Summary
Bu makalede, faredeki infrarenal abdominal aort içine yerleştirilen bir kateter aracılığıyla tek bir böbreğe hedefli doğum için bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Renal araştırma alanında ilaç hedeflerinin verimli bir şekilde değerlendirilmesi için daha fazla ve spesifik renal maruziyeti sağlamak için yönlendirilmiş enjeksiyonlara ihtiyaç vardır. Bazı organlarda ilaç birikmesi, enjektenin doğasına bağlı olarak olumsuz ve istenmeyen etkilere yol açabilir. Diğer dokularda dökülmeyi ve/veya birikimi en aza indirmek için, burada açıklanan yöntem, infra renal aort içine bir kateter yerleştirerek, böbrek atardamarına dallandığı yerin hemen altında, böbreğin ilk kez organa ulaşması ve böbreğin her yerine formülasyonun dağıtılması ile sonuçlanan formülasyonu renal arter kan dolaşımına yönlendirmektedir.
Bu makale, yöntemin yanı sıra zorlukları ve zorlukları hakkında ayrıntılı bir açıklama sunmaktadır. Deneycinin steril koşullarda doğruluk gerektiren bu tür mikrocerrahi ile ustalaşmasına rehberlik eder. Hız, iskemiyi en aza indirmek için çok önemlidir ve prosedürü uygulamak, olumsuz etkileri olmadan başarılı enjeksiyon şansını artıracaktır. Enjeksiyon ve reperfüzyon ile enjekte edilen hacim arasındaki sürenin modüle edilmesiyle, diğer organlara dökülme riski azaltılır.
Bu tekniğin tekli dosing stratejileri için uygun olduğunu unutmayın.
Introduction
İlaç endüstrisindeki klinik öncesi araştırma alanında, model ve yöntem geliştirme günlük çalışmanın bir parçasıdır. İlaçları belirli organlara, hatta bir organın ayrı bölmelerine, büyük dökülme / tuzak olmadan, kan dolaşımı yoluyla diğer dokulara yönlendirebilme yeteneğine artan bir ilgi vardır. Bu, farklı hastalık alanlarının modellerinde ilaç hedeflerinin verimli bir şekilde değerlendirilmesi için daha fazla ve spesifik maruziyet sağlamak için 1,2,3,4.
Maddeleri teslim etmenin yaygın bir yolu sistemik yollarla (örneğin kuyruk damarı yoluyla) çünkü bu yazıda açıklanan yöntemden daha az invazivdir. Bununla birlikte, sistemik uygulama, akciğer, karaciğer ve dalak gibi filtreleme organlarından geçerken, hedeflenen hedef organdan daha fazla metabolizma veya diğer dokularda bileşiğin birikmesi riskini arttırır 2,3,5. Kaderindeki dokuya ulaşmamanın yanı sıra, bu potansiyel olarak enjektenin doğasına bağlı olarak olumsuz ve / veya istenmeyen etkilere yol açabilir. Sadece çok küçük moleküller filtreleme organlarının kılcal damarlarını geçirir ve bu nedenle daha büyük moleküllerle çalışıyorsanız hedeflenen doğum özellikle önemlidir 6.
Enjekte edilen formülasyonun dökülmesini ve/veya birikmesini en aza indirmek için, diğer dokularda, burada açıklanan yöntem, formülasyonu, böbrek atardamarına dallandığı yerin hemen altındaki karın aortuna yerleştirilen bir kateter aracılığıyla böbrek atardamarı kan dolaşımına yönlendirerek böbreğin organa ilk ulaştığı şekilde sonuçlanır. Bu kılavuzlu uygulama ile bir başka avantaj, sistemik uygulama ile elde edilen aynı maruz kalma seviyesine ulaşmak için daha düşük bir doz / hacim kullanılabilmesidir 3.
