Summary
Biz sipariş Odonata (yusufçuk ve damselflies) mavi kuyruklu damselfly kullanarak(Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) ve pied skimmer yusufçuk(Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera) kullanarak sipariş Odonata böceklerde elektroporasyon aracılı RNA girişim için ayrıntılı bir protokol sağlar.
Abstract
Yusufçuklar ve damselflies (sipariş Odonata) metamorfoz ile en atalarının böcek lerinden birini temsil, hangi onların habitat değiştirmek, morfoloji, ve davranış büyük ölçüde sudaki larvaları karasal / hava yetişkinler pupal sahne olmadan. Odonata yetişkinler iyi gelişmiş bir renk vizyonu var ve cinsiyetler arasında vücut renkleri ve desenleri dikkate değer bir çeşitlilik göstermek, aşamaları, ve türler. Odonata üzerinde birçok ekolojik ve davranışsal çalışma yapılmış olsa da, odonata gen fonksiyonel analizini uygulamadaki zorluk nedeniyle moleküler genetik çalışmalar çok azkgelmiştir. Örneğin, RNA girişim (RNAi) Odonata daha az etkilidir, Lepidoptera bildirilen gibi. Bu sorunun üstesinden gelmek için in vivo elektroporasyon ile birlikte bir RNAi yöntemini başarıyla kurduk. Burada aşağıdaki gibi elektroporasyon aracılı RNAi yönteminin bir video içeren ayrıntılı bir protokol sağlar: larva hazırlanması, türlerin belirlenmesi, dsRNA / siRNA çözeltisi ve enjeksiyon iğneleri hazırlanması, larva buz gibi anestezi, dsRNA / siRNA enjeksiyonu, in vivo elektroporasyon, ve yetişkin ortaya çıkana kadar bireysel yetiştirme. Elektroporasyon aracılı RNAi yöntemi hem damselflies (suborder Zygoptera) ve yusufçuklar (suborder Anisoptera) için geçerlidir. Bu protokolde, mavi kuyruklu damselfly Ischnura senegalensis (Coenagrionidae) için yöntemleri damselfly türlerin bir örnek olarak ve pied skimmer yusufçuk Pseudothemis zonata (Libellulidae) yusufçuk türlerinin başka bir örnek olarak sıyoruz. Temsili örnekler olarak, melanin sentez geni multibakır oksidaz 2'yihedefleyen RNAi sonuçlarını gösteriyoruz. Bu RNAi yöntemi, Odonata'nın metamorfoz, morfogenez, renk deseni oluşumu ve diğer biyolojik özellikleri ile ilgili çeşitli gen fonksiyonlarının anlaşılmasını kolaylaştıracaktır. Ayrıca, bu protokol genellikle rnai verimsizlik ve düşük penetrance nedeniyle gen bastırma daha az etkili olduğu model olmayan organizmalar için geçerli olabilir.
Introduction
Yusufçuklar ve damselflies (sipariş Odonata) "metamorfoz"1,2sergileyen böceklerin en atagrupları arasında yer alıyor. Metamorfoz ile yaşam alanlarını, morfolojilerini ve davranışlarını sudaki larvalardan karasal/havadaki yetişkinlere büyük ölçüde değiştirirler3. Odonata yetişkin iyi gelişmiş bir renk vizyonu var ve cinsiyetler arasında vücut renkleri ve desenleri dikkate değer bir çeşitlilik temsil, aşamaları, ve türler3,4,5. Odonata üzerinde birçok ekolojik ve davranışsal çalışmalar yapılmış olsa da6,7, moleküler genetik çalışmalar Odonata gen fonksiyonel analiz uygulanmasında zorluk ağırlıklı olarak engellenmiştir.
Konvansiyonel RNA girişim (RNAi) yöntemi, hangi çift iplikçikli RNA (dsRNA) ilgi geninin işlevini bastırmak için enjekte edilir8, Odonata böcekleretkisiz olduğu ortaya çıktı9, Lepidopteran böcekler de bildirilen10. Öte yandan, önceki raporlar elektroporasyon aracılı RNAi Lepidopteran türlerinde etkili olduğunu ileri sürmüşlerdir, epidermal dokularda özellikle11,12,13. Yakın zamanda elektroporasyon aracılı RNAi etkili küçük yusufçuk Nannophya pygmaea çalışır bulundu (Libellulidae: Anisoptera)9, ama N. pygmaea nispeten nadir bir tür ve bu nedenle moleküler genetik çalışmalar için uygun değildir.
Çoğu Odonata türü iki suborders, Zygoptera (damselflies) veya Anisoptera (gerçek yusufçuklar)3ya sınıflandırılır. Burada mavi kuyruklu damselfly Ischnura senegalensis (Coenagrionidae; Şekil 1A) temsili bir Zygopteran türü ve pied skimmer yusufçuk Pseudothemis zonata (Libellulidae; Şekil 1B) temsilcisi anisopteran türü olarak. Bu iki tür, Japonya'daki doğal ve kentsel göletlerde, Tsukuba City'dekiler de dahil olmak üzere en yaygın Odonata türleri arasındadır ve bu alanda iki türün birçok larvasını toplayabiliriz. Son zamanlarda i. senegalensisbireysel larvalar için bir laboratuvar yetiştirme sistemi kurdu , ayrıntılı olarak Odonata larvagelişimi ve morfogenez sürekli izleme etkin14.
Bu raporda, i. senegalensis ve P. zonataelektroporasyon aracılı RNAi için rafine bir yöntem ve bir video protokolü sağlar. Japonya'da, I. senegalensis ve Ischnura asiatica, genetik olarak yakın, genellikle sympatrically bulunur15, ve larva ayırt etmek zordur16. Ayrıca iki Ischnura türünün kısıtlama parçası uzunluğu polimorfizmi (RFLP) ile nasıl ayırt edilebildiğini de açıklıyoruz.
