Summary
Her præsenterer vi en reproducerbar intensivafdelingsorienteret endotoksinmodel hos rotter.
Abstract
Sepsis og septisk shock er fortsat den hyppigste dødsårsag på intensivafdelinger. På trods af betydelige forbedringer i sepsisstyring varierer dødeligheden stadig mellem 20 og 30%. Der er et presserende behov for nye behandlingsmetoder for at reducere sepsisrelateret multiorgansvigt og død. Robuste dyremodeller giver mulighed for en eller flere behandlingsmetoder samt for at teste deres virkning på fysiologiske og molekylære parametre. I denne artikel præsenteres en simpel dyremodel.
For det første induceres generel anæstesi hos dyr enten ved brug af flygtig eller ved intraperitoneal anæstesi. Efter placering af et intravenøst kateter (halevene), trakeostomi og indsættelse af et intraarterielt kateter (halearterie) startes mekanisk ventilation. Baseline værdier af gennemsnitlig arterielt blodtryk, arteriel iltmætning i blodet og puls registreres.
Injektionen af lipopolysaccharider (1 milligram/kg legemsvægt) opløst i fosfatbufret saltvand inducerer et stærkt og reproducerbart inflammatorisk respons via den vejafgiftslignende receptor 4. Væskekorrektioner samt anvendelse af noradrenalin udføres baseret på veletablerede protokoller.
Dyremodellen, der præsenteres i denne artikel, er let at lære og stærkt orienteret mod klinisk sepsisbehandling på en intensivafdeling med sedation, mekanisk ventilation, kontinuerlig blodtryksovervågning og gentagen blodprøveudtagning. Modellen er også pålidelig, hvilket giver mulighed for reproducerbare data med et begrænset antal dyr i overensstemmelse med 3R-principperne (reducer, erstat, forfine) for dyreforsøg. Mens dyreforsøg inden for sepsisforskning ikke let kan erstattes, giver gentagne målinger mulighed for en reduktion af dyr, og at holde septiske dyr anæstetiseret mindsker lidelsen.
Introduction
Sepsis og dens mere alvorlige form, septisk shock, er syndromer på grund af en infektion, hvilket resulterer i en overskridelse af inflammatorisk reaktion med frigivelse af cytokiner, hvilket fører til fysiologiske og biokemiske ændringer med et undertrykt immunforsvar og dødelige resultater 1,2. Denne ubalancerede inflammatoriske reaktion resulterer i organdysfunktion og organsvigt i forskellige vitale organer som lunge, nyre og lever. Med 37%3 er sepsis en af de mest almindelige årsager til, at en patient bliver indlagt på en intensivafdeling (ICU). Dødeligheden af sepsis ligger i øjeblikket omkring 20-30%4. Tidlig og effektiv antibiotikabehandling er af største vigtighed5. Væske- og vasopressorgenoplivning skal installeres tidligt, bortset fra at behandlingen udelukkende er understøttende6.
Sepsis defineres som en dokumenteret eller mistænkt infektion med bakterier, svampe, vira eller parasitter, som ledsages af organdysfunktion. Septiske chokkriterier er opfyldt, når et yderligere kardiovaskulært sammenbrud, der ikke reagerer på væskebehandling alene, og et laktatniveau på mere end 2 millimole / liter er til stede2. Sepsis relateret organsvigt kan forekomme i ethvert organ, men er meget almindeligt i det kardiovaskulære system, hjernen, nyrerne, leveren og lungen. De fleste patienter, der lider af sepsis, kræver endotracheal intubation for at sikre patientens luftveje, for at beskytte mod aspiration og for at anvende positiv ende ekspiratorisk ventilation med en høj brøkdel af inspireret ilt for at forhindre eller overvinde hypoxi. For at tolerere et trakealrør og mekanisk ventilation kræver patienter normalt sedation.