Diğer uygulama yolları, örneğin, doğrudan renal artere bir kateter yoluyla enjeksiyonlar araştırıldı. Elimizde, bunun böbreğe dolaşımı geri getirmeme riskinin daha yüksek olduğu bulunmuştur. Böbrek atardamarının çok küçük çapı (yaklaşık 0,35-0,55 mm çapında) kesiği nispeten büyük hale getirir ve giriş deliğini kapatırken tıkanma ve/veya emboli riski oluşturur. Deneyimlerimize göre böbrekte iskemik kaynaklı hasar genellikle bu yöntemi kullanırken meydana geldi ve bu nedenle böbreği hedeflemek için daha büyük aortu kesiden maddeler enjekte ederek böbreği başarılı bir şekilde hedeflemenin bu yeni yolunu geliştirdik.
Sıçanlarda, doğrudan renal artere enjeksiyonlarla çalışan darlık / tromboz zorluklarını ve riskini de ortaya çıkaran benzer teknikler geliştirilmektedir 5. Bu, farelerdeki damarlar daha da küçük olduğu için bulgularımızı destekler.
Bu makale ve video, enjeksiyonların kızılötesi aort içine yerleştirilen bir kateter aracılığıyla farelerdeki renal artere nasıl yönlendirilebileceğini ve prosedürdeki yaygın zorlukların nasıl üstesinden gelinebileceği, mümkün olan en güvenli şekilde nasıl çalışılacağı ve böylece tekrarlanabilirliğin nasıl artırılacağı konusunda rehberlik açıklanmaktadır.
Protocol
Deneysel prosedürler İsveç Göteborg Bölgesel Laboratuvar Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı.
1. Ameliyat öncesi bakım
- Enfeksiyonları önlemek için steril teknikler kullanın.
- Anestezi altında (örneğin, izofluran) ve mümkün olan en aseptik şekilde çalışarak ameliyat bölgesini tıraş edin ve kürkü epilasyon kremi ile çıkarın. Kremi yaklaşık 1 dakika bekletin (cilt yanıklarını önlemek için en fazla 2 dakika). Su ile dikkatlice yıkayın. Bu ilk adım tercihen ameliyattan hemen önce hayvanın ekstra soğumasını önlemek için ameliyattan 1-2 gün önce yapılabilir.
- Kuruluğu önlemek için gözlere oftalmik yağlayıcı uygulayın.
- Enfeksiyonları önlemek için cerrahi bölgeyi antiseptik cilt temizleyici ile yıkayın ve ameliyattan hemen önce bölgeyi dezenfektan (klorheksidin) ile silin.
- Analjezi
- Ölümcül bir prosedür değilse, hayvanı analjeziklerle ön doz: Buprenorfin (örneğin, temgezik) 0.05-0.1 mg/ kg s.c.)
- Antikoagülanlar
- Kan pıhtılarını önlemek için antikoagülan kullanın: Ameliyattan hemen önce kuyruk damarından 10 IU heparin (maksimum 5 mL / kg).
2. Cerrahi prosedür
- Aletleri otoklavlayın ve steril kateterler kullanın. Dalgalanmanın sabun ve ebegümeci ile yıkanmasını ve yüz maskesi, saç teli ve steril cerrahi önlük ve eldiven giymesini sağlar. Hayvanları ve tüm "kirli" görevleri ikinci bir kişiye yaptırın.
- Anestezi için izofluran kullanın. Fareyi% 5 izofluran içeren bir anestezi kutusuna yerleştirerek anesteziye neden olabilir. İndüksiyondan sonra refleksleri ve solunumu kontrol ederek anestezinin derinliğini kontrol edin.
- Ameliyat sırasında,% 2 izofluran bakım dozu vermek için fareye bir yüz maskesi yerleştirin.
- Cerrahi masaya koymadan önce hayvanı hibiscrub ve klorheksidin ile yıkayın.
- Anesteziden sonra, fareyi sırtüstü pozisyonda ısıtılmış bir cerrahi ped üzerine yerleştirin ve üst ve alt uzuvları düşük yapışkan bant kullanarak ped üzerine sabitleyin. Akciğer sıkışmasını önlemek için üst ekstremitelerin normal pozisyonda tutulmasını sağlayın. Mümkünse, elektriksiz bir ısı kaynağı kullanın.
