Summary
이 프로토콜은 Fibrin 혈전을 사용하여 샘플 고정응용을 설명하고, 표류를 제한하며, 라이브 이미징 중에 시약을 첨가및 세척할 수 있도록 합니다. 시료는 커버슬립의 표면에 배양 배지를 함유하는 피브리노겐의 한 방울로 전달되며, 그 후 중합화가 혈전을 첨가하여 유도된다.
Abstract
Drosophila는 생물학적 질문의 광대 한 범위를 연구 하는 중요 한 모델 시스템. 상상 디스크, 성여성의 애벌레 뇌 또는 계란 챔버 또는 성인 장의 알방과 같은 비행의 다른 발달 단계에서 다양한 장기와 조직은 추출 및 시간 경과 현미경으로 이미징을위한 문화에서 보관 할 수 있습니다, 세포 및 발달 생물학에 귀중한 통찰력을 제공. 여기에서, 우리는 Drosophila 애벌레 두뇌의 해부에 대한 우리의 현재 프로토콜을 자세히 설명하고, Fibrin 혈전을 사용하여 유리 커버 슬립에 애벌레 두뇌 및 기타 조직을 고정하고 방향을 지정하기위한 현재의 접근 법을 제시합니다. 이 고정 방법은 배양 매체에 피브리노겐과 트롬빈을 첨가해야만 한다. 동일한 배양 접시에 여러 샘플의 반전 된 현미경에 고해상도 시간 경과 이미징에 적합하며, 다점 방문 현미경의 현미경 단계의 움직임으로 자주 발생하는 측면 표류를 최소화하고 이미징 과정에서 시약의 추가 및 제거를 허용합니다. 또한 당사는 표류를 위해 일상적으로 사용하고 시간 경과 분석에서 특정 정량 정보를 추출하고 처리하는 데 일상적으로 사용하는 맞춤형 매크로를 제시합니다.
Introduction
Drosophila는 생물학 질문의 광대 한 범위를 연구 하는 중요 한 모델 시스템 계속 하 고 수십 년 동안 많은 분야에서 지식을 발전에 탁월 한. 특히 눈에 띄는 한 가지 특징은 라이브 이미징에 특히 적합하다는 것입니다. 세포 외 과정 또는 세포 및 조직의 행동을 실시간으로 모니터링 하는 능력은 세포 및 발달 생물학에 관련 된 주요 개념을 생성에 기여 하는 데 계속. 많은 성공적인 프로토콜은 살아있는 견본및 형광 분자의 행동을 연구하기 위하여 살아 있고 건강한 Drosophila 견본을 유지하기 위하여 다른 단에 의해 개발되었습니다. 가상 디스크1,2,애벌레 뇌3,4,5,6,또는 성인 여성의 계란 챔버7,8,9,또는 성인장(10)과 같은 비행으로부터의 장기 및 조직은 예를 들어 시간 경과 현미경으로 이미징을 위한 배양에 보관될 수 있다. 라이브 이미징의 주요 과제는 시편이 기계적 충격에 민감할 수 있는 샘플 무결성을 손상시키지 않으면서 최적의 해상도와 움직이지 않도록 이미징 표면에 가깝게 유지되도록 하는 것입니다. Drosophila 애벌레 두뇌에 있는 신경 폭발 또는 뉴런에게 불린 신경 줄기 세포를 공부하기 위하여는, 예를 들면, 화상 진찰 표면에 가까운 견본을 지키는 것은 밀봉한 화상 진찰실11,12,13에서배양 매체로 그(것)들을 커버해서 달성될 수 있습니다. 그러나 이러한 접근 방식은 미디어 교환을 쉽게 허용하지 않으므로 기동을 위한 실험 공간을 제한합니다. 대안적으로, 샘플은 세포의 접착력을 증가시키고 잠재적으로 미디어 교환을 허용하는 개방형 배양 접시에서 다점 방문 현미경 및 확장 된 라이브 셀 이미징을 허용하기 위해 치료 된 커버립에 배치 할 수 있지만 미디어 교환14,15동안 샘플 드리프트 또는 손실을 방지하기위한 쉬운 수단을 제공하지 않는다.
원래 살아있는 크레인 플라이 정자 세포16에서 meiosis를 연구하기 위해 개발 된 피브린 응고 방법은 이러한 문제를 극복하기위해 특별히 적합하다. 피브리노겐은 관련 배양 배지에 용해되고, 혈소판이 첨가되기 전에 적절한 유리 표면 이미징 챔버에 이 용액의 한 방울에 배치되고 지향되며, 그 결과 용해성 피브린 응고, 유리 표면 및 시료에 부착되는 끈적끈적한 섬유질 메쉬는 배양 배지에 대한 샘플의 접근을 보장한다. 그런 다음 배지는 응고 또는 샘플 위치를 왜곡하지 않고 교환할 수 있습니다. 이미징 중 배양 배지 교환은, 예를 들어, 억제제가 본래의 방법에서와 같이 추가되거나 세척 또는 펄스 추적 실험에 추가되거나 세포와 조직을 제자리에 유지하면서 살아있는 세포 이미징 중에 형광염료를 첨가해야 할 때 바람직하다. 피브린 혈전은 Drosophila 조직의 화상 진찰뿐만 아니라 개별 세포(13,17)에적합합니다. Fibrin 응고는 더 오리엔트 샘플을 돕기 위해 사용될 수 있으며, 그 모양이나 다른 특성으로 인해 일반적으로 피브린 응고 내의 샘플 위치와 응고 자체의 모양을 조절하여 원하는 방식으로 방향을 지정하지 않을 것입니다.
여기에서 우리는 우리의 현재 Fibrin 응고 기지를 둔 화상 진찰 방법에 대한 업데이트를 제공하고 세분화 기반 의 이미지 분석을위한 도구를 제공하고 개발 비행 뇌에서 신경 폭발 부문을 연구하는이 방법의 사용에 초점을 맞추고 있습니다. 우리는 정기적으로 같은 문화 접시에 다른 혈전에서 여러 샘플을 따라 피브린 응고 방법을 사용합니다. 이를 통해 i) 중척추행동 또는 mRNA 국소화와 같은 세포형 의 이미징라이브18,19,ii) 다중점 방문 마이크로를 사용하여 동일한 이미징 설정하에서 상이한 유전자형의 약리학적 치료에 시료의 동작을 모니터링할 수 있습니다. scopy20,iii) 효소의 급성 억제의 효과를연구21 및 iv) 표적 레이저 절제시에 따라 자신의 생리환경 내 세포의 세포 분열방향의 방향을 연구하기 위해 표류를최소화(22) 트롬빈과 피브리노겐과 피브린 응고의 원치 않는 효과는 각 샘플에 대해 경험적으로 테스트해야 하지만, 본 방법은 원칙적으로 살아있는 세포 영상에 의해 분석되어야 하는 임의의 유형의 시료를 고정하기 에 적합하며 드로소필라에서 신경폭발 생물학5,19,20의여러 측면을 성공적으로 연구하는 데 사용되었지만, 또한 여성 세균선 줄기세포(23)의 세포센서 투영의 역학과 급성 aPKC 억제에 따른 극성 변화및목막세포의 급성 aPKC 억제에 따른 극성 변화.