Elektroporasyon aracılı RNAi etkinliğini değerlendirmek için, gen ekspresyonunun yıkılması üzerine soluk miğkül renginin görünür fenotipini göz önünde bulundurarak, temsili bir hedef geni olarak çok bakır oksidaz 2 genini(MCO2; lakcase2olarak da bilinir) seçiyoruz. MCO2 böcek türlerinin çeşitli epidermisin koyulaştırmak için gerekli olduğu bilinmektedir17,18.
Protocol
NOT: Protokollerin genel düzeni Şekil 1'degösterilmiştir.
1. Yusufçuk veya damselflies larvahazırlanması.
- Bir el ağı kullanarak alanında larva toplamak.
NOT: I. senegalensis larvaları genellikle su yüzeyinde yüzen su bitkileri üzerine tutunarak, P. zonata larvaları genellikle alttaki yaprak çöpleri arasında kalırlar. Tsukuba City'de, I. senegalensis'in son yıldız larvaları çoğunlukla Mart'tan Haziran'a kadar, P. zonata'nın ki ise Mayıs'tan Haziran'a kadar bulunur. I. senegalensis larvalarılaboratuvar14'teyumurtadan yetiştirilebilir, ancak tarlada toplanan larvalar erişkin lerin ortaya çıkma oranı nın daha yüksek olduğu açıktır. - PCR amplifiye ürünlerin kısıtlama parçası uzunluğu polimorfizmi (RFLP) ile türlerin tanımlanması.
NOT: Bu adım sadece türlerin larvaların görünümünden tespit edilmesi zorsa gereklidir, I. senegalensis'teolduğu gibi.- Bir larvanın kaudal solungaçlarından birini forceps kullanarak tutun. Sonra, larva kaudal solungaç kendisi düşer (ototomi neden).
NOT: Zygopteran damselflies larvaları genellikle üç kaudal solungaçları var (Şekil 1A). Bir yırtıcı tarafından saldırıya uğradıklarında kaçmak için kendi kaudal solungaçlarını çıkarabiliyorlar. Kaudal solungaç yoksa bacağın bir kısmı kesilir. - 100 μL PBS çözeltisine bir kaudal solungaç koyun [0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.115% Na2HPO4, ve 0.02% KH2PO4 (w /v)] ve bir depozito pestle kullanarak bir el mikseri ile homojenize.
- Karışımı 5.000 x g'de 10 saniye boyunca aşağı doğru çevirin ve nükleer DNA'nın iç transkripsiyonlu spacer 1 (ITS1) bölgesini güçlendirmek için DNA polimeraz ve astarlar kullanarak süpernatantın 0,5 μL'sini PCR amplifikasyonuna tabi takın.
NOT: PCR'yi üreticinin protokolüne göre gerçekleştirin. ITS-F0 kombinasyonu (5'- GGA AAG ATG GCC AAA CTT GA -3') ve 5.8S-AS1 (5'- GCC GGC CCT CAG CCA G -3') astarlar hemen hemen tüm Odonata türlerinde ITS1 bölgesini yükseltebilir19. - 1 μL PCR amplifiye ürün, 0,3 μL 10x M Tampon, 0,1 μL DraI restriksiyon enzimi ve 10 °L su 37 °C'de 1 saat boyunca inkübite.
NOT: Türlerin kombinasyonuna bağlı olarak en iyi restriksiyon enzimlerini seçin. Türlerin tanımlanması için uygun bir restriksiyon enzimi yoksa, DNA dizilimi ile onaylayın. - Ürünlerin 2 μL'ini %2 agarose jel üzerine yükleme boyası ile yükleyin ve elektroforez çalıştırın.
NOT: %1 veya %1,5 agarose jel kullanırken türleri tanımlamak zordur. - Türleri tanımlamak için elektroforez paternini kontrol edin (Şekil 2).
NOT: RFLP desenleri türve popülasyona bağlıdır. Tsukuba popülasyonunda, I. asiatica'nın 400-500 bp'lik büyük bir bandı vardır, oysa I. senegalensis'in yaklaşık 200 bp'lik büyük bir bandı ve 100 bp'den daha az ek bir bandı vardır (Şekil 2'debir ok ucu). ITS1 bölgesi genomda birden fazla kopya da bulunur ve Ischnura türlerinde, ITS1 bölgesindeki mikrouydu polimorfizmi genellikle aynı bireyde bulunur ve RFLP'lerin modelini etkiler.
- Bir larvanın kaudal solungaçlarından birini forceps kullanarak tutun. Sonra, larva kaudal solungaç kendisi düşer (ototomi neden).
- RNAi için kullanıma kadar laboratuvarda toplanan larvaları arkaya alın.
- Her larvayı yaklaşık 3 mL su içeren 12 kuyuluk bir plakanın her kuyunun içine ayrı ayrı yerleştirin.
NOT: I. senegalensis larvaları sık sık birbirini yamyamlaştırdıkları için ayrı ayrı tutulmalıdır, P. zonata larvaları ise nadiren yamyamlaştırDıkları için bir grupta tutulabilir. - Yem I. senegalensis larvaları her gün Artemia salamura karidesi ve P. zonata larvaları haftada en az iki kez kan solucanı ve/veya Tubifex solucanları ile RNAi için uygun gelişim aşamasına gelene kadar.
NOT: Sık beslenme yetişkin ortaya çıkma başarı oranını artırmak için önemlidir. - Dışkı veya artıklarla kirlenir kirlenmez suyu değiştirin.
NOT: Sık sık su değişimi de yetişkin ortaya çıkma başarı oranını artırmak için önemlidir. - RNAi için uygun gelişim aşamasını değerlendirin.
NOT: I. senegalensisin son instar larvaları beş gelişim evresine sınıflandırılabilir14,20. İlk aşama (kanatlar genişlemeye başlamadan önce A evresi) veya son yıldız larvalarının ikinci aşaması (Aşama B), yetişkin ortaya çıkışından sonra RNAi'nin açık fenotipini göz önünde bulundurarak RNAi deneyleri için uygundur (bkz. P. zonata'dakanat genişlemesinden önceki son instar larvaları (I. senegalensisevresine karşılık gelen) bu çalışmada kullanılmıştır.