Endotoksiner, såsom lipopolysaccharider (LPS) som en bestanddel af membranen af gramnegative bakterier, inducerer en stærk inflammatorisk reaktion via den vejafgiftslignende receptor (TLR) 47. Aktivering af en defineret vej sikrer en stabil inflammatorisk reaktion. Cytokiner som cytokininduceret neutrofilt kemotiltrækkende protein 1 (CINC-1), monocytkemotiltrækkende protein 1 (MCP-1) og interleukin 6 (IL-6) er kendt som prognostiske faktorer for sværhedsgrad og resultat i denne model8. Intravenøs LPS-applikation er blevet anvendt med succes til at studere forskellige aspekter af sepsis hos rotter 8,9.
Behandling af sepsis er stadig en udfordring, især på grund af manglen på prædiktive dyremodeller. Hvis endotoxæmi med aktivering af systemisk inflammation er en passende model til udvikling af farmakologiske terapier, kan diskuteres. Men med den velkendte LPS-inducerede TLR 4-vej kan der opnås vigtig viden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg i denne protokol blev godkendt af veterinærmyndighederne i kanton Zürich, Schweiz (godkendelsesnummer 134/2014 og ZH088/19). Desuden var alle trin, der blev udført i dette forsøg, i overensstemmelse med retningslinjerne for forsøg med dyr fra Swiss Academy of Medial Sciences (SAMS) og retningslinjer fra Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA).
1. Anæstesi induktion og dyreovervågning
- Opbevar wistarrotter med en vægt på 250-300 gram (g) i ventilerede bure under patogenfrie forhold. Sørg for en 12-12-timers lys/mørk cyklus ved en omgivelsestemperatur på 22 ± 1 °C og fri adgang til mad og vand.
- Inducere generel anæstesi enten ved flygtig induktion med isofluran (koncentration på 3-5%) i en anæstesiinduktionsboks i 30 sekunder (figur 1A) eller alternativt inducere anæstesi med en enkeltskudsinjektion af ketamin / xylazin (10/1 milligram (mg) pr. 100 g kropsvægt).
- Overfør dyret til en arbejdsplads og læg dyret på en varmemåtte gennem hele forsøget. Hold kropstemperaturen mellem 36,5 og 37 °C.
- Brug en næsekoge til at give ilt (600 ml / minut). Tilsæt isofluran 2-3%, hvis flygtig anæstesi blev valgt til anæstesi vedligeholdelse. Sørg for, at dyret spontant trækker vejret.
- Bekræft niveauet af anæstesi ved fraværet af tåklemmerefleksen inden installationen af trakeostomi og arterielle og venøse katetre.
- Kontroller en tilstrækkelig iltning ved overvågning af perifer iltmætning (normal iltmætning 98 - 100%).
- Brug en salve (vitamin A salve) til at beskytte øjnene.
- Sterile kirurgiske instrumenter og katetre forberedes på et sidebord som vist i figur 1B.
- Forbered desuden overvågning af tryk- og iltmætning som vist i figur 1C.
2. Intravenøs adgang
- Påfør en tourniquet ved rottens proksimale hale for at lette venøs adgang (figur 2A).
- Desinficere halen 3 gange med alkohol.
- Inducer et G26 intravenøst kateter i en af de to laterale haleårer.
BEMÆRK: Fra vores erfaring er det lettere at placere den intravenøse adgang ved den distale del af rottens hale, fordi venen her er placeret tættere på huden. Derudover er der i tilfælde af en mislykket kanylering plads nok til at bevæge sig i nærheden. - Undgå strengt luftindsprøjtning.
- Løsn turneringen efter placering af det intravenøse kateter.
- Fastgør det intravenøse kateter på plads med tape (figur 2B).
- Tilslut sprøjtepumper til den intravenøse adgang til kontinuerlig væske- og lægemiddelpåføring.
- Brug 3-vejs stophaner til bolusvæske, lægemiddelpåføring og venøs blodprøveudtagning.
3. Trakeostomi
- Barber dyrets forreste halsområde.
- Desinficere den barberede hud 3 gange med providone-jodopløsning.
- Udfør et ca. 2 cm langsgående snit ved hjælp af en skalpel (med et bladnummer 10).