시간 경과 형광 화상 진찰은 이 정량적인 정보를 추출하는 방법을 필요로 하는 복잡한 시간 해결된 3D 데이터 세트의 생성을 초래합니다. 여기에서 우리는 Drosophila 애벌레 두뇌 또는 개별 신경 아세포의 신경 폭발에 있는 피질 단백질을 정량화하기 위하여 개발된 세포 피질에서 다중 채널 형광의 반 자동화된 정량화를 허용하는 하이퍼 스택 및 사용자 정의 만든 ImageJ 매크로에서 표류를 위해 이용될 수 있는 ImageJ 기지를 둔24개의 매크로의 추가 발달을 기술합니다.
Protocol
1. 시약 준비
참고: 달리 설명하지 않는 한 이 프로토콜의 모든 단계는 실온에서 수행됩니다.
- 1x PBS-BSA(0.1% w/v)의 용액을 준비하려면 PBS 1mL에 소세럼 알부민(BSA)을 1mg용해한다. 혈소판 1,000대·mL-1의 재고용액을 PBS-BSA 1mL(0.1%w/v)에 1,000대 용해한다. 10 μL의 알리쿼트를 만들고 -20°C에서 최대 4개월 동안 보관하십시오.
- Drosophila 두뇌를 위한 배양 매체를 준비하기 위하여는, 멸균 조건에서 슈나이더의 배지의 1 L에 포도당 1 g를 녹입니다. 최대 3개월 동안 4°C로 걸기 및 보관하십시오.
- 피브리노겐 용액을 준비하려면 1mL의 배양 배지에 10 mg의 피브리노겐을 실온에서 20분 또는 37°C에서 5분 동안 용해하십시오.
참고: 1.2단계에서 제조된 배양 배지와 다른 배양 배지가 사용되고 이 단계에서 이미 형성되는 경우, 배양 배지는 사전에 비활성화되어야 하는 활성 혈전을 포함할 가능성이 있다. Thrombin의 가능성이 소스는 30 분 동안 56 °C에 혈청을 가열하여 비활성화 될 수있는 태아 소 혈청이다. - PBS-BSA의 코팅 용액을 준비하려면 (5 % w / v), 1 x PBS의 1 mL에 소 세럼 알부민 (BSA)의 50 mg을 용해하십시오.
- 4단계에서 사용되는 예시 시약은, 315 μL 디메틸 설프리산화물에서 1 mg NAPP1을 용해시킴으로써 10m NAPP1의 스톡 용액을 준비한다.
2. 드로소필라 애벌레 뇌의 해부
참고: 해부 쌍안경 아래에서 이 단계를 수행합니다.
- 브러쉬를 사용하여 L3 애벌레를 PBS가 함유된 9웰의 보로실리케이트 유리 접시로 옮길 수 있습니다. 애벌레에서 플라이 푸드의 대부분을 분리하고 배양 배지를 포함하는 다른 우물로 옮기도록 저어주세요.
- 집게(예: Dumont #55)를 사용하여 몸 길이의 중간에 전체 직경에 걸쳐 애벌레를 잡습니다(그림 1A, B참조). 애벌레를 들고 있는 동안, 신선한 배양 배지의 200 μL을 포함하는 보로실리케이트 플레이트의 또 다른 우물로 옮기다.
- 애벌레를 방출하지 마십시오. 전체직경(도 1B)에걸쳐 애벌레를 반으로 자르려면, 포셉 팁(도1A,상단 패널)의 측면 이동으로 파악된 영역을 갈기하거나 애벌레를 들고 있는 두 개의 포스프 팁 사이에 다른 한 쌍의 집게를 밀어 넣습니다(도1A,하단 패널). 유충을 반으로 자르지 마십시오, 그것은 신체 길이를 교차 하는 신경을 통해 그것을 당겨 서 뇌를 손상시킬 수 로 (그림 1B의빨간 선).
- 집게를 사용하여 큐티클과 다른 한 쌍의 포셉으로 유충을 잡고 뇌를 당기지 않고 큐티클을 벗겨냅니다(도1C). 뇌에서 유래하는 신경이 눈에 띄고 뇌를 입 부위에 연결하는 장기가 도 1D에도시된 바와 같이 접근할 수 있을 때까지 반복한다.
- 집게를 사용하여 뇌에서 유래한 신경을 유지합니다. 다른 쌍의 집게와 함께, 도 1A에 도시된 기술 중 하나를 사용하여 뇌와 입 부위사이의 연결을 잘라내고, 나머지 큐티클(도1D)에서뇌를 분리한다.
- 복부 신경 코드에서 나오는 축약에 의해 뇌를 유지하기 위해 집게를 사용합니다. 그림 1E에서 회색으로 묘사 된 장기를 부드럽게 뇌에서 끌어 당깁니다.
참고: 눈/안테나 상상 디스크(어두운 노란색)를 당겨 뇌에서 분리하지 마십시오. 이 조직 사이 연결은 두뇌를 손상시키지 않고 당겨서 깨질 수 없을 정도로 견고합니다. - 여전히 신경을 잡고 뇌를 방향을 잡는 동안, 눈 / 안테나 상상 디스크 (어두운 노란색)와 다른 쌍의 집게(그림 1F)와뇌 사이의 연결을 파악합니다. 도 1A에 표시된 기술 중 하나를 사용하여 뇌를 당기지 않고이 연결을 잘라냅니다. 뇌가 다른조직(도 1G)을적절히 지워지고 손상되지 않았는지 확인합니다(그림1H). 손상의 흔적을 보여주는 경우 뇌를 폐기.
- 파이펫 팁을 코팅하기 위해 P20안팎으로 코팅 용액을 피펫합니다. 코팅된 팁과 함께 코팅된 팁으로 뇌를 파이펫으로 3 μL(도2A, 왼쪽)과파이펫을 다른 우물에서 피펫하여 깨끗한 배양 배지의 200 μL을 함유하고 있다.
- 충분한 뇌가 해부될 때까지 2.2-2.8 단계를 반복하여 해부가 수행되는 우물의 배양 매체를 교체합니다.
그림 1: D. 멜라노가스터 애벌레 뇌의 해부. (A)집게를 사용하지 않고 절단하는 기술. 샘플(창백한 녹색)은 집게(상단 패널)의 끝 사이에 접지되거나 샘플을 들고 있는 한 쌍의 집게 팁(아래패널)을 따라 한 쌍의 집게 팁 팁을 실행하여 절단할 수 있습니다. (B–F) 그것을 손상시키지 않고 애벌레 뇌를 격리하기위한 단계 (텍스트 참조). 빨간색: 뇌. 어두운 노란색 : 눈 / 안테나 디스크. 파란색 텍스트: 해당 집게로 수행할 작업입니다. (G)눈에 보이는 손상이없는 고립 된 뇌의 출현. D는 등쪽이고 V는 측면 뷰의 복부 측입니다. (H)해부 동안 뇌를 과도하게 당기는 것으로 인한 일반적인 손상. 상단 패널: 복부 신경 코드의 분리. 하단 패널: 로브변형. 후방은 왼쪽이며 전방은 모든 패널에서 맞습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 피브린 혈전으로 커버슬립에 대한 고정
참고: 해부 쌍안경 아래에서 이 단계를 수행합니다.
- 2.8단계와 같이 코팅된 팁이 있는 P20 파이펫을 사용하여 해부된 뇌를 배양 배지 + 피브리노겐(그림2A)의200 μL을 포함하는 보로실리케이트 플레이트의 또 다른 우물로 이송한다.