- Her larvayı yaklaşık 3 mL su içeren 12 kuyuluk bir plakanın her kuyunun içine ayrı ayrı yerleştirin.
2. RNAi için dsRNA/siRNA çözeltisi ve enjeksiyon iğnelerinin hazırlanması.
NOT: RNAi için çözüm olarak küçük müdahaleci RNA (siRNA) (adım 2.1) veya çift iplikli RNA (dsRNA) (adım 2.2) seçin.
- siRNA çözeltisinin hazırlanması
- Tasarım siRNA siDirect program sürümü 2.0 kullanarak (http://sidirect2.rnai.jp/)21,daha önce Lepidopteran böcekler22bildirilen yönergeleri izleyerek .
- Ticari olarak sentezlenmiş siRNA elde edin.
NOT: Bu çalışmada kullanılan I. senegalensis'in MCO2 genini hedefleyen siRNA dizileri aşağıdaki gibidir: 5'- GCA CUU UCC GUU AUC AAU AUA -3' duyu teli için ve 5'- UAU UGA UAA CGG AAA GUG CUC -3' antisense iplikçik için. Negatif kontrol olarak, gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP)geni hedefleyen siRNA dizileri aşağıdaki gibidir: 5'- GCA UCA AGG UGA ACU UCA AGA -3' duyu iplikçik ve 5'- UUG AAG UUC ACC UUG AUG CCG -3' antisense iplikçik11için . - Enjeksiyon tamponu [100 mM CH3COOK, 2 mM Mg(CH3COO)2, 30 mM HEPES-KOH, pH 7.4]22ile siRNA'yı 100 μM'ye seyreltin.
- Kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
- dsRNA çözeltisinin hazırlanması.
- Primer3 program sürüm 4.1.0 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/)23 kullanarak dsRNA için 300-400 bp bölgesi seçin ve astar kümelerini tasarla.
- Ticari olarak sentezlenmiş astar kümeleri edinin.
NOT: DSRNA sentezi için şablonlar üretmek için, bu çalışmada kullanılan astar setleri aşağıdaki gibidir: (5'- GCC TGT CAG CTT TGT CTT CC -3' ileri astar ve 5'- GGT GTC TGG CGG ACA ACT AT -3' ters astar için) I. senegalensis MCO2 genleri için (IsMCO2, katılım no. LC589180) ve (5'- CCG CAC AGC TCA CTA TTC AA -3' ileri astar ve 5'- GGA GGA TTC CTT CAT CGA CA -3' ters astar için) P. zonata MCO2 genleri için (PzMCO2, katılım no. LC589179). Negatif kontrol olarak, klonlama vektörü üzerindeki β-laktamaz (bla) genini hedefleyen dsRNA için ayarlı astar seti (5'- CTA TGT GGC GCG GTA TTA TTA T -3' ileri astar ve 5'- CAG AAG TGG TCC TGC AAC T -3' ters astar için). - Ticari olarak kullanılabilen Bir RNA ekstraksiyon kiti kullanarak Odonata larvalarından RNA ayıklayın ve üreticinin protokolüne göre ters transkriptaz kullanarak cDNA sentezini gerçekleştirin.
NOT: RNA dizianalizi için hazırlanan cDNA kütüphanesi de kullanılabilir. - Sentezlenen cDNA ve tasarlanan astar setini kullanarak hedef dizileri yükseltin ve üreticinin protokolüne göre ticari bir ligaz kullanarak klonlama vektörüne kopyalayın.
- Plazmidi E. coli yetkili hücrelere dönüştürün ve bir gecede kuluçkadan sonra tek bir koloni yi yedirin.
- PCR-vektör üzerinde astar kullanarak kesici uç bölgesini yükseltin.
- Klonlanan sırayı Sanger dizilimi ile onaylayın.
- PCR-t7 polimeraz promotör dizisi24, 25içeren vektör astarkullanarak kesici uç yükseltmek .
NOT: Bu çalışmada aşağıdaki astarlar kullanılmıştır: T7-F (5' - TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC TAG TCA TAT GGA T - 3') ve T7-R (5'- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC CCG GGG ATC CGA T - 3') 25. - PCR ürününü pcr arıtma kitini kullanarak üreticinin protokolüne göre arındırın, 50 μL distile su ile DNA'yı temizleyin ve eluted DNA çözeltisini santrifüj buharlaştırıcı kullanarak yaklaşık 10 μL'ye yoğunlaştırın.
- Üreticiprotokolüne göre in vitro transkripsiyon ile dsRNA sentezleyin. 100 μL elüsyon arabelleği ile toplam 1000 ng şablon DNA ve elute sentezlenmiş dsRNA kullanın.
- Bir spektrofotometre kullanarak dsRNA konsantrasyonu ölçün ve % 1.5 agarose jel üzerinde elektroforez ile dsRNA kalitesini onaylayın.
NOT: DSRNA sentezi başarılı olduğunda tek bir bant görülebilir. - DsRNA'yı 1000 ng/μL'ye seyreltin ve elüsyon tamponu ile -20 °C'de kullanıma kadar saklayın.
- Enjeksiyon iğnelerinin hazırlanması
- Cam iğne çekmecesi kullanarak cam kılcal bir kılcal çekin.
- Çekilen kılcal damarın ucunu çift taraflı yapışkan bandın üzerine yerleştirin ve kapillerin ucunu forceps ile kırın.
- Kılcal damarı bir enjektöre ayarlayın.
NOT: Nitril eldiven giyiyorsanız kılcal damarları işlemek daha kolaydır. - Hazırlanan kılcal damara siRNA/dsRNA çözeltisi yükleyin.
NOT: Enjekte edilen kılcal damarın ucu çamurda yaşadığı için kılcal damarı tekrar tekrar kullanmayın.
