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Bioengineering

नेवास्कुलराइजेशन की प्रारंभिक घटना की नकल करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक मॉडल

Published: April 10, 2021 doi: 10.3791/62003
Automatic Translation
1, 1, 1, 4, 1, 1, 1, 3, 1,2
1Beijing Advanced Innovation Centre for Biomedical Engineering, Key Laboratory for Biomechanics and Mechanobiology of Chinese Education Ministry, School of Biological Science and Medical Engineering, Beihang University, 2School of Engineering Medicine, Beihang University, 3Artificial Intelligence Key Laboratory of Sichuan Province, School of Automation and Information Engineering, Sichuan University of Science and Engineering, 4Beijing Research Center of Urban System Engineering

Summary

यहां, हम एक माइक्रोफ्लुइडिक चिप और स्वचालित रूप से नियंत्रित, अत्यधिक कुशल परिसंचरण माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम प्रदान करते हैं जो नेवस्कुलराइजेशन के प्रारंभिक माइक्रोएनवायरमेंट को फिर से अपडेट करता है, जिससे एंडोथेलियल कोशिकाओं (एसी) को उच्च चमकदार कतरनी तनाव, ट्रांसेंडोथेलियल प्रवाह के शारीरिक स्तर और विभिन्न संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (VEGF) वितरण द्वारा एक साथ उत्तेजित किया जा सकता है।

Abstract

नियोवैस्कुलराइजेशन आमतौर पर मौजूदा सामान्य वैक्यूलेचर से शुरू किया जाता है और प्रारंभिक चरण में एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसीएस) का बायोमैकेनिकल माइक्रोएनवायरमेंट नियोवैकुलराइजेशन की निम्नलिखित प्रक्रिया से नाटकीय रूप से भिन्न होता है। यद्यपि नियोवैस्कुलराइजेशन के विभिन्न चरणों का अनुकरण करने के लिए बहुत सारे मॉडल हैं, एक इन विट्रो 3 डी मॉडल जो सामान्य वैक्यूलेचर माइक्रोएनवायरमेंट्स की इसी उत्तेजनाओं के तहत नियोस्कुलराइजेशन की प्रारंभिक प्रक्रिया को आत्मसमर्पण करता है, अभी भी कमी है। यहां, हमने एक इन विट्रो 3 डी मॉडल को खंगाला जो नेओवैस्कुलराइजेशन (एमआईईएन) की प्रारंभिक घटना की नकल करता है। MIEN मॉडल में एक माइक्रोफ्लुइडिक स्प्राउटिंग चिप और एक स्वचालित नियंत्रण, अत्यधिक कुशल परिसंचरण प्रणाली शामिल है। एंडोथेलियम के साथ लेपित एक कार्यात्मक, perfusable माइक्रोचैनल का गठन किया गया था और अंकुरण की प्रक्रिया माइक्रोफ्लुइडिक स्प्राउटिंग चिप में नकली थी। नेवस्कुलराइजेशन के शुरू में शारीरिक माइक्रोएनवायरमेंट को माइक्रोफ्लुइडिक कंट्रोल सिस्टम के साथ फिर से पूंजीकृत किया गया था, जिसके द्वारा ईसीएस को उच्च चमकदार कतरनी तनाव, शारीरिक ट्रांसेंडोथेलियल प्रवाह, और विभिन्न संवहनी एंडोथेलियल विकास कारक (VEGF) वितरण एक साथ उजागर किया जाएगा। MIEN मॉडल आसानी से neovascularization तंत्र के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है और दवा स्क्रीनिंग और विष विज्ञान अनुप्रयोगों के लिए एक कम लागत मंच के रूप में एक संभावित वादा रखती है ।

Introduction

नियोवैस्कुलराइजेशन कई सामान्य और पैथोलॉजिकल प्रक्रियाओं में होता है1,2,3,4,जिसमें वयस्कों में दो प्रमुख प्रक्रियाएं, एंजियोजेनेसिस और आर्टेरियोजेनेसिस5शामिल हैं। सबसे प्रसिद्ध विकास कारकों के अलावा, जैसे संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (VEGF)6,यांत्रिक उत्तेजनाएं, विशेष रूप से रक्त प्रवाह प्रेरित कतरनी तनाव, नियोवैस्कुलराइजेशन7के नियमन में महत्वपूर्ण है। जैसा कि हम जानते हैं, कतरनी तनाव के परिमाण और रूपों में नाटकीय रूप से और गतिशील रूप से वैक्यूल्चर के विभिन्न भागों में भिन्नता है, जिसके परिणामस्वरूप संवहनी कोशिकाओं8,9, 10,11,12पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि कतरनी तनाव ईसीएस के विभिन्न पहलुओं को प्रभावित कर सकता है, जिसमें सेल फेनोटाइपिक परिवर्तन, सिग्नल ट्रांसडक्शन, जीन अभिव्यक्ति और भित्ति कोशिकाओं के साथ संचार13,14, 15,16,17,18, 19,20शामिल हैं । इसलिए, नेवस्कुलराइजेशन21,22,23,24को विनियमित करें ।

इसलिए, नियोवैस्कुलराइजेशन को बेहतर ढंग से समझने के लिए, विट्रोमें प्राकृतिक सेलुलर माइक्रोएनवायरमेंट में प्रक्रिया का पुनर्निर्माण करना महत्वपूर्ण है। हाल ही में, माइक्रो-वेसल्स बनाने और माइक्रोफैब्रिकेशन और माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक में प्रगति का लाभ उठाते हुए माइक्रोएनवायरमेंट25,26,27का सटीक नियंत्रण प्रदान करने के लिए कई मॉडल स्थापित किए गए हैं। इन मॉडलों में हाइड्रोजेल28, 29,पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स30, 31, 32या3डी बायोप्रिंटिंग33,34द्वारा माइक्रो-जहाजों का उत्पादन किया जा सकता है। माइक्रोएनवायरमेंट के कुछ पहलू, जैसे ल्यूमिनल कतरनी तनाव22,23,35,36,ट्रांसेंडोथेलियल फ्लो37,38,39,40,बायोकेमिकल एंजियोजेनिक कारकों के ढाल41,42,तनाव/खिंचाव43,44,45,और अन्य प्रकार की कोशिकाओं के साथ सह-संस्कारी32,46 की नकल की गई है और उन्हें नियंत्रित किया गया है। आमतौर पर, एक बड़े जलाशय या सिरिंज पंप का उपयोग छिद्रित माध्यम प्रदान करने के लिए किया जाता था। इन मॉडलों में ट्रांसेंडोथेलियल प्रवाह जलाशय और सूक्ष्म-ट्यूब22 , 23,38,40के बीच दबाव ड्रॉप द्वाराबनायागया था। हालांकि, मैकेनिकल माइक्रोएनवायरमेंट को इस तरह से लगातार बनाए रखना मुश्किल था। ट्रांसएंडोथेलियल प्रवाह में वृद्धि होगी और फिर शारीरिक स्तर से अधिक अगर उच्च कतरनी तनाव के साथ एक उच्च प्रवाह दर परफ्यूजन के लिए इस्तेमाल किया गया था । पिछले अध्ययन से पता चला है कि नियोवैस्कुलराइजेशन की प्रारंभिक अवधि में, अक्षुण्ण ईसीएस और बेसमेंट झिल्ली के कारण ट्रांसएंडोथेलियल प्रवाह का वेग बहुत कम होता है, आमतौर पर 0.05 माइक्रोन/एस8के तहत। इस बीच, हालांकि संवहनी प्रणाली में चमकदार कतरनी तनाव बहुत भिन्न होता है, यह 5-20 dyn/सेमी2,11,47के मतलब मूल्यों के साथ अपेक्षाकृत अधिक है। अभी के लिए, पिछले कार्यों में ट्रांसएंडोथेलियल प्रवाह का वेग आम तौर पर 0.5-15 माइक्रोन/एस22,38, 39,40के बीच रखा गया है, और चमकदार कतरनी तनाव आमतौर पर 10 dyn/सेमी2 2 23के तहत किया गया था । यह एक कठिन विषय के लिए लगातार उच्च चमकदार कतरनी तनाव और ट्रांसएंडोथेलियल प्रवाह के शारीरिक स्तर पर एक साथ ECs बेनकाब रहता है । 

