Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Studere kavitasjon forbedret terapi

Published: April 9, 2021 doi: 10.3791/61989
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Institute of Biomedical Engineering, University of Oxford
* These authors contributed equally

Summary

Den presenterte eksperimentelle protokollen kan brukes til å utføre sanntidsmålinger av kavitasjonsaktivitet i en cellekulturenhet med sikte på å muliggjøre undersøkelse av forholdene som kreves for vellykket legemiddellevering og / eller andre bioeffekter.

Abstract

Interessen for terapeutiske anvendelser av ultralyd er betydelig og økende, med potensielle kliniske mål som spenner fra kreft til Alzheimers sykdom. Kavitasjon - dannelsen og påfølgende bevegelse av bobler innenfor et ultralydfelt - representerer et nøkkelfenomen som underbygger mange av disse behandlingene. Det er imidlertid fortsatt stor usikkerhet om de detaljerte virkningsmekanismene som kavitasjon fremmer terapeutiske effekter ved, og det er behov for å utvikle pålitelige overvåkingsteknikker som kan implementeres klinisk. Spesielt er det signifikant variasjon mellom studier i eksponeringsparametrene som rapporteres å gi terapeutiske effekter og tilsvarende akustiske utslipp. Målet med dette dokumentet er å gi designretningslinjer og en eksperimentell protokoll ved hjelp av allment tilgjengelige komponenter for å utføre studier av kavitasjonsmediert bioeffekter, og inkluderer akustisk overvåking i sanntid. Det er håpet at protokollen vil muliggjøre mer utbredt inkorporering av akustisk overvåking i terapeutiske ultralydforsøk og legge til rette for enklere sammenligning på tvers av studier av eksponeringsforhold og deres sammenheng med relevante bioeffekter.

Introduction

Ultralyd (USA) har blitt brukt mye som en diagnostisk bildeteknikk på grunn av sin trygge og ikke-invasive natur, dens enkle implementering ved pasientens seng, og dens kostnadseffektivitet1. Ved siden av sine diagnostiske og overvåkingsevner har USA et betydelig potensial for terapeutiske anvendelser. Tidlig arbeid utforsket bruken i trombolyse, DNA-transfeksjon, og legemiddellevering2,3,4 og terapeutiske USA representerer nå et svært aktivt forskningsområde, med anvendelser som tumorbehandling5,6,7, immunterapi8,9, blod-hjernebarriere (BBB)forstyrrelse 10,11,12, trombolyse13,14,15og bakteriell infeksjonsbehandling16,17. Et viktig fenomen som underbygger disse applikasjonene er kavitasjon: kjernedannelse, vekst og oscillasjon av gassformige hulrom på grunn av endringer i væsketrykk18,19.

Det er en rekke mekanismer der kavitasjon gir biologiske effekter. For eksempel kan den svært ikke-lineære naturen av bobleoscillasjoner under påvirkning av et anvendt amerikansk felt generere mikrostreaming i den omkringliggende væsken som både kan forbedre legemiddelkonveksjon20 og utøve skjærspenninger på vevet i nærheten av boblene. Dette er spesielt utbredt når bobler er i nærheten av en grense, noe som får bobler til å svinge ikke-sfærisk, og kan potensielt fremme narkotikaopptak gjennom skjærindusert permeabilisering21,22,23,24. Ved høyere trykk observeres større amplitudeoscillasjoner og rask boblekollaps, gir direkte mekanisk stress25 og genererer ofte sjokkbølger, og følgelig store trykkgradienter som kan forstyrre og permeabilisere vev26,27. Sammenbruddet av bobler nær en overflate kan også resultere i dannelse av flytende mikrojets med høy hastighet28,29,30. Disse mikrojetene kan trenge inn i vev, potensielt skape porer eller indusere sekundære stressbølger31,32. Permeabiliseringen av biologiske membraner på både vevs- og cellulære nivåer er forskjellig referert til som sonophoresis, som hovedsakelig brukes i sammenheng med USA-indusert forbedring i hudens permeabilitet33,34og sonoporasjon, som hovedsakelig brukes til å beskrive reversibel permeabilisering av cellulær membran på grunn av dannelse av membranporer35,36.

Viskøs absorpsjon i væsken som umiddelbart omgir den oscillerende boblen, kan gi en betydelig oppvarmingseffekt37. Videre produserer de svært ikke-lineære svingningene akustisk stråling ved frekvenser høyere enn det drivende amerikanske feltet. Dette fører til økt absorpsjon i det omkringliggende vevet og videre oppvarming38. Boblekollaps kan også ledsages av kjemiske effekter på grunn av de forbigående høye temperaturene og trykket i boblekjernen, for eksempel generering av svært reaktive arter og elektromagnetisk stråling, kjent som sonoluminescens32. Disse effektene har blitt undersøkt for å vurdere potensiell skade og/ eller aktivering av relevante cellulære veier for levering39 og utnyttet i lokal aktivering av lysfølsomme legemidler i en tilnærming kjent som sonodynamisk terapi40,41,42,43.

Mange usa-medierte bioeffekter kan initieres utelukkende gjennom kontroll av amerikanske feltparametere (trykkamplitude, frekvens, pulslengde og repetisjonsfrekvens og varighet av eksponering), men pålitelig generering av kavitasjon i biologisk vev krever ofte høy inngangsenergi og har dermed en forhøyet risiko for skade. Innføring av eksogene eller kunstige kavitasjonskjerner kan redusere inngangsenergien som kreves for å produsere det brede spekteret av effekter som er diskutert ovenfor, og introduserer ytterligere effekter som kanskje ikke er mulig med USA alene. Kavitasjonskjerner inkluderer gassbobler26,44, flytende dråper45,46,47 og faste partikler48,49,50, med nanoskala kavitasjonskjerner som et fremvoksende undersøkelsesområde for deres fordeler når det gjelder langvarig sirkulasjonstid, forbedret ekstravasasjon og langvarig kavitasjonsaktivitet49,51,52,53.

De mest brukte kjernene er gassmikrobobler (MB), opprinnelig brukt som kontrastmidler i diagnostisk avbildning. De er vanligvis 1-2 mikrometer i diameter og inneholder en kjerne av en høymolekylær gass med lav vandig løselighet i det omkringliggende mediet. Kjernen er omgitt av en beskyttende lipid, protein eller polymerskall som oftest består av fosfolipider54. Når de blir eksponert for et amerikansk felt, fører komprimerbarheten til MB-ene dem til å gjennomgå volumetriske svingninger, og produserer derfor sterk akustisk spredning, som er ansvarlig for suksessen til MB som kontrastmiddel. Som nevnt fører disse svingningene også til de nevnte mekaniske, termiske og kjemiske effektene som kan utnyttes i terapeutiske applikasjoner. MB-beleggprosessen tilbyr også en mekanisme for å innkapsle legemidler i MB-strukturen og for å feste narkotika og / eller målrette arter til MB-overflaten. Denne teknikken letter utløst frigjøring av legemidler for å redusere systemisk toksisitet55. Det har også nylig blitt vist at materiale fra MB-overflaten kan overføres til biologiske strukturer, noe som forbedrer legemiddelleveransen gjennom såkalt "sonoprinting"56,57,58.

Overvåking av USA-mediert kavitasjonsaktivitet kan gi innsikt i de resulterende biologiske effektene både in vitro og in vivo og potensielt muliggjør tuning og optimalisering av disse effektene. De to mest brukte metodene for overvåking av kavitasjonsaktivitet er i) optiske, som bruker ultra-høyhastighets videomikroskopi og generelt ikke er gjennomførbare in vivo; og ii) akustiske, som registrerer de restrålede lydfeltene produsert av oscillerende og / eller kollapsende bobler. Både amplitud- og frekvenskomponentene i det akustiske signalet inneholder informasjon om bobleadferd. Lave konsentrasjoner av bobler ved lav hendelse amerikanske amplituder har vist seg å produsere overveiende harmoniske utslipp (heltall multipler av kjørefrekvensen)59. Etter hvert som drivtrykket øker, kan bobleutslippsspekteret også inneholde brøkdelskomponenter kjent som subharmonikk og ultraharmonikk60 som indikerer sterkere ikke-lineær oppførsel, samt bredbåndsstøy, noe som indikerer inertial kavitasjon. Heltallsharmonier er en primærindikator for bobleoscillasjon, men kan også skyldes ikke-lineariteter hvor som helst i et eksperimentelt system, for eksempel på grunn av ikke-lineær forplantning. Til sammenligning er brøkdelsharmonier og bredbåndsstøy svært sterkt korrelert med bobledynamikk.

Forholdet mellom bobleadferd og de oppdagede akustiske utslippene kan være komplisert av faktorer som hendelsen amerikansk felt, nukleasjonsmiljøet og egenskapene til deteksjonsveien60. Likevel kan viktig informasjon om bobleatferd og deres interaksjoner med celler oppnås ved å skjelne trender i frekvens og energi i det akustiske spekteret. Disse dataene kan også gi verdifull informasjon som kan brukes til å danne grunnlaget for overvåkingsteknikker for klinisk behandling. For å utnytte denne informasjonen fullt ut, er det nødvendig med utvikling av robuste, overførbare og reproduserbare eksperimentelle metoder.