3. siRNA/dsRNA enjeksiyonu
NOT: Prosedür damselflies (adım 3.1) ve yusufçuklar (adım 3.2) için biraz farklıdır.
- Bir Zygopteran enjeksiyon (damselfly) larva (örneğin, I. senegalensis).
- Ezilmiş buz üzerinde ıslak bir kağıtla kaplı bir larvayı 50-70 saniye boyunca anesthetize edin(Şekil 3A-C).
NOT: Buz gibi anestezi süresi larvanın durumuna bağlıdır; larva 70 saniye buz gibi anesteziden sonra hareket etmeye başlarsa, 70 saniye daha buz gibi anestezi uygulanır. Nadiren hareket eden larvalar için (örn. P. zonata),bu prosedür gerekli değildir. - Prothorax'ın her iki tarafına iki iğne takın ve larvayı sabit bir standa sabitleyin (örn. bir parça strafor)(Şekil 3D).
NOT: İğnenin konumunu ve sayısını enjeksiyon yerine bağlı olarak ayarlayın. - Karında RNAi için 7 ve 8 abdominal segment arasında veya prothorax ve sinthoraks arasında (erimiş mezothorax ve metatoraks) rnai için toraks el ve forseps kullanarak inter-segmental membran germek.
- Segmentler arası membranı elle gererek tutun.
- Hazırlanan kılcal damarın ucunu gerilmiş segmentler arası membrana yerleştirin(Şekil 3D, 3F).
- 1 μL siRNA/dsRNA çözeltisi enjekte edin.
- Ezilmiş buz üzerinde ıslak bir kağıtla kaplı bir larvayı 50-70 saniye boyunca anesthetize edin(Şekil 3A-C).
- Bir Anisopteran (yusufçuk) larva (örneğin, P. zonata)enjeksiyon.
- Larva yüzeyindeki suyu kağıt havlu ile silin.
- Gerekirse, prothorax her iki tarafına iki iğne takın ve sabit bir stand (örneğin, strafor bir parça)(Şekil 3H)larva düzeltmek.
NOT: İğnenin konumunu ve sayısını enjeksiyon yerine bağlı olarak ayarlayın. P. zonatadurumunda, bu adımda iğne ile larva düzeltmek için gerekli değildir. - 4. ve 5.
- 4 ve 5 karın segmenti arasında inter-segmental membran ince bir iğne ile küçük bir delik olun.
NOT: Bu işlem birçok Anisopteran (yusufçuk) türü için gereklidir, çünkü segmentler arası membran doğrudan cam kılcal damar takmak için çok zordur. - Hazırlanan kılcal damarın ucunu hazırlanan deliğe yerleştirin(Şekil 3I).
NOT: Şekil 3H'dagösterildiği gibi, larvaların dorsal tarafının bir kısmı erişkinventral tarafına karşılık gelir, bu nedenle fenotip Şekil 3H-J'degösterildiği gibi tedavi edildiğinde ventrally görünür. - 1 μL siRNA/dsRNA çözeltisi enjekte edin.
4. in vivo elektroporasyon
- Gerekirse, larvayı sabit bir standa sabitlemek için daha fazla iğne ekleyin (örn. bir parça strafor).
- siRNA/dsRNA çözeltisinin enjeksiyonundan sonra forseps kullanarak larva yüzeyine iki damla ultrason jeli uygulayın.
- Ultrason jelüzerine elektrotlar yerleştirin, yan siRNA / dsRNA çözeltisi ve karşı tarafta negatif bir elektrot enjekte tarafında pozitif elektrot ile(Şekil 3E, 3G, 3J).
NOT: Elektroporasyonun yanma etkisini önlemek için larva epidermisine doğrudan dokunmayın. - Bir elektroporatör kullanarak 10 kat elektroporasyon darbeleri (her biri 280 ms/s) üretin.
NOT: Türe, evreye ve dokuya bağlı olarak elektroporasyon gerilimini ayarlayın. Bu çalışmada I. senegalensis'e 25 V, P. zonata'ya45 V uygulandı. - Kalan jeli kağıt havlu ile yüzeyde silin.
- Tedavi edilen larvaları iyileşmek için yaklaşık bir gün ıslak kağıt havlunun üzerinde bekletin ve ertesi gün bir yetiştirme vakasına aktarın.
5. Siteye özel henotypik analiz
- I. senegalensis'i yaklaşık 10 mL su ve bir parça kağıt havlu içeren bir Petri kabında (5 cm çapında) ayrı ayrı tutun ve P. zonata'yı tek kullanımlık dokumasız örgülü plastik bir kafeste saklayın (klosion cage14).
- I. senegalensisiçin , larvalar yemeyi bıraktıktan sonra, tek kullanımlık olmayan dokuma örgü ile plastik bir kafes içine ayrı ayrı taşıyın.
NOT: Aynı kafese iki veya daha fazla larva koymayın. Aksi takdirde, yetişkin olduktan hemen sonra birbirlerini yamyamlaştırırlar. - Yetişkinin ortaya çıkışından sonra, pozitif elektrotun elektroporasyon için yerleştirildiği bölgenin etrafındaki fenotipi gözlemleyin ve fotoğrafleyin.
NOT: Fenotip yalnızca yamalar halinde görünür. Fenotiplerin eksik pigmentasyon nedeniyle ortaya çıkışından hemen sonra tanınması genellikle zordur. - RNAi'nin (örn. kantitatif RT-PCR) etkinliğini incelemek için, fenotip görünürse, bölgeyi inceleyin ve fenotip olmayan bölgeyle karşılaştırın.
NOT: RNAi fenotip düzeyleri, yani boyutu ve cuticle decolorization yeri, genellikle bireyler arasında önemli farklılıklar sergiler (Şekil 4bakınız). - Gelecekteki analizler için ortaya çıkan yetişkinleri %100 EtOH'ta tutun.