वर्तमान अध्ययन में, हम नेवस्कुलराइजेशन (एमआईईएन) की प्रारंभिक घटना की नकल करने के लिए एक इन विट्रो 3 डी मॉडल का वर्णन करते हैं। हमने परफ्यूजन माइक्रो-ट्यूब बनाने और48अंकुरित करने की प्रक्रिया का अनुकरण करने के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक चिप और एक स्वचालित नियंत्रण, अत्यधिक कुशल परिसंचरण प्रणाली विकसित की है। एमआईएन मॉडल के साथ, नेओवैस्कुलराइजेशन की प्रारंभिक अवधि में उत्तेजित ईसीएस के माइक्रोएनवायरमेंट को सबसे पहले पुनःपूंज किया जाता है। ईसीएस को उच्च चमकदार कतरनी तनाव, ट्रांसएंडोथेलियल प्रवाह के शारीरिक स्तर और एक साथ विभिन्न वीजीएफ वितरण से उत्तेजित किया जा सकता है। हम विस्तार से MIEN मॉडल की स्थापना के कदम का वर्णन और महत्वपूर्ण बिंदुओं पर ध्यान दिया जाना है, अंय शोधकर्ताओं के लिए एक संदर्भ प्रदान करने की उंमीद है ।

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Protocol

1. वेफर तैयारी

नोट: यह प्रोटोकॉल इस शोध के दौरान उपयोग किए जाने वाले एसयू-8 2075 नकारात्मक फोटोरेसिस्ट के लिए विशिष्ट है।

  1. सिलिकॉन वेफर को एक स्पिन कोटर पर मेथनॉल और आइसोप्रोपैनॉल के साथ 3 से 5 बार साफ करें: पहले 500 आरपीएम पर 15 एस के लिए स्पिन करें, और फिर 3,000 आरपीएम पर 60 एस के लिए स्पिन करें।
  2. सिलिकॉन वेफर को एक हॉटप्लेट में स्थानांतरित करें, जो 180 डिग्री सेल्सियस तक पहले से गरम है और वेफर को 10 मिनट के लिए बेक करें।
  3. हॉटप्लेट से सिलिकॉन वेफर निकालें और कमरे के तापमान के लिए ठंडा करें। स्पिन कोटिंग के साथ आगे बढ़ने से पहले संकुचित हवा के साथ वेफर को फिर से साफ करें। वेफर के केंद्र में एसयू-8 2075 फोटोरेसिस्ट की 4 एमएल लगाएं।
  4. स्पिन कोटर पर 70 माइक्रोन की सुविधा ऊंचाई प्राप्त करें: पहले 500 आरपीएम पर 12 एस के लिए स्पिन करें, और फिर 2,100 आरपीएम पर 50 एस के लिए स्पिन करें।
  5. सॉफ्ट इस प्रकार एक हॉटप्लेट पर वेफर बेक करें: पहले 65 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए बेक करें, फिर 95 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए बेक करें। इसके बाद, हॉटप्लेट से सिलिकॉन वेफर को हटा दें और लिथोग्राफी से पहले इसे कमरे के तापमान में ठंडा करें।
  6. फोटोरेसिस्ट फिल्म पर एक फोटोमास्क रखें। 200 mJ/सेमी 2 के कुल एक्सपोजर को प्राप्त करनेके लिए लिथोग्राफी उपकरण के साथ वेफर का पर्दाफाश करें।
    नोट: फोटोमास्क में चिप के पैटर्न के नौ सेट होते हैं, इसलिए यह हर बार नौ माइक्रोफ्लुइडिक स्प्राउटिंग चिप्स बना सकता है।
  7. इस प्रकार एक हॉटप्लेट पर वेफर को बेनकाब करें: पहले 65 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए बेक करें, और फिर 95 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए बेक करें। इसके बाद, हॉटप्लेट से सिलिकॉन वेफर को हटा दें और विकसित होने से पहले इसे कमरे के तापमान में ठंडा करें।
  8. विकसित होने के लिए एसयू-8 डेवलपर (पीजीएमईए) से भरे ग्लास पेट्री डिश में वेफर ट्रांसफर करें।
    सावधानी: डेवलपर आंखों और श्वसन तंत्र के लिए परेशान है। एक धूम हुड में विकसित प्रदर्शन करते हैं। ऑपरेशन के दौरान छप काले चश्मे, नाइट्रिल दस्ताने, और एयरलाइन मुखौटा पहनें।
  9. प्रवाह चैनल की दिशा के साथ धीरे पकवान हिलाएं और 10 मिनट के बाद डेवलपर को बदलें।
  10. पैटर्न स्पष्ट रूप से मनाया जा सकता है जब तक 1.9 3-5 बार दोहराएं।
    नोट: सुनिश्चित करें कि वेफर पर कोई फोटोरेसिस्ट अवशेष नहीं बचा है, अन्यथा डेवलपर में वेफर को फिर से कुल्ला करें।
  11. वेफर को पहले से गरम हॉटप्लेट सेट पर 120 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें और इसे 30 मिनट के लिए बेक करें।
  12. एक कवरस्लिप पर सिलेन के पिपेट 35 माइक्रोन, फिर वेफर के साथ कवरस्लिप को एक डिसिकेटर में रखें और वैक्यूम खींचें। डेसीकेटर को सील करें और नरम-लिथोग्राफी प्रक्रियाओं के दौरान पीडीएमएस के आसंजन को रोकने के लिए वेफर को सील करने के लिए 4 घंटे के लिए वैक्यूम के नीचे वेफर छोड़ दें।
    सावधानी: सिलेन विषाक्त है। विषाक्तता को रोकने के लिए, धुएं हुड में सीलनीकरण करें और हैंडलिंग करते समय नाइट्रिल दस्ताने पहनें।
  13. डिसकेटर से वैक्यूम छोड़ें। एक पहले से गरम हॉटप्लेट पर सिलनाइज्ड वेफर निकालें और इसे 2 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें।
  14. जरूरत पड़ने पर वेफर को साफ पेट्री डिश में स्टोर करें।