NOT: Ameliyat sırasında daha kolay ayarlamalar için inhalasyon anestezisi (örneğin izofluran) kullanıyoruz. - Fareyi plastik sargı ile örtün (örneğin, Press'n Seal) ve işi cerrahi bir mikroskopla gerçekleştirin.
- Ameliyat bölgesine sürekli salin ekleyerek dokuları kurumaktan koruyun. Bu aynı zamanda dokunun elastik kalmasına yardımcı olur ve ameliyatı gerçekleştirirken hasar riskini en aza indirir. Hayvanın soğutulmasını önlemek için salin yaklaşık 37 ° C olmalıdır.
- Karın boşluğunu önps ve makasla orta çizgi kesi ile açtıktan sonra, ameliyat bölgesinin iyi bir görünümünü elde etmek için diğer tüm organları bir kenara itmek için nemli, katlanmış, kompres kullanın.
- Ameliyat bölgesine (5 mm künt kanca) iyi bir genel bakışa sahip olmak için retraktörleri kullanın.
- Aortu ve sol böbreği lokalize edin.
- İki mikrocerrahi tostu kullanarak, aortu hem kranially (bkz. 2.10.1) hem de kaudally (bkz. 2.10.2) böbrekten, çevre dokulardan hafifçe temizleyin ve altına bir bağ yerleştirin (6-0 İpek). Herhangi bir yapıyı sıkıştırmamaya dikkat edin. Dokuları hafifçe gererek ve çekerek, renal artere mümkün olduğunca yaklaşarak yolunuzu çalışın. Damarların etrafında kolayca keşfedilmeyen birkaç sinir vardır. Hasarlı sinirler ameliyat sonrası felce veya diğer sorunlara neden olabileceğinden bunu aklınızda bulundurun.
- Kranially (yukarıda) böbrek, enjeksiyon yaparken kan akışını anlık olarak tıkamak için aortu kaldırmak için bu ligatürü kullanın. Bu pozisyonda, renal arterin hemen üstünde, aort ters yönde dallar (bağırsaklara, bkz. Şekil 1). Enjeksiyonun bu şekilde itilmesini önlemek için, ligatürü bu dalın altına koyun. Enjeksiyon prosedürüne başlayana kadar bağdan herhangi bir gerginlik olmadan ayrılın.
- Kaudally (aşağıda) böbrek, diğer potansiyel dallardan kaçınmak için kesiyi aortu böbrek / böbrek arterine dallandığı yere yakın yerleştirin. Böbrekten duyusal olarak aort karın damarı çok yakındır. Damara zarar vermemeye çok dikkat edin.
- Enjeksiyon
- Tüm bitişik harfler yerindeyken; önce alt ve ikinci olarak üst ligatür gererek enjekte edilen sıvıyı böbreğe yönlendirmek için kan akışını tıkar.
- Bir akupunktur iğnesi (Ø 0,25 mm) kullanarak, kateterin (32GA) (yuvarlatılmış) ucunu aort içine delin ve yönlendirin ve enjeksiyon sırasında hareket etmeyecek veya sızmayacak şekilde bağ üzerinde tek bir düğümle sabitleyin. (Şekil 1). Makas yerine akupunktur iğnesi kullanmak, damarda minimum bir giriş deliği yapımını sağlar.
- 50 μL sıvı enjekte edin. Böbrek soluklaşmalı, bu da enjeksiyonun böbreğe perfüzyon yaptığını ve kaderinde olan yere düştüğünü gösterir.
- Bu noktada iki farklı senaryo mümkündür.
- Giriş deliğini kapatmadan önce üst bağdaki gerginliği dikkatlice gevşeterek böbreğe bir miktar dolaşım verin. Bu şekilde iskemi iyileştirilmiştir, ancak enjekte edilen sıvının böbrek damarı yoluyla potansiyel olarak hızlı bir şekilde temizlenebileceğini ve böylece yeterli durma süresine izin vermeyeceğini unutmayın.
- Ya da kan akışını geri vermeden ameliyata devam edin.
- Üst ligatürü tekrar sıktıktan sonra kateteri çekin, aortu dikin ve tam dolaşımı geri verin.
- Kateteri tutan bağı çıkarın.
