Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Mikrofluidisk model til at efterligne indledende hændelse af Neovascularization

Published: April 10, 2021 doi: 10.3791/62003
Automatic Translation
1, 1, 1, 4, 1, 1, 1, 3, 1,2
1Beijing Advanced Innovation Centre for Biomedical Engineering, Key Laboratory for Biomechanics and Mechanobiology of Chinese Education Ministry, School of Biological Science and Medical Engineering, Beihang University, 2School of Engineering Medicine, Beihang University, 3Artificial Intelligence Key Laboratory of Sichuan Province, School of Automation and Information Engineering, Sichuan University of Science and Engineering, 4Beijing Research Center of Urban System Engineering

Summary

Her leverer vi en mikrofluidisk chip og et automatisk kontrolleret, meget effektivt cirkulationsmikrobielt system, der opsummerer det oprindelige mikromiljø af neovascularisering, så endotelceller (ECs) stimuleres af høj lysforskydningsbelastning, fysiologisk niveau af transendotelstrøm og forskellige vaskulære endotelvækstfaktor (VEGF) samtidigt.

Abstract

Neovascularisering initialiseres normalt fra en eksisterende normal vaskulatur, og det biomekaniske mikromiljø af endotelceller (ECs) i den indledende fase varierer dramatisk fra følgende proces med neovascularisering. Selv om der er masser af modeller til at simulere forskellige stadier af neovascularization, en in vitro 3D-model, der kapitulerer den indledende proces med neovascularization under de tilsvarende stimuleringer af normale vaskulatur mikromiljøer er stadig mangler. Her rekonstruerede vi en in vitro 3D-model, der efterligner den første begivenhed af neovascularization (MIEN). MIEN-modellen indeholder en mikrofluidisk spiringschip og et automatisk styrings-, højeffektivt cirkulationssystem. En funktionel, perfusable mikrokanal belagt med endotel blev dannet, og processen med spiring blev simuleret i den mikrofluidiske spirende chip. Det oprindeligt fysiologiske mikromiljø af neovascularisering blev sammenfattet med det mikrofluidiske kontrolsystem, hvorved EC'er ville blive udsat for høj luminal forskydningsbelastning, fysiologisk transendotelstrøm og forskellige vaskulære endotelvækstfaktor (VEGF) fordelinger samtidigt. MIEN-modellen kan let anvendes til undersøgelse af neovasculariseringsmekanisme og har et potentielt løfte som en billig platform for lægemiddelscreening og toksikologiapplikationer.

Introduction

Neovascularization sker i mange normale og patologiske processer1,2,3,4, som omfatter to store processer hos voksne, angiogenese og arteriogenese5. Ud over de mest kendte vækstfaktorer, såsom vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF)6, er mekaniske stimuleringer, især blodgennemstrømningen induceret forskydningsstress, vigtig i reguleringen af neovascularisering7. Som vi ved, varierer størrelsen og formerne for forskydningsstress dramatisk og dynamisk i forskellige dele af vaskulaturen, hvilket resulterer i vigtige virkninger på vaskulære celler8,9,10,11,12. Tidligere undersøgelser har vist, at forskydningsstress kan påvirke forskellige aspekter af ECs, herunder cellefenotypiske ændringer, signaltransduktion, genekspression og kommunikation med vægmalericeller13,14,15,16,17,18,19,20; derfor regulere neovascularization21,22,23,24.

Derfor er det vigtigt at rekonstruere processen i naturlig cellulær mikromiljø in vitrofor bedre at forstå neovascularisering . For nylig er mange modeller blevet etableret for at skabe mikrobeholdere og give præcis kontrol af mikromiljø25,26,27, drage fordel af fremskridt inden for mikrofabrikation og mikrofluidisk teknologi. I disse modeller kan mikrobeholdere genereres af hydrogel28,29, polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidic chips30,31,32 eller 3D bioprint33,34. Nogle aspekter af mikromiljøet, såsom luminal shear stress22,23,35,36, transendotel flow37,38,39,40, biokemisk gradient af angiogene faktorer41,42, stamme / stretch43,44,45, og co-dyrket med andre typer af celler32,46 er blevet efterlignet og kontrolleret. Normalt blev et stort reservoir eller sprøjtepumpe brugt til at give perfunderet medium. Transendotelstrøm i disse modeller blev skabt ved trykfald mellem reservoiret og mikrorør22,23,38,40. Det mekaniske mikromiljø var imidlertid svært at opretholde konstant på denne måde. Transendotel flow ville stige og derefter overstige det fysiologiske niveau, hvis en høj strømningshastighed med høj forskydningsbelastning blev brugt til perfusion. Tidligere undersøgelse viste, at hastigheden af transendotelstrømmen i den indledende periode med neovascularisering er meget lav på grund af de intakte ECs og kældermembran, normalt under 0,05 μm/s8. I mellemtiden, selv om luminal forskydning stress i vaskulære system varierer meget, det er relativt højt med middelværdier på 5-20 dyn/cm2,11,47. Indtil videre er hastigheden af transendotelstrømmen i tidligere værker generelt blevet holdt mellem 0,5-15 μm/s22,38,39,40, og den luminale forskydningsbelastning var normalt under 10 dyn/cm2 23. Det er fortsat et vanskeligt emne til konstant at udsætte ECs for høj luminal forskydning stress og fysiologiske niveau af transendotel flow samtidigt.

I denne undersøgelse beskriver vi en in vitro 3D-model til at efterligne den første begivenhed af neovascularization (MIEN). Vi udviklede en mikrofluidic chip og en automatisk kontrol, meget effektivt cirkulationssystem til at danne perfusion mikrorør og simulere processen med spiring48. Med MIEN-modellen sammenfattes mikromiljøet af EC'er, der blev stimuleret i den indledende periode med neovascularisering, først. ECs kan stimuleres af høj luminal shear stress, fysiologiske niveau af transendotel flow og forskellige VEGF distribution samtidigt. Vi beskriver trinene til at etablere MIEN-modellen i detaljer og de vigtigste punkter, der skal tages hensyn til, i håb om at give en reference til andre forskere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse af Wafer

BEMÆRK: Denne protokol er specifik for SU-8 2075 negative fotoresist, der anvendes i løbet af denne forskning.