For tiden er det stor variasjon i rapporterte protokoller for design av systemer og gjennomføring av studier for å støtte utvikling av kavitasjonsassisterte terapier. Når det gjelder apparatet, har det blitt gjennomført en rekke designtilnærminger. Flere grupper har benyttet seg av parallellplatekamre56,61,62,63, enten spesialbygd eller kommersielt tilgjengelig (f.eks. Hu et al. (2013) utviklet et cellekammer kombinert med en amerikansk sonikeringsmodul og sanntids konfokal bildebehandling64, Carugo et al. (2015) brukte et system som består av en kommersielt tilgjengelig cellekulturrett med et skreddersydd PDMS-lokk for å tillate nedsenking i et vannbad under amerikansk eksponering65, og Pereno et al. (2018) brukte en enhet som består av lagdelte acoustofluidic resonatorer som tillater samtidig optisk og akustisk karakterisering av bobledynamikk og boblecelleinteraksjoner66. Bruken av spesialfabrikerte og applikasjonsspesifikke design kompliserer karakterisering av det amerikanske feltet og andre miljøeksponeringsforhold, noe som gjør sammenligninger på tvers av studier utfordrende. For eksempel er det betydelig variasjon i de amerikanske parametrene identifisert for å oppnå vellykket sonoporasjon, som inkluderer senterfrekvenser fra 0,02 til 15 MHz, driftssykluser som varierer fra 1% til kontinuerlig bølge, og sjeldnefactionaltrykk fra 0,1 til 20 MPa23,64,67,68,69,70 ( Tabell1). Det er tilsvarende stor variasjon i spektralkomponentene (harmonikk, sub-harmonikk etc.) som er identifisert som forbundet med bestemte bioeffekter.

Målet med dette arbeidet er derfor å gi et lett reproduserbart systemdesign og implementeringsrammeverk for in vitro-studie av kavitasjonsinduserte cellulære bioeffekter med spesifikk inkludering av en kavitasjonsovervåkingsevne.

Protocol

1. Prinsipper for systemdesign

MERK: Denne delen presenterer designprinsippene som brukes til å lage systemer for amerikansk eksponering og kavitasjonsovervåking. Disse prinsippene er illustrert med to eksisterende systemer for akustisk transfeksjon (SAT) (vist i figur 1). Hvert system består av et celleeksponeringsrom, en amerikansk kilde og en enkelt elementtransduser som fungerer som en passiv kavitasjonsdetektor (PCD), som alle er integrert i et testkammer på benken. Disse designene bygger på den tidligere systemutviklingen beskrevet i Carugo et al. (2015)65.

  1. Maksimer brukervennligheten.
    1. Gjør celleeksponeringsrommet kompatibelt med eksisterende kulturteknikker og bildesystemer ved å bruke eksisterende kommersielle cellekulturenheter som sådd-/vekstsubstrater.
      1. For SAT2, bruk en kulturrett (35 mm diameter, hvorav et område med 21 mm diameter er observerbart, se Materialbord).
      2. For SAT3, bruk en Transwell-innsats (6,5 mm diameter, se Materialbord). Transwells har en gjennomtrengelig membran og må derfor plasseres i cellemedier i stedet for vann.
  2. Muliggjør rask lasting og forsegling av celleeksponeringsrommet.
    1. Form SAT2 celleeksponeringsrommet ved å trykke på å montere et fleksibelt polymerlokk over kulturfatet (Carugo et al. 201565). Som vist i figur 1Char lokket et par hull med en diameter på 1,2 mm som gjør det mulig å fylle rommet med en 18 G stump sprøyte. Etter påfylling forsegler du disse påfyllingsportene med korte plaststenger (Materialbord).
    2. Fyll SAT3-rommet med sprøyte eller pipette og tetning ved å trykke på en gummipropp/bung.
    3. Muliggjør rask lasting av det forseglede celleeksponeringsrommet i testkammeret. Holdere for celleeksponeringsrommene ble bygget inn i kammerlokkene, der en lett trykk-passform er tilstrekkelig for å sikre riktig justering. Med systemene vist i figur 1kan tiden for prøveendringer være så kort som 20 sekunder når flere celleeksponeringsrom er klargjort på forhånd.
    4. Minimer kammerets interne volum slik at systemet er bærbart og mengden nødvendig vann/medium kan minimeres. Dette akselererer også utvinningen fra utilsiktet søl eller lekkasjer av kavitasjonsmidler ut av celleeksponeringsrommet.
      MERK: SAT2 innvendig volum er ca. 0,8 L. SAT3 innvendig volum er ca 7.6 L - gjort større for å imøtekomme enkel lasting og endring av kildetransduseren eller konfigurasjonen. Et internt kammer på 0,3 L ble tilsatt for å minimere engangsvolumet og for å tillate biologisk relevante væsker annet enn tankfyllingsvannet (f.eks. cellekulturmedier) som skal brukes. Den indre kammerbunnen er laget av 30 μm tykt mylarark for å tillate maksimal akustisk overføring.
    5. Gjør kammeret og de interne komponentene ut av optisk klare materialer når det er mulig, slik at eventuelle problemer (f.eks. lekkasjer, fangede makrobobler) raskt kan observeres og løses.
  3. Maksimer akustisk transmisserbarhet av eksponeringsrommet.
    1. Maksimer overførbarheten gjennom valgene av veggmaterialer og tykkelser i rommet. Under forutsetning av at væskene på hver side av en vegg i hovedsak er de samme (f.eks. vann), er størrelsen på den normale insidenstrykkoverføringskoeffisienten71:
      Equation 1, der λ er bølgelengden i vegg av tykkelse L, Equation 2 og z L og zo er de karakteristiske impedansene (henholdsvis produkter av tetthet og lydhastighet) for veggmaterialet og væsken. T = 1 indikerer perfekt overføring.
    2. For bredspektret overvåking av kavitasjon (f.eks. 1-8 MHz), vil de fleste laboratoriepolymerer (f.eks. PDMS, PTFE, polystyren) endre det overførte trykket med ikke mer enn 10% hvis tykkelsen på materialet er mindre enn 1/10th av en bølgelengde i materialet. Denne tilstanden kan være vanskelig å møte med standard forsyninger ved høye frekvenser (f.eks. #1,5 deksler på 8 MHz), så det er god praksis å forutsi eller kalibrere overføringsfrekvensresponsen direkte.
    3. For smalbåndoverføring av det amerikanske kildesignalet inn i celleeksponeringsrommet, la et tykkere lag hvis det er omtrent et heltalls multiplum av en halv bølgelengde i lagmaterialet. For eksempel brukes PDMS-lokket i SAT2 med en tykkelse på 2,0 mm (~ 2 bølgelengde ved 1MHz, cPDMS ~ 1000 m / s).
  4. Maksimer eksponeringsområdet gjennom valg av kilde- og cellemiljø.
    1. Hvis du vil maksimere antallet eksponerte celler, gjør du området for cellevedlegg så bredt som mulig, samtidig som kompatibiliteten med tilgjengelig kultiverings- og bildeutstyr opprettholdes.
    2. Bruk en amerikansk kilde med et felt som strekker seg over cellevedleggsområdet med minimal romlig variasjon ved å bruke det pre-fokale området til en stor fokusert kilde (SAT2) eller en fokusert eller objektiv kilde med en hovedlobebredde som samsvarer med diameteren på cellevedleggsområdet (SAT3). Se materiallisten for bestemte kilder.
    3. Minimer feltkompleksiteten som introduseres av celleromholderen ved å mekanisk støtte cellerommet langt borte fra den sterkeste delen av hendelsesfeltet, minimere spredningssnittet på holderen eller plassere absorberende materiale på holderen. Eksempler vises i Figur 1A og 1D.
  5. Sørg for repeterbare eksponeringsforhold.
    1. Avslutt det akustiske feltet i en fast grense for å eliminere variasjon som kan oppstå fra luftvannsgrensesnitt i delvis fylte kamre. I SAT2 og 3 oppnås dette ved å installere en akustisk absorber (se Materialbord) på kammerlokket med en ytterligere fordel av å redusere feltkompleksiteten som kan oppstå ved grenserefleksjoner.
    2. Overvåk og registrer kildedrivspenningen ved forsterkerutgangen/ kildeinngangen, slik at mindre variasjoner eller større feil kan oppdages raskt. Bruk en spenningssonde eller en annen enhet som er trygg å bruke over stasjonens spenningsområde. Kontroller regelmessig kalibreringen av spenningssonden ved hjelp av en kjent kilde, for eksempel en bølgeformgenerator.
    3. Kontroller, overvåk og registrer temperaturen i kammeret og innholdet. Responser fra celler, transdusere og forplantningsmedium kan alle være temperaturfølsomme. I SAT2 oppnås overvåking og kontroll med et par sirkulasjonsporter koblet til et vannkondisjoneringssystem, mens SAT3 bruker en akvariumvarmer (ikke vist). Still inn vanntemperaturen etter behov for å etterligne de relevante fysiologiske forholdene for den terapeutiske applikasjonen.
      MERK: Interne temperaturer kan endres både som følge av eksterne faktorer og fra USA-generert oppvarming av svingeren og mediet.
    4. Avfett forsiktig kammervæsken(e) for å minimere sannsynligheten for utilsiktet kavitasjon og/eller spredning fra eksisterende bobler i forplantningsbanen.
      MERK: Hvis avgassing ikke utføres, for eksempel på grunn av den negative effekten på cellene, vil det være et forbedret bakgrunnsnivå av bobleaktivitet, som passer.
  6. Kalibrer det fullstendig monterte systemet.
    1. Ta med en måte å måle trykkfelthendelsen på de eksponerte cellene når alle systemkomponentene er på plass, inkludert celleeksponeringsrommet. I SAT2 og 3 oppnås dette med en åpning i kammerlokket der en nål eller fiberoptisk hydrofon kan settes inn uten å forstyrre feltet som skal måles. Gjør målingene så nært som mulig der cellene er plassert.
    2. Velg en hydrofon med en sensitiv radius (enrcv) er liten nok til at den ikke feilrapporterer trykkfeltet som måles. Den akseptable størrelsen er en funksjon av kildefrekvens (f) og radius (ensrc) i tillegg til avstanden mellom kilde- og feltskanning (zrcv). Et generelt kriterium for valg av hydrofonstørrelse er: Equation 6 , som fører til: , der Equation 7 c er lydhastigheten72.
    3. Påse at hydrofonen er kalibrert under forholdene som brukes i systemkarakterisering, inkludert temperaturen som angitt i avsnitt 1.6. Spesielt hvis hydrofonen holdes i en vinkel med hensyn til skanneplanet, må hydrofonen kalibreres i den vinkelen, da konduktivitetseffekter kan avvike betydelig fra de som forventes basert utelukkende på geometri. Endringen i hydrofonfølsomhet med hensyn til temperatur bør være tilgjengelig fra produsenten.
    4. Skann hele området der celler kan bli eksponert. Hvis du vil registrere et passende nivå av feltdetaljer, bruker du en skanneavstand som ikke er grovere enn 1/5av en bølgelengde med høyest interessefrekvens. Hvis uventet feltkompleksitet observeres, bør du vurdere å bruke korte utbruddssignaler (f.eks. 1-3 sykluser) for å tillate identifisering og kvantifisering av direkte og spredte feltbidrag.
  7. Inkorporer en kavitasjonsovervåkingsevne.
    1. Bestem overvåkingstransdusertypen og -plasseringen som en del av utformingen av det overordnede systemet, i stedet for som en ettermontering. I praksis fører dette til et system som er maksimalt kompakt uten å ofre muligheten til pålitelig å justere de kritiske systemkomponentene.
    2. Plasser en kavitasjonsovervåkingsenhet i systemet på en slik måte at den kan plasseres gjentatt med minimal ekstra oppstillingstid eller forstyrrelse i arbeidsflyten. I SAT2 oppnås dette med et enkelt element piezoelektrisk svinger som fungerer som en PCD montert i kammerlokket, mens SAT3 integrerer PCD i kildebasen ved hjelp av en 90 ° reflektor.
    3. Velg PCD-figuren i henhold til målene for eksperimentene. I figur 2viser beregninger av halvamplitudekonturene til ufokuserte (venstre) og fokuserte (høyre) enheter de dype forskjellene i romlig følsomhet med hensyn til frekvens. Den ufokuserte enheten er bedre egnet for stor volumovervåking med beskjeden romlig variasjon med hensyn til frekvens, mens den fokuserte enheten er bedre egnet for mer radial kompakte målinger ved frekvensene av interesse.
    4. Velg PCD-senterfrekvensen og båndbredden som passer til behovene til eksperimentet. Senterfrekvensen velges vanligvis å være minst fem ganger så høy som den amerikanske kilden for å minimere følsomheten for direkte kildeutslipp. Båndbredden maksimeres vanligvis for å observere et bredt spekter av bobleoppførsel (harmonisk og bredbåndsstøy).
    5. Velg kondisjonerings-, opptaks- og behandlingsmetoder for å tillate analyse av kavitasjonsdata, som beskrevet i neste avsnitt.

