Summary
Wir liefern ein detailliertes Protokoll für elektroporationsvermittelte RNA-Interferenzen bei Insekten der Ordnung Odonata (Libellen und Damselflies) mit dem Blauschwanz-Dammselbst (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) und der pied Skimmer Libelle (Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera).
Abstract
Libellen und Damselflies (Ordnung Odonata) stellen eines der angestammtesten Insekten mit Metamorphose dar, in dem sie ihren Lebensraum, ihre Morphologie und ihr Verhalten drastisch von Wasserlarven zu terrestrischen/luftigen Erwachsenen ohne Pupalstadium verändern. Odonata Erwachsene haben eine gut entwickelte Farbsicht und zeigen eine bemerkenswerte Vielfalt in Körperfarben und Mustern über Geschlechter, Stadien und Arten hinweg. Während viele ökologische und Verhaltensstudien an Odonata durchgeführt wurden, waren molekulargenetische Studien vor allem aufgrund der Schwierigkeit, Genfunktionsanalysen auf Odonata anzuwenden, rar. Zum Beispiel ist RNA-Interferenz (RNAi) weniger wirksam in der Odonata, wie in der Lepidoptera berichtet. Um dieses Problem zu lösen, haben wir erfolgreich eine RNAi-Methode in Kombination mit In-vivo-Elektroporation etabliert. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll mit einem Video der elektroporationsvermittelten RNAi-Methode wie folgt zur Verfügung: Herstellung von Larven, Artenidentifikation, Herstellung von dsRNA/siRNA-Lösung und Injektionsnadeln, eiskalte Anästhesie von Larven, dsRNA/siRNA-Injektion, In-vivo-Elektroporation und individuelle Aufzucht bis zur Erwachsenenbildung. Die elektroporationsvermittelte RNAi-Methode ist sowohl auf Damselflies (Unterordnung Zygoptera) als auch für Libellen (Unterordnung Anisoptera) anwendbar. In diesem Protokoll stellen wir die Methoden für die Blauschwanz-Mutter Ischnura senegalensis (Coenagrionidae) als Beispiel für verdammte Arten und die pied Skimmer Libelle Pseudothemis zonata (Libellulidae) als ein weiteres Beispiel für Libellenarten vor. Als repräsentative Beispiele zeigen wir die Ergebnisse von RNAi, die auf das Melanin-Synthesegen Multikupferoxidase 2abzielen. Diese RNAi-Methode wird das Verständnis verschiedener Genfunktionen erleichtern, die an Metamorphose, Morphogenese, Farbmusterbildung und anderen biologischen Merkmalen von Odonata beteiligt sind. Darüber hinaus kann dieses Protokoll allgemein auf Nicht-Modellorganismen anwendbar sein, bei denen RNAi aufgrund der Ineffizienz und geringen Penetranz bei der Gensuppression weniger effektiv ist.
Introduction
Libellen und Damselflies (die Ordnung Odonata) gehören zu den angestammtesten Insektengruppen, die "Metamorphose"1,2zeigen. Durch Metamorphose verändern sie ihren Lebensraum, ihre Morphologie und ihr Verhalten drastisch von Wasserlarven zu terrestrischen/luftigen Erwachsenen3. Odonata Erwachsene haben eine gut entwickelte Farbsicht und repräsentieren eine bemerkenswerte Vielfalt in Körperfarben und Mustern über Geschlechter, Stadien und Arten3,4,5. Während viele ökologische und Verhaltensstudien an Odonata durchgeführt wurden6,7, molekulargenetische Studien wurden vor allem durch die Schwierigkeit bei der Anwendung von Gen-Funktionsanalyse auf Odonata behindert.
Die konventionelle RNA-Interferenzmethode (RNAi), bei der doppelsträngige RNA (dsRNA) injiziert wird, um die Funktion des Gens von Interesse8zu unterdrücken, erwies sich bei Odonata-Insekten9als ineffektiv, wie in Lepidopteran-Insekten10berichtet. Auf der anderen Seite haben frühere Berichte darauf hingedeutet, dass elektroporationsvermittelte RNAi bei Lepidopteran-Arten wirksam ist, insbesondere in epidermalen Geweben11,12,13. Kürzlich haben wir herausgefunden, dass die elektroporationsvermittelte RNAi effektiv in der winzigen Libelle Nannophya pygmaea (Libellulidae: Anisoptera)9funktioniert, aber N. pygmaea ist eine relativ seltene Art und daher nicht für molekulargenetische Studien geeignet.
Die meisten Odonata-Arten werden in eine der beiden Unterordnungen, Zygoptera (damselflies) oder Anisoptera (echte Libellen)3eingeteilt. Hier konzentrierten wir uns auf die blauschwanzige MutterIschnura senegalensis (Coenagrionidae; Abbildung 1A) als repräsentative Zygopteran-Art und die pied Skimmer Libelle Pseudothemis zonata (Libellulidae; Abbildung 1B) als repräsentative Anisopteran-Art. Die beiden Arten gehören zu den häufigsten Odonata-Arten in natürlichen und städtischen Teichen in Japan, einschließlich der in Tsukuba City, und wir können viele Larven der beiden Arten auf dem Feld sammeln. Kürzlich haben wir ein Laborzuchtsystem für einzelne Larven von I. senegalensiseingeführt, das eine kontinuierliche Überwachung der Entwicklung und Morphogenese der Odonata-Larven im Detail ermöglichte14.