- Træk huden tilbage med 2-0 silkesuturer.
- Forbered strubehovedet og luftrøret med kirurgisk saks (figur 3A).
- Sørg for at åbne luftrøret med kirurgisk mikrosaks ved den 3-5. trakeallås.
- Indsæt en steril trakeal kanyle i luftrøret. Pas på, indsæt ikke kanylen for dybt for at undgå ensidig ventilation.
- Fastgør kanylen på plads ved hjælp af en 2-0 silkesutur.
- Tilslut kanylen til en ventilator for tryk- eller volumenstyret ventilation (figur 3B).
4. Arteriel adgang
- Desinficere rottehalen 3 gange med povidon-jodopløsning.
- Skær huden med en skalpel (med et bladnummer 10) ca. 1 cm i længderetningen på den ventrale side.
- Pas på, skær ikke for dybt for at undgå en skade på halearterien.
- Brug et kirurgisk mikroskop til at udsætte arterien omhyggeligt. Skær fascia omkring arterien med kirurgisk mikrosaks.
- Ligate den distale del af arterien ved hjælp af en 6-0 silke sutur.
- Forbered en proksimal 6-0 silkesutur, men stram ikke silken (figur 4A).
- Indfør et G-26 kateter i arterien mellem den distale og proksimale silkesutur.
- Når kateteret er i arterien, strammes den proksimale silkesutur og fastgøres kateteret på plads (figur 4B).
- Tilslut kateteret til en tryktransducer for at give kontinuerlig arteriel trykmåling (normalt gennemsnitligt arterielt tryk: 60 - 100 mmHg) (figur 4C).
- Derudover skal du placere en 3-vejs stophane mellem kateteret, der er forbundet med tryktransduceren og G-26-kateteret til arteriel blodprøveudtagning.
5. Baselinemåling, sepsisinduktion og opfølgningsmålinger
- Når dyret nåede en stabil tilstand, injiceres LPS.
- Saml blodprøver, når en stabil tilstand er nået (normalt efter 15-30 minutter).
- Udskift væsketab fra blodprøver med Ringers opløsning i forholdet 1:4.
- For at fremkalde sepsis skal LPS injiceres som en bolus eller som en kontinuerlig LPS-applikation.
- Til boluspåføring injiceres 1 mg LPS/kg legemsvægt (kg) opløst i fosfatbufret saltvand (PBS) i en koncentration på 1 mg/ml.
- Til kontinuerlig påføring injiceres 300 μg LPS/kg/time under hele forsøget ved hjælp af en sprøjtepumpe (stamopløsning af LPS: 1 mg/ml i PBS).
- Undgå luftinjektion til enhver tid for at forhindre luftemboli.
- Definer væskeudskiftningsprotokoller, vasokonstriktorpåføringsprotokoller og abortkriterier (for eksempel hypotension defineret som et gennemsnitligt arterielt blodtryk under 50 mmHg i mere end 30 minutter på trods af væskeudskiftning), før du opretter eksperimentet.
BEMÆRK: Vi foreslår en kontinuerlig infusion af Ringers opløsning med en hastighed på 10 ml / kg / time. - Træk enhver kontinuerlig administration af væsker (f.eks. til kontinuerlig LPS-anvendelse) fra den infunderede mængde, således at resultaterne er sammenlignelige med kontrolgruppernes.
BEMÆRK: Ved forsøgets afslutning og inden høst af organer som lever, nyre eller milt til yderligere analyser såsom histologisk eller biokemisk undersøgelse kan dyr aflives ved et snit af den ringere cava-vene. Den anbefalede metode til aflivning er at bringe dyrene til et kirurgisk anæstesiplan inden snit af den ringere vena cava og injektion af iskold saltvand i venstre hjerte, især hvis inflammatoriske markører i organer skal vurderes. Sørg for at overholde de juridiske krav og lokale retningslinjer. For at verificere sepsisrelateret organsvigt kan pro-apoptosemarkør som caspase-3 analyseres såvel som α1-mikroglobulin for at verificere rørformet skade i nyrerne. Den organspecifikke analyse af markører som CINC-1, MCP-1 og IL-6 kan også give information om det organspecifikke inflammatoriske respons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det præsenterede system giver mulighed for endotoxæmi med hæmodynamisk stabile dyr som rapporteret tidligere9. Mens det gennemsnitlige arterielle tryk forbliver stabilt hos dyr med og uden LPS-stimulering udvikler LPS-behandlede dyr egenskaber ved sepsis, såsom et negativt baseoverskud og en stærk inflammatorisk reaktion målt ved plasmacytokinter (6 timer efter påføring), såsom CINC-1 (867 ng / ml), MCP-1 (5027 ng / ml) og IL-6 (867 ng / ml) 8, Figur 5.