2. Instrumentering og behandling for kavitasjonsovervåking

MERK: Denne delen presenterer signalflytkomponentene og funksjonene som anbefales for innsamling av kavitasjonsovervåkingsdata, og databehandlingen som fører til kvalitative og kvantitative vurderinger av kavitasjonsaktivitet.

  1. Instrumentering (se også figur 3).
    1. Med mindre applikasjonen krever en tilpasset enhet, velger du en PCD fra det brede spekteret av kommersielt tilgjengelige enkeltelementtransdusere, vanligvis markedsført for ikke-destruktiv testing av nedsenkede mål. Disse leverandørene har også kabler og tilbehør (f.eks. speilreflektoren i SAT3).
    2. Minimer PCD-respons på den amerikanske kilden. Dette kan gjøres både gjennom valg av PCD (senterfrekvens og båndbredde) og ved å bruke et hakk eller høypassfilter. Sistnevnte kan implementeres enten som en frittstående modul eller som en del av en signalkondisjoneringsenhet.
    3. Bruk en digitaliseringsenhet med et stort dynamisk område (minst 12 biter) til å registrere så mye data som mulig med minimal sannsynlighet for høy signalklipping og maksimalt signal-til-støy-forhold (SNR) for de minste signalene. Når du sammenligner enheter, må du se gjennom spesifikasjonene for signal til støy og forvrengning og/eller effektivt antall biter, da dette er mer fullstendige beskrivelser av oppnåelig dynamisk område. Vurder også om størrelsen på minnebufferen er tilstrekkelig for ønsket lengde og hastighet på datafangst.
    4. Optimaliser bruken av digitaliseringsenhetens dynamiske område. PCD-signaler kan dekke flere størrelsesordener, både på grunn av en lang eksponering (ettersom bobler elimineres) og hvis du kjører eksperimenter på forskjellige amerikanske stasjonsnivåer. Det er derfor nødvendig å kontrollere at signalkondisjoneringskjeden skalerer alle signaler slik at de kan registreres riktig.
    5. Inkluder en forforsterker i signalkjeden, slik at de minste forventede signalene kan fanges tilstrekkelig opp. Etter vår erfaring er PCD selvstøy godt under de fleste digitaliseringslydere, så en beskjeden grad av preamplifisering (f.eks. <100x) kan fortsatt forbedre SNR for det endelige resultatet.
    6. Filtrer den amerikanske kildefrekvensen før forforsterkning for å unngå å mette forsterkeren.
    7. Hvis en amerikansk pulsør/mottaker brukes til å gi forsterknings- og/eller filtreringsfunksjoner, bruker du den i pulsmodus for å bekrefte banelengde/-justering eller se etter uventede spredere i forplantningsbanen mellom PCD og celleeksponeringsrommet.
    8. Aktiver sanntidsstrømming av data til lagring. SAT2- og SAT3-systemene bruker begge 12-biters strømming av USB-oscilloskoper (se Materialfortegnelse), som har bekvemmeligheter av bærbarhet og velbygde brukergrensesnitt.
    9. Bekreft riktig impedansmatching i signalkjeden for å unngå forsterkning eller båndbreddefeil. PCD-enheter har vanligvis utgangsimpedanser nær 50 ohm, så en passende prosess er å erstatte PCD med et kjent signal fra en bølgeformgenerator (med 50 ohm utgangsimpedans) og bekrefte at signalstørrelsen som vises på digitaliseringsenheten samsvarer med forventningene, skalerer lineært når det injiserte signalet endres, og ingen klipping observeres for det største signalet av interesse.
  2. Forhåndsbehandling
    1. Korrigere råspenningssignalene for alle kjente gevinster og følsomheter i signalbanen som er relatert til behandling av data i frekvensområdet av interesse.
    2. Hvis dataene ble registrert med DC-inndatakobling eller på annen måte viser en DC-forskyvning, fjerner du denne forskyvningen ved direkte subtraksjon eller med et filter med høy pass.
  3. Beregn kraftspekteret P for hvert registrerte signal.
    1. Angi Fourier-transformeringslengden Nft slik at den grunnleggende frekvensen for den amerikanske kilden f0 er et stort heltalls multiplum av transformeringshyllebredden: Nft =   nfs/f0, der n er et heltall og f s er samplingsfrekvensen for de digitaliserte dataene. Sett n ≥ 50 for klar fangst av spektralfunksjoner. For eksempel en 1 MHz fundamental samplet på 50 MHz, N ft er 2500 og bin bredde er 0.02 MHz.
    2. Siden transformeringslengden Nft vanligvis er mindre enn varigheten av innspilt signal, bruker du en spektral tetthet (PSD) for eksempel Welchs metode73. Kraft i et frekvensbånd som strekker seg over f1-f2 er Equation 13 , der dF er transformeringshyllebredden.
    3. Hvis du vil karakterisere bobleaktivitet under hver eksponering, estimerer du bidragene til kraftspekteret fra heltallsfaktorer på f0 (harmonikk), oddetalls heltallsverdier på f0/2 (ultraharmonikk) og bredbåndsstøy (inertiell kavitasjon).
    4. Harmonisk og ultraharmonisk innhold estimeres ganske enkelt ved å velge kraftspektrumverdiene ved bestemte frekvenser. Imidlertid kan store amplitude toneresponser spre seg til et lite antall tilstøtende frekvenshyller (f.eks. f0 ± 2-3), så disse bør inkluderes i de smale båndstrømberegningene og utelukkes fra bredbåndsberegningene.
    5. Estimere bredbåndsbåndkavitasjonskraft ved subtraksjon av de harmoniske og ultraharmoniske bidragene fra det totale kraftspekteret. Alternativt kan disse bidragene estimeres ved hjelp av mer sofistikert forhåndsbehandling74.
    6. Beregn den kumulative kavitasjonssignalenergien i løpet av eksponeringens varighet, helst i henhold til spektrumfunksjon / bobleaktivitetstype.
    7. Forutsatt at alle dataposter hadde lik varighet Tr, er den akkumulerte energien i de registrerte dataene Equation 15 , der M angir antall poster.
    8. Hvis det er hull mellom opptakene, som det kan skje når eksponeringen er kontinuerlig, og de lagrede filene fanger opp en brøkdel av den totale eksponeringsvarigheten Te, kan den kumulative energien estimeres som Equation 16
    9. Beregn måling SNR ved sammenligning av spektrumnivåer med de av bakgrunnsstøy registrert i fravær av USA.