In diesem Bericht bieten wir eine verfeinerte Methode und ein Videoprotokoll für die elektroporationsvermittelten RNAi in I. senegalensis und P. zonata. In Japan, I. senegalensis und Ischnura asiatica, die genetisch nahe sind, sind oft sympatrischgefunden 15, und sie sind schwer zu unterscheiden in Larven16. Wir beschreiben auch, wie zwei Ischnura-Arten durch Restriktionsfragmentlänge Polymorphismus (RFLP) unterschieden werden können.
Zur Beurteilung der Wirksamkeit des elektroporationsvermittelten RNAi wählen wir das Multicopperoxidase-2-Gen (MCO2; auch bekannt als laccase2) als repräsentatives Zielgen, aufgrund des sichtbaren Phänotyps der blasseren Nagelhautfarbe beim Knockdown der Genexpression9. MCO2 ist bekannt, dass wesentlich für die Verdunkelung der Epidermis bei einer Vielzahl von Insektenarten17,18.
Protocol
ANMERKUNG: Das Gesamtschema der Protokolle ist in Abbildung 1dargestellt.
1. Vorbereitung von Larven von Libellen oder Damselflies.
- Sammeln Sie Larven im Feld mit einem Handnetz.
HINWEIS: I. senegalensis Larven klammern sich oft an Wasserpflanzen, die auf der Wasseroberfläche schwimmen, während P. zonata Larven oft zwischen Blattstreu am Boden bleiben. In Tsukuba City werden die letzten Instarlarven von I. senegalensis hauptsächlich von März bis Juni und die von P. zonata von Mai bis Juni gefunden. I. senegalensis Larven können aus Eiern im Labor14aufgezogen werden, aber die im Feld gesammelten Larven haben die deutlich höhere Erfolgsrate der Erwachsenenbildung. - Artenidentifikation durch Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) von PCR-verstärkten Produkten.
HINWEIS: Dieser Schritt ist nur notwendig, wenn die Art ist schwer zu identifizieren, aus dem Aussehen der Larven, wie in I. senegalensis.- Halten Sie einen der kaudalen Kiemen einer Larve mit Zangen. Dann fällt die Larve von ihrem kaudalen Kiemen selbst (verursacht Autotomie).
HINWEIS: Larven von Zygopteran damselflies haben in der Regel drei kaudalKiemen (Abbildung 1A). Wenn sie von einem Raubtier angegriffen werden, können sie ihre eigenen kaudalen Kiemen abnehmen, um zu entkommen. Wenn die caudalKiede nicht verfügbar ist, wird ein Teil des Beins seziert. - Legen Sie eine kaudale Kieme in 100 l PBS-Lösung [0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,115% Na2HPO4und 0,02% KH2PO4 (w/v)] und homogenisieren Sie mit einem Handmischer mit einem Ablagerungsschädling.
- Drehen Sie das Gemisch 10 Sekunden lang bei 5.000 x g aus und unterziehen Sie 0,5 l des Überstandes der PCR-Verstärkung mit DNA-Polymerase und Primern, um den internen transkribierten Abstandshalter 1 (ITS1) Bereich der Kern-DNA zu verstärken.
HINWEIS: Führen Sie die PCR gemäß dem Herstellerprotokoll aus. Die Kombination von ITS-F0 (5'- GGA AAG ATG GCC AAA CTT GA -3') und 5.8S-AS1 (5'- GCC GGC CCT CAG CCA G -3') Primer kann die ITS1-Region in fast allen Odonata-Arten verstärken19. - Inkubieren Sie das Gemisch aus 1 l PCR-verstärktem Produkt, 0,3 l 10x M Puffer, 0,1 l DraI-Restriktionsenzym und 1,6 l Wasser bei 37 °C für 1 h.
HINWEIS: Wählen Sie die besten Restriktionsenzyme, abhängig von der Kombination der Arten. Wenn es keine Einschränkungsenzyme gibt, die für die Artenidentifikation geeignet sind, bestätigen Sie dies durch DNA-Sequenzierung. - Tragen Sie 2 l der Produkte mit Ladefarbstoff auf 2% Agarose-Gel und führen Elektrophorese.
HINWEIS: Es ist schwierig, Arten zu identifizieren, wenn 1% oder 1,5% Agarose-Gel verwendet werden. - Überprüfen Sie das Elektrophoresemuster, um die Art zu identifizieren (Abbildung 2).
HINWEIS: RFLP-Muster sind art- und bevölkerungsabhängig. In Tsukuba Population, I. asiatica hat eine Hauptband von 400-500 bp, während I. senegalensis hat eine Hauptband von etwa 200 bp und eine zusätzliche Band von weniger als 100 bp (eine Pfeilspitze in Abbildung 2). Die ITS1-Region existiert in mehreren Kopien im Genom, und bei Ischnura-Arten ist der Mikrosatellitenpolymorphismus innerhalb der ITS1-Region oft in derselben Person vorhanden, was das Muster der RFLPs beeinflusst.
- Halten Sie einen der kaudalen Kiemen einer Larve mit Zangen. Dann fällt die Larve von ihrem kaudalen Kiemen selbst (verursacht Autotomie).
- Die gesammelten Larven im Labor aufziehen, bis sie für RNAi verwendet werden.
- Legen Sie jede Larve separat in jeden Brunnen einer 12-Well-Platte mit ca. 3 ml Wasser.
HINWEIS: I. senegalensis Larven müssen einzeln gehalten werden, weil sie sich häufig gegenseitig kannibalisieren, während P. zonata Larven in einer Gruppe gehalten werden können, weil sie selten Kannibalisieren. - Füttern Sie I. senegalensis Larven mit Artemia Solegarnelen jeden Tag und P. zonata Larven mit Blutwürmern und/oder TubifexWürmern mindestens zweimal pro Woche, bis sie zum geeigneten Entwicklungsstadium für RNAi heranwachsen.