2. माइक्रोफ्लुइडिक स्प्राउटिंग चिप निर्माण

  1. एक प्लास्टिक बीकर में बेस एजेंट के 20 ग्राम और इलाज एजेंट (10:1 अनुपात) के 2 ग्राम गठबंधन और उन्हें अच्छी तरह से एक मिश्रण रॉड के साथ मिश्रण।
  2. बीकर को एक डेसीकेटर में रखें और पीडीएमएस मिश्रण में हवा के बुलबुले को हटाने के लिए 1 घंटे के लिए वैक्यूम खींचें।
  3. पेट्री डिश में वेफर पर पीडीएमएस मिश्रण डालो और पेट्री डिश को वापस डिसिकेटर में रखें, एक और 30 मिनट के लिए डिगैसिंग करें।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए वेफर को डीगैसिंग और इलाज के दौरान क्षैतिज रखा जाता है, पेट्री डिश के तल पर वेफर को गोंद करने के लिए डबल-तरफा चिपकने वाले टेप का उपयोग करने में उपयोगी है।
  4. डेसीकेटर से पेट्री डिश निकालें और इलाज के लिए 3 घंटे के लिए इसे 80 डिग्री सेल्सियस ड्राई ओवन में रखें।
  5. ध्यान से पीडीएमएस परत को वेफर से अलग करें और पैटर्न के अनुसार एक स्केलपेल के साथ परत को नौ चिप्स में काट लें।
    नोट: अलग होने के बाद फीचर साइड को ऊपर रखें ।
  6. क्रमशः 1 मिमी और 3.5 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग करके प्रत्येक चिप से दो हाइड्रोजेल इंजेक्शन पोर्ट और चार मीडिया इंजेक्शन पोर्ट पंच करें।
  7. पीडीएमएस अवशेषों को हटाने के लिए अवशेष मुक्त टेप के साथ छिद्रित चिप्स को साफ करें। चिप्स और नौ ग्लास कवरलिप को प्लाज्मा क्लीनर में रखें और सतह पर सहसंयोजक संबंध बनाने के लिए 30 एस के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ उनका इलाज करें।
  8. चिप्स और कवरस्लिप बाहर ले लो। कवरस्लिप पर चिप्स के फीचर साइड को अटैच करें।
  9. बॉन्डिंग को तेज करने के लिए 1 घंटे के लिए अटैच चिप्स को 80 डिग्री सेल्सियस ड्राई ओवन में रखें।
  10. उपयोग से पहले चिप्स को ऑटोक्लेव करें और बाकी प्रक्रिया के लिए उन्हें बाँझ रखें।

3. सतह संशोधन और हाइड्रोजेल इंजेक्शन

  1. प्रत्येक चिप के लिए, 1 मिलीग्राम/एमएल पॉली-डी-lysine (पीडीएल) के ४० माइक्रोन और हाइड्रोगेल इंजेक्शन पोर्ट से चिप में चैनलों में इंजेक्ट करें ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि पीडीएल चैनलों को भरता है, विशेष रूप से बंदरगाहों के पास संकीर्ण चैनलों में।
  2. पीडीएमएस की सतह को संशोधित करने के लिए चिप्स को 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. पिपेट 200 μL बाँझ पानी और इसे हाइड्रोगेल इंजेक्शन बंदरगाह से चिप में चैनलों में इंजेक्ट करने के लिए बाहर धोने के लिए पीडीएल धोने के लिए।
  4. हाइड्रोफोबसिटी को बहाल करने के लिए 3 घंटे के लिए चिप्स को 120 डिग्री सेल्सियस सूखे ओवन में निकालें।
  5. बर्फ पर एक बाँझ ट्यूब रखें और निम्नलिखित समीकरण के रूप में उपयोग किए जाने वाले टाइप I कोलेजन की मात्रा की गणना करें।
    अंतिम मात्रा (५० μL) एक्स अंतिम कोलेजन एकाग्रता (3 मिलीग्राम/इस शोध में एमएल)/बोतल में एकाग्रता = मात्रा कोलेजन जोड़ा जाएगा
  6. निम्नलिखित समीकरण के रूप में उपयोग किए जाने वाले नाओएच की मात्रा की गणना करें।
    (वॉल्यूम कोलेजन जोड़ा जाएगा) x 0.023 = वॉल्यूम 1 एन नाओएच
  7. निम्नलिखित प्रोटोकॉल के रूप में ट्यूब में हाइड्रोजेल के 50 माइक्रोन तैयार करें: 10x PBS के 5 माइक्रोन, फिनोल लाल की 0.5 माइक्रोन, 1 एन NaOH की गणना की मात्रा, 1 मिलीग्राम/एमएल फाइब्रोनेसिनिन के 4 माइक्रोन, बारी में टाइप I कोलेजन की गणना की मात्रा। डीएच2ओ की उचित मात्रा जोड़ें ताकि कुल मात्रा 50 माइक्रोल तक पहुंच जाए। ट्यूब में सभी सामग्री को अच्छी तरह से मिलाएं।
    नोट: बर्फ पर सभी आपरेशनों प्रदर्शन करते हैं । हाइड्रोजेल के पीएच के दृश्य निर्धारण में सहायता करने के लिए एसिड-आधारित संकेतक के रूप में फिनोल लाल का उपयोग करें। अंतिम हाइड्रोजेल नारंगी को समाप्त करता है जब पीएच लगभग 7.4 होता है और कठोरता लगभग 15 किलोमीटरपीए49होती है।
  8. प्रत्येक चिप के लिए हाइड्रोजेल का 2-3 माइक्रोन और धीरे-धीरे इसे हाइड्रोजेल इंजेक्शन पोर्ट से केंद्रीय हाइड्रोगेल चैनल में इंजेक्ट करें।
  9. जैलेशन की अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर चिप्स को इनक्यूबेट करें।
    नोट: चिप्स को बाँझ पानी के 1 एमएल के साथ एक सील बॉक्स में सील करें यदि उनका तुरंत उपयोग नहीं किया जाता है। सीलबंद चिप्स सबसे अधिक 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

4. सेल सीडिंग

  1. पिपेट 20 माइक्रोन ऑफ 125 μg/mL फाइब्रोनेक्टिन सेल कल्चर चैनल के एक मीडिया इंजेक्शन पोर्ट में।
  2. कैंची के साथ सेल कल्चर चैनल के बंदरगाह को फिट करने के लिए एक पिपेट टिप काटें।
  3. सेल कल्चर चैनल के अन्य मीडिया इंजेक्शन पोर्ट में पिपेट टिप डालें। फिर, इसे फाइब्रोनेक्टिन से भरने के लिए सेल कल्चर चैनल से हवा को पाइप्ट करें।
  4. चिप्स को 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  5. सेल सीडिंग से पहले, प्रत्येक मीडिया इंजेक्शन पोर्ट में ईसीएम मीडिया के 20 माइक्रोन को पिपेट करें और चिप्स को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  6. फिर, सभी मीडिया इंजेक्शन बंदरगाहों में सभी मीडिया को बाहर निकालें।
  7. इसके बाद, सेल कल्चर चैनल के एक मीडिया इंजेक्शन पोर्ट में सेल सस्पेंशन के 5 माइक्रोन। फिर, एंडोथेलियल कोशिकाएं अंतर हाइड्रोस्टैटिक दबाव के तहत पूरे चैनल पर तेजी से फैलती हैं।
    नोट: संस्कृति फ्लास्क से मानव गर्भनाल नस एंडोथेलियल कोशिकाओं (HUVECs) की कोशिश करके सेल निलंबन तैयार करें और उन्हें 400 x ग्रामपर अपकेंद्री करें। फिर, कोशिकाओं को एक ट्यूब में 107 कोशिकाओं/एमएल तक फिर से खर्च करें।
  8. हाइड्रोस्टैटिक दबाव को समायोजित करने और सेल को आगे बढ़ने से रोकने के लिए दूसरे बंदरगाह पर ईसीएम मीडिया के लगभग 4-6 माइक्रोन जोड़ें।
  9. चिप्स को सेल इनक्यूबेटर में निकालें। फिर, चिप्स को हर 30 मिनट पर चालू करें जब तक कि एंडोथेलियल कोशिकाएं सेल कल्चर चैनल 2 घंटे बाद(चित्रा 1)की आंतरिक सतह के चारों ओर कोट न करें।
    नोट: चिप को उल्टा करने के लिए, कवरस्लिप के पीछे थोड़ा पानी पिपेट करें। इसके बाद चिप पेट्री डिश के कवर से अटैच कर सकती है।
  10. इंजेक्शन बंदरगाहों में संलग्न कोशिकाओं को बहुत सावधानी से हटाने के लिए पिपेट टिप का उपयोग करें।
  11. फिर, मीडिया इंजेक्शन बंदरगाहों में चार कंटीली महिला Luer एडाप्टर डालें और ECM मीडिया के साथ भरें ।
    नोट: एडाप्टर चैनल में कोशिकाओं के लिए पोषक तत्व प्रदान करने के लिए तरल पदार्थ जलाशयों के रूप में कार्य कर सकते हैं ।
  12. चिप्स को सेल इनक्यूबेटर से हटा दें। हर 12 घंटे में लूयर एडाप्टर में ईसीएम मीडिया बदलें।