3. Eksperimentell protokoll

  1. SAT Forberedelse
    1. Minimer sannsynligheten for kavitasjon i forplantningsbanen ved å avgasse fyllvæsken (vanligvis filtrert vann) under et trykk på -105 Pa i minst to timer. Bekreftelse med en oppløst oksygensonde om at det delvise oksygentrykket er under 10 kPa anbefales.
    2. Fyll testkammeret langsomt for å minimere gjeninnføringen av luft i avgasset væske. Fortsett å avgasse det fylte kammeret om nødvendig.
    3. Fjern alle gjenværende bobler fra transduseren og mediebeholderoverflatene umiddelbart etter fylling og igjen like før du starter eksponeringsforsøk.
    4. Sørg for at temperaturen i kammeret og innholdet har stabilisert seg før du starter eksponeringsforsøk.
    5. La den amerikanske kildestrømforsterkeren varme opp (per produsentanbefaling) slik at gevinsten og produksjonen er stabil med hensyn til tid.
  2. Klargjøring av eksponeringsrom
    1. Kavitasjonsmiddel suspensjon
      1. Når du fortynner kavitasjonsmiddelet, rør forsiktig og kontinuerlig for å lage en jevn suspensjon uten å fange makrobobler eller ødelegge midlet (spesielt hvis de er skallede bobler).
      2. Når du arbeider med MB, må du trekke ut og dispensere sakte ved hjelp av den største nålen som er tilgjengelig for å minimere ødeleggelse under lasteprosessen75. En 18 G stump fyllnål har blitt brukt regelmessig med SAT-systemene.
  3. SAT2 Forberedelse
    1. Steriliser PDMS-lokket før bruk i eksperimenter med levende celler.
    2. Form celleeksponeringsrommet ved å trykke på å montere PDMS-lokket på kulturfatet.
    3. Forbered en sprøyte med en 18 G stump kanyle og fyll med ca. 10 ml væske (f.eks. MB suspensjon eller vannkontroll).
    4. Sett nålen gjennom et av PDMS-fyllhullene og fyll kammeret langsomt, vipp slik at makrobobler kan unnslippe gjennom det åpne fyllhullet. For best resultat, vipp kammeret slik at det åpne hullet er over fyllhullet.
    5. Når det er fylt, lukk det åpne hullet ved å sette inn en kort (4-5 mm) polymerstang. Sett enheten slik at begge hullene er horisontale.
    6. Fjern den stumpe påfyllingsnålen mens du injiserer ekstra væske slik at luften ikke trekkes inn. Lukk hullet med en annen polymerstang. Denne prosessen fullfører forseglingen av celleeksponeringsrommet.
    7. Kontroller visuelt rommet for bevis på fangede makrobobler, og hvis noen blir funnet, gjenta 3.3.3.-3.3.6.
    8. Trykk på monter celleeksponeringsrommet i romholderen. Monter kammerlokket på plass på toppen av kammeret. Senking av lokket med vinkel mot horisontal fraråder makrobobler å hvile på de nedsenkede delene (absorber, holder).
    9. Vurder oppdriften av partiklene i suspensjon når du bestemmer retningen på celleeksponeringsrommet (f.eks. flytende bobler eller synkende nanopartikler) og hvordan dette vil påvirke deres kontakt med celler.
    10. I alle operasjoner, bruk så lite kraft som mulig for å minimere fleksuren til cellevekstoverflaten og løsrivelse av celler.
  4. SAT3 Forberedelse
    1. Fyll Transwell med ca. 150 μL væske (f.eks. MB suspensjon eller vannkontroll).
    2. Form celleeksponeringsrommet ved å forsegle transwellet forsiktig med en gummiplugg, fjern eventuell overløpsvæske med et rent papirhåndkle eller tørk. Steriliser gummipluggen før bruk i eksperimenter med levende celler.
    3. Kontroller visuelt rommet for bevis på oppfangede makrobubbles, og hvis noen blir funnet, fjern pluggen, fjern makroboblene og gjenta 4.4.2.
    4. Trykk på monter celleeksponeringsrommet i romholderen. Monter kammerlokket på plass på toppen av kammeret. Senking av lokket med vinkel mot horisontal fraråder makrobobler å hvile på de nedsenkede delene (absorber, holder).
      MERK: Som nevnt ovenfor kan makrobobler forårsake en rekke ikke-repeterbare og potensielt skadelige effekter på amerikanske eksponeringsforsøk. Mest kritisk kan makrobobler som er fanget i celleeksponeringsrommet forårsake PCD-responser og lokale cellulære bioeffekter som ikke er representative for den tiltenkte behandlingen. Kontroller alltid alle systemkomponenter visuelt for å finne og fjerne makrobobler før du starter amerikanske eksperimenter.

4. Datainnsamling

  1. Etablere bakgrunns-PCD-responsnivåer ved å utføre innledende eksperimenter med et celleeksponeringsrom fylt med kontrollvæske (f.eks. avgasset vann eller cellemedier).
  2. Ta opp PCD-data uten å kjøre den amerikanske kilden for å etablere elektroniske bakgrunnsstøynivåer.
  3. Ta opp PCD-data mens du kjører den amerikanske kilden på hele spekteret av planlagte stasjonsnivåer. Disse dataene vil indikere hvilke deler av den akustiske responsen som ikke er relatert til kavitasjonsmidlene som skal testes senere.
    MERK: Vanlige laboratorievæsker (f.eks. PBS eller cellemedier) vil vise kavitasjon ved moderate trykk (f.eks. 0,5 MPa ved 0,5 MHz) hvis de ikke avgasses.
  4. Før du begynner målinger, gi tid til suspensjonen å termisk likevekte med kammertemperaturen. En fin nål termokobling kan være nyttig for dette formålet.
  5. Overvåk eksperimentene i sanntid både i tids- og frekvensdomenene.
    1. Tidsdomeneovervåking av PCD avslører om signalene er dimensjonert riktig for gjeldende instrumenteringsinnstillinger. Spesielt skal signalutklipp unngås, siden det vil vises i frekvensdomenet som flertonet harmonisk respons.
    2. Tidsdomeneovervåking av PCD viser også om kavitasjonssignaler ses tidligere enn forventet basert på forplantningstid fra den amerikanske kilden til eksponeringsrommet til PCD. Hvis slike signaler ses, kan dette indikere lekkasje av kavitasjonsmiddel i testkammeret.
    3. Frekvensdomeneovervåking av PCD indikerer typen bobleatferd og kan brukes til å justere stasjonsnivåene etter behov for å oppnå ønsket celletamulans (f.eks. lavere drivnivåer for harmonisk eksitasjon).
  6. For å sikre at de første eksponeringene ikke blir oversett, start datainnsamlingsprosessen før du slår på det amerikanske kildestasjonssignalet.
  7. Overvåk forsterkerutgangssignalet som driver den amerikanske kilden (i motsetning til bølgeformgeneratorutgangen) gjennom hele eksperimentet for å sikre at eksponeringen fortsetter som forventet. Bruk en høyspenningssonde for denne målingen og sørg for at oscilloskopet er satt til å kompensere for sondedemping.
  8. Etter å ha eksponert en prøve, fjern den forsiktig fra testkammeret.
    1. Fjern og rengjør PDMS-lokket (SAT2)/gummipluggen (SAT3) som forberedelse til senere bruk.
    2. Overfør kulturretten (SAT2)/Transwell (SAT3) etter behov for etterfølgende analyse (f.eks. mikroskopi, fluorescensavbildning).
    3. Etter et lite antall eksponeringer (f.eks. 3-5), er det god praksis å innhente baseline kavitasjonssignaler (i fravær av kavitasjonsmiddel) og sammenligne med det opprinnelige datasettet for å sikre at kammermediet ikke er forurenset.

