Summary
Her præsenterer vi en enkel metode til adskillelse af follikulære celler og oocytter i zebrafisk æggestokkene follikler, som vil lette undersøgelser af æggestokkene udvikling i zebrafisk.
Abstract
Zebrafisk er blevet en ideel model til at studere æggestokkenes udvikling af hvirveldyr. Follikel er den grundlæggende enhed af æggestokken, som består af oocytter og omgivende follikulære celler. Det er vigtigt at adskille både follikulære celler og oocytter til forskellige forskningsformål, såsom til primærkultur af follikulære celler, analyse af genekspression, oocytmodning og in vitro-befrugtning osv. Den konventionelle metode bruger pincet til at adskille begge rum, hvilket er besværligt, tidskrævende og har stor skade på oocyten. Her har vi etableret en enkel metode til at adskille begge rum ved hjælp af en trukket glas kapillær. Under et stereomikroskop kan oocytter og follikulære celler let adskilles ved pipetter i en trukket fin glaskapillær (diameteren afhænger af follikeldiameteren). Sammenlignet med den konventionelle metode har denne nye metode høj effektivitet i adskillelsen af både oocytter og follikulære celler og har lav skade på oocytterne. Endnu vigtigere er det, at denne metode kan anvendes på tidlige follikler, herunder på præ-vitellogenesis-fasen. Således kan denne enkle metode bruges til at adskille follikulære celler og oocytter af zebrafisk.
Introduction
Zebrafisk er en vigtig modelorganisme til undersøgelse af hvirveldyrudvikling og fysiologi. Zebrafisken kan tjene som en god model til at studere de molekylære mekanismer i æggestokkenes udvikling1,2,3. Mange funktioner i æggestokkene udvikling er meget bevaret under udviklingen fra fisk til pattedyr1,2. Svarende til de andre hvirveldyr, zebrafisk voksne har asynkrone æggestokke, der indeholder æggestokkene follikler af alle udviklingsstadier4. Follikel er det grundlæggende reproduktive element i æggestokken. Follikel består af oocyt, der er omgivet af et eller flere lag af somatiske celler kaldet follikulære celler. Udviklingen af follikler afhænger af den tovejskommunikation mellem oocytter og follikulære celler5. Det er vigtigt at adskille follikulære celler og oocytter fra æggestokkene follikler til forskellige forskningsformål såsom follikulær celle primære kultur, genekspression analyse, oocyt modning, og in vitro befrugtning.
Traditionelle adskillelsesmetoder omfatter mekanisk adskillelse ved tang og enzymatisk fordøjelse6,7,8,9,10. Men den mekaniske adskillelse med pincet er tidskrævende og besværlig. Det vil også forårsage den store skade på oocyten under adskillelsen. Selvom enzymfordøjelsesmetoden er enkel at betjene og kræver kort tid, skal behandlingstiden og enzymkoncentrationen valideres, og integriteten og overlevelsesraten for de isolerede oocytter er ikke ideel. Derfor har vi etableret en enkel metode til at adskille begge rum i forskellige udviklingsstadier ved hjælp af trukket glas kapillær rør.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de procedurer, der udføres i fiskeforsøg, er i overensstemmelse med reglerne fra Animal Experimentation Ethics Committee of Northwest Normal University.
1. Præparater
- Dyr
- Brug voksne kvindelige zebrafisk med en kropslængde på 4-6 cm.
BEMÆRK: Vi brugte zebrafisk fra et lokalt marked. - Hav zebrafisken i et cirkuleret vandsystem med en 14 timers lys og 10 timers mørk cyklus ved ca. 28 °C.
- Foder fisk to gange dagligt med nyklækkede saltlage rejer.
- Brug voksne kvindelige zebrafisk med en kropslængde på 4-6 cm.
- Trukket glas kapillær
- Brug en 15 cm glaskapillær og læg hovedet i en alkoholbrænder for at opvarme den. Hold den ene ende af glas kapillær i hånden og hold den anden ende med pincet.