  1. Rengør silicium wafer 3 til 5 gange med methanol og isopropanol på en spin coater som følger: først spin for 15 s ved 500 omdrejninger i minuttet, og derefter spin for 60 s ved 3.000 rpm.
  2. Siliciumskiflen overføres til en kogeplade, som forvarmes til 180 °C, og skiven bages i 10 minutter.
  3. Fjern siliciumskiflen fra kogepladen, og afkøl den til stuetemperatur. Rengør waferen igen med trykluft, før du fortsætter med spinbelægningen. Påfør 4 mL af SU-8 2075 fotoresist til midten af wafer.
  4. Få en funktionshøjde på 70 μm på spincoateren som følger: Drej først i 12 s ved 500 omdrejninger i minuttet, og drej derefter i 50 s ved 2.100 omdrejninger i minuttet.
  5. Blød bage wafer på en kogeplade som følger: først bages i 8 min ved 65 °C, derefter bages i 20 min ved 95 °C. Fjern derefter siliciumskiflen fra kogepladen og afkøl den til stuetemperatur før litografi.
  6. Placer en fotomaske på fotoresistfilmen. Udsæt waferen med et litografiudstyr for at opnå en samlet eksponering på 200 mJ/cm2.
    BEMÆRK: Fotomasken indeholder ni sæt mønstre af chippen, så den kan fremstille ni mikrofluidiske spiringschips hver gang.
  7. Stolpe udsætte wafer på en kogeplade som følger: først bages i 5 min ved 65 °C, og derefter bages i 20 min ved 95 °C. Fjern derefter siliciumskiflen fra kogepladen og afkøl den til stuetemperatur, før du udvikler dig.
  8. Overfør wafer til et glas Petri parabol fyldt med SU-8 udvikler (PGMEA) til at begynde at udvikle.
    ADVARSEL: Udvikleren er irriterende for øjnene og luftvejene. Udfør udvikling i en røghætte. Brug stænkbriller, nitrilhandsker og flyselskabsmaske under operationen.
  9. Ryst skålen forsigtigt i retning af flowkanalen og skift udvikleren efter 10 minutter.
  10. Gentag trin 1.9 3-5 gange, indtil mønstrene tydeligt kan observeres.
    BEMÆRK: Sørg for, at der ikke er nogen fotoresistrester tilbage på waferen, ellers skylles waferen i udvikleren igen.
  11. Waferen overføres til en forvarmet kogeplade, der er indstillet til 120 °C, og bages i 30 minutter.
  12. Rør 35 μL silan på en coverlip, og sæt derefter coverlipet sammen med waferen i en ekssikkator og træk vakuum. Forsegl ekssikkatoren, og lad vaflen være under vakuum i 4 timer for at dæmpe waferen for at forhindre, at PDMS klæber under de bløde litografiprocesser.
    ADVARSEL: Silanen er giftig. For at forhindre forgiftning skal du udføre silanisering i røghætten og bære nitrilhandsker under håndtering.
  13. Udløsning af vakuumet fra ekssikkatoren. Den silaniserede wafer fjernes på en forvarmet kogeplade, og den bages ved 65 °C i 2 timer.
  14. Opbevar waferen i en ren petriskål, indtil det er nødvendigt.

2. Mikrofluidisk spiring chip fabrikation

  1. Kombiner 20 g basismiddel og 2 g hærdningsmiddel (10:1-forhold) i et plastikbæger og bland dem grundigt med en blandingsstang.
  2. Placer bægeret i en ekssikkator og træk vakuum i 1 time for at fjerne luftbobler i PDMS-blandingen.
  3. Hæld PDMS blandingen på wafer i Petri parabol og læg Petri parabol tilbage i ekssikkatoren, afgasning i yderligere 30 min.
    BEMÆRK: Det er nyttigt at bruge dobbeltsidet klæbebånd til at lime waferen fast på bunden af petriskålen for at sikre, at waferen holdes vandret under afgasning og hærdning.
  4. Petriskålen tages ud af ekssikkatoren, og den anbringes i en tør ovn på 80 °C i 3 timer for at hærde.
  5. Adskil forsigtigt PDMS-laget fra waferen og skær laget til ni chips med en skalpel i henhold til mønsteret.
    BEMÆRK: Hold funktionssiden oppe efter adskillelsen.
  6. Punch to hydrogel injektion porte og fire medier injektion porte ud af hver chip ved hjælp af en 1 mm og en 3,5 mm biopsi punch, hhv.
  7. Rengør stansechips med rester-fri tape for at fjerne PDMS rester. Placer chips og ni glas coverlips i en plasma renere og behandle dem med ilt plasma i 30 s til at danne kovalente limning på overfladen.
  8. Tag chips og coverslips ud. Fastgør funktionssiden af spånerne på coverlips.
  9. Placer de vedhæftede spåner i en 80 °C tør ovn i 1 time for at intensivere limningen.
  10. Autoklave chips før brug og holde dem sterile for resten af proceduren.

3. Overflademodifikation og hydrogelindsprøjtning

  1. For hver chip pipetter 40 μL på 1 mg/mL poly-D-lysin (PDL) og injicerer det i kanaler i chippen fra hydrogelindsprøjtningsporten.
    BEMÆRK: Sørg for, at PDL fylder kanaler, især i smalle kanaler i nærheden af portene.
  2. Spånerne inkuberes ved 37 °C i 4 timer for at ændre PDMS' overflade .
  3. Rør 200 μL sterilt vand og injicere det i kanaler i chippen fra hydrogel injektion port til at vaske ud PDL.
  4. Spånerne fjernes i en tør ovn på 120 °C i 3 timer for at genoprette hydrofobiteten.
  5. Placer på is et sterilt rør og beregn mængden af type I kollagen, der skal anvendes som følgende ligning.
    Endeligt volumen (50 μL) x Endelig kollagenkoncentration (3 mg/mL i denne forskning) / Koncentration i flaske = volumenkollagen, der skal tilsættes
  6. Beregn den mængde NaOH, der skal bruges som følgende ligning.
    (volumen kollagen, der skal tilsættes) x 0,023 = volumen 1 N NaOH
  7. Der fremstilles 50 μL hydrogel i røret som følgende protokol: Der tilsættes 5 μL 10x PBS, 0,5 μL phenolrødt, beregnet volumen på 1 N NaOH, 4 μL på 1 mg/mL Fibronectin, beregnet volumen af type I kollagen efter tur. Tilsæt den korrekte mængde dH2O, så det samlede volumen når 50 μL. Bland alt indhold i røret grundigt.
    BEMÆRK: Udfør alle operationer på is. Brug phenolrød som en syrebaseret indikator til at hjælpe med visuel bestemmelse af hydrogelens pH- pH. Den endelige hydrogel ender orange, når pH er omkring 7,4 og stivheden er omkring 15 kPa49.
  8. Rør 2-3 μL hydrogel for hver spån, og indsprøjt den langsomt i den centrale hydrogelkanal fra hydrogelindsprøjtningshavnen.
  9. Spånerne inkuberes ved 37 °C i 30 minutter for at muliggøre gelering.
    BEMÆRK: Luk spånerne i en forseglet kasse med 1 mL sterilt vand, hvis de ikke anvendes med det samme. Forseglede spåner kan opbevares ved 37 °C i højst 24 timer.