Representative Results

Figur 4 viser eksempler på PCD-svar for tids- og frekvensdomene, som illustrerer tre distinkte kavitasjonsatferd. Alle data ble samlet inn på SAT3 ved hjelp av SonoVue MB fortynnet 5x i PBS, med en endelig konsentrasjon på ~ 2 * 107 MB / ml. Temperaturen for alle eksemplene i denne delen var 19 ± 1 °C. Den amerikanske kilden ble drevet med en puls på 2,0 ms ved 0,5 MHz for å oppnå en topp negativt trykk på 0,20 (figur 4A og 4B), 0,30 (figur 4C og 4D) og 0,70 MPa (figur 4E og 4F). Signalopptakene begynte 1,4 ms før t = 0 starten av den amerikanske pulsen. Innsett-sporene viser signalet som registrert (rødt) og med et 2 MHz høypassfilter (blått) for et tidsvindu sentrert på tidspunktet for flyturen fra kilde til celleeksponeringsrom til PCD. Lavnivåresponsen før denne tiden skyldes direkte mottatt stråling fra kilden, noe som er vanlig i konfigurasjoner der PCD er bak den amerikanske kilden.

Ved det laveste hendelsestrykket består PCD-responsen utelukkende av heltallsharmonier av den grunnleggende amerikanske frekvensen på 0,5 MHz. Økning fra 0,20 til 0,30 MPa resulterer i uttalt ultraharmonikk i spekteret i tillegg til ytterligere forhøyet heltallsharmoni. Tidsdomenebølgeformene ved disse to trykkene ser like ut, selv om 0,30 MPa-resultatene viser mer variasjon i løpet av pulsvarigheten. Ved høyeste trykk har tidsdomenbølgeformamplituden vokst ikke-lineært i forhold til lavere trykk som følge av tydelig forhøyet bredbåndsstøy som er synlig i spekteret. Denne støyen anses ofte å være et resultat av inertiell kavitasjon, og i dette eksemplet tilsvarer ødeleggelse av MBs.

Hvis du vil se dette tydeligere, vises PCD-svar som en tidsfunksjon i figur 5. I venstre panel (figur 5A) vises hele spektra over en 50 sekunders eksponeringstid, der kilden sendte ut 2,0 ms pulser hvert 0,20 sekund. Tilsvarende total-, harmoniske og bredbåndskrefter vises i panelet til høyre (Figur 5B). USA ble slått på på t = 3 .0 s, da ble det sett store amplitude bredbåndsresponser. Den første piggen antas å tilsvare ødeleggelsen av de største boblene i suspensjonen (SonoVue er polydisperse) og er en vanlig observasjon i kavitasjonsforsøk med skallede bobler og til og med med ikke-avgassede medier (f.eks. PBS).

Etter noen sekunder ble bredbåndsresponsen raskt redusert, tilsynelatende på grunn av bobleødeleggelse, og signalet består hovedsakelig av harmonikk. Dette antyder at frigjort gass og gjenværende MB vibrerer stabilt og ikke-inertialt. På t ~ 50s har bredbåndskomponenten falt til nivået av den opprinnelige bakgrunnsstøyen. Eksponeringstester som dette er derfor viktige når du prøver å forstå tidsskalaene der forskjellige bobleeffekter kan virke på cellene i kammeret.

Bobler vil sannsynligvis oversette som svar på strålingskrefter generert under amerikansk eksponering og bevegelse av MB inn og ut av PCD-synsfeltet kan føre til økt variasjon i det overvåkede kavitasjonssignalet, spesielt når det gjelder fortynnede suspensjoner. Den følsomme regionen til PCD bør derfor strekke seg over så mye av celleeksponeringsoverflaten som mulig. En sammenligning av svarene fokuserte og ufokuserte PCD-er med identiske senterfrekvenser (se figur 2) vises i figur 6, ved hjelp av en 20:1-fortynning av MB i normal PBS er SAT2. Tids- og prøvegjennomsnittet i panel figur 6A viser at den ufokuserte PCD-en inneholder en sterkere bredbåndsrespons, ledsaget av redusert variasjon fra prøve til prøve i både harmoniske (figur 6B) og ultraharmoniske krefter (figur 6C).

Det er viktig å erkjenne at medier som brukes til in vitro-cellearbeid ikke blir avgasset og kan presentere et forbedret bakgrunnsnivå for bobleaktivitet. Figur 7 viser responsen i SAT2 av PBS som brukes i leverandørformen og etter to timer med avgassing under vakuum, hvoretter luftmetningen ble redusert fra 92% til 46% som bestemt med en optisk sensor (PreSens, Tyskland). Spektra i figur 7A ble gjennomsnittet over eksponeringstid og repetisjoner med fem uavhengige prøver, og viser tydelig tydelig forhøyet ultraharmoni i normal PBS. Krefter oppsummert over tre harmonikk (Figur 7B) er godt innenfor standardavviket for hver eksperimentelle utgang. Til sammenligning viser de ultraharmoniske summene i figur 7C at normal PBS har nesten en størrelsesorden høyere nivå og vesentlig høyere variasjon mellom prøver. Disse eksemplene indikerer at et vanlig cellekompatibelt medium kan oppføre seg som kan være (feil) tilskrevet tilstedeværelsen av MB. Siden det vanligvis er upraktisk å degas kulturmedium på grunn av den negative effekten på celler og / eller kavitasjonsmiddelstabilitet, er det viktig å utføre egnede kontroller i enhver kavitasjonsrelatert studie.

Figure 1
Figur 1: Illustrasjoner av to design av det amerikanske eksponeringssystemet som omfatter kavitasjonsovervåking: SAT3 (D-F). (A) SAT2-kommentert montering med sidevegg fjernet for klarhet. (B) SAT2 med sideveggen intakt. (C) SAT2 celleeksponeringsrom, demontert. (D) SAT3-merknadsenhet. (E) SAT3 i normale (venstre) og objektiverte (høyre) konfigurasjoner for strålebredde som samsvarer med forskjellige frekvenser. (F) SAT3 celleeksponeringsrom, demontert. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Beregninger av halvamplitudetrykkfeltkonturer for 12,7 mm diameter ufokusert (venstre) og sfærisk fokuserte (høyre) transdusere. Frekvenser på henholdsvis 2, 4 og 8 MHz vises som røde, blå og grønne konturer for et PCD-element ved koordinatopprinnelsen (0,0). De ytterste konturene av den ufokuserte enheten er relativt ufølsomme for frekvens, men den indre strukturen er frekvensavhengig. Det sfærisk fokuserte feltet trekker seg sammen etter hvert som frekvensen øker, men inne i konturene varierer feltene jevnt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Instrumentering for kavitasjonssignalkondisjonering og opptak (blå piler), amerikansk kildeeksitasjon (røde linjer) og datainnhenting som utløses. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Tids- (venstre) og frekvens (høyre) domene-PCD-svar registrert med MBs fortynnet 5x i PBS. Hendelsen topp negativt trykk var (A, B) 0,2 MPa, (C, D) 0,4 MPa, (E, F) 0,7 MPa, alle på 0,5 MHz. Signalopptak begynner 1,4 ms før t = 0 starten av 2,0 ms varighet ultralydpuls. (A, C, E) Tidsdomenesignaler (røde) vises på en fast vertikal skala, noe som indikerer hvordan responsnivået endres med hendelsestrykk. Innsett-sporene viser signalet som registrert (rødt) og med et 2 MHz høypassfilter (blått) for et tidsvindu sentrert på tidspunktet for flyturen fra kilde til celleeksponeringsrom til PCD. (B, D, F) Støy- og signalkrafttetthet beregnes for henholdsvis t<0 og t>0. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Spektrumhistorier over en 50 sekunders eksponering av en suspensjon av MB fortynnet 5x i PBS. (A) Full spektra og (B) totale, harmoniske og bredbåndssignaler, alt som en funksjon av tid. Kjøreforholdene var 0,5 MHz, 0,7 MPa topp negativt trykk, 2,0 ms pulsvarighet, 200 ms puls repetisjonsperiode. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Effekt av PCD-fokuseringsgeometri registrert med en 20:1-fortynning av mikrobobler i normal PBS. Kjøreforholdene var: 1,0 MHz, 0,50 MPa topp negativt trykk, 3,0 ms pulsvarighet, 10 ms puls repetisjonsperiode. (A) Full spektra gjennomsnittet over eksponeringstid og tre uavhengige prøve repetisjoner. (B) Strøm i 3, 4 og 5 MHz harmonikk, og (C) strøm i 2,5, 3,5 og 4,5 MHz ultraharmonikk. Tykke linjer er utvalgsgjennomsnitt, skyggelagte områder angir +/- 1 standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Effekt av avgassede medier registrert med PBS. (A) Full spektra gjennomsnittet over eksponeringstid og fem uavhengige prøve repetisjoner. (B) Strøm i 3, 4 og 5 MHz harmonikk, og (C) strøm i 2,5, 3,5 og 4,5 MHz ultraharmonikk. Tykke linjer er utvalgsgjennomsnitt, skyggelagte områder angir +/- 1 standardavvik. Stasjonsforholdene var 1,0 MHz, 0,50 MPa topp negativt trykk, 1,0 ms pulsvarighet, 200 ms puls repetisjonsperiode. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

parameter enhet minimum maksimum
frekvens Mhz 0.02 15
trykk (topp negativ) Mpa 0.1 20
puls lengde Sykluser 1 Cw
Driftssyklus % 1 Cw
eksponeringstid s 10 1000

Tabell 1: Oppsummering av utvalget av rapporterte parametere som letter sonoporasjon in vitro.