- Kateteri geri çekin.
- Giriş deliğini tek bir dikişle dikin (ethilon 11-0, yuvarlak iğne).
- Önce alt ligatürü gevşetin ve sonra üsttekini çok yavaşça gevşetin. Sızıntı varsa, ligatürü tekrar sıkın, birkaç saniye bekleyin ve yeniden deneyin. İskemik hasarı önlemek için toplam iskemi süresini maksimum 5-10 dakika tutun.
- Bölgeyi iterek katılığı test edin ve nabızları arayın ve devridaimin kurulmasını yeniden sağlamak için böbreğin "normal renklendirmeye" dönmesini sağlamak için.
- İplikleri kesin ve aort altındaki bitişik harfleri çıkarın.
- Kompresi çıkarın ve bağırsakları yerine geri itin. Karın boşluğuna salin ekleyerek bazı sıvıları geri verin ve cildi metal klipslerle kapatmadan önce peritona (Vicryl 6-0) dikiş atın.
- Uyanmadan önce hayvanlara deri altından 0.7-1 mL Rehydrex verilir.
NOT: İyi eğitilmiş bir dalgalanma için tüm prosedür yaklaşık 30-45 dakika sürer.
3. Ameliyat sonrası bakım
- Ameliyat sonrası 2-3 gün boyunca kafesin bir kısmının altına bir ısıtma yastığı (yaklaşık 38 °C) yerleştirerek hayvanların sıcak bir ortamda uyanmalarına izin verin.
- Ameliyat sonrası 3 gün boyunca 2-3 kez/gün analjezi (Buprenorfin, örneğin, temgezik 0.05-0.1 mg/kg s.c.) sağlamaya devam edin.
- Hayvanlar dehidrasyon belirtileri gösteriyorsa, ara sıra 10 mL / kg Rehydrex s.c. verin.
Representative Results
Film, en iyi video kalitesine sahip olanları sunmak için farklı ameliyatlardan videoların bir karışımıdır. Farenin uyanmaması gereken alıştırma oturumlarından bazı diziler alınmıştır. Bu nedenle, fare her zaman düzgün bir şekilde örtülmez. Bir hayvanın uyanması gerektiğinde, her zaman aseptik bir şekilde çalışırız.
Histolojik analizler, enjeksiyonların doğrudan böbrek arterine yapılması, muhtemelen sonuç olarak geri dönüşü olmayan iskemi ile kan akışının yetersiz devridaimi nedeniyle böbrek hasarına yol açtığını ortaya koydu (Şekil 2). Öte yandan karın aortundan enjeksiyon herhangi bir iskemik yaralanmaya neden olmadı (Şekil 3).
Evans mavi boyası, aort yoluyla perfüzyonun böbreğin ilk ulaşılan organ olmasına neden olacağını görselleştirmek için kullanılmıştır (Şekil 4). Böbrek damardan geçene kadar başka hiçbir organ maviye dönüşmedi.
Ayrıca, bu yöntemi kullanarak mezenkimal kök hücreler kullanarak perfüzyonlu böbreğe enjekte edilen formülasyonların engraftasyonlarını artırabileceğimizi gösterdik (Şekil 5).