4. Cellesåning

  1. Rør 20 μL på 125 μg/mL Fibronectin i en medieindsprøjtningsport på cellekulturkanalen.
  2. Skær en pipettespids, så den passer til porten til cellekulturkanalen med en saks.
  3. Sæt pipettespidsen i den anden medieindsprøjtningsport på cellekulturkanalen. Rør derefter luft ud fra cellekulturkanalen for at fylde den med Fibronectin.
  4. Spånerne inkuberes ved 37 °C i 1 time.
  5. Før cellesåning pipetter 20 μL ECM-medier i hver medieindsprøjtningsport og inkuber chipsene ved 37 °C i 30 min.
  6. Rør derefter alle medier ud i alle medieinjektionsporte.
  7. Dernæst pipetter 5 μL celleaffjedring i en medieindsprøjtningsport af cellekulturkanalen. Derefter spredte endotelceller sig hurtigt over hele kanalen under differentieret hydrostatisk tryk.
    BEMÆRK: Forbered celleaffjedringen ved at prøve at udtage menneskelige navlestrengs-endotelceller (HUVEC'er) fra dyrkningskolben og centrifuging dem ved 400 x g. Derefter genbruges cellerne til 107 celler / mL i et rør.
  8. Der tilsættes ca. 4-6 μL ECM-medier til den anden port for at justere det hydrostatiske tryk og stoppe cellens bevægelse.
  9. Fjern spånerne til celleinkubatoren. Vend derefter chipsene hvert 30. minut, indtil endotelcellerne frakker rundt om cellekulturkanalens indre overflade 2 timer senere (Figur 1).
    BEMÆRK: For at gøre chippen på hovedet, pipet lidt vand på bagsiden af coverlip. Derefter kan chippen fastgøres til dækslet på petriskålen.
  10. Brug pipettespidsen til at fjerne de vedhæftede celler i injektionsportene meget omhyggeligt.
  11. Indsæt derefter fire piggede kvindelige Luer-adaptere i medieindsprøjtningsportene og fyld med ECM-medier.
    BEMÆRK: Adapterne kan fungere som væskereservoirer for at give næringsstoffer til cellerne i kanalen.
  12. Fjern spånerne til celleinkubatoren. Skift ECM-medier i Luer-adaptere hver 12.

5. Måling af fitc-dextran diffusional permeabilitet

BEMÆRK: For at vurdere mikrobeholderens barrierefunktion vurderes ef-kulturkanalens diffusionspermeabilitet med eller uden celleforing.

  1. Tag en mikrofluidic spirende chip med hydrogel injiceres.
  2. Gentag trin 4.1-4.6.
  3. Fjern alle Luer-adaptere, og pipet alle medier ud i fire medieinjektionsporte.
  4. Placer chippen på det konfokale laserscanningsmikroskop.
  5. Rør 5 μL dyrkningsmedier indeholdende 500 μg/mL 40 kDa FITC-dextran til én port af cellekulturkanal.
    BEMÆRK: 40 kDa FITC-dextran har samme molekylære størrelse som VEGF-165 (39-45 kDa).
  6. Tag billeder hver 3 s for 30 s. Således måles den diffusionelle permeabilitet uden celleforing.
  7. Tag den mikrofluidiske spiringschip ud, når HUVEC'er er sammenløbet i cellekulturkanalen.
  8. Gentag trin 5.3-5.5.
  9. Tag billeder hver 3 s for 30 s. Således måles den diffusionelle permeabilitet med celleforing.
  10. Diffusionstrængbarheden beregnes ved at kvantificere ændringer i lysstofrørets intensitet over tid ved hjælp af følgende modificerede ligning50.
    Pd= (I2- I1) / ((I1- Ib)· Δt) · S/d
    hvor Pd er den diffusionelle permeabilitetskoefficient, I1 er den gennemsnitlige intensitet på et indledende tidspunkt, I2 er den gennemsnitlige intensitet efter deltatid (Δt), jegb er baggrundsintensiteten, S er kanalens areal i fluorescensbilleder, og d er det samlede interval af mikroindlæg i fluorescensbilleder. I det nuværende værk er Δt sat til 9 s.
    BEMÆRK: Den nuværende ligning er lidt forskellig fra den oprindelige50, på grund af fluorescensens diffusionsretning i chippen er kun fra EF-kanalen til hydrogelkanalen, som ikke er som det cirkulære rør, der spredes i alle radialretningen.

6. Opsætning af mikrofluidisk kontrolsystem

BEMÆRK: Det mikrofluidiske kontrolsystem i denne undersøgelse består af en mikrosprøjtepumpe, en elektromagnetisk klemmeventil, en boblefældechip, en mikrofluidisk chip, en mikroperistaltisk pumpe og et reservoir. Hver del af systemet kan erstattes af alternativer, der er i stand til at udføre den samme funktion.