Figur 1: Klargøring af udstyr: Anæstesiinduktionsboks og næsecone til anæstesi/iltpåføring (A). Sterilt materiale, der skal forberedes inden operationen: 26G intravenøse katetre, en skalpel med et blad nummer 10, buede tang, lige tang, 1 nåleholder, 2-0 og 6-0 silkebånd, q-spidser, kirurgiske scisorer, kirurgiske mikrosnit (B). Overvågningsudstyr: Anæstesiovervågning med tryktransducer og en mætning af perifer iltningssensor (SpO2) til kontinuerlig overvågning (C). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Venøs adgang: En tourniquet påføres den proksimale rottehale (A). Den venøse adgang skal indføres ved den distale del af halen og fastgøres på plads (B). Luftemboli bør strengt undgås. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Trakeostomi: Strubehovedet og luftrøret fremstilles direkte ved hjælp af kirurgisk saks og udsættes ved hjælp af 2-0 silkesuturer (A). Efter åbning af luftrøret ved hjælp af kirurgisk mikrosaks ved den 3-5. trakeallås introduceres en trakealkanyle, fastgøres på plads og tilsluttes en ventilator (B) Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Arteriel adgang: Efter kirurgisk eksponering af halearterien ved hjælp af en skalpel og kirurgisk mikrosaks strammes en distal silke 6-0 ligatur, og der fremstilles en proksimal ligatur (A). Efter indsættelse af G-26-kateteret i arterien fastgøres det på plads (B). Det arterielle kateter giver mulighed for gentagen blodprøveudtagning samt for kontinuerlig blodtryksovervågning (C). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Repræsentative resultater: Mens dyr forbliver hæmodynamisk stabile i LPS såvel som i sham-gruppen (A), udvikler de egenskaber ved endotoxæmi, såsom et negativt baseoverskud (B) og øgede inflammatoriske mediatorer såsom cytokininduceret neutrofilt kemotiltrækkende protein 1 (CINC-1) (C), monocytkemoattrækkende protein 1 (MCP-1) (D) og interleukin 6 (IL-6) (E). Figuren er gengivet med tilladelse fra Wolters Kluwer Health Inc., Beck-Schimmer et al., Eur J Anaesthesiol 2017; 34:764-7759. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her giver mulighed for en meget reproducerbar, men alligevel enkel at lære sepsismodel, som kan tilpasses i henhold til forskningsspørgsmålet. Væsentlige in vivo-data, der henviser til organfunktion såsom puls, blodtryk og perifer arteriel iltmætning, kan indsamles kontinuerligt, og blodprøveudtagning kan udføres gentagne gange under hele forsøget. Derudover kan ændringer med hensyn til væskeudskiftningsprotokoller og vasopressorunderstøttelse installeres. På grund af dyrenes hæmodynamiske stabilitet kan forsøg udføres over flere timer, som tidligere rapporteret8.