NOT: Odonata türlerinin vücut rengi ölümden sonra hızla kaybolur, bu yüzden ölmeden önce etanol onları saklamak önemlidir. Etanol bazen böcekleri renklendirir, bu gibi durumlarda böcekler ölmeden önce donarlar.
Representative Results
Yukarıdaki protokolü MCO2 geni ve negatif kontrol genlerini hedef alan elektroporasyon aracılı RNAi'ye (SiRNA içinEGFP ve dsRNA için bla) (i) I. senegalensis (Şekil 4),(ii) toraksında I. senegalensis (Şekil 5), ve (iii) p. zonata (Şekil 6)karnında uygulandı. RNAi deneylerinin sonuçları Tablo 1'deözetlenmiştir. Negatif yüklü siRNA/dsRNA sadece pozitif yüklü hücrelere dahil olduğundan, pozitif elektrodun elektroporasyon için yerleştirildiği bölgede RNAi fenotipleri gözlendi.
Hem I. senegalensis ve P. zonata, melanin pigmentasyonu inhibisyonu (yani, siyah, kahverengi, ve kırmızımsı kahverengi) pozitif elektrot yerleştirildi bölge etrafında yamalar ortaya çıktı (beyaz ok uçları ve Şekil 4noktalı çizgiler , Şekil 5, ve Şekil 6) MCO2 RNAi ile birlikte yapıldı zaman (Tablo 1), Daha önce N pygeolarak bildirilmiştir . Buna karşılık, kontrol geni enjekte edildiğinde elektroporasyon bölgesi çevresinde hiçbir henotik etki gözlenmedi(EGFP siRNA veya bla dsRNA) (Şekil 4,Şekil 5 , ve Şekil 6, Şekil 1). Buna ek olarak, elektroporasyon olmadan MCO2 geni enjekte yetişkin pigmentasyon üzerinde hiçbir etkisi yoktu(Şekil 4, Tablo 1), elektroporasyon Odonata RNAi için gerekli olduğunu gösteren. Bu mavi, yeşil ve sarı renklendirmeler kütikül melanin sentezi dahil mco2 geninin RNAi etkilenmez unutulmamalıdır, hangi makul bu vücut renkleri şeffaf kütikül26ile görülebilir epidermal hücrelerde bulunan pigment granüller atfedilen gerçeği yansıtan . Şekil 4'tegösterildiği gibi, siRNA tedavisi ne de dsRNA tedavisine tabi tutulan bireyler arasında dikkate değer bir fenotipik fark tanınmazken, RNAi fenotipinin büyüklüğü ve lokasyonunda önemli farklılıklar gözlendi (ör. Şekil 4'te IsMCO2 dsRNA'nın iki örneğini karşılaştırın).
RNAi tedavisi için en uygun gelişim evresini belirlemek için, RNAi tedavisinin fenotipik sonuçlarını I. senegalensisin son larva instarında beş morfolojik aşamada (evre A-E) karşılaştırdık (Şekil 7A). MCO2 RNAi'nin neden olduğu melanin pigmentasyonuinin inhibisyonu, A ve B evrelerinde enjekte edildiğinde ortaya çıkan tüm erişkinlerde gözlenmiştir(Şekil 7C). C ve D evrelerinde enjekte edildiğinde, ortaya çıkan bazı erişkinlerde melanin pigmentasyonunun baskılanması kesinlikle gözlenmiştir, ancak diğer erişkinlerde yaraların neden olduğu anormal renklenme lergörülmüştür (Şekil 7B).
Şekil 1: Odonata'da elektroporasyon aracılı RNAi yöntemleri. Bir. Ischnura senegalensis (Coenagirionidae) temsili bir damselfly tür olarak. B. Pseudothemis zonata (Libellulidae) temsili yusufçuk türü olarak. C. Protokollerin genel düzeni. Mavi ve turuncu kutular sırasıyla I. senegalensis ve P. zonataprotokollerini gösterir. Mor kutular her iki türe uygulanan yaygın protokolleri gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Ischnura türleriiçin kısıtlama parça uzunluğu polimorfizmi (RFLP) tabanlı türlerin tanımlanmasının temsili bir sonucudur. Arrowhead, I. senegalensis'eözgü bandı gösterir. 1, 2, 4: I. asiatica, 3: I. senegalensis, M: 100-baz çifti merdiven işareti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Odonata'da elektroporasyon aracılı RNAi yöntemi. A-C. Buz gibi anestezi I. senegalensis. Ok uçları larva yı gösterir. Bir. Islak bir kağıtla ezilmiş buzun üzerine larva koymak. B. Buz üzerindeki larvanın büyütülmüş görünümü. C. Buz üzerinde ıslak bir kağıtla kaplı bir larva. D-G. I. senegalensisiçin RNAi yöntemi . D. Göğüs kafesine iğne. E. Göğüs kafesinde elektroporasyon. F. Karnına iğne. G. Karında elektroporasyon. H-J. P. zonataiçin RNAi yöntemi . H. Karnında küçük bir delik açıyor. Ben, ben. Karnına iğne. J. Karında elektroporasyon. Oklar bir delik veya enjeksiyon yapma noktasını gösterir. +, -: Pozitif/negatif yan elektrotlar. Sayılar karın segmentini gösteriyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: RNAi fenotiplerinin I. senegalensis'inkarnındaki dorsal görünümleri . Beyaz ok uçları bastırılmış melanizasyon bölgelerini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: RNAi fenotiplerinin I. senegalensistoraksında lateral ve dorsal görünümleri . Beyaz ok uçları ve noktalı çizgiler bastırılmış pigmentasyon bölgelerini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: P. zonata'nınkarnındaki RNAi fenotiplerinin ventral görünümleri. Beyaz ok uçları ve noktalı çizgiler bastırılmış melanizasyon bölgelerini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: I.senegalensisin son larva instarı sırasında etap bağımlı IsMCO2 RNAi etkileri. Bir. Bileşik gözlerde beş morfolojik aşamada (evre A-E) morfolojik değişiklikler ve erişkinlerin ortaya çıkışına kadar geçen gün sayısı. Parantez içinde sayılar öncekirapordan 14. B. Yaralara bağlı anormal pigmentasyon. Ok ucu elektroporasyon bölgesini gösterir. C. RNAi'nin beş morfolojik aşamada yetişkin pigmentasyonu üzerine etkisi I. senegalensis. Çubuktaki numara, kişi sayısını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Tür | I.senegalensis | P.zonata | |||||||||