- Efter opvarmning 5-10 sekunder bliver glasset på ilden af alkoholbrænder rødt og blødt. Stræk hovedet af glasset kapillær med pincet til at gøre kapillær åbning med den nødvendige diameter.
BEMÆRK: Diameteren afhænger af follikeldiametre: prævitellogen (PV; ca. 0,30 mm i diameter), tidlig vitellogen (EV; ca. 0,40 mm i diameter), midvitellogen (MV; ca. 0,50 mm i diameter), sen vitellogen (LV; ca. 0,60 mm i diameter) og fuldvoksen, men umoden (FG; ca. 0,65 mm i diameter). - Stræk åbningen af glaskapillær til den passende diameter, hvilket er lidt mindre på størrelse med adskilte follikler. Glasset kapillær med en åbning meget større end størrelsen af æggestokkene follikler kan ikke udføre adskillelse, men de meget mindre ville bryde folliklerne under adskillelse. Øv strækningen af glaskapillæren flere gange.
BEMÆRK: Opvarmningstiden afhænger af størrelsen af glaskapillær. Stræk ikke glaskapillæren direkte på ilden af alkoholbrænder. Det vil bryde glasset kapillær. - Skær glaskapillæren med en ampulskærer og bryd glaskapillæren med pincet for at opnå et glat snit.
BEMÆRK: En skarp eller brudt åbning af glaskapillæren ville beskadige folliklerne. - Brug et 30 cm plastrør til at indsætte en 1 mL pipettespids med et filterelement i den ene ende, sæt den trukket glaskapillær i enden af pipetten, og tilslut en 200 μL pipettespids i en anden ende.
2. Adskillelse af zebrafisk oocytter og follikulære celler på forskellige stadier
- Dissektion af zebrafisk æggestokken
- Fyld en isspand til 4/5 fuld med gylleis og tilsæt tilstrækkeligt fiskevand til at lade gylleis flyde. Vent 2-5 minutter, kontroller vandtemperaturen, og sørg for, at temperaturen er mellem 2-4 °C.
- Bedøve voksne kvinder ved at placere fisk i isvandet i mindst 2-5 minutter, indtil fisk stopper gill bevægelse. Halshugge fisken ved at skære rygmarven ved hjælp af en skarp saks for at sikre døden.
- Placer fisken på dissekerepladen med pincet.
- Brug dissekering saks til at skære som følger. Disseker fra cloaca til gællerne langs midten af maven. Klip fra bagsiden af cloaca. Klip fra den forreste spids til den dorsale side. Fjern forsigtigt huden og musklerne på den ene side af kroppen. Udsæt de indre organer og tag hele æggestokken med pincet.
- Placer straks æggestokkene forsigtigt i en 100 mm kulturret, der indeholder 60% Leibovitz's L-15 (L-15) medium.
- Isolering af æggestokkene follikler
BEMÆRK: Det iscenesættelsessystem, vi har vedtaget, er baseret på den oprindelige definition af Selman et al.4.- Isoler follikler af forskellige stadier manuelt ved hjælp af et par fine pincet som beskrevet tidligere8.
- Grupper æggestokkene follikler i følgende faser: PV, EV, MV, LV og FG faser.
- Adskillelse af follikulære celler og oocyt fra æggestokkene follikler
- Sæt æggestokkene follikler på forskellige stadier i en ren Petri parabol indeholder 60% L-15 medium.
- Brug den trukket glas kapillær fra trin 1,2, suge folliklerne ind i glasset kapillær 2-3 cm og blæse dem ud.
BEMÆRK: Når glaskapillærernes åbningsdiameter er passende, kan folliklen adskilles fra oocyten ved indånding én gang.- Hvis follikulære cellelag er knyttet til oocyten fast, gentag 2-3 gange for at opnå en fuldstændig adskillelse. Undgå flere forsøg på at tvinge en follikel gennem en mindre kapillær, hvilket ville skade hårsækken.