Det skal påpeges, at der skal vælges en passende sepsis-model for at besvare et specifikt forskningsspørgsmål10,11. Alle sepsismodeller har deres fordele, men også deres ulemper. I den aktuelle artikel præsenteres en endotoxæmimodel, som inducerer en stærk, men steril betændelse. Nøgleegenskaber ved sepsis, såsom udvikling af et stærkt inflammatorisk respons12, endoteldysfunktion og skade13 og multiorgansvigt14 er til stede. Den præsenterede model er derfor i overensstemmelse med den tidligere offentliggjorte definition af sepsismodeller hos dyr ved "International Expert Consensus for Pre-Clinical Sepsis Studies"15. Andre nøgleelementer kan være anderledes end i bakteriel sepsis. LPS-bolusapplikationen inducerer for eksempel et hypodynamisk kardiovaskulært respons16, hvilket ikke svarer til det hyperdynamiske respons, der observeres i human sepsis. Sidstnævnte kan dog induceres af en kontinuerlig LPS-infusion som også foreslået i den nuværende artikel16. Det skal tages i betragtning, at LPS kun repræsenterer ét toksin og kan være for forenklet for visse forskningsspørgsmål - på den anden side øger forenkling reproducerbarheden af dataene. Et andet kendetegn ved endotoxæmimodeller er et andet cytokinrespons sammenlignet med bakteriemodeller - endotoxæmi inducerer højere, men alligevel kortere varige cytokinforhøjelser10. Selvom modellen muliggør gentagne målinger over flere timer, er trakeostomien ikke ideel til overlevelsesforsøg. I tilfælde af overlevelsesforsøg kan tracheal intubation eller spontan vejrtrækning via en maske foretrækkes.
Tre fundamentalt forskellige klasser af sepsismodeller anvendes i øjeblikket i laboratoriesepsisforskning: toksæmimodeller (f.eks. LPS), bakterielle infektionsmodeller (f.eks. Intravenøs Escherichia coli) og værtsbarriereforstyrrelsesmodeller (f.eks. Cecal ligation og punktering, CLP)17. Selvom toksæmimodeller med LPS blev foreslået som en uhensigtsmæssig model til replikation af human sepsis15, skal det understreges, at karakteristika ved disse grundlæggende klasser af sepsismodeller er blevet beskrevet detaljeret 8,12,13,14 og blevet kritisk gennemgået i en nylig artikel 17.
Der er ikke noget endeligt svar på, hvad humane dyreforsøg er, men den mest sunde fornuft er 3R-princippet, efter deres definition bør dyreforsøg reduceres, erstattes og raffineres18. Mens det i sepsisforskning er vanskeligt at erstatte dyreforsøg, kan gentagen blodprøveudtagning og kontinuerlige målinger af vitale data reducere antallet af dyr, der er nødvendige. Desuden forfiner det forsøgsopstillingen at holde septiske dyr anæsteteret, da dyrenes lidelser mindskes.
Sammenfattende præsenterer vi en velkarakteristisk og reproducerbar model af endotoxæmi, en indstilling svarende til en intensivafdeling med mulighed for at generere en høj datatæthed og samtidig begrænse dyrebyrden. Derudover kan denne model let ændres afhængigt af det forskningsspørgsmål, der skal besvares.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter med hensyn til den præsenterede undersøgelse. Martin Schläpfer har indsendt et patent for at afbøde de negative virkninger af kirurgi og/eller anæstesi for patienter, der bruger medicinske gasser, især ilt (O2) og kuldioxid (CO2). Han har modtaget ubegrænsede forskningsbevillinger fra Sedana Medical, Sverige, og fra Roche, Schweiz, der ikke er relateret til dette arbejde.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Beatrice Beck-Schimmer (MD) og Erik Schadde (MD) for deres kritiske undersøgelse og deres værdifulde bidrag til dette manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-0 silk sutures | Ethicon, Sommerville, NJ | K833 | Standard surgical |
| 26 intravenous catheter | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 391349 | Standard anesthesia equipment |
| 6-0 LOOK black braided silk | Surgical Specalities Corporation, Wyomissing, PA | SP114 | Standard surgical |
| Alaris Syringe Pump | Bencton Dickinson | ||
| Betadine | Mundipharma, Basel, Switzerland | 7.68034E+12 | GTIN-number |
| Curved fine tips microforceps | World precision instruments (WPI), Sarasota, FL | 504513 | Facilitates vascular preparation |
| Fine tips microforceps | World precision instruments (WPI), Sarasota, FL | 501976 | Tips need to be polished regularly |
| Infinity Delta XL Anesthesia monitoring | Draeger, Lübeck, Germany | ||
| Isoflurane, 250 mL bottles | Attane, Piramal, Mumbai, India | LDNI 22098 | Standard vet. equipment |
| Ketamine (Ketalar) | Pfitzer, New York, NY | ||
| Lipopolysaccharide (LPS) from Escherichia coli, serotype 055:B5 | Sigma, Buchs, Switzerland | ||
| Q-tips small | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | EH11.1 | Standard surgical |
| Ringerfundin | Bbraun, Melsungen, Germany | ||
| Tec-3 Isofluorane Vaporizer | Ohmeda, GE-Healthcare, Chicago, IL | not available anymore | Standard vet. equipment |
| Xylazine (Xylazin Streuli) | Streuli AG, Uznach, Switzerland |
References
- Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. The pathophysiology and treatment of sepsis. New England Journal of Medicine. 348 (2), 138-150 (2003).
- Singer, M., et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). Journal of the American Medical Association. 315 (8), 801-810 (2016).
- Vincent, J. L., et al. Assessment of the worldwide burden of critical illness: the intensive care over nations (ICON) audit. Lancet Respiratory Medicine. 2 (5), 380-386 (2014).
- Fleischmann, C., et al. Assessment of Global Incidence and Mortality of Hospital-treated Sepsis. Current Estimates and Limitations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 259-272 (2016).
- Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Critical Care Medicine. 34 (6), 1589-1596 (2006).
- Gotts, J. E., Matthay, M. A. Sepsis: pathophysiology and clinical management. British Medical Journal. 353, (2016).
- Akira, S., Takeda, K.
- Urner, M., et al. Insight into the beneficial immunomodulatory mechanism of the sevoflurane metabolite hexafluoro-2-propanol in a rat model of endotoxaemia. Clinical and Experimental Immunology. 181 (3), 468-479 (2015).
- Beck-Schimmer, B., et al. Which Anesthesia Regimen Is Best to Reduce Morbidity and Mortality in Lung Surgery?: A Multicenter Randomized Controlled Trial. Anesthesiology. 125 (2), 313-321 (2016).
- Deitch, E. A. Animal models of sepsis and shock: a review and lessons learned. Shock. 9 (1), 1-11 (1998).
- Buras, J. A., Holzmann, B., Sitkovsky, M. Animal models of sepsis: setting the stage. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (10), 854-865 (2005).
- Perretti, M., Duncan, G. S., Flower, R. J., Peers, S. H. Serum corticosterone, interleukin-1 and tumour necrosis factor in rat experimental endotoxaemia: comparison between Lewis and Wistar strains. British Journal of Pharmacology. 110 (2), 868-874 (1993).
- Marechal, X., et al. Endothelial glycocalyx damage during endotoxemia coincides with microcirculatory dysfunction and vascular oxidative stress. Shock. 29 (5), 572-576 (2008).
- Thiemermann, C., Ruetten, H., Wu, C. C., Vane, J. R. The multiple organ dysfunction syndrome caused by endotoxin in the rat: attenuation of liver dysfunction by inhibitors of nitric oxide synthase. British Journal of Pharmacology. 116 (7), 2845-2851 (1995).
- Osuchowski, M. F., et al. Minimum quality threshold in pre-clinical sepsis studies (MQTiPSS): an international expert consensus initiative for improvement of animal modeling in sepsis. Intensive Care Medicine Experimental. 6 (1), 26 (2018).
- Fink, M. P., Heard, S. O. Laboratory models of sepsis and septic shock. Journal of Surgical Research. 49 (2), 186-196 (1990).
- Buras, J. A., Holzmann, B., Sitkovsky, M. Animal models of sepsis: Setting the stage. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (10), 854-865 (2005).
- Balls, M. The principles of humane experimental technique: timeless insights and unheeded warnings. Altex-Alternatives to Animal Experimentation. 27 (2), 144-148 (2010).