5. फिटसी-डेक्सट्रान प्रसार पारमीता का मापन

नोट: सूक्ष्म पोत के बाधा समारोह का आकलन करने के लिए, सेल अस्तर के साथ या बिना ईसी संस्कृति चैनल की प्रसार पारीयता का आकलन किया जाता है।

  1. हाइड्रोजेल इंजेक्शन के साथ एक माइक्रोफ्लुइडिक स्प्राउटिंग चिप निकालें।
  2. 4.1-4.6 कदम दोहराएं।
  3. सभी Luer एडाप्टर निकालें और चार मीडिया इंजेक्शन बंदरगाहों में सभी मीडिया बाहर पिपेट ।
  4. चिप को कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप पर रखें।
  5. संस्कृति मीडिया के पिपेट 5 माइक्रोन जिसमें 500 माइक्रोन/एमएल 40 केडीए फिटसी-डेक्सट्रान सेल कल्चर चैनल के एक बंदरगाह पर है।
    नोट: 40 केडीए फिटसी-डेक्सटरान में वीजीएफ-165 (39-45 केडीए) के समान आणविक आकार है।
  6. 30 s के लिए हर 3 एस छवियों को कैप्चर करें। इस प्रकार, सेल अस्तर के बिना प्रसार पारिग्रह को मापा जाता है।
  7. सेल कल्चर चैनल में एचयूवीसी के रूप में घुलने-मिलने के बाद माइक्रोफ्लुइडिक स्प्राउटिंग चिप निकालें।
  8. चरण 5.3-5.5 दोहराएं।
  9. 30 s के लिए हर 3 एस छवियों को कैप्चर करें। इस प्रकार, सेल अस्तर के साथ प्रसार पारिग्रह को मापा जाता है।
  10. निम्नलिखित संशोधित समीकरण50का उपयोग कर समय के साथ फ्लोरोसेंट तीव्रता के परिवर्तनों की मात्रा निर्धारित करके प्रसार पारिष्मशील की गणना करें ।
    पीडी= (मैं2-मैं1)/(मैं1- मैंबी)· ·· S/d
    जहां, पीडी प्रसार पारमेबिलिटी गुणांक है, मैं1 एक प्रारंभिक समय बिंदु पर औसत तीव्रता है, मैं2 डेल्टा समय(ΤT) केबाद औसत तीव्रता है, मैं बी पृष्ठभूमि तीव्रता है, एस फ्लोरेसेंस छवियों में चैनल का क्षेत्र है, और डी फ्लोरेसेंस छवियों में सूक्ष्म पदों का कुल अंतराल है। वर्तमान कार्य में, 9 एस के रूप में सेट किया गया है।
    नोट: वर्तमान समीकरण मूल50से थोड़ा अलग है, चिप में फ्लोरेसेंस की प्रसार दिशा के कारण केवल ईसी चैनल से हाइड्रोजेल चैनल तक है, जो सभी रेडियल दिशा में परिपत्र ट्यूब स्परिंग की तरह नहीं है।

6. माइक्रोफ्लुइडिक कंट्रोल सिस्टम सेटअप

नोट: वर्तमान अध्ययन में माइक्रोफ्लुइडिक नियंत्रण प्रणाली में एक माइक्रो-सिरिंज पंप, एक विद्युत चुम्बकीय चुटकी वाल्व, एक बुलबुला जाल चिप, एक माइक्रोफ्लुइडिक चिप, एक माइक्रो-पेरिस्टाल्टिक पंप और एक जलाशय शामिल है। सिस्टम के प्रत्येक भाग को एक ही कार्य करने में सक्षम विकल्पों द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है।

  1. बबल ट्रैप चिप निर्माण
    नोट: बबल ट्रैप चिप का उपयोग परिसंचरण में हवा के बुलबुले को हटाने के लिए किया जाता है। चिप में तीन पीडीएमएस लेयर होते हैं। शीर्ष परत का निर्माण तरल कक्ष के रूप में ग्रिड संरचना बनाने के लिए नरम लिथोग्राफी का उपयोग करके किया जाता है। ग्रिड संरचना का प्रत्येक चैनल 100 माइक्रोन चौड़ा है। नीचे की परत एक छेद के साथ एक पीडीएम हिस्सा है। दो परतों के बीच, एक 100 माइक्रोन पतली पीडीएमएस फिल्म रखी गई है।
    1. बबल ट्रैप चिप के लिए वेफर तैयार करने के लिए चरण 1 दोहराएं।
    2. बबल ट्रैप चिप की ऊपरी परत और निचली परत को गढ़ने के लिए चरण 2.1-2.5 दोहराएं।
      नोट: शीर्ष परत के फोटोमास्क पैटर्न के तीन सेट होते हैं, इसलिए पैटर्न के अनुसार पीडीएमएस परत को तीन चिप्स में काटें।
    3. 3.5 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग करके शीर्ष परत के इनलेट और आउटलेट चैनलों के अंत पर छह छेद पंच करें।
    4. शीर्ष परत पर पैटर्न के अनुसार 6 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग करके नीचे की परत की संबंधित स्थिति पर दो छेद पंच करें।
    5. पीडीएमएस मिश्रण के 10 ग्राम तैयार करने के लिए चरण 2.1-2.2 दोहराएं और इसे एक साफ सिलिकॉन वेफर के केंद्र पर डालें।
    6. निम्नलिखित स्पिन प्रोटोकॉल लागू करके 100 माइक्रोन पीडीएमएस फिल्म तैयार करें: 500 आरपीएम पर 15 एस के लिए स्पिन करें, स्पिन की गति को 1,300 आरपीएम तक बढ़ाएं और यहां 45 एस के लिए पकड़ें।
    7. वेफर को पहले से गरम हॉटप्लेट सेट पर 180 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें और इसे 30 मिनट के लिए बेक करें।
    8. पीडीएमएस अवशेषों को हटाने के लिए अवशेष-मुक्त टेप के साथ छिद्रित परतों को साफ करें। शीर्ष परतों और वेफर को प्लाज्मा क्लीनर में रखें और सतह पर सहसंयोजक संबंध बनाने के लिए 30 एस के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ उनका इलाज करें।
    9. शीर्ष परतों और वेफर को बाहर निकालें। पीडीएमएस फिल्म पर शीर्ष परतों के फीचर पक्ष को संलग्न करें।
    10. एक सुई के साथ शीर्ष परतों के किनारे के साथ ध्यान से फिल्म काटें।
    11. धीरे-धीरे फिल्म को वेफर से अलग करें और अलग होने के बाद फिल्म को साइड अप करने के लिए चिप्स को पलट दें।
    12. नीचे की परतों और संलग्न चिप्स को प्लाज्मा क्लीनर में रखें और उन्हें फिर से 30 एस के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ इलाज करें।
    13. नीचे परतों और संलग्न चिप्स बाहर ले लो। पीडीएमएस फिल्म पर नीचे की परतों को संलग्न करें और बुलबुला जाल चिप्स किया जाता है।
      नोट: संलग्न करते समय शीर्ष परत पर पैटर्न के साथ नीचे की परत पर छेद संरेखित करें।
    14. बॉन्डिंग को तेज करने के लिए चिप्स को 1 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस ड्राई ओवन में रखें।
  2. माइक्रोफ्लुइडिक कंट्रोल सिस्टम को इकट्ठा करें
    नोट: सिस्टम के सभी हिस्सों, जैसे बबल ट्रैप चिप, जलाशय, ट्यूब और कनेक्टर का उपयोग इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों को छोड़कर ऑटोक्लेव नसबंदी के बाद किया जाता है। एक साफ बेंच पर माइक्रोफ्लुइडिक कंट्रोल सिस्टम को असेंबल करें।
    1. माइक्रोफ्लुइडिक कंट्रोल सिस्टम को असेंबल करने के लिए दो पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन ट्यूब, दो शॉर्ट सिलिकॉन ट्यूब, तीन लंबी सिलिकॉन ट्यूब, एक कंटीली मादा ल्यूयर एडाप्टर, एक वाई टाइप कनेक्टर और तीन एल टाइप कनेक्टर तैयार करें ।
      नोट: पॉलीटीट्राफ्लोरोएथिलीन ट्यूब का लाभ कम लोच है, इसलिए, पाइपलाइन में कम मीडिया की आवश्यकता होती है। सिलिकॉन ट्यूब, इसके विपरीत, उच्च लोच है, इसलिए, यह चुटकी वाल्व और पेरिस्टाल्टिक पंप के लिए उपयुक्त है।
    2. सिरिंज को प्रीहीटेड (37 डिग्री सेल्सियस) ईसीएम माध्यम के 10 एमएल से भरें।
      नोट: प्रीहीटिंग मध्यम रिलीज भंग गैस में मदद करता है।
    3. एक कंटीली मादा लूयर एडाप्टर द्वारा सिरिंज से पॉलीटट्राफ्लोरोएथिलीन ट्यूब कनेक्ट करें। फिर, पॉलीटट्राफ्लोरोएथिलीन ट्यूब के दूसरे छोर को वाई टाइप कनेक्टर से कनेक्ट करें।
    4. इसके बाद, दो लंबी सिलिकॉन ट्यूबों को वाई टाइप कनेक्टर के अन्य दो सिरों से जलाशय से जोड़ने वाली एक ट्यूब और अन्य ट्यूब को बबल ट्रैप चिप से जोड़ने के साथ कनेक्ट करें।
    5. जलाशय से एक और लंबी सिलिकॉन ट्यूब कनेक्ट करें।
    6. इसके बाद, बबल ट्रैप चिप की शीर्ष परत पर सभी इनलेट और आउटलेट छेद को जोड़ने के लिए दो छोटे सिलिकॉन ट्यूब का उपयोग करें। एक पॉलीटीट्राफ्लोरोएथिलीन ट्यूब को चिप के बैकएंड से कनेक्ट करें।
    7. इसके बाद, माइक्रो-सिरिंज पंप पर सिरिंज को ठीक करें।
    8. विद्युत चुम्बकीय चुटकी वाल्व में दो लंबी सिलिकॉन ट्यूब क्लिप।
    9. इसके बाद, सिरिंज और जलाशय के बीच पाइपलाइन को खोलने के लिए विद्युत चुम्बकीय चुटकी वाल्व को स्विच करें। ट्यूब में हवा निकास के लिए एक माइक्रो सिरिंज पंप का उपयोग कर जलाशय के लिए मीडिया सुई ।
    10. फिर, सिरिंज और बबल ट्रैप चिप के बीच पाइपलाइन को खोलने के लिए वाल्व को फिर से स्विच करें। तरल कक्ष और बुलबुला जाल चिप के बैकएंड ट्यूब को भरने के लिए मीडिया इंजेक्ट करें।