Şekil 1: Dikiş ve kateterin yerleştirilmesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Üst resim: Sol böbreğin kranially olarak ilk ligatürün nereye yerleştir çekeceği hakkında açıklama. Orta resim: Kateterin yerleştirilmesinden hemen önce ameliyat bölgesine genel bakış (protokolde 2.11). Alt resim: Enjeksiyondan hemen önce ameliyat bölgesine genel bakış (protokolde 2.10)
Şekil 2: Doğrudan renal artere enjeksiyonlar. NaCl'nin doğrudan renal artere enjeksiyonu ile yapılan bir çalışmanın tasarımı ve IHC sonuçları Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Aort yönetiminden sonra 7. günde IHC sonuçları. IHC, enjeksiyondan 7 gün sonra karın aort yoluyla renal artere NaCl enjeksiyonu ile yapılan bir çalışmadan elde edilen sonuçlar Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Evans mavi boya enjeksiyonu. Evans mavi boya aort yoluyla bir enjeksiyonun seri görünümünü gösteren üst resim. Evans mavi boyası aort yoluyla enjeksiyondan sonra bir böbreğin kesitini gösteren alt resim. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Abdominal arteriyel infüzyon, sağ böbreğe göre sol böbrekte mezenkimal kök hücrelerin gravürünü önemli ölçüde arttırmıştır. İnsan kemik iliği türevli mezenkimal kök hücreler süspansiyonda CM-Dil (kırmızı floresan) ile etiketlendi. Üç farede bir milyon etiketli MSC karın atardamarı ile aşılandı. MSD infüzyondan üç saat sonra fareler sonlandırıldı. Sol ve sağ böbrekler hasat edildi ve kriyoseksiyon için OCT'ye gömüldü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Bu yöntem böbrek hasarına neden olmadan böbreğe formülasyon sağlamada başarılı olmuştur. Her türlü formülasyonun (örneğin, küçük moleküller, kök/progenitör hücreler veya mikrovesiküller) teslimi için kullanılabilir. Yöntem sağlıklı hayvanlarda veya renal hastalık modellerinde uygulanabilir.
Şekil 2 ve Şekil 3'tehistoloji sunulmuştur. Şekil 2 perfüzyondan 180 dakika sonra histolojiyi gösterirken Şekil 3 infüzyondan 7 gün sonra tarihi gösterir. Bunun nedeni, renal arter ile yapılan deneylerin sadece 180 dakika uzunluğunda olmasıdır. Bu yeni yöntemle kronik bir hasarımız olmadığından emin olmak için bilerek 7 gün bekledik. N sayısı küçüktür, ancak bu sadece bir örnektir.
Böbreği hedeflemek için yeni geliştirilen bu aort uygulama yönteminin nispeten düşük verime sahip invaziv bir yöntem olduğunu ve sadece tek dosing stratejileri için uygun olduğunu unutmayın. Bu yöntemle yinelenen dosing mümkün değildir.
Ligatür yerleşimlerinin küçük ayarlamaları ile bu yöntem muhtemelen her iki böbreği de simultaniously5,7demlendirmek için kullanılabilir. Aort dallanma yoluyla dökülme riskinin artmasıyla, tıkalı bağı böbreğe mümkün olduğunca yakın tutmaya karar verdik ve enjeksiyonu sadece sol böbreğe yönlendirdik. Ayrıca, uninefrektomi veya hatta belki de eşzamanlı renal iskemi reperfüzyon yaralanması (IRI) gibi diğer modellere veya tekniklere ek olarak da kullanılabilir. Bize göre, enjeksiyonu IRI3 ameliyatından sadece 24 saat sonra yapmak çok serttir ve hayvanın iyileşmesini önemli ölçüde etkileyecektir.
Yeni fare suşları kullanırken, yöntemin bir şekilde ayarlanması gerekmediğinden emin olmak için her zaman bu suştaki bazı hayvanlar üzerinde bir pilot deney yapılmalıdır. Örneğin, bazı suşlarda aorttan damar dallanması biraz farklı konumlandırılabilir. Formülasyonun doğru konumda olduğundan emin olmak için bitişik harflerin konumu biraz değişebilir.
Dehidratasyon
Karın boşluğunun açılması dehidratasyon için büyük risk oluşturur. Bu nedenle, ameliyat sonrası iyileşme için iyi bir temel sağlamak için hem ameliyat sırasında hem de ameliyat sonrası sıvıların (yaklaşık 37 °C) eklenmesi zorunludur. Genellikle ameliyat sonrası 1 mL/fare.c.
Iskemi
Ameliyat süresinin uzaması veya tam devridaime ulaşılamazsa iskemi ile sonuçlanacaktır. Gerçek iskemi süresini kaydetmek ve böbreğe (ve sırt bacaklarına) dolaşımın geri geldiğinden emin olmak önemlidir. Sürekli eğitim ve becerilerin yenilenmesi her zaman olduğu gibi önemlidir. İşlemin daha hızlı yapılması böbreğin iskemiye maruz kalma süresini azaltır. İskemi süresinin (aort ligasyonu) yaklaşık 5 dakika (en fazla 10 dk) tutulmasının böbreğe zarar vermediği gösterilmiştir.