| Enjekte edilen bölge | Karın | Toraks | Karın | ||||||||
| siRNA/dsRNA | siRNA | dsRNA | dsRNA | dsRNA | |||||||
| Hedef gen | IsMCO2 | EGFP | IsMCO2 | IsMCO2 | Bla | IsMCO2 | Bla | PzMCO2 | PzMCO2 | Bla | |
| Elektroporasyon | + | + | + | - | + | + | + | + | - | + | |
| Enjekte edilen larvalar | 22 | 25 | 30 | 6 | 53 | 12 | 20 | 17 | 5 | 9 | |
| Ortaya çıkan yetişkinler | 7 | 6 | 13 | 4 | 40 | 11 | 14 | 11 | 2 | 5 | |
| Daha az pigmentli bölgelere sahip yetişkinler (oran) | 7 (100%) |
0 (0%) |
13 (100%) |
0 (0%) |
0 (0%) |
10 (91%) |
0 (0%) |
11 (100%) |
0 (0%) |
0 (0%) |
|
Tablo 1. RNAi'nin I. senegalensis ve P. zonata'dayetişkin pigmentasyonu üzerineetkisi. A evresindeki sonuçlar I. senegalensis'tegösterilmiştir. IsMCO2: Multibakır oksidaz 2 geni I. senegalensis, EGFP: Geliştirilmiş yeşil floresan protein geni, bla: pGEM-T Easy Vector beta laktamaz geni, PzMCO2: multibakır oksidaz 2 p. zonatageni . Kontrol genlerinin sonuçları, yazarların bugüne kadar yapmış olduğu toplam deney sayısını temsil ediyor.
Discussion
RNAi tedavisinin öldürücülüğü
RNAi tedavisinin ölümcüllüğünün Odonata larvalarının yetiştirilmesine ve durumuna bağlı olduğunu bulduk. Alanında toplanması kısa bir süre sonra larvalar genellikle sağlıklı dır ve elektroporasyon aracılı RNAi tedavisinden sonra düşük mortalite oranları sergilerler. Buna karşılık, larvalar uzun bir süre için laboratuvarda yetiştirilen (örneğin, bir ay) yetişkin ortaya çıkması düşük başarı oranları muzdarip eğilimindedir. I. senegalensis, tarlada toplanan larvayerine, yumurtadan laboratuvarda yetiştirilen larvalar kullanılabilir14, ancak laboratuvar da yetiştirilen larvaları kullanan RNAi'nin başarı oranları alan dangazlarını kullananlara göre çok daha düşük türdedir (metamorfoz sırasında birçok kişi ölmüştür). Buna ek olarak, sık larva besleme ve temiz su yetiştirme yetişkin ortaya çıkma başarı oranlarını artırmak ve RNAi tedavinin öldürücü azaltılması için önemlidir.
RNAi tedavisinin etkinliği
Yukarıda açıklandığı gibi, RNAi fenotip düzeyleri, yani boyutu ve tirek decolorization yeri, genellikle aynı RNAi tedaviye tabi bireyler arasında önemli bir varyasyon sergiledi (örneğin, Şekil 4), ama fenotipik penetrasyon düzeyleri Odonata türleri arasında oldukça farklı gibi görünüyor. Gözlenen henotypik bölgeler I. senegalensis (Şekil 4-5) p. zonata (Şekil 6) ve N. pygmaea9'dandaha büyük ve daha belirgindi. Bu fark larva yüzeyindeki manikül kalınlığından kaynaklanıyor olabilir, I. senegalensis'in manikülünün P. zonata ve N. pygmaea'nınmanikülünden daha ince olduğu düşünülürse). İncelediğimiz kadarıyla siRNA ve dsRNA'nın etkileri arasında net bir fark fark lenmemiştir (Şekil 4, Tablo 1).
RNAi için uygun gelişim aşaması
RNAi'nin verimli bir şekilde gerçekleştirilmesi için uygun larva evrelemenin önemli olduğu unutulmamalıdır. Yetişkin pigmentasyonuin inhibisyonu, D evresinden önce MCO2 RNAi'den (yetişkin ortaya çıkmadan yaklaşık 3 gün önce) neden oldu, bu da N. pygmaea9ile ilgili önceki raporla tutarlıdır. C ve D evrelerinde enjekte edildiğinde gözlenen RNAi fenotipleri, A ve B evrelerinde tedavi edilenlere göre daha az göze çarpıyordu, bu da C ve D evrelerinin gen ekspresyonunu yeterince bastırmak için çok geç olabileceğini gösteriyor. RNAi tedavisi için uygun zamanlama gen ekspresyonunun zamanlamasına bağlıdır, ve MCO2 geni yetişkin ortaya çıkışı sırasında geçici olarak yüksek ekspresyon sergiler9, diğer böceklerde olduğu gibi17,18. Stinkbug Plautia staliolarak , MCO2 geninin RNAi nakavt enjeksiyon dan sonra 4 günden itibaren gözlendi27, hangi mevcut sonuçlar ile tutarlıdır.
I. senegalensis üzerinde daha önceki çalışmamız, b evresi sonra, yetişkin ortaya çıkması gün son instar larvaların çoğunluğu arasında nispeten küçük bir varyasyon sergi, evre B yetişkin ortaya çıkması doğru sürecin başlangıcına karşılık gelebileceğini düşündüren gösterdi, sonra metamorfoz için gelişimsel süreçler önceden belirlenmiş ve koordine bir şekilde devam14. Yaralardan kaynaklanan morfolojik anormallikler genellikle Larvaların C ve D evrelerinde RNAi ile tedavi edildiğinde gözlenmiştir(Şekil 7B, 7C). Bu durum, bu evrelerde metamorfozun dramatik bir ilerlemesi ile ilişkili olması muhtemeldir, rnai tedavisinin C evresinden ve devamından kaçınılması gerektiğini düşündürmektedir. Özetle, RNAi deneyleri için A veya B aşamasındaki son instar larvaların (veya larva kanatları önemli ölçüde genişlemeden önceki aşamada) kullanılmasını öneririz.
Elektroporasyon aracılı RNAi yönteminin kullanışlılığı ve üstünlüğü
Geleneksel RNAi basit ve güçlü bir deneysel yöntemdir, ancak kelebekler gibi bazı böceksoyları 10, yaprak bitleri28 ve yusufçuklar9 düşük RNAi verimliliği sergi, hangi gen fonksiyon analizi kurulması için önemli bir sorundur. Bu çalışmada, elektroporasyon aracılı RNAi'nin uygun gelişim evrelerinde tedavi edilirse, en azından epidermiste, neredeyse %100 verimlilikle yusufçuklarda lokal gen baskılanmasına neden olabileceğini bulduk(Tablo 1). Son zamanlarda, CRISPR / Cas9 tabanlı gen nakavt başarıyla böcek çeşitli uygulanmıştır, olmayan model organizmalar için güçlü bir moleküler genetik araç sağlayan29. Burada, ancak, CRISPR / Cas9 kesinlikle büyük ama elektroporasyon aracılı RNAi yöntemi bazı açılardan CRISPR / Cas9 üstün olabilir işaret.
İlk olarak, elektroporasyon aracılı RNAi yönteminde, RNAi fenotiplerinin göründüğü vücut bölgesi elektroporasyon üzerine pozitif elektrotun konumu ile deneysel olarak kolayca kontrol edilebilir. Buna ek olarak, gen ekspresyonunun baskılandığı bölge pozitif elektrotun yerleştirildiği bölge çevresinde sınırlı olduğundan, RNAi fenotipleri aynı bireyde kontrol fenotipleri ile kolayca karşılaştırılabilir. İkinci olarak, enjekte edilen yumurtaların nakavt fenotiplerini gözlemlemek için yetişkinliğe kadar yetiştirilmesi gereken CRISPR/Cas9 yöntemiile karşılaştırıldığında, elektroporasyon aracılı RNAi gen nakavt fenotiplerinin genellikle çok daha kısa sürede gözlemlenebildiği için üstündür. Örneğin, I. senegalensis için üç ila dört ay ve p. zonata için yumurtadan yetişkinlere14,30için bir ila iki yıl sürer. Ancak, erişkin epidermis içinde RNAi fenotiplerini gözlemlemek için, dsRNA enjeksiyonundan b evresinde son instar larvalarına bir aydan az bir süre alır ve hem I. senegalensis hem de P. zonata için yetişkin ortaya çıkışına kadar dır (Şekil 7). Üçüncü olarak, elektroporasyon aracılı RNAi yöntemi, CRISPR/Cas9 yöntemi için gerekli olan küçük yumurtalara mikroenjeksiyondan daha kolay olan büyük larvalara dsRNA enjeksiyonu gerektirir. Buna ek olarak, elektroporasyon aracılı RNAi olan yeni yumurtladı yumurta toplamak zordur böcek türleri için geçerlidir. Örneğin, P. zonata dişileri uçuş sırasında su yüzeyinde yüzen bitkilerin üzerine yumurtlarlar ve bu nedenle hem tarlada hem de laboratuvarda yumurtalarını toplamak zordur. Bu nedenle, bu protokolün geleneksel RNAi yönteminin verimli çalışmadığı model olmayan organizmalar için genel olarak geçerli olmasını bekliyoruz.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Biz teknik tavsiye ve destekler için Minoru Moriyama teşekkür, Bin Hirota ve Ryutaro Suzuki Odonata larvaları toplamak için, ve Misa Shinya el yazması yararlı yorumlar için. Bu çalışma JSPS KAKENHI Hibe Numaraları JP18J21561 GO ve JP18H02491, JP18H04893, JP19H03287 ve JP20H04936 RF desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plate | Violamo | VTC-P12 | For rearing larvae before injection |
| Brine shrimp eggs | JAPAN PET DESIGN | 4975677012396 | |
| Calibrated micropipette (1-5 µL) | Drummond | 2-000-001-90 | |
| Deposit pestle 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | K749520-0090 | |
| Digital high defenition microscope camera | Leica Microsystems | MC170HD | |
| Disposable non-woven mesh | HAKUGEN EARTH | DSC-105A | |
| DNA Ligation Kit Ver.2.1 | Takara Bio | 6022 | |
| DraI | Takara Bio | 1037A | |
| Electrode (1mmφ) | NEPAGENE | CUY650P1 | |
| Electroporator | CellProduce | Cure-gene | |
| Forceps | KOWA Forceps Industry | K-10 No1 | |
| Glass needle puller | NARISHIGE | PN-3 | |
| Hand mixer | AS ONE | 1-229-02 | |
| Hand net | HOGA | IS33-3B | |
| HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 346-01373 | For injection buffer |
| Insect pin capitate No. 3 | Shiga Konchu Fukyusha | N230 | For fixing larvae |
| KCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | For PBS |
| KH2PO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 169-04245 | For PBS |
| KOAc | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 160-03175 | For injection buffer |
| KOH | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 168-21815 | For injection buffer |
| Laboratory Jack (150x150) | AS ONE | 1-4642-11 | For adjusting the position of the manipulator |
| LOGIQLEAN Gel for Ultrasound Hard type | GE Healthcare | 2369385 | |
| Manipulator | Muromachi Kikai Co., Ltd. | SJ-1 | For adjusting the position of the injector and the capillary |
| MEGAscript RNAi kit | Thermo Fisher Scientific | AM1626 | |
| Mg(OAc)2 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 130-00095 | For injection buffer |
| Na2HPO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02865 | For PBS |
| NaCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 191-01665 | For PBS |
| Petri dish (5 cm diameter) | Iwaki | 1010-060 | For rearing injected larvae |
| Pneumatic Injector | NARISHIGE | IM-12 | |
| pT7Blue T-Vector | Novagen | 69820 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | |
| RNAiso Plus | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 9109 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74106 | |
| Shiga micro insect pin with stainless headless | Shiga Konchu Fukyusha | N251 | For making a small hole |
| Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | S8APO | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | |
| TaKaRa Ex Taq | Takara Bio | RR001B | For PCR-amplification from plasmid |
| Tks Gflex DNA Polymerase | Takara Bio | R060B | For PCR-amplification from caudal gill |
References
- Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
- Wipfler, B., et al. Evolutionary history of Polyneoptera and its implications for our understanding of early winged insects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (8), 3024-3029 (2019).