HINWEIS: Häufige Fütterung ist entscheidend, um die Erfolgsrate der Erwachsenen-Bildung zu erhöhen. - Das Wasser wechseln, sobald es mit Kot oder Resten verschmutzt wird.
HINWEIS: Häufige Wasserwechsel sind auch wichtig, um die Erfolgsrate der Erwachsenenbildung zu erhöhen. - Beurteilen Sie die geeignete Entwicklungsphase für RNAi.
HINWEIS: Die letzten Instar-Larven von I. senegalensis können in fünf Entwicklungsstadien14,20eingeteilt werden. Die erste Stufe (Stufe A, bevor sich die Flügel zu dehnen beginnen) oder die zweite Stufe (Stufe B) der letzten Instar-Larven eignet sich für RNAi-Experimente, wenn man den klaren Phänotyp von RNAi nach erwachsenen Aufkommen betrachtet (siehe Diskussion). In P. zonatawurden in dieser Studie die letzten Instarlarven vor der Flügelausdehnung (entsprechend Stadium A von I. senegalensis)verwendet.
- Legen Sie jede Larve separat in jeden Brunnen einer 12-Well-Platte mit ca. 3 ml Wasser.
2. Herstellung von dsRNA/siRNA-Lösung und Injektionsnadeln für RNAi.
HINWEIS: Wählen Sie entweder kleine störende RNA (siRNA) (Schritt 2.1) oder doppelsträngige RNA (dsRNA) (Schritt 2.2) als Lösung für RNAi.
- Vorbereitung der siRNA-Lösung
- Design siRNA mit siDirect Programm Version 2.0 (http://sidirect2.rnai.jp/)21, nach den Richtlinien zuvor in Lepidopteran Insekten22berichtet .
- Erhalten Sie kommerziell synthetisierte siRNA.
HINWEIS: Die Sequenzen von siRNA, die auf das MCO2-Gen von I. senegalensis abzielen, wurden in dieser Studie wie folgt verwendet: 5'- GCA CUU UCC GUU AUC AAU AUA -3' für Sinnesstrang und 5'- UAU UGA UAA CGG AAA GUG CUC -3' für Antisense-Strang. Als Negativkontrolle waren die Sequenzen von siRNA, die auf verbessertes grünes fluoreszierendes Protein (EGFP) Gen abzielten, wie folgt: 5'- GCA UCA AGG UGA ACU UCA AGA -3' für Sinnesstrang und 5'- UUG AAG UUC ACC UUG AUG CCG -3' für Antisense-Strang11. - Verdünnen Sie die siRNA auf 100 m mit Injektionspuffer [100 mM CH3COOK, 2 mM Mg(CH3COO)2, 30 mM HEPES-KOH, pH 7.4]22.
- Bei -80 °C bis zur Verwendung lagern.
- Vorbereitung der dsRNA-Lösung.
- Wählen Sie eine 300-400 bp Region für dsRNA mit primer3 Programmversion 4.1.0 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/)23 und entwerfen Sie die Primer-Sets.
- Erhalten Sie kommerziell synthetisierte Primer-Sets.
ANMERKUNG: Um Vorlagen für die dsRNA-Synthese zu erstellen, wurden die in dieser Studie verwendeten Primer-Sets wie folgt verwendet: (5'- GCC TGT CAG CTT TGT CTT CC -3' für Vorwärtsprimer und 5'- GGT GTC TGG CGG ACA ACT AT -3' für Reverse Primer) für MCO2-Gene von I. senegalensis (IsMCO2, Beitrittsnummer. LC589180) und (5'- CCG CAC AGC TCA CTA TTC AA -3' für Vorwärtsgrundierung und 5'- GGA GGA TTC CTT CAT CGA CA -3' für Reverse Primer) für MCO2-Gene von P. zonata (PzMCO2, Beitritts-Nr. LC589179). Als Negativkontrolle waren die Grundierungssets für dsRNA, die auf β-Lactamase -bla) Gen auf dem Klonvektor abzielten (5'- CTA TGT GGC GCG GTA TTA TtA T -3' für Vorwärtsprimer und 5'- CAG AAG TGG TCC TGC TGC T -3' für Reverse Primer). - Extrahieren Sie RNA aus Odonata-Larven mit einem handelsüblichen RNA-Extraktionskit und führen Sie die cDNA-Synthese mit Reverse-Transkriptase gemäß dem Herstellerprotokoll durch.
HINWEIS: CDNA-Bibliothek für RNA-Sequenzierungsanalyse vorbereitet kann auch verwendet werden. - Verstärken Sie die Zielsequenzen mit der synthetisierten cDNA und dem entworfenen Primer-Set und klonen Sie sie mithilfe einer kommerziellen Ligase gemäß dem Herstellerprotokoll in den Klonvektor.
- Verwandeln Sie das Plasmid in E. coli-kompetente Zellen und nehmen Sie nach der nächtlichen Inkubation eine einzige Kolonie auf.
- PCR-verstärkung den Insert-Bereich mit Primern auf dem Vektor.
- Bestätigen Sie die geklonte Sequenz durch Sanger-Sequenzierung.
- PCR-verstärkung den Einsatz mit Vektorprimern, die die T7-Polymerase-Promotorsequenz24, 25enthalten.