BEMÆRK: Under indånding og udblæsning falder follikulærlaget af og adskiller sig fra oocyten, og til sidst adskilles follikulære celler og denuded oocytter (Figur 1).
- Hvis follikulære cellelag er knyttet til oocyten fast, gentag 2-3 gange for at opnå en fuldstændig adskillelse. Undgå flere forsøg på at tvinge en follikel gennem en mindre kapillær, hvilket ville skade hårsækken.
- Pool denuded men intakte oocytter og indsamle de overlevende denuded oocytter for yderligere assays.
- At undersøge, om follikulære celler blev adskilt fra intakte follikler, plette de intakte follikler og adskilt oocytter med 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- Prøverne fikseres i 4% bufferparaformaldehyd ved stuetemperatur (RT) i 1 time. Vask flere gange af PBS.
- Pletten af DAPI på RT i 30 min. Vasket flere gange med PBS. Se og fotografere med et fluorescensmikroskop (f.eks. Leica DFC7000 T).
- For at bekræfte den færdige adskillelse skal de intakte follikler og adskilte oocytter fastgøres i 4% bufferparaformaldehyd natten over ved 4 °C og indeholder intissuefrysningsmedium (f.eks. Leica) ved -25 °C.
- Skær de faste væv på en mikrotomi, og monter på glasrutsjebaner.
- Vask sektionerne i PBS og visualiser cellekernerne med DAPI. Se og fotografere på et fluorescensmikroskop.
3. In vitro-modning (IVM) og in vitro-befrugtning (IVF)
BEMÆRK: Proceduren for IVM af IVF blev fulgt som beskrevet tidligere med mindre ændring 11,12,13.
- Forbered frisk modning medium (+ DHP medium) før æggestokkene dissektion fra voksne zebrafisk kvinde. For at forberede det friske modningsmedium tilsættes 9 mL Leibovitz's L-15 medium, pH 9,0, til 15 mL koniske rør. Der tilsættes 10 μL 17α-20β-dihydroxy-4 pregnen-3-one (DHP) (5 mg/mL), 490 μL dH2O og 500 μL 10% kvægserumalbumin (BSA).
- Forbered Hanks løsning og E3-løsning på forhånd. Forbered Hanks' løsning som beskrevet af Baars et al.14. Forbered E3 medium: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2,0,33 mM MgSO4og 1-5% Methylenblåt.
- Udfør dissektion af zebrafisk æggestokke og isolering af æggestokkene follikler som i trin 2.
- Saml fuldvoksne fase follikler og bruge som umodne oocytter. For hver voksen hun zebrafisk kan mindst 150-200 fuldvoksne fase follikler isoleres. Vælg de intakte og sunde follikler til IVM.
- Inkuber de fuldvoksne fasesække i +DHP-medium i 12-brønds plader, og kontroller regelmæssigt for at sikre, at oocytterne forbliver intakte. Fjern eventuelle lysing oocytter med en Pasteur pipette.
BEMÆRK: Under oocytmodningen bliver oocytterne gradvist gennemskinnelige. Et flertal af oocytterne bliver gennemskinnelige efter behandling af DHP i 2 timer. Dette kan observeres under et dissekerende mikroskop med transmitteret lysoptik. - De yderste follikulære celler fjernes fra hver modnet oocyt som beskrevet i trin 2.3.
- Overfør de denuded oocytter til en petriskål med et par dråber kulturmedium og fortsæt til befrugtning.
- Den friske sædopløsning fremstilles ved hjælp af testikler, der er dissekeret fra mindst tre hanner i 500 μL af Hanks' opløsning. Sæt sædopløsningen på is, hvor den kan holde sin styrke af befrugtning i op til 2-3 timer.
- Der tilsættes 100 μL sædopløsning til denuded og modnede oocytter på en petriskål. Tilsæt forsigtigt sædopløsningen blandt æggene, og hvirvle sæd og æg sammen ved hjælp af en pipettespids.
- Tilsæt straks 1 ml E3 medium opløsning for at aktivere æggene og igen forsigtigt hvirvle æg og sæd ved hjælp af en pipettespids.
- Efter ca. 1 minut efter befrugtning (mpf) skal pladen oversvømmes med E3 medium opløsning. Fuld chorion ekspansion kan observeres inden for 10-15 mpf.
- Mellem 35-45 mpf skal du vælge de embryoner, der gennemgår symmetrisk kavalergang i 2-cellefasen, og som derfor befrugtes. Fjern embryoner, der ikke gennemgår cellespaltning.
- Lad embryonerne udvikle sig i petriskålen ved 28 °C med en grænse på 80 embryoner pr. 10 cm plade. Se og fotografere embryoets udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne metode kan bruges til at adskille follikulære celler og oocytter på forskellige stadier af æggestokkene follikel udvikling i zebrafisk. Figur 1 viser adskillelsen af zebrafisk oocytter og follikulære celler fra æggestokkene ved hjælp af et kapillærglasrør (figur 1). For at undersøge, om follikulærcellerne var adskilt fra intakte follikler, blev de intakte follikler og adskilte oocytter fra forskellige stadier af follikler fra PV-fasen til FG-fasen farvet med DAPI (50 μg/mL) ved 37 °C i 30 minutter. Kernen i follikulære celler kan farves af DAPI. Det blå signal fra DAPI blev observeret i intakte follikler, men ikke denuded oocytter (Figur 2). Dette indikerer, at follikelens oocytter og follikulære celler kan adskilles rent ved hjælp af denne metode. For yderligere at bekræfte den klare adskillelse blev de intakte follikler og adskilte oocytter skåret i de histologiske sektioner. DAPI-farvningsresultater viste, at follikulære celler klart blev fjernet i denuded oocytter (figur 3). Alle disse resultater tyder på, at denne metode kan bruges til at adskille follikulære celler og oocytter i forskellige stadier follikler af zebrafisk.
Denne metode kan bruges til at studere oocytmodningen af zebrafisk. For at studere den tovejskommunikation mellem oocytter og follikulære celler under oocytmodningen skal de denuded oocytter fremstilles til forskellige assays. Ved hjælp af en trukket glas kapillær, denuded oocytter adskilt fra fuldvoksne fase zebrafisk follikler viste sig at gennemgå den spontane oocyt modning uden nogen behandling efter 4 timers inkubation, normalt mindst 30% adskilt oocytter overlevede og satsen for modenhed af disse overlevede oocytter kunne være op til 80% (Figur 4). Disse modne oocytter kunne gennemgå den fulde chorion ekspansion efter placering i vandet, hvilket tyder på, at follikulære celler blev helt fjernet (Figur 4). Således kan denne metode bruges til at opnå denuded oocytter til at studere oocytmodningen af zebrafisk.
Denne metode kan bruges til IVF i zebrafisk. In vitro modning (IVM) metoder er blevet veletableret i zebrafisk. Ved hjælp af disse metoder kan de fuldt dyrkede fase follikler induceres til modnet fase11,12,13,15,16. For yderligere at udføre in vitro-befrugtning (IVF) skal follikulærlaget af modne follikler stadig fjernes manuelt. Her blev IVM af zebrafisk induceret af behandling af DHP. Follikulært lag af modnet follikler blev fjernet af en kapillær glasrør. Disse defolliculated oocytter kunne befrugtes og udvikles til rugefasen (Figur 5). Resultatet tyder på, at denne metode kan bruges til IVF i zebrafisk. Normalt kan omkring 10% af sunde embryoner fås fra de modne oocytter.
Figur 1. Adskillelse af follikulære celler og oocytter fra zebrafisk æggestokkene follikler ved hjælp af en trukket glas kapillær. 1) Morfologien af den intakte follikel på FG-stadium. 2) Indånding af den intakte follikel i den trukket glas kapillær. 3) Follikulær celle er løsrevet fra oocyt, når hårsækken er blæst ud fra den trukket glas kapillær. 4) Vellykket adskillelse af follikulære celler og oocyt. Skalalinjer: 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Morfologien af intakte follikler og denuded oocytter adskilt fra forskellige stadier af follikler efter DAPI farvning. De intakte follikler og adskilt oocytter fra forskellige stadier af follikler fra PV fase til FG fase blev plettet af DAPI. De blå signaler fra DAPI blev observeret i intakte follikler, men ikke denuded oocyt. Skalalinjer: 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Histologiske dele af intakte follikler og isolerede oocytter efter DAPI farvning. Cellekerner af follikulære celler blev visualiseret med DAPI farvning. Det blå signal kan observeres. Follikulære celler blev tydeligt fjernet i denuded oocytter. Skalalinjer: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Modningen og fuld chorion udvidelse af denuded oocytter adskilt fra fuldvoksne fase follikler ved hjælp af en trukket glas kapillær. (A)Morfologien af intakte follikler ved fuldvoksne follikler. (B) De denuded oocytter adskilt fra fuldvoksne fase follikler kan gennemgå spontan oocyt modning uden nogen behandling efter 4 timers inkubation. (C) De modne oocytter kan gennemgå fuld chorion ekspansion efter aktivering af vand. Skalalinje: 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Morfologien af tidlige embryoner opnået ved IVM og IVF. IVM blev fremkaldt ved behandling af DHP (5 μg/mL) i 2 timer. Efter IVM blev follikulære celler fjernet fra de modnede oocytter af en trukket glaskapillær. De modne oocytter blev befrugtet af IVF. Udviklingen af embryoner på forskellige stadier blev set og fotograferet. Skalastænger: (A-I) 200 μm, (J) 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver her en ny metode til enkel og hurtig adskillelse af follikulære celler og oocytter fra zebrafisk æggestokkene follikler. Denne metode har flere fordele i forhold til den konventionelle metode. Primær blandt disse er den stærkt øgede lethed af adskillelse med høj effektivitet og effektivitet, da kun en enkelt og ekstern manipulation er påkrævet. Dette punkt øger anvendeligheden for forskere, der ikke er gode til mikroskopisk anatomi. Ifølge vores erfaring kan man med succes adskille follikulære celler og oocytter fra en fuldt udvokset fase follikel inden for 5-10 s ved hjælp af glaskapillæren. Der kræves dog mindst 30-60 s for at gøre denne adskillelse ved hjælp af pincet. Endnu vigtigere, normalt mindst 20% af denuded oocytter adskilt af glasset kapillær kan gennemgå spontan oocyt modning. I modsætning hertil kan ikke ud over 1% af de denuded oocytter gennemgå spontan oocyt modning ved hjælp af pincet. Effektiviteten af den nye metode ved hjælp af s glaskapillær er således bedre end den tidligere etablerede metode ved hjælp af pincet. For det andet, denne metode kan bruges til at adskille follikulært cellede og oocyted af æggestokkene follikler på tidlige udviklingsmæssige stadier såsom PV, EV, og MV faser. En sådan adskillelse kan ikke udføres på tidlige stadier af follikler ved hjælp af de nuværende metoder.
Der er også et par begrænsninger ved hjælp af denne metode. For eksempel er den passende diameter af glaskapillæråbning afgørende for adskillelse af follikulære celler og oocytter i denne metode. En åbning meget større eller mindre end størrelsen af æggestokkene follikler ville føre til svigt af adskillelse. Således bør åbningen diameter af glas kapillær justeres afhængigt af størrelsen af æggestokkene follikler, som kræver en vis praksis.
Adskillelse af follikulære celler og oocytter har flere applikationer i at studere æggestokkene udvikling. Follikulære celler og oocytter på forskellige stadier af æggestokkene follikler opnået ved denne metode kan bruges til at analysere genekspression. Follikulære celler adskilt kan bruges til primær cellekultur. Denuded oocytter adskilt er nyttige til at undersøge krydstale mellem follikulære celler og oocytter, og levere en god model for at studere oocyt modning. Desuden kan denne metode bruges til at fjerne follikulære celler i nogle assays såsom in vitro oocyt modning eller in vitro befrugtning. Tilgængeligheden af en metode, der i høj grad øger lethed og hastighed adskillelse bør lette en bredere udnyttelse af zebrafisk æggestokkene follikler i det langsigtede mål om at forstå de snørklede af æggestokkene udvikling. Derudover er strukturen af æggestokkenes follikler ens blandt forskellige fiskearter; Derfor er det interessant at teste, om denne metode også kan anvendes i andre fisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette forskningsarbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China [32060170, 31601205 og 31560334], gæsteforskerprojekt støttet af China Scholarship Council og fonden for State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology [2020FB05].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 17α,20β-DHP | Cayman | 16146-5 (5 mg) | |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Ampoule cutter | AS ONE | 5-124-22 1 bag (100 pieces) | |
| Anhydrous Na2HPO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Brine shrimp | Hongjie | 250 g | |
| CaCl2 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Culture dish | Biosharp | BS-90-D (10PCS/PK) | |
| DAPI | Solarbio | S2110 (25mL) | |
| Dissecting Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Dissection forcep | VETUS | HRC30 | |
| Dissection scissor | Kefu | 160 mm | |
| Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M205C | |
| Glass capillary | IWAKI | IK-PAS-5P (200 pcs/PACK) | |
| Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 (1 mg) | |
| KCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| KH2PO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 41300-039 (10×1L) | |
| MgSO4•7H2O | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Micropipette tips | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| NaHCO3 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Penicilia-streptomycia | Gibco | #15140122 (100 mL) | |
| Stereomicroscope | ZEISS | Discover.v20 |
References
- Clelland, E., Peng, C.
- Ge, W. Intrafollicular paracrine communication in the zebrafish ovary: the state of the art of an emerging model for the study of vertebrate folliculogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 237, 1-10 (2005).
- Li, J., Ge, W. Zebrafish as a model for studying ovarian development: Recent advances from targeted gene knockout studies. Molecular and Cellular Endocrinology. 507, 1-19 (2020).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. Journal of Morphology. 218, 203-224 (1993).
- Matzuk, M. M., Burns, K. H., Viveiros, M. M., Eppig, J. J. Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation. Science. 296, 2178-2180 (2002).
- Liu, L., Ge, W. Growth differentiation factor 9 and its spatiotemporal expression and regulation in the zebrafish ovary. Biology of Reproduction. 76, 294-302 (2007).
- Zhou, R., Tsang, A. H., Lau, S. W., Ge, W. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptors in the zebrafish ovary: evidence for potentially dual roles of PACAP in controlling final oocyte maturation. Biology of Reproduction. 85, 615-625 (2011).
- Li, J., Liu, Z., Wang, D., Cheng, C. H. K. Insulin-like growth factor 3 is involved in oocyte maturation in zebrafish. Biology of Reproduction. 84, 476-486 (2011).
- Pang, Y., Thomas, P. Role of G protein-coupled estrogen receptor 1, GPER, in inhibition of oocyte maturation by endogenous estrogens in zebrafish. Developmental Biology. 342, 194-206 (2010).
- Peyton, C., Thomas, P. Involvement of epidermal growth factor receptor signaling in estrogen inhibition of oocyte maturation mediated through the G protein-coupled estrogen receptor (Gper) in zebrafish (Danio rerio). Biology of Reproduction. 85, 42-50 (2011).
- Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., F, P. Functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (122), e55213 (2017).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics. 242, 44-52 (2013).
- Seki, S., et al. Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes. Reproduction. 135, 285-292 (2008).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments. , e54492 (2016).
- Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Scientific Reports. 6, 34555 (2016).
- Li, J., Bai, L., Liu, Z., Wang, W. Dual roles of PDE9a in meiotic maturation of zebrafish oocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2020).