  1. Boble fælde chip fabrikation
    BEMÆRK: Boblefældechippen bruges til at fjerne luftbobler i omløb. Chippen består af tre PDMS-lag. Det øverste lag er konstrueret ved hjælp af blød litografi til at danne gitterstruktur som det flydende kammer. Hver kanal i gitterstrukturen er 100 μm bred. Det nederste lag er en PDMS-del med et hul. Mellem de to lag lægges en 100 μm tynd PDMS-film.
    1. Gentag trin 1 for at forberede waferen til boblefældechippen.
    2. Gentag trin 2.1-2.5 for at fremstille det øverste lag og nederste lag af boblefældechippen.
      BEMÆRK: Fotomasken i det øverste lag indeholder tre sæt mønstre, så skær PDMS-laget til tre chips i henhold til mønsteret.
    3. Punch seks huller på enden af indløb og udløb kanaler i det øverste lag ved hjælp af en 3,5 mm biopsi punch.
    4. Punch to huller på den tilsvarende position af det nederste lag ved hjælp af en 6 mm biopsi punch i henhold til mønsteret på det øverste lag.
    5. Gentag trin 2.1-2.2 for at forberede 10 g PDMS-blanding og hæld den på midten af en renset siliciumskifer.
    6. Fremstille en 100 μm PDMS film ved at anvende følgende spin protokol: spin for 15 s ved 500 omdrejninger i minuttet, øge spin hastighed til 1.300 omdrejninger i minuttet og hold her i 45 s.
    7. Waferen overføres til en forvarmet kogeplade, der er indstillet til 180 °C, og bages i 30 minutter.
    8. Rengør de stansede lag med resterfrit tape for at fjerne PDMS-rester. Placer de øverste lag og wafer i en plasma renere og behandle dem med ilt plasma i 30 s til at danne kovalente limning på overfladen.
    9. Tag de øverste lag og wafer. Fastgør funktionssiden af de øverste lag til PDMS-filmen.
    10. Skær filmen forsigtigt langs kanten af de øverste lag med en nål.
    11. Langsomt adskille filmen fra wafer og vende chips til at gøre filmen side op efter adskillelse.
    12. Placer de nederste lag og vedhæftede chips i en plasmarenser og behandle dem med iltplasma i 30 s igen.
    13. Tag de nederste lag og vedhæftede chips ud. Fastgør de nederste lag på PDMS-filmen, og boblefældechipsene er færdige.
      BEMÆRK: Juster hullerne på det nederste lag med mønstrene på det øverste lag, når de fastgøres.
    14. Spånerne anbringes i en tør ovn på 80 °C i 1 time for at intensivere bindingen.
  2. Saml det mikrofluidiske kontrolsystem
    BEMÆRK: Alle dele af systemet, såsom boblefældechip, reservoir, rør og stik, bruges efter autoklavesterilisering, undtagen elektronisk udstyr. Saml det mikrofluidiske kontrolsystem på en ren bænk.
    1. For at samle det mikrofluidiske kontrolsystem skal du forberede to polytetrafluorethylenrør, to korte silikonerør, tre lange silikonerør, en barbed kvindelig Luer-adapter, et stik af Y-type og tre L-stik.
      BEMÆRK: Fordelen ved polytetrafluorethylenrør er lav elasticitet, derfor er der behov for færre medier under rørledning. Silikonerør har derimod høj elasticitet, derfor er det egnet til knivspidsventilen og peristaltisk pumpe.
    2. Fyld sprøjten med 10 mL forvarmet (37 °C) ECM-medium.
      BEMÆRK: Forvarmning hjælper mediet med at frigive opløst gas.
    3. Tilslut et polytetrafluorethylenrør til sprøjten af en barbed kvindelig Luer-adapter. Tilslut derefter den anden ende af polytetrafluorethylenrøret til et stik af typen Y.
    4. Tilslut derefter to lange silikonerør til de to andre ender af Y-typestik med et rør, der forbinder til reservoiret, og det andet rør, der opretter forbindelse til boblefældechippen.
    5. Tilslut et andet langt silikonerør til reservoiret.
    6. Brug derefter to korte silikonerør til at forbinde alle indløbs- og udløbshuller på det øverste lag af boblefældechippen. Tilslut et polytetrafluorethylenrør til chippens bagende.
    7. Derefter fastgøres sprøjten på mikrosprøjtepumpen.
    8. Klip to lange silikonerør ind i den elektromagnetiske klemmeventil.
    9. Skift derefter den elektromagnetiske klemmeventil for at åbne rørledningen mellem sprøjten og reservoiret. Indsprøjt mediet i beholderen ved hjælp af en mikrosprøjtepumpe for at udtømme luft i røret.
    10. Skift derefter ventilen igen for at åbne rørledningen mellem sprøjten og boblefældechippen. Injicer mediet for at fylde væskekammeret og bagrøret på boblefældechippen.

7. Endotel spiring assay

BEMÆRK: I denne undersøgelse anvendes en fasetopinkubator, der er samlet med fasekontrastmikroskop, til at observere spiringsprocessen i realtid. Fasetopinkubatoren kan opretholde temperaturen, fugtigheden og CO2-styringen på mikroskopstadier, hvilket er godt for levende cellebilleddannelse. Men udstyret er ikke nødvendigt for analysen. Protokollerne her kan også arbejdes i en grundlæggende celleinkubator.

  1. Tag ud endotel spiring chips fra cellen inkubatoren.
  2. Fjern derefter Luer-adaptere på cellekultursiden. Sæt to rørpropper i hydrogelindsprøjtningsportene på den mikrofluidiske spiringschip.
    BEMÆRK: Stikkene kan omdannes fra nåle, og deres hovedfunktion er at forhindre medier i at spilde.
  3. Tilslut bagrøret af boblefældechippen til en port af cellekulturkanal.
    BEMÆRK: Sørg for, at der ikke er bobler i røret før tilslutning.
  4. Sæt et T-stik til den anden port, og tilslut det til et langt silikonerør, der er forbundet med reservoiret.
  5. Klip det lange silikonerør ind i den mikroperistaltiske pumpe.
  6. Indsæt derefter et luftfilter til reservoiret.
  7. Derefter samles den mikrofluidiske spiringschip til scenepladeinkubatoren.
  8. Tilslut derefter vakuumpumpen til hullerne i det nederste lag af boblefældechip med et TPU-rør.
  9. Opsæt cirkulationsvolumen og strømningshastighed i det brugerdefinerede program, som styrer mikrosprøjtepumpen og den elektromagnetiske klemmeventil samtidigt (Figur 2).
    BEMÆRK: Strømningshastigheden på tværs af den endotelcellekulturkanal beregnes i henhold til den klassiske ligning.
    τ = 6μQ / Wh2
    hvor τ er forskydningsbelastning (dyn/cm2), μ er viskositet af mediet (8,8 x 10-4 Pa•s), Q er strømningshastigheden på tværs af endotelcellekulturkanalen (ml/s), h er kanalhøjde (70 μm), og W er kanalbredde (1.000 μm). Mediets viskositet måles ved hjælp af et koaksialt cylindertyperopolationsflaske visometer. Kanalens højde og bredde er forudbestemt og bekræfter manuelt ved hjælp af et fasekontrastmikroskop ved 4x forstørrelse. Cirkulationsvolumenet er 5 mL, og strømningshastigheden er 85 μL/min (gennemsnit 0,2 m/s i cellekulturkanal) for 15 dyn/cm2 forskydningsspænding ifølge beregningen.
  10. Dernæst skal du indstille strømningshastigheden af mikroperistaltisk pumpe.
    BEMÆRK: Strømningshastigheden for mikroperistaltisk pumpe er lidt højere end mikrosprøjtepumpen for at forhindre, at mediet løber ud.
  11. Tænd for mikrosprøjtepumpen. Derefter etableres cirkulationskontrolsystemet.