7. एंडोथेलियल अंकुरण परख

नोट: चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप के साथ इकट्ठे एक चरण शीर्ष इनक्यूबेटर का उपयोग वर्तमान अध्ययन में वास्तविक समय में अंकुरण की प्रक्रिया का निरीक्षण करने के लिए किया जाता है। स्टेज टॉप इनक्यूबेटर तापमान, आर्द्रता और सीओ2 नियंत्रण को माइक्रोस्कोप चरणों पर बनाए रख सकता है, जो लाइव सेल इमेजिंग के लिए अच्छा है। लेकिन परख के लिए उपकरण जरूरी नहीं है। यहां दिए गए प्रोटोकॉल को बेसिक सेल इनक्यूबेटर में भी काम किया जा सकता है।

  1. सेल इनक्यूबेटर से एंडोथेलियल स्प्राउटिंग चिप्स निकालें।
  2. फिर, सेल कल्चर साइड पर लूयर एडाप्टर को हटा दें। माइक्रोफ्लुइडिक स्प्राउटिंग चिप के हाइड्रोगेल इंजेक्शन बंदरगाहों में दो पाइप प्लग डालें।
    नोट: प्लग सुइयों से बदल सकते हैं और उनका मुख्य कार्य मीडिया को फैलने से रोकना है।
  3. सेल कल्चर चैनल के एक पोर्ट से बबल ट्रैप चिप की बैकएंड ट्यूब को कनेक्ट करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि कनेक्शन से पहले ट्यूब में कोई बुलबुले नहीं हैं।
  4. दूसरे बंदरगाह के लिए एक टी प्रकार कनेक्टर डालें और जलाशय से जुड़े लंबे सिलिकॉन ट्यूब से कनेक्ट करें।
  5. माइक्रो-पेरिस्टाल्टिक पंप में लंबी सिलिकॉन ट्यूब क्लिप करें।
  6. इसके बाद जलाशय में एयर फिल्टर डालें।
  7. इसके बाद, माइक्रोफ्लुइडिक स्प्राउटिंग चिप को स्टेज टॉप इनक्यूबेटर में असेंबल करें।
  8. इसके बाद, वैक्यूम पंप को टीपीयू ट्यूब के साथ बबल ट्रैप चिप की निचली परत में छेद से कनेक्ट करें।
  9. कस्टम प्रोग्राम में सर्कुलेशन वॉल्यूम और फ्लो रेट सेट करें, जो माइक्रो-सिरिंज पंप और इलेक्ट्रोमैग्नेटिक पिंच वाल्व को एक साथ नियंत्रित करताहै (चित्र 2)।
    नोट: एंडोथेलियल सेल कल्चर चैनल में प्रवाह दर की गणना क्लासिक समीकरण के अनुसार की जाती है।
    τ = 6μQ / Wh2
    जहां, कतरनी तनाव (dyn/cm2),μ माध्यम (8.8 x 10-4 Pa•s) की चिपचिपाहट है, क्यू एंडोथेलियल सेल कल्चर चैनल (एमएल/एस) में प्रवाह दर है, एच चैनल ऊंचाई (70 माइक्रोन) है, और डब्ल्यू चैनल चौड़ाई (1,000 माइक्रोन) है। माध्यम की चिपचिपाहट को कोक्सियल सिलेंडर प्रकार घूर्णन विस्कोमीटर का उपयोग करके मापा जाता है। चैनल की ऊंचाई और चौड़ाई पूर्व निर्धारित है और मैन्युअल रूप से 4x आवर्धन पर एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग करके पुष्टि करते हैं। परिसंचरण की मात्रा 5 एमएल है और प्रवाह दर गणना के अनुसार 15 डाइन/सेमी 2 कतरनी तनाव के लिए 85 μL/मिनट (सेल कल्चर चैनल में औसत02 मीटर/एस) है।
  10. इसके बाद, माइक्रो-पेरिस्टाल्टिक पंप की प्रवाह दर स्थापित करें।
    नोट: माइक्रो-पेरिस्टाल्टिक पंप की प्रवाह दर माइक्रो-सिरिंज पंप की तुलना में थोड़ी अधिक है, ताकि मीडिया को फैलने से रोका जा सके।
  11. माइक्रो सिरिंज पंप चालू करें। इसके बाद सर्कुलेशन कंट्रोल सिस्टम स्थापित होता है।