Discussion

De kritiske trinnene for akustisk måling ble innkapslet av Apfel i 198176 som "kjenn din væske, kjenn ditt lydfelt, vet når noe skjer." I forbindelse med denne protokollen omfatter disse svingerkalibrering og justering og vannforberedelses- og boblehåndteringstrinnene. For det første er det viktig at hydrofonen som brukes til å kalibrere kjøretransduseren og/eller PCD-en selv er nøyaktig kalibrert gjennom regelmessig ekstern service eller intern sammenligning med en referansestandard. På samme måte må responsen til både kjøretransduseren og PCD regelmessig karakteriseres for å se etter endringer i utgang og / eller tap av følsomhet. Hvis kjøreforholdene og mottaksfølsomheten til systemet er ukjente, vil det være umulig å utlede noen meningsfull sammenheng mellom eksponeringsforhold, bioeffekter og akustiske utslipp. Direkte relatert til dette må justeringen av transduserne til hverandre og prøvekammeret kontrolleres nøye for å sikre at eksponeringsforholdene i kammeret er som forventet og prøvetakingsvolumet for PCD tilsvarer interesseområdet. Som angitt kan temperatur- og gassinnholdet i suspendert medium påvirke de endelige resultatene betydelig, og konsistens er ekstremt viktig i denne forbindelse77,78. På samme måte krever preparatet, karakteriseringen og håndteringen av kavitasjonsmiddelfjæringen svært nøye for å sikre at forventet størrelsesfordeling og konsentrasjon av partikler er tilstede i prøven. For eksempel, hvis konsentrasjonen av bobler er for høy, vil det være effektiv skjerming av prøvevolumet fra det amerikanske hendelsesfeltet. MB-agenter er spesielt utsatt for ødeleggelse og koalescens, og ytterligere veiledning om deres håndtering finnes i Mulvana et. al. (2012)79.

Et svært vanlig problem med påvisning av kavitasjonssignaler er å oppnå en tilstrekkelig SNR. Dette skyldes delvis selve signalets natur, som beskrevet, men kan også skyldes kilder til elektrisk støy i det eksperimentelle oppsettet. Kontroll av forbindelsene mellom systemkomponenter, spesielt de som involverer koaksialkabler, kan bidra til å eliminere noen av disse. Det kan være nødvendig å bytte ut eller reparere koaksialkabler. Det kan også hjelpe å identifisere og fjerne eller deaktivere annet utstyr i laboratoriet, for eksempel pumper som kan forårsake elektrisk støy. Dårlig elektrisk impedanssamsvar mellom systemkomponenter kan være en ytterligere årsak til dårlig signal-til-støy-forhold og også potensielt skade på utstyr og bør kontrolleres nøye. Utløserinnstillingene på signalgeneratoren og oscilloskopet bør på samme måte kontrolleres for å bekrefte at de er konfigurert riktig for eksperimentet og ikke har gått tilbake til produsentens standardinnstillinger. Hvis det er betydelig ødeleggelse av bobler under håndtering, i tilfelle SAT2, kan det være nyttig å feste en ny sprøyte til utløpsporten og bruke denne til forsiktig å trekke ut væske fra kammeret, og dermed trekke inn suspensjonen. Dette kan også bidra til å eliminere makrobobler eller aktivere flyt under amerikansk eksponering, hvis ønskelig.

Det er ikke mulig å fullstendig eliminere akustiske refleksjoner i prøvekammeret, og dermed vil hendelsesfeltet ikke være helt ensartet over hele prøvevolumet. Som nevnt i trinn 1.3.2 og 1.3.3, vil overførbarheten av akustiske vinduer være frekvensavhengig, og dermed bør ønsket båndbredde for akustiske utslippsmålinger vurderes nøye. Spesielt kan det være betydelige refleksjoner av komponenter med høyere frekvens. Dette er en annen grunn til at kalibrering av feltet i det fullt monterte systemet er så viktig for å minimere usikkerheten i hendelsespresset. Passende gating av de registrerte signalene bør også vurderes for å minimere effekten av flere refleksjoner. Bruk av kommersielle enheter for enkelhets skyld og behovet for akustisk transparens betyr at noe optisk gjennomsiktighet må ofres. Dette kan påvirke kvaliteten på etterfølgende avbildning, for eksempel for å vurdere celle levedyktighet eller legemiddelopptak. Noen av membranene som brukes i kommersielle enheter er også porøse, og dermed oppstår ufullkommen isolasjon mellom prøvekammeret og det omkringliggende vannbadet. Som ovenfor kan den tilsvarende risikoen for forurensning reduseres ved å bruke et mindre underkammer, hvis innhold regelmessig kan erstattes. Cellekulturenhetene som er angitt i materialtabellen, er først og fremst egnet for cellemonolayere som kanskje ikke er representative for vev når det gjelder alle amerikanske / kavitasjonsmediert bioeffekter. Nærheten til cellene til en solid overflate vil også påvirke MB-dynamikken på en måte som kanskje ikke reflekterer forholdene i vivo, for eksempel å fremme mikrostreaming og mikrojetting som beskrevet i introduksjonen. Disse begrensningene kan imidlertid løses gjennom en enkel erstatning av alternative vevsmodeller.

Målet med å foreslå SAT-ene er å gi et middel til å forbedre reproduserbarheten av akustiske eksponeringsforhold og akustiske utslipp mellom studier av usa-medierte bioeffekter, og dermed forhåpentligvis legge til rette for bedre forståelse av de underliggende mekanismene og utviklingen av behandlingsovervåkingsteknikker for å forbedre sikkerhet og effekt. Systemene er designet for å være kompatible med kommersielt tilgjengelige cellekulturenheter, slik at et bredt spekter av biologiske analyser kan utføres i henhold til anvendelsen av interesse og muliggjøre ytelsen til eksperimenter med høy gjennomstrømning, og fjerner behovet for tidkrevende justeringsprosedyrer mellom kjøringer. Ved å standardisere protokoller for karakterisering av eksponeringsforhold og fangst av akustiske utslipp, kan systemavhengig variasjon forhåpentligvis reduseres. Utvalget av parametere som bør utforskes for et bestemt eksperiment, vil avhenge av applikasjonen (ønsket bioeffekt, celletype, dybde av målvev hvis in vivo etc.) og arten av et kavitasjonsmiddel som brukes. Gitt det store antallet variabler (amerikansk frekvens, trykkamplitude, pulslengde, pulsrepetisjonsfrekvens etc.) er det lite sannsynlig at det er praktisk å utforske hele parameterområdet. En fordel med den foreslåtte protokollen er at den gjør det mulig å opprette noen grenser på dette parameterområdet raskt. For eksempel muliggjør det bestemmelse av minimumstrykket der et kavitasjonssignal genereres, maksimalt trykk eller pulslengde som kan brukes før celleavløsning / død oppstår, og trykket der fraksjonell harmonikk eller bredbåndsstøy produseres. Det anbefales at et slikt sett med scoping-målinger utføres som et første trinn i en studie.

Som presentert er SAT-ene designet for sanntidsovervåking av akustiske utslipp, med biologiske analyser utført utenfor eksperimentet. Det ville imidlertid være relativt enkelt å modifisere SAT for å muliggjøre direkte optisk observasjon av prøvekammeret via et mikroskopmål. Dette kan igjen kobles til et fluorescens- og/eller høyhastighetsmikroskopisystem for å muliggjøre observasjon av for eksempel legemiddelopptak og bobledynamikk. PCD-utgangen som for tiden presenteres når det gjelder spenning indikerer: i) typer kavitasjonsadferd og deres relative proporsjoner; ii) hvor lenge disse kavitasjonsatferdene vedvarer; iii) om de observerte tids kumulative eksponeringsegenskapene er korrelert med en bestemt bioeffekt; og iv) om de relative nivåene og tidsavhengig atferd er i samsvar med tidligere eksperimenter i eksponeringssystemet. Selv om PCDs mottaksfølsomhet kan kvantifiseres, er det nødvendig med ytterligere romlig informasjon for å på en pålitelig måte karakterisere de akustiske utslippene når det gjelder absolutt energi. Dette kan oppnås ved å erstatte PCD med en array-sonde for å implementere passiv akustisk kartlegging (PAM)80. Dette vil imidlertid øke kompleksiteten i signalbehandling og beregningstiden og kraften som kreves.