- 배양 배지 + 피브리노겐의 9 μL과 함께 한 뇌의 파이펫. 팁의 끝으로 35mm 세포 배양 접시의 커버 유리 바닥을 거의 만지고, 배양 배지가 파이펫 팁을 종료한 직후 커버슬립을 터치하여 뇌와 배지가 팁의 측면으로 미끄러지지 않도록 하여 뇌를 손상시킬 수있습니다(그림 2A).
- 한 쌍의 집게 또는 닫힌 한 쌍의 집게를 사용하여 배양 배지 + 피브리노겐 드롭 내에서 뇌를 부드럽게 밀고 배치하십시오.
참고: 열린 한 쌍의 집게로 드롭을 만지면 배양 배지가 집게팁(도 2B)사이에모세관에 의해 당겨질 수 있습니다. - 뇌의 복부 부분을 이미지화해야 하는 경우, 혈전 내뇌를 제대로 방향을 지정하기 위해 다음과 같이 피브리노겐 응고를 유도한다(도2C).
- 뇌를 드롭의 한쪽으로 밀어 넣습니다. P1 팁, 트롬빈 용액의 파이펫 1 μL이 장착된 P1 파이펫을 사용하여 파이펫 끝으로 뇌의 반대편에 있는 낙하의 가장자리를 터치하고, 트롬빈(도2C,첫 번째 도면)을 피펫으로 처리합니다.
- 피브리노겐이 중합을 시작할 때까지 1-2분 동안 기다려, 낙하의 한쪽에서 흐린 침전물의형성(도 2C,두 번째 도면). 부드럽게 밀고 "턱"피브린 응고에 뇌를,이미지에 부분 (예를 들어, 복부 측) 뇌를 변형하지 않고 커버 슬립에 가능한 한 가까운 있는지 확인(그림 2C,세 번째 도면).
- 피브린 응고에 들어가지 않는 뇌의 측면에 가까운 Thrombin 용액의 1 μL을 피펫. (그림2C,네 번째 도면).
- 두 번째 피브린 응고가 설정될 때까지 2-3분기다립니다(그림 2C,다섯 번째 도면). 혈전의 가장자리를 눌러 커버슬립을 더 강하게 부착하여 뇌를 변형시키지 않도록 주의하십시오(그림2C,제6 및 일곱 번째 도면). 뇌가 커버슬립에서 너무 멀리 떨어져 있는 것처럼 보이는 경우, 뇌에 가까운 피브린 응고를 눌러 더 가까이 가져.
- 뇌의 등쪽 부분을 배화해야 하는 경우 다음과 같이 피브린 응고를 유도한다(도2D).
- 커버슬립을 향한 등쪽 부분의 중앙에 뇌를 배치합니다. 얇은 팁, 트롬빈 용액의 파이펫 1 μL이 장착된 P10 파이펫을 사용하여 파이펫 끝으로 뇌의 반대편에 있는 낙하의 가장자리를 터치하고, 트롬빈(도2D,첫 번째 도면)을 피펫으로 한다.
- 피브리노겐이 중합을 시작하기위해 2-3분 동안 기다린후 흐린 섬유침(도2D,제2도면)의 형성을 초래한다. 혈전의 가장자리를 눌러 커버슬립을 더 강하게 부착하여 뇌를 변형시키지 않도록 주의하십시오(그림2D,세 번째 및 네 번째 도면).
- 여러 응고 샘플이 커버슬립에 고정되어야 하는 경우 3.1-3.5 단계를 반복합니다.
- 팁의 끝으로 응고 위에 약 0.5cm 위치, 부드럽게 파이펫 390 혈전 의 상단에 피브리노겐 드롭 없이 배양 매체의 μL(그림 2B,오른쪽 페트리 접시). 커버슬립에서 분리될 수 있으므로 응고 의 측면에 배양 배지를 추가하지 마십시오.
- 나머지 Thrombin을 씻어내려면 파이펫을 사용하여 배양 배지의 300 μl을 제거하고 깨끗한 배양 배지300 μl을 추가하여 혈전이 완전히 침지되도록 합니다. 초과 트롬빈을 씻어 두 번 반복합니다.
그림 2: 피브린 혈전을 사용하여 드로소필라 애벌레 뇌의 고정화. (A)BSA 코팅 파이펫 팁을 사용하여 뇌는 배양 배지(노란색)에서 배양 배지 + 피브리노겐 용액(orange)으로 옮겨진 다음 문화 배지 + 피브리노겐3.5 μL과 함께 문화 접시의 커버슬립(light blue)에 파이펫을 넣습니다. 피브리노겐 응고는 등대 또는 복부 위치에 있는 두뇌를 고정하기 위하여 Thrombin의 추가에 의해 유도됩니다 (D 및 E참조). 혈전의 확보된 뇌는 이후 피브리노겐이 없는 배양 배지로 덮여 있으며, 과잉 혈소판은 배양 배지를 3번 첨가및 제거하여 제거된다. (B)커버슬립에 배양 배지 + 피브리노겐(주황색)의 드롭 내뇌의 위치는 닫힌 한 쌍의 집게 또는 단 하나의 포셉 팁으로 부드럽게 밀어서만 조절되어야 한다. 집게의 열린 쌍에 드롭을 터치하면 배양 매체가 집게의 끝 사이에 모세관에 의해 당겨질 수 있습니다. (C)복부 측을 이미징하기 위한 애벌레 뇌의 위치를 위한 단계(텍스트 참조). (D)등쪽 측을 이미징하기 위한 애벌레 뇌를 포지셔닝하는 단계(텍스트 참조). (D)및(E),녹색: 트롬빈. 다크 오렌지: 피브린 응고. 옅은 파란색 : 커버 슬립. 파란색 화살표: 응고를 안정화하기 위해 덮개 슬립에 밀어붙일 응고의 가장자리입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 라이브 이미징 중 시약 추가
- 초점의 변화를 일으키는 온도 변화를 방지하기 위해, 시약을 사용하여 용액을 배양 접시 자체와 동일한 온도로 배양 접시에 첨가하여 추가하기 전에 동일한 온도로 가져 오십시오. 환경 챔버를 사용하는 경우 챔버 내에 솔루션을 둡니다.
- 문화 접시 자체를 대체하지 않고 문화 접시의 뚜껑을 제거합니다. 쉽게 제거할 수 있도록 35mm 접시 뚜껑을 이미지 촬영 하기 전에 접시 위에 거꾸로 놓습니다.
- P1000 파이펫을 사용하면 배양 접시 내부의 배양 배지 표면에 피펫 팁을 배치하고 원하는 시약 농도(예: 20 μM NAPP1의 용액의 400 μL을 10μM NAPP1의 최종 농도를 위한 배양 배지의 400 μL)에 도달하기 위해 적절한 시약 용액을 부드럽게 방출합니다. 혈전을 분리할 수 있는 강한 플럭스를 생성하지 않고.
- 배양 접시 내에서 용액을 균질화하려면 P200 파이펫을 사용하여 소량의 용액을 5배(예: 접시 내에서 800 μL의 부피에 150 μL)로 천천히 피펫합니다.
- 문화 접시 자체를 대체하지 않고 문화 접시 위에 뚜껑을 교체하고 이미징을 다시 시작합니다.
5. 라이브 이미징 중 시약 세척
- 세척 전에, 문화 접시와 같은 온도에서 세척 용액을 유지합니다.