8. डेटा विश्लेषण

नोट: अंकुरित होने की मात्रा निर्धारित करने के लिए, अंकुरण के सामान्यीकृत क्षेत्र, औसत अंकुरित लंबाई, और सबसे लंबे समय तक अंकुरित लंबाई की गणना की गई। परिणाम तीन स्वतंत्र अध्ययनों से प्राप्त एसईएम ± मतलब का प्रतिनिधित्व करते हैं। सांख्यिकीय महत्व (पी < 0.05) छात्र के टी-टेस्ट द्वारा मूल्यांकन किया जाताहै।

  1. 15 मिनट के लिए पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ प्रयोगों के बाद माइक्रोफ्लुइडिक स्प्राउटिंग चिप में कोशिकाओं और अंकुरित को ठीक करें। 4′, 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल डाइहाइड्रोक्लोराइड (DAPI; 1: 1000; सिग्मा-एल्ड्रिच) 10 मिनट के लिए और फिर ट्राइटीसी फ्लालोइडिन (P5285, 1: 100; सिग्मा-एल्ड्रिच) 1 घंटे के लिए । प्रत्येक चरण के बीच 5 मिनट के अंतराल पर तीन बार पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं।
  2. चिप्स की कॉन्फोकल इमेज को टाइलिंग मोड में लें और इमेज एडिटिंग सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल करके उन्हें सिलाई करें।
  3. अंकुरण के सामान्यीकृत क्षेत्र की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रोग्रामिंग सॉफ्टवेयर में एक कस्टम कोड का उपयोग करके जेड-प्रोजेक्शन छवियों के फ्लोरोसेंट पिक्सल की संख्या गिनें (पूरक फ़ाइलदेखें)।
  4. जेड-प्रोजेक्शन छवियों में अंकुरित अनाज के प्रत्येक टिप को मैन्युअल रूप से पहचानें और लेबल करें और औसत अंकुरित लंबाई और सबसे लंबी अंकुरित लंबाई (पूरक फ़ाइलदेखें) की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक और कस्टम कोड का उपयोग करके एक और कस्टम कोड का उपयोग करके ईसीएस बेसमेंट झिल्ली के लिए स्प्राउट्स टिप्स के बीच दूरी की गणना करें।

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Representative Results

यहां प्रस्तुत नेवस्कुलराइजेशन (एमआईईएन) की प्रारंभिक घटना की नकल करने के लिए इन विट्रो 3 डी मॉडल में माइक्रोफ्लुइडिक स्प्राउटिंग चिप और माइक्रोफ्लुइडिक नियंत्रण प्रणाली शामिल थी। माइक्रोफ्लुइडिक स्प्राउटिंग चिप को पिछले प्रकाशनों 22 ,23,37,40,51,52,53से अनुकूलित किया गया था । संक्षेप में, इसमें तीन चैनल और छह बंदरगाह शामिल थे: एक एंडोथेलियल सेल कल्चर चैनल और चार मीडिया इंजेक्शन बंदरगाहों के साथ एक तरल चैनल, और दो हाइड्रोजेल इंजेक्शन बंदरगाहों(चित्रा 3)के साथ एक केंद्रीय हाइड्रोजेल चैनल। माइक्रोफ्लुइडिक कंट्रोल सिस्टम में माइक्रो-सिरिंज पंप, इलेक्ट्रोमैग्नेटिक चुटकी वाल्व, बबल ट्रैप चिप, माइक्रो-पेरिस्टाल्टिक पंप और कल्चर मीडियम जलाशय(चित्रा 4)शामिल थे । माइक्रो-सिरिंज पंप और इलेक्ट्रोमैग्नेटिक पिंच वाल्व को एक साथ नियंत्रित करने के लिए एक कस्टम प्रोग्राम का इस्तेमाल किया गया था, जिसके साथ फ्लो रेट और सर्कुलेशन वॉल्यूम सेट किया जा सकता है । प्रणालीगत त्रुटि के कारण कई चक्रों के बाद मात्रा के मामूली परिवर्तन को सही करने के लिए एक मुआवजा मात्रा शुरू की गई थी। परफ्यूजन के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले माध्यम को कम करने के लिए मीडियम रिसाइकल के लिए इलेक्ट्रोमैग्नेटिक पिंच वाल्व पेश किया गया । इलेक्ट्रोमैग्नेटिक पिंच वाल्व एक चक्र में दो चरणों में माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम बनाने के लिए दो राज्यों के बीच स्विच कर सकता है । इंजेक्शन फेज में कल्चर मीडियम को माइक्रो सिरिंज पंप से धीरे-धीरे माइक्रोफ्लुइडिक स्प्राउटिंग चिप में इंजेक्ट किया गया। जबकि रिसाइकिल फेज में कल्चर मीडियम को जलाशय से वापस माइक्रो सिरिंज पंप तक काफी तेजी से निकाला गया।

हमारे एमआईईएन मॉडल में माइक्रो-वेसल के बैरियर फंक्शन का आकलन 40 केडीए एफटीसी-डेक्सट्रान के डिफ्यूजनल पारगम्यता गुणांक(पीडी)को मापकर किया गया था। जैसा कि यह चित्रा 5में दिखाया गया है, सेल लाइनिंग के साथ स्थिर सुसंस्कृत चिप का पीडी 0.1 ± 0.3 माइक्रोन/एस है, और सेल अस्तर के बिना खाली चैनल का पीडी 5.4 ± 0.7 माइक्रोन/एस है। फिर, एमआईएन मॉडल में स्थिर और परफ्यूजन के तहत एंडोथेलियल अंकुरण परख किया गया। स्थिर परिस्थितियों में, एंडोथेलियल अंकुरण सीडिंग के बाद लगभग 4 घंटे हुआ और अंकुरित केंद्रीय हाइड्रोगेल चैनल में लगभग 48 घंटे में दूसरी तरफ स्थानांतरित हो जाएंगे। अंकुरित 48 घंटे के बाद धीरे-धीरे अपमानित होते हैं। जबकि 5 या 15 dyn/सेमी2 कतरनी तनाव (सेल कल्चर चैनल में औसत ०.०७ या ०.२ मीटर/s) के संपर्क में आने के बाद, एनसी पॉलीगोनल से बदलते प्रवाह दिशा में गठबंधन, कोबलस्टोन आकार फ्यूसिफॉर्म में, और कतरनी तनाव(चित्रा 6)की वृद्धि के साथ अंकुरण की डिग्री में कमी आई । हालांकि, कतरनी परिस्थितियों में अंकुरित स्थिर संस्कृति स्थितियों की तुलना में अधिक स्थिर थे । वे परफ्यूजन के तहत 48 घंटे से अधिक बनाए रख सकते थे। मात्रात्मक आंकड़ों से पता चला है कि एंडोथेलियल अंकुरण अंकुरण के क्षेत्रफल में अंकुरण, औसत अंकुरित लंबाई, और सबसे लंबे समय तक अंकुरित लंबाई(चित्रा 7)के क्षेत्र के मामले में काफी कमी आई ।