Dökülme
Enjekte edilen formülasyon böbrek damarı üzerinden dolaşıma yeniden girerken diğer organlara dökülme riski göz önünde bulundurularak, enjekte edilen hacim minimumda tutulmalıdır. Maksimum 50 μL hacim öneriyoruz.
Yan etkiler (tromboz ve felç)
Başlangıçta modeli kurarken arka bacaklarda felç ile ilgili tutarlı olmayan sorunlar yaşadık. Ameliyat öncesi ilgili antikoagülan dozu (kuyruk damarında 10 IU heparin) sonra, bu yan etki önemli ölçüde azaldı. Alanında uzman uzmanlara danıştıktan sonra, atrömatik cerrahi ile çalışma konusunda daha da dikkatli olmaya başladık, yani hiçbir dokuda sıkışma yok ve mümkün olduğunca az alana dokunuyoruz. Birlikte yapılan bu eylemler felç sıklığını yaklaşık% 50'den neredeyse hiçe düşürdü.
Başlangıçta yöntem geliştirme sırasında, kesi deliğini kapatmak için renal artere antikoagülan doku uyguladık. Aortta basınç çok daha yüksek olduğu için aort içine enjeksiyon yaparken bu mümkün değildi. Antikoagülan ayrıca damar lümenine girerse tromboz riskini arttırır.
Adventitia çok trombojenik olduğu için dikiş yaparken aortu lümeninde adventitia maruz kalmadığından emin olun. Ayrıca uyluk dikişi yaparak herhangi bir ters yara kenarlarından veya aortu daraltmaktan kaçının.
Artık formülasyonları doğrudan böbreğe ulaştırmak için yerleşik bir yöntemimiz var.
Disclosures
Yazarın açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
RRSSC'den René Remie'ye, özel tasarlanmış bir kateter üretiminde işbirliği için tekniği ve Instech laboratuvarlarını ince ayar yapmama yardımcı olduğu için teşekkürler. AstraZeneca Ar-Ge'deki tüm meslektaşlarına, videoyu sesle tamamladığınız için Xerox'un yanı sıra ipuçları ve püf noktaları içeren verimli tartışmalar için de büyük bir teşekkür.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt hook 5mm 8/pack | Cooper surgical | 3316-8G | |
| ETHILON Nylon Suture 11/0 | Ethicon | W2881 | For vessel |
| Microsurgery forceps curved | Karo Pharma | FRC-15 RM-8 | |
| Microsurgery forceps straight | Karo Pharma | FRS-15 RM-8 | |
| Mouse renal artery cannula, 3mm 32ga stainless steel, 10cm 2Fr PU, fits 25ga | Instech | C07SS-MRA1813 | |
| Vicryl, 6-0, BV-1 needle | Angthos | W9575 | For abdominal cavity |
References
- Porvasnik, S. L., Mah, C., Polyak, S. Targeting Murine Small Bowel and Colon Through Selective Superior Mesenteric Artery Injection. Microsurgery. 30 (6), 487-493 (2010).
- Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study. Gene Therapy. 21 (6), 618-628 (2014).
- Cai, J., et al. Maximum efficacy of mesenchymal stem cells in rat model of renal ischemia-reperfusion injury: renal artery administration with optimal numbers. PLoS One. 9 (3), 92347 (2014).
- Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery. Journal of Visualized Experiments. (119), e54804 (2017).
- Monteiro Carvalho Mori da Cunha, M. G., et al. A Surgical Technique for Homogenous Renal Distribution of Substances in Rats. European Surgical Research. 51, 58-65 (2013).
- De Jong, W. H., et al. Particle size-dependent organ distribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Biomaterials. 29 (12), 1912-1919 (2008).
- Ullah, M., et al. A Novel Approach to Deliver Therapeutic Extracellular Vesicles Directly into the Mouse Kidney via Its Arterial Blood Supply. Cells. 9 (4), 937 (2020).