- 문화 접시 자체를 대체하지 않고 문화 접시의 뚜껑을 제거합니다.
- P200 또는 P1000 파이펫을 사용하면 혈전 의 상단을 노출하지 않고 배양 접시에서 일부 배양 배지를 천천히 제거합니다(예: 접시 내의 배양 배지 800 μL에서 600 μL제거).
- 시약을 희석시키기 위해 P1000 파이펫으로 배양 식 배지의 표면에 파이펫 팁을 배치하고 세척 용액을 천천히 방출합니다(예를 들어, 6의 희석 계수를 위해 접시 내에 남은 배양 배지의 200 μL에 1mL의 세척 용액을 추가).
- 시약이 필요에 따라 희석될 때까지 5.3 및 5.4단계를 반복합니다(예를 들어, 또 다른 3개의 유사한 라운드는 1296의 희석계수를 초래하여 10 μM NAPP1에서 7.7nM의 초기 농도를 감소시킵니다).
- 문화 접시 자체를 대체하지 않고 문화 접시 위에 뚜껑을 교체하고 이미징을 다시 시작합니다.
6. 삼차원 및/또는 멀티채널 시간 경과에 표류하는 xyz의 보정
- 준비
- 다운로드 및 설치 ImageJ24. 터보 레그25 및 멀티 스택Reg26 플러그인을 다운로드하고 ImageJ의 플러그인 폴더 안에 배치합니다.
- 멀티하이퍼스택Reg(추가코딩 파일 1)및 자동하이퍼스택레그 이미지J 매크로(추가코딩 파일 2)를다운로드합니다. 매크로를 설치하려면 ImageJ의 플러그인 폴더 안에 .ijm 파일을 배치하거나 ImageJ/매크로/StartupMacros.txt 파일에 .ijm 파일의 내용을 추가합니다.
- ImageJ에서 여러 조각 및/또는 여러 채널을 포함한 타임랩스 영화를 엽니다(이제부터는 "하이퍼스택", 그림 3A,4A라고함). 시간 경과에 하나의 슬라이스와 하나의 채널만 포함된 경우 MultiStackReg를 사용하여 정렬을 직접 수행할 수 있습니다.
- 멀티하이퍼스택레그 사용 측면 드리프트 수정
- 하이퍼스택의 채널 및/또는 슬라이스를 정렬을 위한 참조로 사용해야 하는지 결정합니다. 한 채널, 한 슬라이스 참조 스택("참조 스택"이라고 함)을 생성하려면 이미지 | 클릭하십시오. 중복...중복 하이퍼 스택 확인란을 선택, 채널 (c)에서 관련 채널 번호를 입력: (예를 들어, 1-2와 1로교체) 및 /또는 슬라이스의 관련 채널 번호 (z): (예를 들어, 1-15를 8로대체), 프레임 (예를 들어, 1-50)클릭하기 전에 모든 프레임 (예를 들어, 1-50)을 포함되도록 (그림 3B).
- 또는 6.2.1 단계, 한 채널, 한 슬라이스 참조 스택에 대해 여러 슬라이스의 투영이 바람직하다면 이미지를 클릭| 스택 | Z 프로젝트 ...- 모든 시간 프레임이 틱되어 확인을 클릭, 첫 번째 및 마지막 조각과 프로젝션의 유형을 선택합니다. 시간 경과에 관련없는 채널을 삭제하는 채널이 여러 개인경우(이미지 | 스택 | 결과 투영에서 슬라이스를 삭제하거나 선택한 참조 채널을복제(이미지 | 중복)(그림 3B).
- 선택적으로, 참조 스택을 자르기 위해 도구 모음의 사각형 도구를 선택하고 관심 영역을 통해 사각형을 추적하고 이미지를 클릭하여 하나의 부품만 참조로 사용| 자르기.
- 멀티 스택레그를 시작하려면 플러그인 | 클릭하십시오. 등록 | 멀티 스택레그. 팝업 메뉴 스택 1에서: 이전 단계에서 생성 된 하나의 채널, 한 슬라이스 스택의 이름을 선택합니다. 팝업 메뉴 변환에서 : 번역을선택 ; 변환 파일 저장 확인란을 선택하여 다른 모든 필드를 무시합니다.
참고: 다른 유형의변환(참조 25). - 확인을 클릭합니다. 정렬 파일을 저장하려면 위치와 이름을 선택하고 저장을 클릭합니다. 참조 스택 창에서 프레임이 자동으로 이동을 중지할 때까지 기다렸다가 등록이 끝났음을나타냅니다(그림 3B).
- 참조 스택을 확인하여 정렬이 만족스러운지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 다른 참조 슬라이스, 채널 및/또는 자르기로 6.2.1-6.2.5 단계를 반복합니다. 참조 스택을 닫습니다.
- 하이퍼스택 창을 선택하고 MultiHyperStackReg 매크로를 실행합니다. 6.2.5 단계에서 생성된 변환 파일을 선택하고 열기를 클릭합니다. 정렬이 하이퍼 스택의 모든 채널 및/또는 슬라이스에 적용될 때까지 기다립니다.이 시점에서 접미사 "_aligned"이 있는 새 창이열립니다(그림 3C).
- 멀티하이퍼스택레그 사용 초점 드리프트 수정
- 이미지 | 클릭 속성... 1픽셀 간격으로 1채널 하이퍼스택을 직교적으로 다시 슬라이스하려면 이미지 | 스택 | [/]... 시작 시 상단을 선택: 팝업 메뉴, 체크 보간 방지 및 확인을클릭합니다.
참고: ImageJ에서 메모리를 해제해야 하는 경우 다시 슬라이스한 후 하이퍼스택을 닫을 수 있습니다. - 다시 슬라이스에 의해 생성 된 새 창을 선택합니다 (이제부터 "다시 슬라이스 된 하이퍼 스택", 그림 4B라고함). 다시 슬라이스된 하이퍼스택에 여러 채널이 있는 경우 참조 채널을 선택하여 정렬을 수행하고 채널 스크롤 막대에서 다른 채널을 선택하여 다른 채널을 삭제합니다. 이미지 | 클릭 스택 | 슬라이스 삭제,현재 팝업 삭제 메뉴에서 채널을 선택하고 확인을 클릭합니다.
- 다시 슬라이스된 하이퍼스택(이후부터는 "다시 슬라이스된 참조 스택"이라고 함)을 생성하거나, 다시 슬라이스된 하이퍼스택의 단일 슬라이스(6.2.1 참조) 또는 리슬라이스하이퍼스택의 여러 조각을 투영하여(단계 6.2.2 참조)(그림 4C참조).
- 선택적으로, 다시 슬라이스 된 참조 스택을 자르기 위해 하나의 부분을 참조로 사용하여 (단계 6.2.3 참조).
- MutiStackReg를 사용하여 다시 슬라이스된 참조 스택에서 이미지 등록을 수행합니다(단계 6.2.4-6.2.6)(그림 4C참조).
- 다시 슬라이스된 하이퍼스택 창을 선택하고 MultiHyperStackReg 매크로를 실행합니다. 6.3.5 단계에서 생성된 변환 파일을 선택하고 열기를 클릭하고 하이퍼스택의 모든 채널 및/또는 슬라이스에 정렬이 적용될 때까지 기다립니다.이 시점에서 접미사 "_aligned"이 있는 새 창이 열립니다(이후부터는 "다시 슬라이스된 참조 스택", 그림 4D라고함). 원래 다시 슬라이스된 하이퍼스택을 닫습니다.