Annen instrumentering for måling av membran elektrisk motstand eller anvendelse av fysiske målrettingsmetoder, for eksempel magnetiske felt, kan også innlemmes. Det ville også være mulig å bruke tredimensjonale vevsstrukturer som tumorsfæroider, organoider eller til og med ex vivo vevsprøver på akustisk "myke" gelunderlag i stedet for cellemonolayers for å studere amerikanske og kavitasjonsmedierte effekter i mer realistiske vevsmiljøer.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Ingeniør- og fysikkforskningsrådet for å støtte dette arbeidet gjennom tilskudd EP/L024012/1. VB støttes også av Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) og Medical Research Council (MRC) (grant EP/L016052/1). VB og AV takker Clarendon Foundation for Post Graduate Scholarships. AV takker også Exeter College for et Santander-stipend. Forfatterne står i gjeld til James Fisk og David Salisbury for deres uvurderlige hjelp i produksjonen av apparatet. De anerkjenner også takknemlig bidragene fra Dr. Dario Carugo og Joshua Owen i utviklingen av tidligere prototype SATs.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorber Precision Acoustics APTFlex F28 panel 1.0 cm standard thickness
Amplifier (power) E&I Ltd. 1040L 400W power amplifier to drive ultrasound source
Amplifier (pre) Stanford Research Systems SR445A Fixed gain multi-stage preamplifier for PCD signals
Aquarium heater Aquael Ultra 50W Different models for different tank sizes.
Digitizer TiePie Engineering HS5-110-XM Extended memory option: 32M points per channel
Hydrophone Precision Acoustics FOH 0.01 mm diameter sensitive area minimises directivity effects
Microbubbles Bracco SonoVue FDA approved microbubbles
PCD mirror (SAT3) Olympus NDT F-102 90 degree beam reflection
PCD transducer Olympus NDT V320-SU Immersion transducer, 7.5MHz
PCD waterproof cable Olympus NDT BCU-58-1 W
PDMS (SAT2 compartment lid) Corning Sylgard 184 See Carugo et al. (2015) for preparation guidelines
Polymer rod (SAT2 seal) Zeus PTFE monofilament
Rubber plug (SAT3 lid/seal) VWR 391-2101 6mm bottom dia., 8mm top dia., red
Signal generator Agilent 33250 Waveform generator for ultrasound source
Substrate for cell exposure compartment, SAT2 Ibidi µ-Dish 35mm
Substrate for cell exposure compartment, SAT3 Corning Transwell 6.5mm
Ultrasound source (SAT3) Sonic Concepts H107 with central hole Use of a HIFU-capable source allows pressures >1MPa to be generated both at the focus and pre-focally for expanded spatial coverage