8. Dataanalyse

BEMÆRK: For at kvantificere spirerne blev det normaliserede spiringsområde, den gennemsnitlige spirelængde og længste spirelængde beregnet. Resultaterne repræsenterer en gennemsnitlig ± SEM opnået fra tre uafhængige undersøgelser. Statistisk signifikans (P < 0,05) vurderes af Student's t-test.

  1. Fix celler og spirer i mikrofluidic spirende chip efter forsøg med 4% paraformaldehyd i PBS i 15 min. Pletkerner med 4′,6-diamidino-2-phenylindol dihydrochlorid (DAPI; 1: 1000; Sigma-Aldrich) i 10 min og derefter plette cytoskelet med TRITC falloidin (P5285, 1: 100; Sigma-Aldrich) i 1 time. Vask celler med PBS tre gange med 5 minutters mellemrum mellem hvert trin.
  2. Tag konfokale billeder af chipsene i flisetilstand, og sy dem ved hjælp af billedredigeringssoftware.
  3. Tæl antallet af fluorescerende pixel af Z-projektionsbilleder ved hjælp af en brugerdefineret kode i programmeringssoftware for at kvantificere normaliseret spiringsområde (Se Supplerende fil).
  4. Manuelt identificere og mærke hver spids af spirer i Z-projektion billeder og beregne afstande mellem spirer tips til ECs kældermembran ved hjælp af en anden brugerdefineret kode til at kvantificere den gennemsnitlige spire længde og længste spire længde (Se Supplerende File).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den in vitro 3D-model til at efterligne den første tilfælde af neovascularization (MIEN) præsenteret her bestod af en mikrofluidisk spirende chip og et mikrofluidisk kontrolsystem. Den mikrofluidiske spirechip blev optimeret fra tidligere publikationer22,23,37,40,51,52,53. Kort sagt indeholdt den tre kanaler og seks porte: en endotelcellekulturkanal og en flydende kanal med fire medieindsprøjtningsporte og en central hydrogelkanal med to hydrogelindsprøjtningsporte (figur 3). Det mikrofluidiske kontrolsystem bestod af en mikrosprøjtepumpe, en elektromagnetisk klemmeventil, en boblefældechip, en mikroperistaltisk pumpe og et dyrkningsmediumreservoir (Figur 4). Et brugerdefineret program blev brugt til at styre mikrosprøjtepumpen og den elektromagnetiske klemmeventil samtidigt, som strømningshastigheden og cirkulationsvolumenet kan indstilles med. En kompensationsvolumen blev introduceret for at rette den lille ændring af lydstyrken efter flere cyklusser på grund af systemisk fejl. For at minimere det medium, der anvendes til perfusion, blev der introduceret en elektromagnetisk klemmeventil til medium genbrug. Den elektromagnetiske klemmeventil kan skifte mellem to tilstande for at gøre det mikrofluidiske system i to faser i en cyklus. I injektionsfasen blev kulturmediet langsomt injiceret fra mikrosprøjtepumpen til den mikrofluidiske spirechip. Mens der i genbrugsfasen blev kulturmediet meget hurtigt ekstraheret fra reservoiret tilbage til mikrosprøjtepumpen.

Mikrobeholderens barrierefunktion i vores MIEN-model blev vurderet ved at måle den diffusionelle permeabilitetskoefficient (Pd) på 40 kDa FITC-dextran. Som det fremgår af figur 5, er Pd af statisk kulturpergeret chip med celleforing 0,1 ± 0,3 μm/s, og Pd af tom kanal uden celleforing er 5,4 ± 0,7 μm/s. Derefter blev endotelspiringsanalyse under statisk og perfusion udført i MIEN-modellen. Under statiske forhold opstod endotelspiring ca. 4 timer efter såning, og spirerne ville migrere over den centrale hydrogelkanal til den anden side på ca. 48 timer. Spirerne nedbrydes gradvist efter 48 timer. Mens der efter 24 timers eksponering for 5 eller 15 dyn/cm2 forskydningsbelastning (gennemsnitligt 0,07 eller 0,2 m/s i cellekulturkanalen) justeres ECs i strømningsretningen, der skifter fra polygonal, brostensbelagt form til fusiform, og graden af spiring faldt med stigningen i forskydningsstress (Figur 6). Spirerne under forskydningsforhold var imidlertid mere stabile end under statiske dyrkningsforhold. De kunne opretholde over 48 timer under perfusion. Kvantitative statistikker viste, at endotelspiring faldt betydeligt med hensyn til spireareal, gennemsnitlig spirelængde og længste spirelængde (figur 7).