- 다시 슬라이스된 정렬된 하이퍼스택을 원래 하이퍼스택의 xy 뷰로 변환하려면 스택 | 클릭합니다. [/]... 최종 초점 정렬 하이퍼스택이 열리는 새창(그림 4E)이다시 슬라이스된 정렬된 하이퍼스택을 닫습니다.
- 이미지 | 클릭 속성... 1픽셀 간격으로 1채널 하이퍼스택을 직교적으로 다시 슬라이스하려면 이미지 | 스택 | [/]... 시작 시 상단을 선택: 팝업 메뉴, 체크 보간 방지 및 확인을클릭합니다.
- 횡표류및 초점 드리프트를 자동으로 수정하려면 AutoHyperStackReg 매크로를 실행합니다. 참조 채널,해당하는 경우 및 측면 및/또는 포커스 드리프트를 수정할지 여부를 선택합니다. 확인을 클릭합니다.
그림 3: 멀티하이퍼스택레그와 측면 드리프트의 보정을 위한 파이프라인. (A)측면 및 초점 드리프트는 여러 조각과 타임포인트를 포함하는 하이퍼스택에서 관찰될 수 있다. (B)단일 슬라이스, 단일 채널 참조 스택은 중복 또는 Z 프로젝션에 의해 하이퍼스택으로부터 생성된다. 참조 스택은 MultiStackReg 플러그인에 의해 정렬되어 정렬 파일을 생성합니다. (C)MultiHyperstackReg 매크로는 하이퍼 스택에 정렬 파일을 적용하는 데 사용되며, 그 결과 측면 드리프트가 수정되는 정렬된 하이퍼스택이 발생합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 멀티하이퍼스택레그와 초점 드리프트의 보정을 위한 파이프라인. (A)여러 슬라이스와 타임포인트를 포함하는 하이퍼스택에서 초점 드리프트를 관찰할 수 있다. (B)하이퍼스택은 보간 없이 Y축을 따라 각 픽셀 라인을 따라 맨 위에서 직교로 다시 슬라이스됩니다. 이렇게 하면 하이퍼스택과 동일한 정보가 포함된 다시 슬라이스된 하이퍼스택이 생성되며 y 및 z 좌표가 전환됩니다. 원래 하이퍼스택의 초점 드리프트(z)는 다시 슬라이스된 하이퍼스택에서 y의 드리프트로 발생합니다. (C)단일 슬라이스, 단일 채널 재슬라이스 기준 스택은 복제 또는 Z 프로젝션에 의해 다시 슬라이스된 하이퍼스택으로부터 생성됩니다. 다시 슬라이스된 참조 스택은 MultiStackReg 플러그인에 의해 정렬되어 정렬 파일을 생성합니다. (D)MultiHyperstackReg 매크로는 재슬라이스된 하이퍼스택에 정렬 파일을 적용하는 데 사용되며, 그 결과 초점이 (y)에서 리딩되는 정렬된 하이퍼스택이 생성됩니다. (E)두 번째 직교 재슬라이스는 하이퍼 스택의 원래 좌표를 복원하여 이제 더 이상 초점 드리프트(z)를 제공하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
7. 회전 라인 스캔을 통해 피질 신호 측정
- 회전 라인 스캔 ImageJ 매크로(보충 코딩 파일 3)를다운로드합니다.
- ImageJ에서 시간 경과를 엽니다. 프레임 스크롤 모음을 첫 번째 프레임에 배치하고 시간 경과에 여러 조각이 포함된 경우 슬라이스 스크롤 모음을 신호가 측정되는 슬라이스로 배치합니다.
- 추적 모드
- 도구 모음에서 직선 도구를 선택합니다. 측정할 피질영역(그림 5A)을가로질러 선을 추적하여 선이 피질에 대략 수직이고 선이 다음 시간마다 피질을 교차할 만큼 충분히 길다는 것을 확인합니다(그림5B, 제1 및 제2 패널).
- 도구 모음에서 줄 도구 아이콘을 두 번 클릭하여 선 너비 창을 엽니다. 선과 피질 사이의 교차를직선(도 5B, 제3 패널)으로유지하면서 필요에 따라 선의 폭을 늘립니다.
- 회전 선스캔 매크로를 시작합니다. 측정할 피질 영역의 방향이 한 시점에서 다음 시간대로 크게 변경되지 않는 경우 회전범위(도 5E)를낮은 값(약 10°)으로 설정합니다. 측정 값값을 0픽셀로 설정하여 최대 신호 강도가 감지되는 선의 신호만 측정하거나 이 선 주위의 신호를 측정하기 위해 더 높은 값으로만 측정합니다.
참고: 측정 주변 값은 피질을 감지한 후 신호 측정에만 영향을 미치며 검출 자체에영향을 미치지 않습니다. - 채널의 피질 찾기: 팝업 메뉴에서 감지가 수행되는 채널을 선택합니다. 각 시점에서 피질이 감지된 위치를 시각화하려면 표시 위치를 선택합니다. 리센터(Recenter)를 유지하고 확인란을 체크박스로 조정합니다. 확인을 클릭합니다.
- 완료되면 클립보드 상태로 복사된 결과가 ImageJ 창 상태에 표시되고 시간 경과를 스크롤하여 감지된 피질 위치(노란색 오버레이)와 측정영역(시안 오버레이)이 만족스러운지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 회전 선 검색 옵션 창에서 다른 라인 위치, 길이 또는 너비 및 다른 설정으로 7.3.1-7.3.4 단계를 반복합니다.
- 측정값을 스프레드시트 소프트웨어에 붙여넣습니다.
참고: 열은 시간 경과및 선에서 나타나는 순서대로 채널에 해당하며 선은 프레임에 해당합니다.
- 추적 금지 모드
- 도구 모음에서 직선 도구를 선택합니다. 측정할 피질 영역을 가로질러 선(시안, 도 5A에표시)을 추적하여, 라인이 피질에 대략 수직이고 라인이 매 시(그림5C, 제1 및 제2 패널)에서피질을 교차할 만큼 충분히 길다는 것을 확인합니다.
- 도구 모음의 줄 도구 아이콘을 두 번 클릭하여 선 너비 창을 엽니다. 선과 피질 사이의 교차를직선(도 5C, 제3 패널)으로유지하면서 필요에 따라 선의 폭을 늘립니다.
- 회전 선스캔 매크로를 시작합니다. 전체 타임랩스 전반에 걸쳐 측정되는 피질 영역의 방향 변화에 따라 회전범위(도 5E)를설정합니다. 측정 값값을 0픽셀로 설정하여 최대 신호 강도가 감지되는 선의 신호만 측정하거나 이 선 주위의 신호를 측정하기 위해 더 높은 값으로만 측정합니다.
참고: 측정 주변 값은 피질을 감지한 후 신호 측정에만 영향을 미치며 검출 자체에영향을 미치지 않습니다. - 채널의 피질 찾기: 팝업 메뉴에서 감지가 수행되는 채널을 선택합니다. 각 시점에서 피질이 감지된 위치를 시각화하려면 디스플레이 위치를 선택합니다. 리센터 및 리오리엔테이션 을 선택 해제... 확인을 클릭합니다.
- 완료되면 클립보드에 복사된 결과가 ImageJ 창 상태에 표시되고, 경과를 스크롤하여 감지된 피질 위치(노란색 오버레이)와 측정된 영역(시안 오버레이)이 만족스러운지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 회전 선 검색 옵션 창에서 다른 줄 위치, 길이 또는 너비 및 다른 설정으로 이전 단계를 반복합니다.
- 측정값을 스프레드시트 소프트웨어에 붙여넣습니다.
참고: 열은 시간 경과및 선에서 나타나는 순서대로 채널에 해당하며 선은 프레임에 해당합니다.
그림 5: 회전 라인칸으로 피질 신호 측정. (A)신호가 측정되는 피질(black)에 수직으로 추적되는 선(cyan). 회색의 다른 음영은 세 시간 (t1, t2, t3)를 통해 변화하는 셀 위치를 보여줍니다. (B)왼쪽: 추적 모드에서 선의 올바른 위치 지정. 중간: 다음 시점에서 피질과 겹치지 않는 추적 모드에서 선의 잘못된 위치 지정. 오른쪽: 지나치게 넓은 선이 지나면 피질과 선 사이의 교차점(주황색 선)이 직선이 아닙니다. (C)왼쪽: 비추적 모드에서 선의 올바른 위치 지정. 중간: 모든 시점에서 피질과 겹치지 않는 비추적 모드에서 선의 잘못된 위치 지정. 오른쪽: 지나치게 넓은 선이 지나면 피질과 선 사이의 교차점(주황색 선)이 직선이 아닙니다. (D)스캔 라인의 길이와 폭. (E)Linescans은 "회전 단계" 매개 변수에 의해 정의된 간격으로"회전 범위" 매개 변수에 의해 정의된(D)에도시된 원래 오리엔테이션 주위의 방향 범위 내에서 수행됩니다. (F)피질에 비해 스캐닝 라인의 비최적 방향, 라인을 따라 측정된 낮은 신호의 결과. (G)선의 최적 방향은 선을 따라 측정된 신호 강도의 가장 높은 피크를 초래하는 것으로 정의된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Representative Results
라이브 이미징 중 피브린 혈전 및 문화 매체 교환을 통해 드로소필라 조직의 고정.
2단계(도1)에제시된 절차에 따라 해부되고 3단계(그림2)에제시된 절차에 따라 피브린 혈전에서 고정화된 후, GFP 태그바주카(Baz:GFP)를 발현하는 애벌레 뇌, 극성 단백질 파-3의 플라이 직교로, 30분 동안 포심형 을 이미지화하였다. Baz:GFP는 작은 ATP 아날로그 1-NAPP120을추가하여 비정형 단백질 키나아제 C(aPKC)의 급성 억제를 허용하는 알렐인 APKCas4와결합된다. 따라서 1-NAPP1은 4단계에서 제시된 절차에 따라 배양 배지에 첨가되었고, 2.5h를 위해 라이브 이미징이 재개되었다. 키나아제 aPKC의 야생형 버전을 운반하는 제어 뇌는 ATP 아날로그에 반응하지 않았고, APKC(apkcas4)의 아날로그 민감 돌연변이를 추가로 운반하는 뇌는 신경폭발과 자손에서 바즈의 신경상피성 및 밝은 클러스터의 수축을 나타냈다(그림6, 비디오 1). 신경 폭발은 조직이 건강하게 남아 있음을 나타내는 시간 경과를 통해 분할에 계속, 뇌는 문화 매체 변화에도 불구하고 약간의 드리프트를 보여, 그들은 잘 고정되어 있음을 나타내는. 유사하게,27년에제시된 절차에 따라 해부된 후, 바즈를 표현하는 오바리오레::GFP는 피브린 혈전에서 동일한 커버슬립에 고정되어 8분 동안 이미지되었으며, 그 후 1-NAPP1의 적용으로 APkc의 수축을 유도했지만 대조군(그림7, 비디오 2).
멀티하이퍼스택레를 사용하여 측면 및 초점 드리프트를 보정합니다.
횡및 초점 드리프트(비디오3,왼쪽 패널)를 모두 표시하는 하이퍼스택은 먼저 측면 드리프트(6.2, 도 3, 비디오 3,중간 패널)에 대해 먼저 수정한 다음, 멀티스택레그 플러그인과 멀티하이퍼스택레그 매크로를 사용하여 포커스 드리프트(6.3, 도4, 비디오 3,오른쪽 패널)를 사용하여 원래 하이퍼스택에서 관찰된 움직임의 실질적인 감소를 초래하였다.
회전 라인스캔을 이용한 피질 신호 측정
Baz::GFP(녹색) 및 적외선 형광 단백질(CD4:mIFP, 빨간색)으로 태그된 막 단백질 CD4를 발현하는 신경아세포가 하나의 미토시스 중에 이미지화되었다. CD4:mIFP 신호는 라인스캔을 이용한 신경아세포의 다양한 부분에서 피질을 검출하기 위한 참조로 사용되었다(7단계, 도 5, 도 8A-C)및 Baz::GFP 신호는 검출된 위치에서 측정되었다 8D). 그들의 분열 도중, 신경 폭발은 뚜렷하고 반대 피질 도메인을 설치해서 일시적으로 편광했습니다: 정맥 극및 기저 극. Baz는 정압 극을 정의하고, 일관되게, Baz:GFP 신호는 신경 폭발의 정압 극에서 증가하고 분열 도중 기저 극에서 감소합니다(그림 8C, D). 피질의 위치는 시간경과(도 8C, 비디오 4)를통해 만족스럽게 추적하였다. Drosophila 선 및 유전자형보충표 1-2에서참조됩니다.
그림 6: 라이브 이미징 중 고정된 애벌레 뇌에 ATP 아날로그를 적용합니다. (A)바즈를 표현하는 두 개의 애벌레 뇌의 라이브 이미징:GFP는 동일한 커버슬립에 고정되어 있습니다. 배양 배지는 ATP 아날로그 1-NAPP1의 10 μM 농도로 0분에서 변경된다. 제어 뇌는 ATP 아날로그에 눈에 띄게 반응하지 않는 반면 APKC(aPKCAS4)의아날로그 민감한 돌연변이를 운반하는 뇌는 신경 폭발과 자손에서 신경 피상화증 (화살촉)과 밝은 클러스터의 수축을 표시합니다. 23 μM. 스케일 바의 깊이에 대한 33 슬라이스의 최대 강도 투영: 20 μM.(B)신경 상피성배율. 스케일 바: 10 μM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 라이브 이미징 중에 고정된 계란 챔버에 ATP 아날로그를 적용합니다. 바즈를 표현하는 두 개의 오병의 라이브 이미징 : GFP는 동일한 커버 슬립에 고정. 배양 배지는 ATP 아날로그 1-NAPP1의 10 μM 농도로 0분에서 변경된다. 대조군 계란 챔버는 ATP 아날로그에 눈에 띄게 반응하지 않는 반면 APKC(aPKCAS4)의아날로그 민감한 돌연변이를 운반하는 계란 챔버는 결국 부착 접합의 명백한 고장으로 이어지는 상피 (화살표 헤드)의 수축을 표시합니다. 27 μM. 스케일 바의 깊이에 대한 33 슬라이스의 최대 강도 투영 : 20 μM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 회전 라인스캔을 사용하여 피질 신호의 측정. (A)라이브 D. 멜라노가스터 신경 폭발 바즈를 표현 ::GFP (녹색) 및 CD4:mIFP (빨간색). 원안 선: 초기 스캐닝 라인은 측정하기 위해 다양한 피질 영역에 수직으로 추적되었습니다. 스케일 바: 5 μM.(B)피질 라인스캔을 사용하여 피질(진한 파란색 선)의 식별및 CD4:mIFP(빨간색)를 참조 채널로 식별한다. 시안 선: 피질 검출 후 신호를 측정하는 "주변 측정" 매개 변수(여기, 2픽셀)에 의해 정의된 영역입니다. 스케일 바: 2 μm.(C)시안: CD4:mIFP(빨간색)를 참조 채널로 사용하여(A)에 표시된 초기 스캐닝 라인에서 회전 라인스캔 방법에 의해 신경아세포 분열 중에 확인된 피질 영역. 스케일 바: 5 μM. 화살표: 정격 기둥. 애로우헤드: 기저기둥. (D)바즈:GFP 신호 강도의 측정은(C)에표시된 회전 라인스캔에 의해 식별된 두 개의 해당 영역에서 시간이 지남에 따라 이다. 미토시스 동안 Baz:GFP는 신경 폭발의 정압극에 일시적으로 풍부해지고 반대쪽 기저 극에서 고갈됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: 라이브 이미징 중 고정 된 애벌레 뇌에 미디어 교환을 적용하여 그림 6,스케일 바 : 20 μm에 제시 된 억제제추가하십시오.