HINWEIS: In dieser Studie wurden folgende Primer verwendet: T7-F (5' - TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC TAG TCA TAT GGA T - 3') und T7-R (5'- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC CCG GGG ATC CGA T - 3') 25. - Reinigen Sie das PCR-Produkt mit dem PCR-Reinigungskit gemäß dem Herstellerprotokoll, löschen Sie die DNA mit 50 l destilliertem Wasser und konzentrieren Sie die eluierte DNA-Lösung mit einem Zentrifugalverdampfer auf ca. 10 l.
- Synthesize dsRNA durch In-vitro-Transkription nach dem Herstellerprotokoll. Verwenden Sie insgesamt 1000 ng Template DNA und elute synthetisierte dsRNA mit 100 l Elutionspuffer.
- Messen Sie die Konzentration von dsRNA mit einem Spektralphotometer und bestätigen Sie die Qualität von dsRNA durch Elektrophorese auf einem 1,5% Agarose-Gel.
HINWEIS: Ein einzelnes Band kann gesehen werden, wenn die dsRNA-Synthese erfolgreich ist. - DsRNA mit Elutionspuffer auf 1000 ng/l verdünnen und bis zur Anwendung bei -20 °C lagern.
- Herstellung von Injektionsnadeln
- Ziehen Sie eine Glaskapillare mit einem Glasnadelzieher.
- Legen Sie die Spitze der gezogenen Kapillare auf ein doppelseitiges Klebeband und brechen Sie die Spitze der Kapillare mit Zangen.
- Stellen Sie die Kapillare auf einen Injektor ein.
HINWEIS: Es ist einfacher, die Kapillare zu handhaben, wenn Sie Nitrilhandschuhe tragen. - Last siRNA/dsRNA Lösung auf die vorbereitete Kapillare.
HINWEIS: Verwenden Sie die Kapillare nicht wiederholt, da die Spitze der injizierten Kapillare mit Schmutz verstopft werden kann, da die im Feld gesammelten Larven im Schlamm lebten.
3. siRNA/dsRNA-Injektion
HINWEIS: Das Verfahren ist etwas anders für Damselflies (Schritt 3.1) und Libellen (Schritt 3.2).
- Injektion in eine Zygopteran (verdammt) Larve (z.B. I. senegalensis).
- Anästhetisieren Sie eine Larve, die 50-70 Sekunden lang mit einem nassen Papier auf zerkleinertem Eis bedeckt ist (Abbildung 3A-C).
ANMERKUNG: Die Dauer der eiskalten Anästhesie hängt vom Zustand der Larve ab; Wenn sich die Larve nach 70 Sekunden eiskalter Anästhesie zu bewegen beginnt, werden weitere 70 Sekunden eiskalte Anästhesie aufgetragen. Für Larven, die sich selten bewegen (z.B. P. zonata), ist dieses Verfahren nicht unbedingt erforderlich. - Befestigen Sie zwei Stifte auf beiden Seiten des Prothorax und fixieren Sie die Larve an einem festen Ständer (z. B. ein Stück Styropor) (Abbildung 3D).
HINWEIS: Passen Sie die Position und Anzahl der Pins an, je nach Injektionsort. - Dehnen Sie die intersegmentale Membran zwischen dem 7. und 8. Bauchsegment für RNAi im Bauch oder zwischen dem Prothorax und Synthorax (geschmolzenes Mesothorax und Metathorax) für RNAi im Thorax mit Händen und Zangen.
- Halten Sie die segmentübergreifende Membran von Hand gestreckt.
- Setzen Sie die Spitze der vorbereiteten Kapillare in die gestreckte intersegmentale Membran ein (Abbildung 3D, 3F).
- Injizieren Sie 1 L siRNA/dsRNA-Lösung.
- Anästhetisieren Sie eine Larve, die 50-70 Sekunden lang mit einem nassen Papier auf zerkleinertem Eis bedeckt ist (Abbildung 3A-C).
- Injektion in eine Anisopteran (Libelle) Larve (z.B. P. zonata).
- Wischen Sie das Wasser mit einem Papiertuch von der Larvenoberfläche ab.
- Bei Bedarf zwei Stifte auf beiden Seiten des Prothorax befestigen und die Larve an einem festen Ständer (z.B. einem Stück Styropor) befestigen (Abbildung 3H).
HINWEIS: Passen Sie die Position und Anzahl der Pins an, je nach Injektionsort. Im Fall von P. zonataist es nicht unbedingt notwendig, die Larven bei diesem Schritt mit Stiften zu fixieren. - Dehnen Sie die segmentübergreifende Membran zwischen dem 4. und 5. Bauchsegment von Hand.
- Machen Sie ein kleines Loch mit einer feinen Nadel in der segmentübergreifenden Membran zwischen dem 4. und 5. Bauchsegment.
HINWEIS: Dieses Verfahren ist für viele Anisopteran (Dragonfly) Arten notwendig, da die intersegmentale Membran zu schwer ist, eine Glaskapillare direkt einzufügen. - Setzen Sie die Spitze der vorbereiteten Kapillare in das vorbereitete Loch ein (Abbildung 3I).
HINWEIS: Wie in Abbildung 3Hdargestellt, entspricht ein Teil der Dorsalseite der Larven der ventralen Seite des Erwachsenen, so dass der Phänotyp ventral erscheint, wenn er wie in Abbildung 3H-Jbehandelt wird. - Injizieren Sie 1 L siRNA/dsRNA-Lösung.
4. In-vivo-Elektroporation
- Fügen Sie bei Bedarf weitere Stifte hinzu, um die Larve an einem festen Standfuß (z. B. einem Stück Styropor) zu fixieren.
- Nach der Injektion der siRNA/dsRNA-Lösung zwei Tröpfchen Ultraschallgel mit Zangen auf die Larvenoberfläche auftragen.
- Legen Sie Elektroden auf das Ultraschallgel, wobei die positive Elektrode auf der Seite mit der siRNA/dsRNA-Lösung und einer negativen Elektrode auf der gegenüberliegenden Seite injiziert wird (Abbildung 3E, 3G, 3J).
HINWEIS: Berühren Sie nicht direkt die Epidermis der Larve, um die brennende Wirkung der Elektroporation zu vermeiden. - Generieren Sie 10-fache Elektroporationsimpulse (je 280 ms/s) mit einem Elektroporator.
HINWEIS: Passen Sie die Spannung der Elektroporation an, abhängig von der Art, den Stadien und dem Gewebe. In dieser Studie wurden 25 V auf I. senegalensis und 45 V auf P. zonataangewendet. - Das restliche Gel auf der Oberfläche mit einem Papiertuch abwischen.
- Halten Sie die behandelten Larven etwa einen Tag auf einem nassen Papiertuch ruhen und am nächsten Tag in einen Aufzuchtkoffer geben.
5. Standortspezifische phänoseische Analyse
- I. senegalensis einzeln in einer Petrischale (5 cm Durchmesser) mit ca. 10 ml Wasser und einem Stück Papiertuch aufbewahren und P. zonata in einem Kunststoffkäfig mit Einem Einweg-Vlies (Eclosionskäfig14) aufbewahren.
- Für I. senegalensis,nachdem die Larven aufhören zu essen, bewegen Sie sie einzeln in einen Kunststoffkäfig mit einem Einweg-Vlies.
HINWEIS: Legen Sie nicht zwei oder mehr Larven in denselben Käfig. Andernfalls werden sie sich sofort kannibalisieren, nachdem sie erwachsen geworden sind. - Nach der Entstehung des Erwachsenen, beobachten und fotografieren Sie den Phänotyp um den Bereich, in dem die positive Elektrode für die Elektroporation platziert wurde.
HINWEIS: Der Phänotyp wird nur in Patches angezeigt. Phänotypen sind aufgrund einer unvollständigen Pigmentierung oft schwer sofort nach der Entstehung zu erkennen. - Um die Effizienz von RNAi (z.B. quantitative RT-PCR) zu untersuchen, wenn der Phänotyp sichtbar ist, sezieren Sie die Region und vergleichen Sie sie mit der Region ohne Phänotyp.
HINWEIS: Die Konzentrationen des RNAi-Phänotyps, d. h. Größe und Lage der Nagelhautentfärbung, weisen oft erhebliche Unterschiede zwischen individuen auf (siehe Abbildung 4). - Halten Sie die entstandenen Erwachsenen in 100% EtOH für zukünftige Analysen.
HINWEIS: Die Körperfarbe der Odonata-Art verblasst schnell nach dem Tod, daher ist es wichtig, sie in Ethanol zu lagern, bevor sie sterben. Ethanol verfärbt manchmal die Insekten, in solchen Fällen, dass die Insekten eingefroren werden, bevor sie sterben.
Representative Results
Wir wandten das obige Protokoll auf elektroporationsvermittelte RNAi an, die auf MCO2-Gen- und Negativkontrollgene abzielen (EGFP für siRNA und bla für dsRNA) (i) im Bauch von I. senegalensis (Abbildung 4), (ii) im Thorax von I. senegalensis (Abbildung 5) und (iii) im Bauch von P. zonata (Abbildung 6). Die Ergebnisse der RNAi-Experimente sind in Tabelle 1zusammengefasst. Da negativ geladene siRNA/dsRNA nur in positiv geladene Zellen integriert ist, wurden RNAi-Phänotypen um den Bereich beobachtet, in dem die positive Elektrode zur Elektroporation platziert wurde.
Sowohl in I. senegalensis als auch in P. zonatatrat die Hemmung der Melaninpigmentierung (d. h. schwarz, braun und rötlich braun) in Flecken um den Bereich auf, in dem die positive Elektrode platziert wurde (weiße Pfeilspitzen und gepunktete Linien in Abbildung 4, Abbildung 5und Abbildung 6), als MCO2 RNAi in Kombination mit Elektroporation durchgeführt wurde (Tabelle 1), wie zuvor in N. pygmaea9berichtet. Im Gegensatz dazu wurden keine phänotypischen Effekte um die Elektroporationsstelle beobachtet, als das Kontrollgen injiziert wurde (EGFP siRNA oder bla dsRNA) (Abbildung 4, Abbildung 5und Abbildung 6, Tabelle 1). Darüber hinaus hatte die Injektion des MCO2-Gens ohne Elektroporation keinen Einfluss auf die Pigmentierung von Erwachsenen (Abbildung 4, Tabelle 1), was darauf hindeutet, dass Elektroporation für RNAi in Odonata unerlässlich ist. Es sollte beachtet werden, dass die blauen, grünen und gelben Färbungen nicht durch die RNAi des MCO2-Gens beeinflusst werden, die an der Melaninsynthese in der Nagelhaut beteiligt ist, die plausibel die Tatsache widerspiegeln, dass diese Körperfarben Pigmentgranulaten zugeschrieben werden, die in den epidermalen Zellen vorhanden sind, die durch die transparente Nagelhaut26sichtbar sind. Wie in Abbildung 4dargestellt, wurden keine bemerkenswerten phänotypischen Unterschiede zwischen den Personen, die einer siRNA-Behandlung und einer dsRNA-Behandlung unterzogen wurden, festgestellt, während bei verschiedenen Personen, die der gleichen RNAi-Behandlung unterzogen wurden, erhebliche Unterschiede in Größe und Position des RNAi-Phänotyps beobachtet wurden (z. B. zwei Beispiele von IsMCO2 dsRNA in Abbildung 4).
Um das für die RNAi-Behandlung am besten geeignete Entwicklungsstadium zu bestimmen, verglichen wir die phänotypchenden Folgen der RNAi-Behandlung in fünf morphologischen Stadien (Stadium A-E) im endlichen Larven-Instern von I. senegalensis (Abbildung 7A). Die Durch MCO2 RNAi verursachte Hemmung der Melaninpigmentierung wurde bei allen erwachsenen Erwachsenen beobachtet, wenn sie in den Stadien A und B injiziert wurde (Abbildung 7C). Bei injektionen in den Stadien C und D, Unterdrückung der Melaninpigmentierung wurde sicherlich bei einigen erwachsenen erwachsenen beobachtet, aber andere Erwachsene zeigten abnormale Färbung durch Wunden verursacht (Abbildung 7B).
Abbildung 1:Elektroporationsvermittelte RNAi-Methoden in Odonata. A. Ischnura senegalensis (Coenagirionidae) als repräsentative Damselfly-Art. B. Pseudothemis zonata (Libellulidae) als repräsentative Libellenart. C. Das Gesamtschema der Protokolle. Blaue und orange Felder geben die Protokolle für I. senegalensis bzw. P. zonataan. Die violetten Kästchen zeigen die gemeinsamen Protokolle an, die auf beide Arten angewendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Ein repräsentatives Ergebnis der Aufrestriktionsfragmentlänge Polymorphismus (RFLP)-basierte Artenidentifikation für Ischnura-Arten. Pfeilspitze zeigt das I. senegalensis-spezifischeBand an. 1, 2, 4: I. asiatica, 3: I. senegalensis, M: 100-Base-Paarleiter-Marker. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3:Elektroporationsvermittelte RNAi-Methode in Odonata. A-C. Eiskalte Anästhesie von I. senegalensis. Pfeilspitzen weisen auf eine Larve hin. A. Eine Larve mit einem nassen Papier auf zerkleinertes Eis setzen. B. Vergrößerte Ansicht einer Larve auf Eis. C. Eine Larve, die mit einem nassen Papier auf Eis bedeckt ist. D-G. RNAi-Methode für I. senegalensis. D. Injektion in den Thorax. E. Elektroporation am Thorax. F. Injektion in den Bauch. G. Elektroporation am Bauch. H-J. RNAi-Methode für P. zonata. H. Ein kleines Loch am Bauch machen. Ich. Injektion in den Bauch. J. Elektroporation am Bauch. Pfeile zeigen den Punkt der Herstellung eines Lochs oder einer Injektion an. +, -: Positive/negative Seitenelektroden. Zahlen geben das Bauchsegment an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Dorsale Ansichten von RNAi-Phänotypen auf dem Bauch von I. senegalensis. Weiße Pfeilspitzen zeigen die Bereiche der unterdrückten Melanisierung an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Seitliche und dorsale Ansichten von RNAi-Phänotypen auf dem Thorax von I. senegalensis. Weiße Pfeilspitzen und gepunktete Linien zeigen die Bereiche der unterdrückten Pigmentierung an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Ventralansichten von RNAi-Phänotypen im Bauch von P. zonata. Weiße Pfeilspitzen und gepunktete Linien zeigen die Bereiche der unterdrückten Melanisierung an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Stufenabhängige IsMCO2 RNAi-Effekte während des letzten Larveninsterns von I.senegalensis. A. Morphologische Veränderungen in den zusammengesetzten Augen in fünf morphologischen Stadien (Stadium A-E) und die Anzahl der Tage bis zur Erwachsenenbildung in dieser Studie. Zahlen in Klammern stammen aus dem vorherigen Bericht14. B. Abnorme Pigmentierung durch Wunden. Pfeilspitze zeigt Elektroporationsstelle an. C. Die Wirkung von RNAi in fünf morphologischen Stadien auf die Pigmentierung von Erwachsenen in I. senegalensis. Die Zahl auf der Leiste gibt die Anzahl der Personen an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Spezies | I.senegalensis | P.zonata | |||||||||
| Injizierte Region | Bauch | Thorax | Bauch | ||||||||
| siRNA/dsRNA | Sirna | dsRNA | dsRNA | dsRNA | |||||||
| Zielgen | IsMCO2 | EGFP | IsMCO2 | IsMCO2 | Bla | IsMCO2 | Bla | PzMCO2 | PzMCO2 | Bla | |
| Electroporation | + | + | + | - | + | + | + | + | - | + | |
| Injizierte Larven | 22 | 25 | 30 | 6 | 53 | 12 | 20 | 17 | 5 | 9 | |
| Entstandene Erwachsene | 7 | 6 | 13 | 4 | 40 | 11 | 14 | 11 | 2 | 5 | |
| Erwachsene mit weniger pigmentierten Regionen (Verhältnis) | 7 (100%) |
0 (0%) |
13 (100%) |
0 (0%) |
0 (0%) |
10 (91%) |
0 (0%) |
11 (100%) |
0 (0%) |
0 (0%) |
|
Tabelle 1. Die Wirkung von RNAi auf die Pigmentierung von Erwachsenen bei I. senegalensis und P. zonata. Die Ergebnisse der Stufe A werden in I. senegalensisdargestellt. IsMCO2: Multicopperoxidase 2 Gen von I. senegalensis, EGFP: Enhanced green fluorescent protein gene, bla: beta lactamase gene from pGEM-T Easy Vector, PzMCO2: multicopper oxidase 2 gene of P. zonata. Die Ergebnisse für die Kontrollgene stellen die Gesamtzahl der Experimente dar, die die Autoren bisher durchgeführt haben.
Discussion
Tödlichheit der RNAi-Behandlung
Wir fanden heraus, dass die Letalität der RNAi-Behandlung stark von der Aufzuchtgeschichte und dem Zustand der Odonata-Larven abhängt. Die Larven kurz nach der Sammlung im Feld sind in der Regel gesund und weisen nach der elektroporationsvermittelten RNAi-Behandlung niedrige Sterblichkeitsraten auf. Im Gegensatz dazu leiden die Larven, die über einen längeren Zeitraum (z. B. einen Monat) im Labor aufgezogen werden, tendenziell unter niedrigen Erfolgsraten der Erwachsenenbildung. In I. senegalensiskönnen anstelle der im Feld gesammelten Larven die im Labor von Eiern gezüchteten Larven14verwendet werden, aber die Erfolgsraten von RNAi mit den im Labor gezüchteten Larven sind in der Regel wesentlich niedriger (viele Individuen starben während der Metamorphose) als diejenigen, die die feldgesammelten Larven verwendeten. Darüber hinaus sind häufige Larvenfütterung und saubere Seimtheitierung wichtig, um die Erfolgsraten der Erwachsenenbildung zu erhöhen und die Tödlichkeit der RNAi-Behandlung zu reduzieren.
Effizienz der RNAi-Behandlung
Wie oben beschrieben, zeigten die Konzentrationen des RNAi-Phänotyps, nämlich Größe und Lage der Nagelhautentfärbung, oft erhebliche Unterschiede zwischen Individuen, die der gleichen RNAi-Behandlung unterzogen wurden (z. B. Abbildung 4), aber die Konzentrationen der phänotypischen Penetranz scheinen zwischen den Odonata-Arten bemerkenswert unterschiedlich zu sein. Die beobachteten phänotischen Regionen waren in I. senegalensis (Abbildungen 4-5) größer und prominenter als in P. zonata (Abbildung 6) und N. pygmaea9. Dieser Unterschied kann auf die Dicke der Nagelhaut auf der Larvenoberfläche zurückzuführen sein, wenn man bedenkt, dass die Nagelhaut von I. senegalensis dünner ist als die Nagelhaut von P. zonata und N. pygmaea). Bei der Untersuchung wurde kein eindeutiger Unterschied zwischen den Wirkungen von siRNA und dsRNA (Abbildung 4, Tabelle 1) erkannt.
Angemessene Entwicklungsphase für RNAi
Es sollte beachtet werden, dass eine richtige Larveninszenierung wichtig ist, um RNAi effizient durchzuführen. Die Hemmung der Pigmentierung von Erwachsenen wurde durch MCO2 RNAi vor dem Stadium D (ca. 3 Tage vor erwachsenen Aufkommen) verursacht, was mit dem vorherigen Bericht über N. pygmaea9übereinstimmt. Die RNAi-Phänotypen, die bei der Injektion in den Stadien C und D beobachtet wurden, waren weniger auffällig als die in den Stadien A und B behandelten, was darauf hindeutet, dass die Stufen C und D zu spät sein könnten, um die Genexpression ausreichend zu unterdrücken. Der geeignete Zeitpunkt für die RNAi-Behandlung hängt vom Timing der Genexpression ab, und das MCO2-Gen zeigt eine vorübergehend hohe Expression während der Erwachsenenbildung9, wie bei anderen Insekten17,18. Im Stinkbug Plautia staliwurde ab Tag 4 nach der Injektion27der RNAi-Knockdown des MCO2-Gens beobachtet, was mit den vorliegenden Ergebnissen übereinstimmt.
Unsere vorherige Studie über I. senegalensis zeigte, dass nach dem Stadium B, Tage bis zur Erwachsenenbildung zeigen relativ geringe Variationen unter der Mehrheit der endgültigen Instar Larven, was darauf hindeutet, dass das Stadium B kann dem Beginn des Prozesses in Richtung Erwachsenen-Entstehen entsprechen, nach dem die Entwicklungsprozesse für Metamorphose in einer präfixen und koordinierten Weise14ablaufen. Morphologische Anomalien, die durch Wunden verursacht wurden, wurden häufig beobachtet, wenn die Larven in den Stadien C und D RNAi behandelt wurden (Abbildung 7B, 7C). Dies ist wahrscheinlich mit einem dramatischen Fortschreiten der Metamorphose während dieser Stadien verbunden, was darauf hindeutet, dass eine RNAi-Behandlung von der Stufe C und weiter vermieden werden sollte. Zusammenfassend empfehlen wir, dass endgültige Instarlarven im Stadium A oder B (oder in der Phase vor der deutlichen Ausdehnung der Larvenflügel) für RNAi-Experimente verwendet werden sollten.
Nützlichkeit und Überlegenheit der elektroporationsvermittelten RNAi-Methode
Die herkömmliche RNAi ist eine einfache und leistungsfähige experimentelle Methode, aber einige Insektenlinien wie Schmetterlinge10, Blattläuse28 und Libellen9 weisen eine geringe RNAi-Effizienz auf, für die die Etablierung von Genfunktionsanalysen eine große Herausforderung darstellt. In dieser Studie fanden wir heraus, dass elektroporationsvermittelte RNAi lokale Gensuppression bei Libellen mit fast 100% Effizienz induzieren können, zumindest in Epidermis, wenn sie in geeigneten Entwicklungsstadien behandelt werden (Tabelle 1). Kürzlich wurden CRISPR/Cas9-basierte Genknockouts erfolgreich auf eine Vielzahl von Insekten angewendet und bieten ein leistungsfähiges molekulargenetisches Werkzeug für Nicht-Modellorganismen29. Hier weisen wir jedoch darauf hin, dass CRISPR/Cas9 sicherlich großartig ist, aber die elektroporationsvermittelte RNAi-Methode kann CRISPR/Cas9 in mancher Hinsicht überlegen sein.
Erstens kann bei der elektroporationsvermittelten RNAi-Methode der Körperbereich, in dem RNAi-Phänotypen auftreten, durch die Position der positiven Elektrode bei der Elektroporation leicht experimentell gesteuert werden. Da die Region, in der die Genexpression unterdrückt wird, um den Bereich begrenzt ist, in dem die positive Elektrode platziert wurde, können die RNAi-Phänotypen leicht mit den Kontrollphänotypen nebeneinander im selben Individuum verglichen werden. Zweitens ist die elektroporationsvermittelte RNAi im Vergleich zur CRISPR/Cas9-Methode, bei der injizierte Eier bis ins Erwachsenenalter aufgezogen werden müssen, insofern überlegen, als die Gen-Knockdown-Phänotypen in der Regel in viel kürzerer Zeit beobachtet werden können. Zum Beispiel dauert es drei bis vier Monate für I. senegalensis und ein bis zwei Jahre für P. zonata von Eiern bis Erwachsene14,30. Um jedoch RNAi-Phänotypen innerhalb der erwachsenen Epidermis zu beobachten, dauert es weniger als einen Monat von der dsRNA-Injektion in die endgültige Instar-Larven im Stadium B bis zur Erwachsenenbildung für I. senegalensis und P. zonata (Abbildung 7). Drittens führt die elektroporationsvermittelte RNAi-Methode zu einer dsRNA-Injektion in große Larven, was einfacher ist als die Mikroinjektion in winzige Eier, die für die CRISPR/Cas9-Methode erforderlich sind. Darüber hinaus ist die elektroporationsvermittelte RNAi auf Insektenarten anwendbar, deren neu gelegte Eier schwer zu sammeln sind. Zum Beispiel legen Weibchen von P. zonata während des Fluges Eier auf schwimmende Pflanzen auf der Wasseroberfläche, und so ist es schwierig, ihre Eier sowohl auf dem Feld als auch im Labor zu sammeln. Daher erwarten wir, dass dieses Protokoll allgemein auf Nicht-Modellorganismen anwendbar sein kann, bei denen die herkömmliche RNAi-Methode nicht effizient funktioniert.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Minoru Moriyama für die technische Beratung und Unterstützung, Bin Hirota und Ryutaro Suzuki für das Sammeln von Odonata Larven und Misa Shinya für hilfreiche Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI Grant Numbers JP18J21561 an GO und JP18H02491, JP18H04893, JP19H03287 und JP20H04936 an RF unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plate | Violamo | VTC-P12 | For rearing larvae before injection |
| Brine shrimp eggs | JAPAN PET DESIGN | 4975677012396 | |
| Calibrated micropipette (1-5 µL) | Drummond | 2-000-001-90 | |
| Deposit pestle 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | K749520-0090 | |
| Digital high defenition microscope camera | Leica Microsystems | MC170HD | |
| Disposable non-woven mesh | HAKUGEN EARTH | DSC-105A | |
| DNA Ligation Kit Ver.2.1 | Takara Bio | 6022 | |
| DraI | Takara Bio | 1037A | |
| Electrode (1mmφ) | NEPAGENE | CUY650P1 | |
| Electroporator | CellProduce | Cure-gene | |
| Forceps | KOWA Forceps Industry | K-10 No1 | |
| Glass needle puller | NARISHIGE | PN-3 | |
| Hand mixer | AS ONE | 1-229-02 | |
| Hand net | HOGA | IS33-3B | |
| HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 346-01373 | For injection buffer |
| Insect pin capitate No. 3 | Shiga Konchu Fukyusha | N230 | For fixing larvae |
| KCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | For PBS |
| KH2PO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 169-04245 | For PBS |
| KOAc | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 160-03175 | For injection buffer |
| KOH | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 168-21815 | For injection buffer |
| Laboratory Jack (150x150) | AS ONE | 1-4642-11 | For adjusting the position of the manipulator |
| LOGIQLEAN Gel for Ultrasound Hard type | GE Healthcare | 2369385 | |
| Manipulator | Muromachi Kikai Co., Ltd. | SJ-1 | For adjusting the position of the injector and the capillary |
| MEGAscript RNAi kit | Thermo Fisher Scientific | AM1626 | |
| Mg(OAc)2 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 130-00095 | For injection buffer |
| Na2HPO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02865 | For PBS |
| NaCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 191-01665 | For PBS |
| Petri dish (5 cm diameter) | Iwaki | 1010-060 | For rearing injected larvae |
| Pneumatic Injector | NARISHIGE | IM-12 | |
| pT7Blue T-Vector | Novagen | 69820 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | |
| RNAiso Plus | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 9109 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74106 | |
| Shiga micro insect pin with stainless headless | Shiga Konchu Fukyusha | N251 | For making a small hole |
| Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | S8APO | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | |
| TaKaRa Ex Taq | Takara Bio | RR001B | For PCR-amplification from plasmid |
| Tks Gflex DNA Polymerase | Takara Bio | R060B | For PCR-amplification from caudal gill |
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