- Corbet, P. S. Dragonflies Behavior and Ecology of Odonata. , Cornell University Press. Ithaca, NY. (1999).
- Futahashi, R. Color vision and color formation in dragonflies. Current Opinion in Insect Science. 17, 32-39 (2016).
- Futahashi, R. Diversity of UV reflection patterns in Odonata. Frontiers in Ecology and Evolution. 8 (201), (2020).
- Córdoba-Aguilar, A. Dragonflies and damselflies. Model organisms for ecological and evolutionary research. , Oxford University Press. Oxford. (2008).
- Bybee, S., et al. Odonata (dragonflies and damselflies) as a bridge between ecology and evolutionary genomics. Frontiers in Zoology. 13 (46), (2016).
- Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borràs-Castelles, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA interference the red flour beetle, Tribolium castaneum. Journal of Visualized Experiments. 92, 52059 (2014).
- Okude, G., et al. Electroporation-mediated RNA interference reveals a role of multicopper oxidase 2 gene in dragonfly’s cuticular pigmentation. Applied Entomology and Zoology. 53 (3), 379-387 (2017).
- Terenius, O., et al. RNA interference in Lepidoptera: An overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. Journal of Insect Physiology. 57, 231-245 (2011).
- Ando, T., Fujiwara, H. Electroporation-mediated somatic transgenesis for rapid functional analysis in insects. Development. 140, 454-458 (2013).
- Nishikawa, H., et al. A genetic mechanism for female-limited Batesian mimicry in Papilio butterfly. Nature Genetics. 47 (4), 405-409 (2015).
- Osanai-Futahashi, M., et al. Positional cloning of a Bombyx pink-eyed white egg locus reveals the major role of cardinal in ommochrome synthesis. Heredity. 116 (2), 135-145 (2016).
- Okude, G., Futahashi, R., Tanahashi, M., Fukatsu, T. Laboratory rearing system for Ischnura senegalensis (Insecta: Odonata) enables detailed description of dragonfly’s larval development and morphogenesis. Zoological Science. 34 (5), 386-397 (2017).
- Ozono, A., Kawashima, I., Futahashi, R. Dragonflies of Japan (3rd edition). , Bunichi-Sogo Syuppan, Co Ltd. Tokyo. (2017).
- Ozono, A., Kawashima, I., Futahashi, R. The Handbook of Japanese Aquatic Insects. Volume 3: Dragonfly larvae. , Bunichi-Sogo Syuppan, Co Ltd. Tokyo. (2019).
- Arakane, Y., Noh, M. Y., Asano, T., Kramer, K. J. Tyrosine metabolism for insect cuticle pigmentation and sclerotization. Extracellular Composite Matrices in Arthropods. , Springer. 165-220 (2016).
- Asano, T., et al. Mini-review an insect-specific system for terrestrialization: Laccase-mediated cuticle formation. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 108, 61-70 (2019).
- Futahashi, R., Okude, G., Sugimura, M., Ugai, S.
- Okude, G., Fukatsu, T., Futahashi, R. Interspecific crossing between blue-tailed damselflies Ischnura elegans and I. senegalensis in the laboratory. Entomological Science. 23 (2), 165-172 (2020).
- Naito, Y., Yoshimura, J., Morishita, S., Ui-Tei, K. siDirect 2.0: updated software for designing functional siRNA with reduced seed-dependent off-target effect. BMC Bioinformatics. 10, 392 (2009).
- Yamaguchi, J., Mizoguchi, T., Fujiwara, H. siRNAs induce efficient RNAi response in Bombyx mori embryos. PLoS ONE. 6 (9), e25469 (2011).
- Untergasser, A., et al.
- Futahashi, R. Whole-mount in situ hybridization of sectioned tissues of species hybrids to detect cis-regulatory changes in gene expression pattern. Methods in Molecular Biology. 772, 319-328 (2011).
- Matsuura, Y., Kikuchi, Y., Miura, T., Fukatsu, T. Ultrabithorax is essential for bacteriocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9376-9381 (2015).
- Henze, M. J., Lind, O., Wilts, B. D., Kelber, A. Pterin-pigmented nanospheres create the colours of the polymorphiic damselfly Ischnura elegans. Journal of The Royal Society Interface. 16, 20180785 (2019).
- Nishide, Y., et al. Diversity and function of multicopper oxidase genes in the stinkbug Plautia stali. Scientific Reports. 10 (1), 3464 (2020).
- Christiaens, O., Swevers, L., Smagghe, G. DsRNA degradation in the pea aphid (Acyrthosiphon pisum) associated with lack of response in RNAi feeding and injection assay. Peptides. 53, 307-314 (2014).
- Sun, D., Guo, Z., Liu, Y., Zhang, Y. Progress and prospects of CRISPR/Cas systems in insects and other arthropods. Frontiers in Physiology. 8, 608 (2017).
- Miyakawa, K. A study of the life-history of Pseudothemis zonata (Burm.) (Odonata, Libellulidae) II. Immature stage. Kontyû. 37 (4), 409-422 (1969).