비디오 2: 라이브 이미징 중에 고정 된 계란 챔버에 미디어 교환을 적용하여 그림 7,스케일 바 : 20 μm에 제시 된 억제제추가 : 20 μm. 이 비디오를 다운로드하십시오.
비디오 3: MultiHyperStackReg를 사용하여 측면 및 초점 드리프트를 보정합니다. 막 프로브 PH::GFP를 표현하는 신경 폭발의 라이브 이미징. Xy: 단일 초점 평면. Xz: 직교 재슬라이스. 왼쪽: 드리프트를 교정하기 전. 중간: 측면 드리프트를 보정한 후. 오른쪽: 측면 및 초점 드리프트를 보정한 후, 10 μm. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 4: 그림 8,스케일 바: 5 μm에 제시된 회전 라인스캔을 사용하여 피질의 감지: 5 μm. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 이미지 드로소필라 조직의 유전자형. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 2: 사용된 유전자의 기원. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
추가 코딩 파일 1: 사용된 유전자의 기원. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
전체 마운트 D. 멜라노가스터 애벌레 뇌의 라이브 이미징은 생리적 맥락에 가까운 조건에서 비대칭 신경 줄기 세포 분열을 관찰 할 수있는 기회를 제공합니다. 우리의 프로토콜의 첫 번째 부분은 애벌레 뇌의 해부에 우리의 접근 방식을 소개합니다. 이미 언급 된 바와 같이13,준비의 중요한 측면은 뇌를 손상시키지 않도록하는 것입니다. 이 것의 가장 어려운 측면은 뇌에 지나치게 당기지 않고 이웃 상상 디스크에서 뇌를 분리하는 것입니다. "당기지 않고 절단"하는 우리의 접근 방식은 한 쌍의 집게팁으로 연삭 운동을 수행하거나조직(그림 1A)사이의 연결을 유지하는 두 개의 다른 집게 팁을 따라 집게 팁을 밀어내는 반면, Lerit 등은 해부 핀으로 톱모양의 움직임을 설명하는 것입니다. 우리는 모든 접근 방식을 시도하고 자신에게 가장 적합한 것을 채택하는 실험자 조언. 또한 BSA 또는 FCS 코팅 파이펫 팁을 사용하여 절연 된 뇌를 전송하는 해부 도구보다는 권장됩니다. 코팅은 조직이 플라스틱에 달라붙는 것을 방지하고 조직이 안전하게 전달되는 동시에 항상 완전히 침지되는 동시에 전송 중에 해부 도구에 충실할 때 일시적인 변형을 적용하지 않고 완전히 침지할 수 있습니다. 코팅 된 팁은 한 번에 여러 뇌의 전송을 허용하는 다른 장점이 있습니다, 이는 특정 매체 내에서 샘플의 거주 시간을 제어하는 것이 중요 할 때 특히 유용합니다; 그들은 다른 조직의 전송에 적합, 심지어 깨지기 쉬운 것 들, 예를 들어, 지방 시체; 더 큰 팁을 사용하거나 팁의 극단을 절단하여 다양한 샘플 크기를 수용할 수 있습니다.
다음으로, 이 프로토콜은 문화 접시의 표지 슬립에 애벌레 두뇌를 고정하기 위해 피브리노겐 응고의 사용을 설명합니다. 뇌는 배양 배지 + 피브리노겐의 한 방울 내에서 지향되며, 그 후 응고는 Thrombin의 첨가에 의해 유도됩니다. 피브린 형성은 점진적이며, 필요한 경우 시료의 방향을 미세 조정할 수 있는 시간 창을제공한다(도 2C). 우리가 애벌레 두뇌의 경우에 대하여 조언하는 견본의 약간 압축이 필요한 경우에 - 또한 단계 3.4.4 및 3.5.2 도중 견본에 더 많거나 더 가깝게 응고를 눌러 미세하게 조정될 수 있습니다. 이 피브리노겐응고의 주요 장점은 뇌가 가스 투과성 멤브레인과 커버슬립 사이에 장착된 Lerit 외.에 기술된 프로토콜을 통해 응고하는, 살아있는 화상 진찰 도중 배양 매체를 대체하는 기능입니다. 우리의 프로토콜을 통해 가스 투과성 멤브레인을 사용하는 가능한 장점은 뇌가 응고 및 일부 매체에 의해 공기에서 분리되기 때문에 우리의 접근 방식에 더 제한 될 수있는 샘플의 최적의 산소화를 제공한다는 것입니다. 이러한 이유로 문화접시 내 배양 배지의 양을 평가하지는 않았지만 혈전을 완전히 몰입시키면서 혈전 위에 배양 배지의 양을 제한하는 것이 좋습니다.
혈전조작이 실험적으로 어렵고 시간이 많이 소요될 수 있으므로 실험자가 샘플 없이 혈전을 조작하는 것이 좋습니다. 커버슬립에 배양 배지 + 피브리노겐의 방울의 양을 조절, 피브리노겐의 농도 또는 혈소르빈의 부피 및 농도는 준비를 쉽게 하는 데 도움이 될 수 있으며 다른 유형의 조직에 프로토콜을 조정할 때 중요할 수 있습니다. 혈전을 조작하는 충분한 경험을 가지고 있으면 방향을 미세 조정하는 것이 복잡하지만 필요한 경우 여러 뇌를 하나의 응고에 고정할 수 있습니다. 여러 혈전은 커버슬립상에 형성될 수 있으며, 예를 들어 상이한 유전자형의 이미지 샘플을 허용한다. 다른 혈전을 덮고 있는 배양 매체의 방울을 혼합하기 위해 절대로 복용해야 하지만 동일한 커버슬립에 다른 혈전을 다른 문화 매체에 노출시킬 수도 있습니다. 애벌레 뇌가 고정되고 라이브 이미징을 위한 준비가 되면, 과도한 광손상을 피하기 위해 Lerit 외13의 권고사항을 따르는 것이 좋습니다. 우리는 단지 단계 인큐베이터와 라이브 이미징 동안 25 °C에서 뇌를 유지하는 뿐만 아니라, 이미징의 시작 전에 적어도 30 분 동안이 단계를 예열하기 위해 이러한 권장 사항에 추가합니다. 우리의 손에, 체계적으로 그렇게하지 못하면 강한 초점 드리프트를 초래한다.
그것은 상호 연관된 현미경 검사법을 수행하고 살아있는 화상 진찰 후에 견본을 고치고 면역스테인을 능력을 발휘할 수 있다는 것을 몇몇 문맥에서 유리할 수 있습니다. 그러나, Fibrin 혈전을 사용 하 여 제한은 기계적으로 그것을 손상 하지 않고 혈전에서 뇌를 분리 하는 것은 거의 불가능하다. 이러한 한계를 극복하는 가능한 방법은 플라스민으로 피브린 혈전을 저하시키거나 피브린중합화를허용하는 손잡이를 모방한 펩타이드를 첨가하여 혈전 분해를 유도하는 방법을 개발하는 것이다. 우리는 일반적으로 단일 세포에서 200 μM 긴 조직에 이르기까지 샘플에 Fibrin 혈전을 사용하지만, 우리는 또한 성공적으로 3mm 폭 이상 성인 범블비에서 혈전및 이미지 뇌에 고정 할 수 있습니다. 혈전에서 고정할 수 있는 샘플 크기의 상한은 계속 결정되어야 한다. 마찬가지로, 우리는 일반적으로 4 5 시간 동안 시료를 이미지 고정하지만, 우리는 성공적으로 혈전이 적어도 장기 생존을 방해하지 않는다는 것을 나타내는, 최대 3 일 동안 기본 문화에서 신경 폭발을 이미지. 반대로, 혈전은 이러한 목적을 위해 연동 펌프와 같은 장치에 대한 필요 없이 장기간 이미징을 위한 요구 사항인 매체의 정기적인 교체를 용이하게 할 수 있다. 우리는 피브린 혈전의 투과성 매개 변수를 측정하지 않은 동안, 혈전의 섬유 질 젤 같은 특성은 세포 투과성 분자에 의해 침투 할 것으로 보인다. 우리는 세포 생물학에 사용되는 Latrunculin A, Colcemid 또는 1-NAPP1, HALO 태그 리간드 및 세포 생물학에 사용되는 다른 표준 염료가 아무문제없이 피브린 응고의 세포에 도달하고 지금까지 혈전에 의해 유지 될 분자를 발생하지 않은 것으로 나타났습니다, 그러나, 경험적으로 테스트 할 필요가 있는 가능성입니다.
결론적으로, Fibrin 혈전을 사용하면 살아있는 조직을 라이브 이미징을 위한 고정 장치를 구현하기가 안정적이고 비교적 쉽습니다. 측면 표류를 제한하는 그것의 유용성을 넘어, 살아있는 화상 진찰 도중 배양 매체를 변경하는 기능은 D. melanogaster 신경 폭발의 비대칭 세포 분열을 공부하는 우리의 화학 유전학 접근에 귀중한 입증되었습니다21. 우리는 이 기술이 화학 유전학을 관련시키는 경우에 특히, 다른 조직의 넓은 범위에서 연구 결과, 특히, 예를 들면, 단백질 자기 라벨링29에유익할 것이라는 점을 예상합니다.
우리의 MultiHyperStackReg 매크로는 터보 레그 이미지J 플러그인에 의존, 이는 연속 프레임 또는 스택의 조각을 정렬, 멀티 스택Reg ImageJ 플러그인, 이는 다른 스택에 변환을 적용 할 수 있습니다. MultiHyperStackReg는 단순히 하이퍼 스택 (적어도 4 차원스택 스택)에 이러한 변환을 적용 할 수 있습니다. MultiHyperStackReg의 사용으로, 우리가 설명하듯이, 많은 작업이 필요하고 꽤 많은 시간을 소비 할 수 있습니다, 우리는 또한 자동 하이퍼 스택Reg 매크로를 썼다, 이는 자동으로 단계 6.2 및 6.3에 설명 된 모든 단계를 수행. 그러나, 멀티 하이퍼 스택Reg와는 달리, AutoHyperStackReg는 현재이 스택의 하위 영역을 기반으로 스택의 정렬을 계산 할 수있는 가능성이 부족, 우리가 발견 한 옵션은 때때로 만족스러운 정렬에 대한 중요하다. AutoHyperStackReg의 또 다른 제한은 사용이 TurboReg 및 MultiStackReg에서 제안한 다른 변환이 아닌 번역으로 제한되는 반면, MultiHyperStackReg는 사용자가 필요로 하는 경우 하이퍼 스택에 적용할 수 있다는 것입니다. 향후 릴리스는 이러한 기능을 구현하며 GitHub30에서사용할 수 있습니다. 마지막으로, 당사의 회전 라인칸 매크로는 시간이 지남에 따라 피질이 위치 또는 방향을 변경하더라도 시간 경과시 피질 신호를 신속하게 측정할 수 있는 쉬운 방법을 제공합니다. 추적 모드또는 비추적 모드가 분석에 가장 적합한지 여부는 피질 신호의 품질과 일관성에 따라 달라집니다. 추적 모드는 사용자가 피질이 모든 시간 지점에 대해 어디에 있는지 고려할 필요가 없으며 시간이 지남에 따라 위치 및 방향의 큰 변화를 수용 할 수 있기 때문에 사용하기 쉽습니다. 그러나, 피질 신호가 전체 영화 동안 검출을 위해 충분히 강한 경우에만 적합하다: 피질(예를 들어, 피질에 가까운 밝은 세포질 구획)보다 다른 것을 검출하지 못하면 다음 의 모든 시간점에 대한 검출을 손상시킬 수 있습니다(예를 들어, 세포질 구획은 피질과 피질 선이 피질에서 멀리 이동하며 피질 선이 경과할 수 있습니다). 비추적 모드는 검출이 사용자가 원래 그려진 선으로 제한되기 때문에 이러한 함정을 갖지 못합니다(예를 들어, 밝은 세포질 구획은 몇 시간 시점에서 검출이 실패할 수 있지만, 세포질 구획이 검출 영역에서 멀어짐에 따라, 피질의 적절한 검출은 피질 위치 또는 방향 방향이 시간이 지남에 따라 많이 변하는 경우 잘 동작하지 않는다. 추적 모드에 대해 개발될 다음 기능(GitHub30에서사용할 수 있음)은 지정된 시간점을 분석하고 참조 타임포인트를 정의하는 옵션이 될 것이며, 그 이후에는 감지가 수행되므로 사용자가 문제가 있는 시간점을 최소한 피할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
야누슈케 연구소의 작업은 웰컴 트러스트 보조금 100031/Z/12/A 및 1000032/Z/12/A에 의해 지원됩니다. 조직 화상 진찰 시설은 웰컴에서 부여 WT101468에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin bovine serum, BSA | Merck | 5470 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture | Sigma | F7524 | |
| Fibrinogen from human plasma | Sigma | F3879 | |
| FluoroDish Cell Culture Dish - 35mm, 23 mm well | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| PP1 Analog (1NA-PP1) | Merck Millipore | 529579 | |
| Pyrex spot plate with nine depressions | Sigma | CLS722085-18EA | |
| Schneider's Insect Medium | Sigma | S0146 | |
| Thrombin from bovine plasma | Merck | T4648 |
References
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