Figure 1
Figur 1:Endotelceller dækker rundt om cellekulturkanalens indre overflade. HUVEC'er er jævnt fordelt i cellekulturkanalen 2 timer efter cellesåning. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Det brugerdefinerede program, der bruges til at styre mikrosprøjtepumpen og den elektromagnetiske klemmeventil samtidigt. Hovedside (op) og underside (ned) i det brugerdefinerede program, som strømningshastigheden og cirkulationsvolumen kan konfigureres med. En kompensationsvolumen blev introduceret for at rette den lille ændring af lydstyrken efter flere cyklusser på grund af systemisk fejl. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Den mikrofluidiske spiringschips skematisk. Chippen indeholder tre kanaler og seks porte: en endotelcellekulturkanal og en flydende kanal med fire medieindsprøjtningsporte og en central hydrogelkanal med to hydrogelindsprøjtningsporte. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Det mikrofluidiske kontrolsystems skematiske egenskaber. Det mikrofluidiske kontrolsystem består af en mikrosprøjtepumpe, en elektromagnetisk klemmeventil, en boblefældechip, en mikroperistaltisk pumpe og et kulturmediumreservoir. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Diffusionel permeabilitet (Pd) af 40 kDa FITC-dextran. Pd af statisk kulturpergeret chip med celleforing er 0,1 ± 0,3 μm/s, og Pd af tom kanal uden celleforing er 5,4 ± 0,7 μm/s. **, p < 0,01. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Repræsentative billeder af endotelspiring under forskellige forskydningsforhold. Efter 24 timers statisk dyrkning invaderer HUVECs fra cellekulturkanalen ind i den tilstødende hydrogelkanal gennem mikropæle og et stort antal spirer i hydrogelen. Mens der efter 24 timers eksponering for 5 eller 15 dyn / cm2 forskydning stress, graden af spiring falde naturligvis. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Kvantificeret spiringsområde, gennemsnitlig spirelængde og længste spirelængde. Efter 24 timers statisk kultur (S0) eller udsættelse for 5 (S5) eller 15 (S15) dyn/cm2 forskydningsstress falder graden af spiring med stigningen i forskydningsstress. *, s. < 0.05; **, s. < 0.01. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende fil. Klik her for at hente denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I lang tid har realtidsobservation af neovascularisering været et problem. Flere tilgange er blevet udviklet for nylig for at skabe perfunderede fartøjer foring med ECs og støder op til ekstracellulære matrix forspiring 22,32,40,46,54, men den mekaniske mikromiljø er stadig svært at opretholde konstant. Det er fortsat et vanskeligt emne at efterligne det oprindelige biomekaniske mikromiljø af ECs, som udsættes for høj luminal shear stress og lav hastighed af transendotel flow. Her præsenterede vi en MIEN-model, der for det første simulerer den første tilfælde af neovascularisering i efterligne fysiologisk mikromiljø. Med MIEN-modellen opnås automatisk, effektiv og boblefri langsigtet perfusion. Luminal shear stress på ECs kan eventuelt ændres når som helst under forsøg med transendotel flow opholder sig på fysiologisk niveau.

Nøglen til MIEN-modellen er at afkoble effekten af luminal flow på ECs fra transendotel flow. Til dette formål indsættes et T-stik kreativt i udløbsporten på EF-kulturkanalen. Den ene ende af stikket er forbundet til reservoiret gennem den mikroperistaltiske pumpe. Den anden ende af stikket udsættes for inkubatorens luft. Det holder trykket inde i endotelcellekulturkanalen det samme som det atmosfæriske tryk, da der hverken er overskud af medieindsamling for at øge trykket eller overskydende medier, der trækkes væk for at danne undertryk i kanalen. På denne måde er strømningsmodstanden efter mikrofluidisk spiringschip meget lille, så transendotelstrømmen kan opretholdes på fysiologisk rækkevidde selv under høj lysforskydningsbelastning.

Et kritisk skridt i protokollen er en vellykket indsprøjtning af hydrogel i centrale hydrogel kanal. Huang et al. foreslog, at en vellykket påfyldning af gelerne afhænger af afbalancering af kapillærkræfterne og overfladespændingen inden for den mikrofluidiske gelkanal55. De fandt tre forskellige variabler til at styre balancen: afstanden mellem mikro-stillinger, overfladen egenskaber af enheden, og viskositet hydrogel prækursor løsninger. I den nuværende model er designet af den mikrofluidiske spiringschip optimeret fra tidligere værker22,23,37,40,51,52,53. Geometrien og afstanden mellem mikropæle til at adskille tre kanaler bestemmes ud fra tidligere beregninger og talrige eksperimenter. Desuden udføres PDL-belægning og højtemperaturbagning for at ændre PDMS-overfladen; Dermed justeres balancen mellem hydrofilicitet og hydrofobicitet før hydrogelindsprøjtning.

Det andet kritiske trin i protokollen er fjernelsen af bobler. En stor mængde luft opløses i cirkulationsmediet under forsøget på grund af T-typens stik og mikroperistaltiske pumpe, hvilket resulterer i bobler i omløb og i høj grad påvirker endotelcellernes funktion. For at fjerne bobler introduceres en boblefældechip før mikrofluidisk spirende chip. Det virker baseret på den høje gas permeabilitet af PDMS membranen. Når bobler kommer ind i fælden, spredes de af den lille og tætte gitterstruktur og fanges på grund af det undertryk, der genereres af vakuumpumpen, så de ikke bevæger sig fremad i den mikrofluidiske spirende chip. Desuden transporterer boblerne gennem PDMS-membranen ind i det undertrykshul, der er forbundet til vakuumpumpen og forsvinder til sidst. Alligevel skal der lægges stor vægt på dannelsen af bobler under eksperimentet. Så snart der er fundet bobler før mikrofluidisk spiringschip i rørledningen, skal du straks stoppe mikrosprøjtepumpen. Vink forsigtigt rørledningen med fingeren for at lade boblerne bevæge sig til boblefældechippen og fjernes.

Selv om det oprindelige mikromiljø af neovascularisering er delvist rekapituleret, er der nogle begrænsninger for denne MIEN-model. De mekaniske mikromiljøer i endotelceller som blodinduceret forskydningsstress og ekstracellulær matrixstivhed ændrer sig under neovasculariseringsprocesserne. Før neovascularisering er den endoteliske kældermembran stadig intakt med komplet barrierefunktion, hvilket resulterer i høj lysforskydningsbelastning med lav hastighed af transendotelstrøm og interstitiel strøm8,9. Ved begyndelsen af angiogenese og arteriogenese, et kendetegn begivenhed er matrix metalloproteases (MMPs) mægling af kælderen nedbrydning, hvilket vil øge ECs permeabilitet og remodel matrix, hvilket fører til ændringer i mekaniske mikromiljøer såsom blod induceret forskydning stress og ekstracellulær matrix stivhed. I det nuværende arbejde fokuserer vi på påbegyndelsen af neovascularisering, så de mekaniske miljøer inden for den mikrofluidiske spiringschip er designet til at holde stabile for at simulere de fysiologiske forhold. Der vil dog ske ændringer af mekaniske mikromiljøer, når ECs spirer, ligesom in vivo. Desuden ligner mange tidligere undersøgelser34,53,56, den nuværende model tager kollagen hydrogel som en ekstracellulær matrix. Som vi fokuserer på effekten af flow induceret forskydning stress, kun én stivhed hydrogel anvendes. Men i betragtning af den vigtige effekt af matrixstivhed på celleadfærd og neovascularisering bør forskellige stivheder af kollagen undersøges og kan opnås ved at regulere pH i kollagen, da kollagenens mekaniske egenskaber afhænger af dets pH49. Men det er vigtigt at bemærke, at hydrogel skal skylles grundigt med PBS for at fjerne resterende syrer eller baser før celle såning for at forhindre skader på cellerne. For at efterligne de komplekse komponenter i ECM in vivobør forskellige hydrogeler som Matrigel, hyaluronsyre (HA) og fibrinogen osv. i fremtiden anvendes til at forbedre den nuværende model. Blodtryk induceret cyklisk stamme er en anden vigtig hæmodynamisk kraft, der modulerer morfologi og funktioner vaskulære celler57. Tidligere undersøgelser har vist, at trækstammen forstærkede ekspressionen af angiogene faktorer i humane mesenchymale stamceller58 og inducerede angiogenese via nedbrydning af type IV-kollagen i den vaskulære endotelkældermembran59. Disse resultater viste, at blodtryk induceret stamme kan påvirke neovascularization også. Den nuværende model fokuserer på effekten af flow induceret forskydning stress, så det ikke er relevant at indføre stamme som hydrogel ikke holder stramt nok til kanalen og vil falde af, når strakt. Vi vil være opmærksomme på at overvinde denne vanskelighed i fremtidige værker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Research Foundation of China Grants-in-Aid (tilskud nr. 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 og 32071311), Kinas nationale nøgleprogram for forskning og udvikling (tilskud nr. 2016YFC1101101 og 2016YFC1102202), 111-projektet (B13003) og Beijing Natural Science Foundation (4194079).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Genview GP3108
Collagen I, rat tail Corning 354236
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Electromagnetic pinch valve Wokun Technology WK02-308-1/3
Endothelial cell medium (ECM) Sciencell 1001
Fetal bovine serum (FBS) Every Green NA
Fibronectin Corning 354008
FITC-dextran Miragen 60842-46-8
Graphical programming environment Lab VIEW NA
Image editing software PhotoShop NA
Image processing program ImageJ NA
Isopropanol Sigma-Aldrich 91237
Lithography equipment Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences URE-2000/35
Methanol Sigma-Aldrich 82762
Micro-peristaltic pump Lead Fluid BT101L
Micro-syringe pump Lead Fluid TYD01
Oxygen plasma MING HENG PDC-MG
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
PBS (10x) Beyotime ST448
Permanent epoxy negative photoresist Microchem SU-8 2075
Phenol Red sodium salt Sigma-Aldrich P5530
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) Sigma-Aldrich P7886
Polytetrafluoroethylene Teflon NA
Program software MATLAB NA
Recombinant Human VEGF-165 StemImmune LLC HVG-VF5
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 1.06498
Stage top incubator Tokai Hit NA
SU-8 developer Microchem NA
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931
TRITC Phalloidin Sigma-Aldrich P5285

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  2. Barger, A. C., Beeuwkes, R. D., Lainey, L. L., Silverman, K. J. Hypothesis: vasa vasorum and neovascularization of human coronary arteries. A possible role in the pathophysiology of atherosclerosis. New England Journal of Medicine. 310 (3), 175-177 (1984).
  3. Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
  4. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and angiogenesis in tissue engineering: beyond creating static networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
  5. Carmeliet, P. M. J. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nature Medicine. 6 (4), 389-395 (2000).
  6. Yancopoulos, G. D., et al. Vascular-specific growth factors and blood vessel formation. Nature. 407 (6801), 242-248 (2000).
  7. Heil, M., Eitenmüller, I., Schmitz-Rixen, T., Schaper, W. Arteriogenesis versus angiogenesis: similarities and differences. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10 (1), 45-55 (2006).
  8. Tarbell, J. M., Demaio, L., Zaw, M. M. Effect of pressure on hydraulic conductivity of endothelial monolayers: role of endothelial cleft shear stress. Journal of Applied Physiology. 87 (1), 261 (1999).
  9. Pedersen, J. A., Lichter, S., Swartz, M. A. Cells in 3D matrices under interstitial flow: Effects of extracellular matrix alignment on cell shear stress and drag forces. Journal of Biomechanics. 43 (5), 900-905 (2010).
  10. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Biophysical aspects of blood flow in the microvasculature. Cardiovascular Research. 32 (4), 654-667 (1996).
  11. Ballermann, B. J., Dardik, A., Eng, E., Liu, A. Shear stress and the endothelium. Kidney International. 54, 100-108 (1998).
  12. Stone, P. H., et al. Prediction of sites of coronary atherosclerosis progression: In vivo profiling of endothelial shear stress, lumen, and outer vessel wall characteristics to predict vascular behavior. Current Opinion in Cardiology. 18 (6), 458-470 (2003).
  13. Wragg, J. W., et al. Shear stress regulated gene expression and angiogenesis in vascular endothelium. Microcirculation. 21 (4), 290-300 (2014).
  14. Yoshino, D., Sakamoto, N., Sato, M. Fluid shear stress combined with shear stress spatial gradients regulates vascular endothelial morphology. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 9 (7), 584-594 (2017).
  15. Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2016).
  16. Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
  17. Hergenreider, E., et al. Atheroprotective communication between endothelial cells and smooth muscle cells through miRNAs. Nature Cell Biology. 14 (3), 249 (2012).
  18. Chien, S. Mechanotransduction and endothelial cell homeostasis: the wisdom of the cell. American Journal of Physiology Heart & Circulatory Physiology. 292 (3), 1209 (2007).
  19. Qi, Y. X., et al. PDGF-BB and TGF-{beta}1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1908-1913 (2011).
  20. Chiu, J. J., Shu, C. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological Reviews. 91 (1), 327-387 (2011).
  21. Tressel, S. L., Huang, R. P., Tomsen, N., Jo, H. Laminar shear inhibits tubule formation and migration of endothelial cells by an angiopoietin-2 dependent mechanism. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2150-2156 (2007).
  22. Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15342-15347 (2011).
  23. Galie, P. A., et al. Fluid shear stress threshold regulates angiogenic sprouting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 7968-7973 (2014).
  24. Pipp, F., et al. Elevated fluid shear stress enhances postocclusive collateral artery growth and gene expression in the pig hind limb. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (9), 1664-1668 (2004).
  25. Islam, M. M., Beverung, S., Steward, R. Bio-Inspired Microdevices that Mimic the Human Vasculature. Micromachines (Basel. 8 (10), (2017).
  26. Warren, K. M., Islam, M. M., Leduc, P. R., Steward, R. 2D and 3D mechanobiology in human and nonhuman systems. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21869 (2016).
  27. Pellegata, A. F., Tedeschi, A. M., De Coppi, P. Whole organ tissue vascularization: engineering the tree to develop the fruits. Front Bioeng Biotechnol. 6, 56 (2018).
  28. Nguyen, D. H., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  29. Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).
  30. Ribas, J., et al. Biomechanical strain exacerbates inflammation on a progeria-on-a-chip model. Small. 13 (15), 1603737 (2017).
  31. Song, J. W., Bazou, D., Munn, L. L. Anastomosis of endothelial sprouts forms new vessels in a tissue analogue of angiogenesis. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (8), 857-862 (2012).
  32. Kim, J., et al. Engineering of a Biomimetic Pericyte-Covered 3D Microvascular Network. PLoS One. 10 (7), 0133880 (2015).
  33. Divito, K. A., Daniele, M. A., Roberts, S. A., Ligler, F. S., Adams, A. A. Microfabricated blood vessels undergo neoangiogenesis. Biomaterials. 138, 142-152 (2017).
  34. Lee, V. K., et al. Creating perfused functional vascular channels using 3D bio-printing technology. Biomaterials. 35 (28), 8092 (2014).
  35. Buchanan, C. F., Verbridge, S. S., Vlachos, P. P., Rylander, M. N. Flow shear stress regulates endothelial barrier function and expression of angiogenic factors in a 3D microfluidic tumor vascular model. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 517-524 (2014).
  36. Jr, S. R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology Cell Physiology. 308 (8), 657 (2015).
  37. Kim, S., Chung, M., Ahn, J., Lee, S., Jeon, N. L. Interstitial flow regulates the angiogenic response and phenotype of endothelial cells in a 3D culture model. Lab on A Chip. , 4189-4199 (2016).
  38. Shirure, V. S., Lezia, A., Tao, A., Alonzo, L. F., George, S. C. Low levels of physiological interstitial flow eliminate morphogen gradients and guide angiogenesis. Angiogenesis. (6801), 1-12 (2017).
  39. Bazou, D., et al. Flow-induced HDAC1 phosphorylation and nuclear export in angiogenic sprouting. Scientific Reports. 6, 34046 (2016).
  40. Vickerman, V., Kamm, R. D. Mechanism of a flow-gated angiogenesis switch: early signaling events at cell-matrix and cell-cell junctions. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (8), 863 (2012).
  41. Song, J., et al. Microfluidic platform for single cell analysis under dynamic spatial and temporal stimulation. Biosens Bioelectron. 104, 58-64 (2018).
  42. Jeong, G. S., et al. Sprouting angiogenesis under a chemical gradient regulated by interactions with an endothelial monolayer in a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 83 (22), 8454-8459 (2011).
  43. Steward, R. L., Tan, C., Cheng, C. M., Leduc, P. R. Cellular force signal integration through vector logic Gates. Journal of Biomechanics. 48 (4), (2015).
  44. Jing, Z., Niklason, L. E. Microfluidic artificial "vessels" for dynamic mechanical stimulation of mesenchymal stem cells. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. (12), 1487-1497 (2012).
  45. Zheng, W., et al. A microfluidic flow-stretch chip for investigating blood vessel biomechanics. Lab on A Chip. 12 (18), 3441-3450 (2012).
  46. Buchanan, C. F., et al. Three-dimensional microfluidic collagen hydrogels for investigating flow-mediated tumor-endothelial signaling and vascular organization. Tissue Engineering Part C Methods. 20 (1), 64 (2014).
  47. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Biophysical aspects of blood flow in the microvasculature. Cardiovascular Research. 32 (4), 654-667 (1996).
  48. Zhao, P., et al. Flow shear stress controls the initiation of neovascularization via heparan sulfate proteoglycans within biomimic microfluidic model. Lab on A Chip. 21, 421-434 (2021).
  49. Yamamura, N., Sudo, R., Ikeda, M., Tanishita, K. Effects of the mechanical properties of collagen gel on the in vitro formation of microvessel networks by endothelial cells. Tissue Engineering. 13 (7), 1443 (2007).
  50. Huxley, V. H., Curry, F. E., Adamson, R. H. Quantitative fluorescence microscopy on single capillaries: alpha-lactalbumin transport. American Journal of Physiology. 252 (1), Pt 2 188 (1987).
  51. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on A Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
  52. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  53. Polacheck, W. J., et al. A non-canonical Notch complex regulates adherens junctions and vascular barrier function. Nature. 552 (7684), 258-262 (2017).
  54. Nguyen, D. H., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  55. Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on A Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
  56. Chung, M., Ahn, J., Son, K., Kim, S., Jeon, N. L. Biomimetic model of tumor microenvironment on microfluidic platform. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  57. Kakisis, J., Liapis, C., Sumpio, B. Effects of cyclic strain on vascular cells. Endothelium. 11 (1), 17-28 (2004).
  58. Charoenpanich, A., et al. Cyclic tensile strain enhances osteogenesis and angiogenesis in mesenchymal stem cells from osteoporotic donors. Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 67-78 (2014).
  59. Narimiya, T., et al. Orthodontic tensile strain induces angiogenesis via type IV collagen degradation by matrix metalloproteinase. Journal of Periodontal Research. 52 (5), (2017).

Tags

Bioengineering Problem 170 neovascularisering mikrofluidics shear stress mikromiljø transendothelial flow 3D-kultur
Mikrofluidisk model til at efterligne indledende hændelse af Neovascularization
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, P., Zhang, X., Liu, X., Wang,… More

Zhao, P., Zhang, X., Liu, X., Wang, L., Su, H., Wang, L., Zhang, D., Deng, X., Fan, Y. Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization. J. Vis. Exp. (170), e62003, doi:10.3791/62003 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter