References
- Porvasnik, S. L., Mah, C., Polyak, S. Targeting Murine Small Bowel and Colon Through Selective Superior Mesenteric Artery Injection. Microsurgery. 30 (6), 487-493 (2010).
- Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study. Gene Therapy. 21 (6), 618-628 (2014).
- Cai, J., et al. Maximum efficacy of mesenchymal stem cells in rat model of renal ischemia-reperfusion injury: renal artery administration with optimal numbers. PLoS One. 9 (3), 92347 (2014).
- Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery. Journal of Visualized Experiments. (119), e54804 (2017).
- Monteiro Carvalho Mori da Cunha, M. G., et al. A Surgical Technique for Homogenous Renal Distribution of Substances in Rats. European Surgical Research. 51, 58-65 (2013).
- De Jong, W. H., et al. Particle size-dependent organ distribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Biomaterials. 29 (12), 1912-1919 (2008).
- Ullah, M., et al. A Novel Approach to Deliver Therapeutic Extracellular Vesicles Directly into the Mouse Kidney via Its Arterial Blood Supply. Cells. 9 (4), 937 (2020).