Figure 1
चित्रा 1:सेल कल्चर चैनल की आंतरिक सतह के चारों ओर एंडोथेलियल कोशिकाओं का कोट। एचयूवीसी को सेल सीडिंग के बाद सेल कल्चर चैनल 2 एच में समान रूप से फैलाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:कस्टम कार्यक्रम माइक्रो सिरिंज पंप और विद्युत चुम्बकीय चुटकी वाल्व को एक साथ नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया । कस्टम प्रोग्राम का मुख्य पृष्ठ (ऊपर) और उपपेज (नीचे) जिसके साथ प्रवाह दर और परिसंचरण की मात्रा स्थापित की जा सकती है। प्रणालीगत त्रुटि के कारण कई चक्रों के बाद मात्रा के मामूली परिवर्तन को सही करने के लिए एक मुआवजा मात्रा शुरू की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:माइक्रोफ्लुइडिक स्प्राउटिंग चिप की योजनाबद्ध। चिप में तीन चैनल और छह बंदरगाह शामिल हैं: एक एंडोथेलियल सेल कल्चर चैनल और चार मीडिया इंजेक्शन बंदरगाहों के साथ एक तरल चैनल, और दो हाइड्रोजेल इंजेक्शन बंदरगाहों के साथ एक केंद्रीय हाइड्रोजेल चैनल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:माइक्रोफ्लुइडिक नियंत्रण प्रणाली की योजनाबद्ध। माइक्रोफ्लुइडिक कंट्रोल सिस्टम में माइक्रो-सिरिंज पंप, इलेक्ट्रोमैग्नेटिक पिंच वाल्व, बबल ट्रैप चिप, माइक्रो-पेरिस्टाल्टिक पंप और कल्चर मीडियम जलाशय होते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:40 केडीए फिटसी-डेक्सट्रान का प्रसार पारगम्यता(पीडी)। सेल लाइनिंग के साथ स्थिर सुसंस्कृत चिप का पीडी 0.1 ± 0.3 माइक्रोन/एस है, और सेल अस्तर के बिना खाली चैनल का पीडी 5.4 ± 0.7 माइक्रोन/एस **, पी < 0.01 है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6:विभिन्न कतरनी परिस्थितियों में एंडोथेलियल अंकुरण की प्रतिनिधि छवियां। स्थिर खेती के 24 घंटे के बाद, HUVECs सेल संस्कृति चैनल से सूक्ष्म पदों के माध्यम से आसन्न हाइड्रोगेल चैनल में आक्रमण और हाइड्रोगेल में अंकुरित की एक बड़ी संख्या । जबकि 5 या 15 dyn/सेमी 2 कतरनी तनाव के लिए जोखिम के24 घंटे के बाद, अंकुरण की डिग्री स्पष्ट रूप से कम । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्र 7:अंकुरण का मात्रात्मक क्षेत्र, औसत अंकुरित लंबाई, और सबसे लंबी अंकुरित लंबाई। स्थिर संस्कृति (S0) या 5 (S5) या 15 (S15) dyn/सेमी 2 कतरनी तनाव के लिए जोखिम के24 घंटे के बाद, कतरनी तनाव की वृद्धि के साथ अंकुरण की डिग्री कम । *, पी < 0.05; **, पी < 0.01। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक फाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

लंबे समय से, नेवस्कुलराइजेशन का वास्तविक समय अवलोकन एक समस्या रही है। हाल हीमें22, 32,40, 46,54अंकुरण के लिए ईसीएस के साथ अस्तर और बाह्य मैट्रिक्स के निकट कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं, लेकिन यांत्रिक माइक्रोएनवायरमेंट को लगातार बनाए रखना अभी भी कठिन है। यह एक कठिन विषय के लिए ECs, जो उच्च चमकदार कतरनी तनाव और ट्रांसएंडोथेलियल प्रवाह के कम वेग के अधीन है की प्रारंभिक जैव यांत्रिक माइक्रोएनवायरमेंट की नकल करने के लिए रहता है । यहां, हमने एक एमआईईएन मॉडल प्रस्तुत किया जो सबसे पहले शारीरिक माइक्रोएनवायरमेंट की नकल में नियोवैस्कुलराइजेशन की प्रारंभिक घटना का अनुकरण करता है। एमआईईएन मॉडल के साथ, स्वचालित, कुशल और बुलबुला मुक्त दीर्घकालिक परफ्यूजन हासिल किया जाता है। आईसी पर ल्यूमिनल कतरनी तनाव को शारीरिक स्तर पर रहने वाले ट्रांसएंडोथेलियल प्रवाह के साथ प्रयोगों के दौरान किसी भी समय वैकल्पिक रूप से बदला जा सकता है।

एमआईएन मॉडल की कुंजी ट्रांसएंडोथेलियल प्रवाह से ईसीएस पर चमकदार प्रवाह के प्रभाव को अलग कर रही है। इस उद्देश्य के लिए, एक टी-प्रकार कनेक्टर रचनात्मक रूप से ईसी संस्कृति चैनल के आउटलेट बंदरगाह पर डाला जाता है। कनेक्टर का एक सिरा माइक्रो-पेरिस्टाल्टिक पंप के माध्यम से जलाशय से जुड़ा हुआ है। कनेक्टर का दूसरा छोर इनक्यूबेटर की हवा के संपर्क में है। यह एंडोथेलियल सेल कल्चर चैनल के अंदर दबाव रखता है, क्योंकि चैनल में नकारात्मक दबाव बनाने के लिए न तो अधिशेष मीडिया इकट्ठा होता है और न ही अतिरिक्त मीडिया को दूर खींचा जा रहा है । इस तरह माइक्रोफ्लुइडिक स्प्राउटिंग चिप के बाद फ्लो रेजिस्टेंस बहुत छोटा होता है ताकि हाई ल्यूमिनल कतरनी स्ट्रेस के तहत भी फिजिकल रेंज में ट्रांसएंडोथेलियल फ्लो को बनाए रखा जा सके।

प्रोटोकॉल के भीतर एक महत्वपूर्ण कदम केंद्रीय हाइड्रोगेल चैनल में हाइड्रोजेल का सफल इंजेक्शन है। हुआंग एट अल का प्रस्ताव है कि जैल के सफल भरने केशिकी बलों और माइक्रोफ्लुइडिक जेल चैनल५५के भीतर सतह तनाव संतुलन पर निर्भर करता है । उन्हें संतुलन को नियंत्रित करने के लिए तीन अलग-अलग चर मिले: सूक्ष्म पदों के बीच अंतर, डिवाइस की सतह गुण, और हाइड्रोगेल अग्रदूत समाधानों की चिपचिपाहट। वर्तमान मॉडल में, माइक्रोफ्लुइडिक स्प्राउटिंग चिपका डिजाइन पिछले कार्यों22, 23,37,40,51,52,53से अनुकूलित है। तीन चैनलों को अलग करने के लिए माइक्रो-पोस्ट की ज्यामिति और रिक्ति पिछली गणनाओं और कई प्रयोगों के आधार पर निर्धारित की जाती है। इसके अलावा, पीडीएम सतह को संशोधित करने के लिए पीडीएल कोटिंग और उच्च तापमान बेकिंग किया जाता है; इसलिए, हाइड्रोजेल इंजेक्शन से पहले हाइड्रोफिलिटी और हाइड्रोफोबसिटी के बीच संतुलन को समायोजित करें।

प्रोटोकॉल का अन्य महत्वपूर्ण कदम बुलबुले को हटाना है। टी-प्रकार कनेक्टर और माइक्रो-परिस्टाल्टिक पंप के कारण प्रयोग के दौरान बड़ी मात्रा में हवा परिसंचरण माध्यम में भंग हो जाएगी, जिसके परिणामस्वरूप परिसंचरण में बुलबुले होते हैं और एंडोथेलियल कोशिकाओं के कार्य को बहुत प्रभावित करते हैं। बुलबुले को हटाने के लिए, माइक्रोफ्लुइडिक स्प्राउटिंग चिप से पहले एक बुलबुला जाल चिप पेश की जाती है। यह पीडीएमएस झिल्ली की उच्च गैस पारमशीलता के आधार पर काम करता है। जब बुलबुले जाल में आ जाते हैं, तो वे छोटे और घने ग्रिड संरचना से फैल जाते हैं और वैक्यूम पंप द्वारा उत्पन्न नकारात्मक दबाव के कारण फंस जाते हैं ताकि वे माइक्रोफ्लुइडिक स्प्राउटिंग चिप में आगे बढ़ने में विफल हो जाएं। इसके अलावा, बुलबुले पीडीएमएस झिल्ली के माध्यम से वैक्यूम पंप से जुड़े नकारात्मक दबाव छेद में परिवहन करते हैं और अंततः गायब हो जाते हैं। फिर भी, प्रयोग के दौरान बुलबुले के गठन पर बहुत ध्यान दिया जाना चाहिए। जैसे ही पाइप लाइन में माइक्रोफ्लुइडिक स्प्राउटिंग चिप से पहले बुलबुले पाए जाएं, माइक्रो सिरिंज पंप को तुरंत बंद कर दें। धीरे से उंगली के साथ पाइपलाइन को फ्लिंच करने के लिए बुलबुले बुलबुला जाल चिप के लिए कदम और हटा दिया जाएगा ।

यद्यपि नियोवैस्कुलराइजेशन का प्रारंभिक माइक्रोएनवायरनमेंट आंशिक रूप से पुनर्पूंजीकरण है, इस एमआईईएन मॉडल की कुछ सीमाएं हैं। नियोवैस्कुलराइजेशन प्रक्रियाओं के दौरान रक्त प्रेरित कतरनी तनाव और बाहकालीन मैट्रिक्स कठोरता जैसी एंडोथेलियल कोशिकाओं के यांत्रिक माइक्रोएनवायरमेंट्स बदल रहे हैं। नियोवैस्कुलराइजेशन से पहले, एंडोथेलियल बेसमेंट झिल्ली अभी भी पूर्ण बाधा कार्य के साथ बरकरार है, जिसके परिणामस्वरूप ट्रांसएंडोथेलियल प्रवाह और मध्यवर्ती प्रवाह8,9के कम वेग के साथ उच्च चमकदार कतरनी तनाव होता है। एंजियोजेनेसिस और आर्टेरियोजेनेसिस की शुरुआत में, एक हॉलमार्क घटना बेसमेंट क्षरण की मैट्रिक्स मेटलोप्रोटीज (एमएमपी) मध्यस्थता है, जो आईसी पारगम्यता और पुन: तैयार मैट्रिक्स में वृद्धि करेगी, जिससे रक्त प्रेरित कतरनी तनाव और बाह्य मैट्रिक्स कठोरता जैसे यांत्रिक माइक्रोएनवायरमेंट्स में परिवर्तन होगा। वर्तमान कार्य में, हम नियोवैस्कुलराइजेशन की शुरुआत पर ध्यान केंद्रित करते हैं, इसलिए माइक्रोफ्लुइडिक स्प्राउटिंग चिप के भीतर यांत्रिक वातावरण को शारीरिक स्थितियों का अनुकरण करने के लिए स्थिर रखने के लिए डिज़ाइन किया गया है। हालांकि, मैकेनिकल माइक्रोएनवायरमेंट्स के परिवर्तन ईसीएस स्प्राउटिंग के साथ होंगे, जैसे वीवो में। इसके अलावा, पिछले कई अध्ययनों के समान34,53,56,वर्तमान मॉडल कोलेजन हाइड्रोजेल को एक बाह्राश मैट्रिक्स के रूप में लेता है। जैसा कि हम प्रवाह प्रेरित कतरनी तनाव के प्रभाव पर ध्यान केंद्रित करते हैं, केवल एक कठोरता हाइड्रोगेल का उपयोग किया जाता है। हालांकि, कोशिका व्यवहार और नियोवैस्कुलराइजेशन पर मैट्रिक्स कठोरता के महत्वपूर्ण प्रभाव को ध्यान में रखते हुए, कोलेजन के विभिन्न कठोरता का अध्ययन किया जाना चाहिए और कोलेजन के पीएच को विनियमित करके प्राप्त किया जा सकता है क्योंकि कोलेजन के यांत्रिक गुण इसके पीएच49पर निर्भर हैं। लेकिन यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं को नुकसान को रोकने के लिए कोशिका सीडिंग से पहले अवशिष्ट एसिड या कुर्सियां हटाने के लिए हाइड्रोजेल को पीबीएस के साथ अच्छी तरह से धोया जाना चाहिए। इसके अलावा, वीवो मेंईसीएम के जटिल घटकों की नकल करने के लिए, वर्तमान मॉडल को बेहतर बनाने के लिए भविष्य में विभिन्न हाइड्रोगेल जैसे मैट्रिगेल, हायलुरोनिक एसिड (एचए), और फाइब्रिनोजेन आदि का उपयोग किया जाना चाहिए। रक्तचाप प्रेरित चक्रीय तनाव एक अन्य महत्वपूर्ण हेमोडायनामिक बल है जो57संवहनी कोशिकाओं के आकृति विज्ञान और कार्यों को संशोधित करता है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि तन्य तनाव ने मानव मेसेंचिमल स्टेमकोशिकाओं में एंजियोजेनिक कारकों की अभिव्यक्ति को बढ़ाया और संवहनी एंडोथेलियल बेसमेंटझिल्लीझिल्ली में टाइप IV कोलेजन के क्षरण के माध्यम से एंजियोजेनेसिस को प्रेरित किया । इन परिणामों से संकेत मिलता है कि रक्तचाप प्रेरित तनाव नियोवैस्कुलराइजेशन को भी प्रभावित कर सकता है। वर्तमान मॉडल प्रवाह प्रेरित कतरनी तनाव के प्रभाव पर केंद्रित है तो यह तनाव लागू करने के लिए लागू नहीं है के रूप में हाइड्रोगेल कसकर चैनल के लिए पर्याप्त छड़ी नहीं है और जब फैला गिर जाएगा । हम भविष्य के कार्यों में इस कठिनाई को दूर करने पर ध्यान देंगे।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल नेचुरल साइंस रिसर्च फाउंडेशन ऑफ चाइना ग्रांट-इन-एड (ग्रांट नग 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 और 32071311), चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (अनुदान नग 2016YFC1101101 और 2016YFC1102202), 111 परियोजना (B13003), और बीजिंग प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (4194079) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Genview GP3108
Collagen I, rat tail Corning 354236
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Electromagnetic pinch valve Wokun Technology WK02-308-1/3
Endothelial cell medium (ECM) Sciencell 1001
Fetal bovine serum (FBS) Every Green NA
Fibronectin Corning 354008
FITC-dextran Miragen 60842-46-8
Graphical programming environment Lab VIEW NA
Image editing software PhotoShop NA
Image processing program ImageJ NA
Isopropanol Sigma-Aldrich 91237
Lithography equipment Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences URE-2000/35
Methanol Sigma-Aldrich 82762
Micro-peristaltic pump Lead Fluid BT101L
Micro-syringe pump Lead Fluid TYD01
Oxygen plasma MING HENG PDC-MG
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
PBS (10x) Beyotime ST448
Permanent epoxy negative photoresist Microchem SU-8 2075
Phenol Red sodium salt Sigma-Aldrich P5530
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) Sigma-Aldrich P7886
Polytetrafluoroethylene Teflon NA
Program software MATLAB NA
Recombinant Human VEGF-165 StemImmune LLC HVG-VF5
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 1.06498
Stage top incubator Tokai Hit NA
SU-8 developer Microchem NA
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931
TRITC Phalloidin Sigma-Aldrich P5285

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Zhao, P., Zhang, X., Liu, X., Wang, L., Su, H., Wang, L., Zhang, D., Deng, X., Fan, Y. Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization. J. Vis. Exp. (170), e62003, doi:10.3791/62003 (2021).

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