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maier, A., Steidl, S., Christlein, V., Hornegger, J. Medical Imaging Systems - An Introductory Guide. Lecture Notes in Computer Science. , Springer. (2018).
  2. Tachibana, K., Tachibana, S. Albumin microbubble echo-contrast material as an enhancer for ultrasound accelerated thrombolysis. Circulation. 92, 1148-1150 (1995).
  3. Bao, S., Thrall, B. D., Miller, D. L. Transfection of a reporter plasmid into cultured cells by sonoporation in vitro. Ultrasound in Medicine and Biology. 23 (6), 953-959 (1997).
  4. Price, R. J., Skyba, D. M., Kaul, S., Skalak, T. C. Delivery of colloidal particles and red blood cells to tissue through microvessel ruptures created by targeted microbubble destruction with ultrasound. Circulation. 98 (13), 1264-1267 (1998).
  5. Theek, B., et al. Sonoporation enhances liposome accumulation and penetration in tumors with low EPR. Journal of Controlled Release. 231, 77-85 (2016).
  6. Dimcevski, G., et al. A human clinical trial using ultrasound and microbubbles to enhance gemcitabine treatment of inoperable pancreatic cancer. Journal of Controlled Release. 243, 172-181 (2016).
  7. Snipstad, S., et al. Ultrasound Improves the Delivery and Therapeutic Effect of Nanoparticle-Stabilized Microbubbles in Breast Cancer Xenografts. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (11), 2651-2669 (2017).
  8. Unga, J., Hashida, M. Ultrasound induced cancer immunotherapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 72, 144-153 (2014).
  9. Yang, C., Du, M., Yan, F., Chen, Z. Focused ultrasound improves NK-92MI cells infiltration into tumors. Frontiers in Pharmacology. 10, 326 (2019).
  10. McDannold, N., Arvanitis, C. D., Vykhodtseva, N., Livingstone, M. S. Temporary disruption of the blood-brain barrier by use of ultrasound and microbubbles: Safety and efficacy evaluation in rhesus macaques. Cancer Research. 72 (14), 3652-3663 (2012).
  11. O'Reilly, M. A., Hynynen, K. Ultrasound and microbubble-mediated blood-brain barrier disruption for targeted delivery of therapeutics to the brain. Methods in Molecular Biology. 1831, 111-119 (2018).
  12. Mainprize, T., et al. Blood-Brain Barrier Opening in Primary Brain Tumors with Non-invasive MR-Guided Focused Ultrasound: A Clinical Safety and Feasibility Study. Scientific Reports. 9, 321 (2019).
  13. Ebben, H. P., Nederhoed, J. H., Lely, R. J., Wisselink, W., Yeung, K. Microbubbles and UltraSound-accelerated Thrombolysis (MUST) for peripheral arterial occlusions: Protocol for a phase II single-arm trial. BMJ Open. 7, 014365 (2017).
  14. de Saint Victor, M., Barnsley, L. C., Carugo, D., Owen, J., Coussios, C. C., Stride, E. Sonothrombolysis with Magnetically Targeted Microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (5), 1151-1163 (2019).
  15. Dixon, A. J., Li, J., Rickel, J. M. R., Klibanov, A. L., Zuo, Z., Hossack, J. A. Efficacy of Sonothrombolysis Using Microbubbles Produced by a Catheter-Based Microfluidic Device in a Rat Model of Ischemic Stroke. Annals of Biomedical Engineering. , (2019).
  16. Horsley, H., et al. Ultrasound-activated microbubbles as a novel intracellular drug delivery system for urinary tract infection. Journal of Controlled Release. 301, 166-175 (2019).
  17. Lattwein, K. R., et al. Sonobactericide: An Emerging Treatment Strategy for Bacterial Infections. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (2), 193-215 (2020).
  18. Crum, L. A., Fowlkes, J. B. Acoustic cavitation generated by microsecond pulses of ultrasound. Nature. 319, 52-54 (1986).
  19. Holland, C. K., Apfel, R. E. Thresholds for transient cavitation produced by pulsed ultrasound in a controlled nuclei environment. Journal of the Acoustical Society of America. 88, 2059-2069 (1990).
  20. Rifai, B., Arvanitis, C. D., Bazan-Peregrino, M., Coussios, C. C. Cavitation-enhanced delivery of macromolecules into an obstructed vessel. The Journal of the Acoustical Society of America. 128, (2010).
  21. Wu, J., Ross, J. P., Chiu, J. F. Reparable sonoporation generated by microstreaming. The Journal of the Acoustical Society of America. 111 (3), 1460-1464 (2002).
  22. Doinikov, A. A., Bouakaz, A. Acoustic microstreaming around a gas bubble. The Journal of the Acoustical Society of America. 127 (2), 703-709 (2010).
  23. De Cock, I., et al. Ultrasound and microbubble mediated drug delivery: acoustic pressure as determinant for uptake via membrane pores or endocytosis. Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. 197, 20-28 (2015).
  24. Pereno, V., Lei, J., Carugo, D., Stride, E. Microstreaming inside Model Cells Induced by Ultrasound and Microbubbles. Langmuir. 36, 6388-6398 (2020).
  25. Chen, H., Brayman, A. A., Kreider, W., Bailey, M. R., Matula, T. J. Observations of translation and jetting of ultrasound-activated microbubbles in mesenteric microvessels. Ultrasound in Medicine and Biology. 37 (12), 2139-2148 (2011).
  26. Lentacker, I., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Drug loaded microbubble design for ultrasound triggered delivery. Soft Matter. 5, 2161-2170 (2009).
  27. Song, J. H., Moldovan, A., Prentice, P. Non-linear Acoustic Emissions from Therapeutically Driven Contrast Agent Microbubbles. Ultrasound in Medicine and Biology. 45 (8), 2188-2204 (2019).
  28. Ohl, C., Arora, M., Ikink, R., De Jong, N., Versluis, M., Delius, M. Sonoporation from Jetting Cavitation Bubbles. Biophysical Journal. 91 (11), 4285-4295 (2006).
  29. Li, Z. G., Liu, aQ., Klaseboer, E., Zhang, J. B., Ohl, C. D. Single cell membrane poration by bubble-induced microjets in a microfluidic chip. Lab on a Chip. 13 (6), 1144-1150 (2013).
  30. Wang, Q. X., Manmi, K. Three dimensional microbubble dynamics near a wall subject to high intensity ultrasound. Physics of Fluids. 26, 032104 (2014).
  31. Suslick, K. S. Ultrasound: Its Chemical, Physical, and Biological Effects. Radiology. , VHC Publishers. New York. (1988).
  32. Mitragotri, S. Healing sound: the use of ultrasound in drug delivery and other therapeutic applications. Nature reviews. Drug discovery. 4 (3), 255-260 (2005).
  33. Mitragotri, S. Sonophoresis: Ultrasound-mediated transdermal drug delivery. Percutaneous Penetration Enhancers Physical Methods in Penetration Enhancement. , 3-14 (2017).
  34. Park, J., Lee,, et al. Enhanced Transdermal Drug Delivery by Sonophoresis and Simultaneous Application of Sonophoresis and Iontophoresis. AAPS PharmSciTech. 20 (3), 96 (2019).
  35. Lentacker, I., De Cock, I., Deckers, R., De Smedt, S. C., Moonen, C. T. W. Understanding ultrasound induced sonoporation: Definitions and underlying mechanisms. Advanced Drug Delivery Reviews. 72, 49-64 (2014).
  36. Wawryka, P., Kiełbik, A., Iwanek, G. Microbubble based sonoporation - the basics into clinical implications. Medical Research Journal. 4 (3), 178-183 (2019).
  37. Hilgenfeldt, S., Lohse, D., Zomack, M. Sound scattering and localized heat deposition of pulse-driven microbubbles. The Journal of the Acoustical Society of America. 107 (6), 3530-3539 (2000).
  38. Holt, R. G., Roy, R. A. Measurements of bubble-enhanced heating from focused, MHz-frequency ultrasound in a tissue-mimicking material. Ultrasound Medical Biology. 27 (10), 1399-1412 (2001).
  39. Tan, J., Li, P., Xue, H., Li, Q. Cyanidin-3-glucoside prevents hydrogen peroxide (H 2 O 2 )-induced oxidative damage in HepG2 cells. Biotechnology Letters. 42 (11), 2453-2466 (2020).
  40. Costley, D., et al. Treating cancer with sonodynamic therapy: A review. International Journal of Hyperthermia. 31 (2), 107-117 (2015).
  41. You, D. G., et al. ROS-generating TiO2 nanoparticles for non-invasive sonodynamic therapy of cancer. Scientific Reports. 6, 23200 (2016).
  42. Canavese, G., et al. Nanoparticle-assisted ultrasound: A special focus on sonodynamic therapy against cancer. Chemical Engineering Journal. 340, 155-172 (2018).
  43. Beguin, E., et al. Direct Evidence of Multibubble Sonoluminescence Using Therapeutic Ultrasound and Microbubbles. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (22), 19913-19919 (2019).
  44. Stride, E., et al. Microbubble Agents: New Directions. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (6), 1326-1343 (2020).
  45. Rapoport, N., Gao, Z., Kennedy, A. Multifunctional nanoparticles for combining ultrasonic tumor imaging and targeted chemotherapy. Journal of the National Cancer Institute. 99 (14), 1095-1106 (2007).
  46. Cao, Y., et al. Drug release from phase-changeable nanodroplets triggered by low-intensity focused ultrasound. Theranostics. 8 (5), 1327-1339 (2018).
  47. Zhang, L., et al. Mitochondria-Targeted and Ultrasound-Activated Nanodroplets for Enhanced Deep-Penetration Sonodynamic Cancer Therapy. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (9), 9355-9366 (2019).
  48. Delogu, L. G., et al. Functionalized multiwalled carbon nanotubes as ultrasound contrast agents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (41), 16612-16617 (2012).
  49. Paris, J. L., et al. Ultrasound-mediated cavitation-enhanced extravasation of mesoporous silica nanoparticles for controlled-release drug delivery. Chemical Engineering Journal. 340, 2-8 (2018).
  50. Mannaris, C., et al. Gas-Stabilizing Gold Nanocones for Acoustically Mediated Drug Delivery. Advanced Healthcare Materials. 7 (12), 1800184 (2018).
  51. Kwan, J. J., et al. Ultrasound-induced inertial cavitation from gas-stabilizing nanoparticles. Physical Review E - Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 92 (2), (2015).
  52. Kwan, J. J., et al. Ultrasound-Propelled Nanocups for Drug Delivery. Small. 11 (39), 5305-5314 (2015).
  53. Mannaris, C., et al. Microbubbles, Nanodroplets and Gas-Stabilizing Solid Particles for Ultrasound-Mediated Extravasation of Unencapsulated Drugs: An Exposure Parameter Optimization Study. Ultrasound in Medicine and Biology. 45, 954-967 (2019).
  54. Roovers, S., et al. The Role of Ultrasound-Driven Microbubble Dynamics in Drug Delivery: From Microbubble Fundamentals to Clinical Translation. Langmuir. 35, 10173-10191 (2019).
  55. Lentacker, I., Geers, B., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Design and Evaluation of Doxorubicin-containing Microbubbles for Ultrasound-triggered Doxorubicin Delivery: Cytotoxicity and Mechanisms Involved. Molecular Therapy. 18 (1), 101-108 (2010).
  56. De Cock, I., Lajoinie, G., Versluis, M., De Smedt, S. C., Lentacker, I. Sonoprinting and the importance of microbubble loading for the ultrasound mediated cellular delivery of nanoparticles. Biomaterials. 83, 294-307 (2016).
  57. Roovers, S., et al. Sonoprinting of nanoparticle-loaded microbubbles: Unraveling the multi-timescale mechanism. Biomaterials. 217, 119250 (2019).
  58. Carugo, D., et al. Modulation of the molecular arrangement in artificial and biological membranes by phospholipid-shelled microbubbles. Biomaterials. 113, 105-117 (2017).
  59. Stride, E. P., Coussios, C. C. Cavitation and contrast: The use of bubbles in ultrasound imaging and therapy. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 224 (2), 171-191 (2010).
  60. Stride, E., Coussios, C. Nucleation, mapping and control of cavitation for drug delivery. Nature Reviews Physics. 1, 495-509 (2019).
  61. Dong, Y., et al. Antibiofilm effect of ultrasound combined with microbubbles against Staphylococcus epidermidis biofilm. International Journal of Medical Microbiology. 307 (6), 321-328 (2017).
  62. Van Rooij, T., et al. Vibrational Responses of Bound and Nonbound Targeted Lipid-Coated Single Microbubbles. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (5), 785-797 (2017).
  63. Duan, X., Yu, A. C. H., Wan, J. M. F. Cellular Bioeffect Investigations on Low-Intensity Pulsed Ultrasound and Sonoporation: Platform Design and Flow Cytometry Protocol. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 66 (9), 1422-1434 (2019).
  64. Hu, Y., Wan, J. M. F., Yu, A. C. H. Membrane Perforation and Recovery Dynamics in Microbubble-Mediated Sonoporation. Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).
  65. Carugo, D., Owen, J., Crake, C., Lee, J. Y., Stride, E. Biologicallyand acoustically compatible chamber for studying ultrasound-mediated delivery of therapeutic compounds. Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (7), 1927-1937 (2015).
  66. Pereno, V., et al. Layered acoustofluidic resonators for the simultaneous optical and acoustic characterisation of cavitation dynamics, microstreaming, and biological effects. Biomicrofluidics. 12 (3), 034109 (2018).
  67. Fan, Z., Liu, H., Mayer, M., Deng, C. X. C. X. Spatiotemporally controlled single cell sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (41), 16486-16491 (2012).
  68. Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2016).
  69. Helfield, B. L., Chen, X., Qin, B., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Mechanistic Insight into Sonoporation with Ultrasound-Stimulated Polymer Microbubbles. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (11), 2678-2689 (2017).
  70. Aron, M., Vince, O., Gray, M., Mannaris, C., Stride, E. Investigating the Role of Lipid Transfer in Microbubble-Mediated Drug Delivery. Langmuir. 35 (40), 13205-13215 (2019).
  71. Kinsler, L. E., Frey, A. R., Coppens, A. B., Sanders, J. V. Fundamentals of Acoustics, 4th Edition. , Wiley. ISBN: 0-471-84789-5 (2000).
  72. Wear, K. A. Considerations for Choosing Sensitive Element Size for Needle and Fiber-Optic Hydrophones-Part I: Spatiotemporal Transfer Function and Graphical Guide. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 66 (2), 318-339 (2019).
  73. Stoica, P., Moses, R. Spectral Analysis of Signals. , Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. (2005).
  74. Lyka, E., Coviello, C., Kozick, R., Coussios, C. C. Sum-of-harmonics method for improved narrowband and broadband signal quantification during passive monitoring of ultrasound therapies. Journal of the Acoustical Society of America. 140 (1), 741-754 (2016).
  75. Barrack, T., Stride, E. Microbubble Destruction During Intravenous Administration: A Preliminary Study. Ultrasound in Medicine and Biology. 35 (3), 515-522 (2009).
  76. Apfel, R. E. Acoustic cavitation. Methods in Experimental Physics. 19, 355-411 (1981).
  77. Mulvana, H., Stride, E., Tang, M. X., Hajnal, J. V., Eckersley, R. J. The Influence of Gas Saturation on Microbubble Stability. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (6), 1097-1100 (2012).
  78. Mulvana, H., Stride, E., Hajnal, J. V., Eckersley, R. J. Temperature dependent behavior of ultrasound contrast agents. Ultrasound in Medicine and Biology. 36 (6), 925-934 (2010).
  79. Mulvana, H., Eckersley, R. J., Tang, M. X., Pankhurst, Q., Stride, E. Theoretical and Experimental Characterisation of Magnetic Microbubbles. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (5), 864-875 (2012).
  80. Coviello, C., et al. Passive acoustic mapping utilizing optimal beamforming in ultrasound therapy monitoring. Journal of the Acoustical Society of America. 137 (5), 2573-2585 (2015).

Tags

Tilbaketrekning Utgave 170 Ultralyd Mikrobobler Legemiddellevering Bioeffekter Kavitasjon Sonoporation Terapiovervåking Passiv akustisk kartlegging
Studere kavitasjon forbedret terapi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gray, M., Vasilyeva, A. V., Brans,… More

Gray, M., Vasilyeva, A. V., Brans, V., Stride, E. Studying Cavitation Enhanced Therapy. J. Vis. Exp. (170), e61989, doi:10.3791/61989 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter