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Biology

मच्छर इलेक्ट्रोएंटेनोग्राफी के लिए एक चरण-दर-चरण गाइड

Published: March 10, 2021 doi: 10.3791/62042
Automatic Translation
1
1Department of Biochemistry; The Fralin Life Science Institute; The Global Change Center; Department of Entomology and the Center for Emerging Zoonotic and Arthropod-Borne Pathogens, Virginia Polytechnic Institute and State University

Summary

वर्तमान लेख में मादा और पुरुष दोनों सहित मच्छरों के कई जेनेरा में सफल और कम शोर इलेक्ट्रोएंटेनोग्राम के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल का विवरण दिया गया है।

Abstract

मादा मच्छर पृथ्वी पर सबसे घातक जानवर हैं, जो रक्त-भोजन प्राप्त करते समय प्रसारित रोगजनकों के कारण हर साल 1 मिलियन से अधिक लोगों के जीवन का दावा करते हैं। खिलाने के लिए एक मेजबान का पता लगाने के लिए, मच्छर दृश्य, यांत्रिक, थर्मल और घ्राण सहित संवेदी संकेतों की एक विस्तृत श्रृंखला पर भरोसा करते हैं। अध्ययन में इलेक्ट्रोएंटेनोग्राफी (ईएजी) नामक तकनीक का विवरण दिया गया है, जो शोधकर्ताओं को यह आकलन करने की अनुमति देता है कि क्या मच्छर एकाग्रता-निर्भर तरीके से व्यक्तिगत रसायनों और रसायनों के मिश्रणों का पता लगा सकते हैं। गैस-क्रोमैटोग्राफी (जीसी-ईएजी) के साथ युग्मित होने पर, यह तकनीक एंटीना को एक पूर्ण हेडस्पेस / जटिल मिश्रण में उजागर करने की अनुमति देती है और यह निर्धारित करती है कि रुचि के नमूने में मौजूद कौन से रसायन, मच्छर का पता लगा सकते हैं। यह मेजबान शरीर की गंध के साथ-साथ पौधे के पुष्प गुलदस्ते या अन्य पारिस्थितिक रूप से प्रासंगिक गंध (जैसे, अंडाकार साइटों की गंध) पर लागू होता है। यहां, हमने एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है जो तैयारी प्रतिक्रिया समय की लंबी अवधि की अनुमति देता है और एडीज, क्यूलेक्स, एनोफिलीज और टॉक्सोरिंचाइट मच्छरों सहित कई जेनेरा से मादा और पुरुष दोनों मच्छरों पर लागू होता है। चूंकि सामान्य रूप से मच्छर-मेजबान इंटरैक्शन और मच्छर जीव विज्ञान में ओल्फैक्शन एक प्रमुख भूमिका निभाता है, ईएजी और जीसी-ईएजी नई रोग वेक्टर नियंत्रण रणनीतियों (जैसे, चारा) के विकास के लिए रुचि के यौगिकों को प्रकट कर सकते हैं। व्यवहार परख के साथ पूरक, प्रत्येक रसायन की वैलेंस (जैसे, आकर्षित, विकर्षक) निर्धारित की जा सकती है।

Introduction

मच्छर पृथ्वी पर सबसे घातक जीव हैं, जो प्रति वर्ष एक मिलियन से अधिक लोगों के जीवन का दावा करते हैं और दुनिया की आधी से अधिक आबादी को उन रोगजनकों के संपर्क में आने के जोखिम में डालते हैं जो वे1 को काटते हैं। ये कीड़े संकेतों की एक विस्तृत श्रृंखला (यानी, थर्मल, दृश्य, यांत्रिक, घ्राण, श्रवण) पर भरोसा करते हैं ताकि संभोग और अंडाकार के लिए (पौधे और जानवर दोनों) पर फ़ीड करने के लिए एक मेजबान का पता लगाया जा सके, साथ ही लार्वा और वयस्क दोनों चरणों 2,3 पर शिकारियों से बचा जा सके। इन इंद्रियों के बीच, ओल्फैक्शन उपर्युक्त व्यवहारों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, विशेष रूप से गंध अणुओं 2,3 के मध्यम से लंबी दूरी का पता लगाने के लिए। एक मेजबान या एक अंडाकार साइट द्वारा उत्सर्जित गंध का पता विभिन्न विशिष्ट घ्राण रिसेप्टर्स (जैसे, जीआरएस, ओआर, आईआर) द्वारा लगाया जाता है जो मच्छर पैल्प्स प्रोबोसिस, टारसी और एंटीना 2,3 पर स्थित होते हैं।

चूंकि ओल्फैक्शन उनके मेजबान-मांग (पौधे और जानवर), संभोग और अंडाकार व्यवहार का एक प्रमुख घटक है, इस प्रकार यह मच्छर नियंत्रण के लिए नए उपकरण विकसित करने के लिए अध्ययन करने के लिए एक आदर्श लक्ष्य का गठन करताहै। विकर्षक (जैसे, डीईईटी, आईआर 3535, पिकारिडिन) और चारा (जैसे, बीजी सेंटिनल मानव लालच) पर शोधबेहद विपुल है, लेकिन मच्छर नियंत्रण में वर्तमान चुनौतियों (जैसे, कीटनाशक प्रतिरोध, आक्रामक प्रजातियां) के कारण, मच्छर जीव विज्ञान द्वारा सूचित नए कुशल नियंत्रण विधियों को विकसित करना आवश्यक है।

मच्छरों में यौगिकों या यौगिकों के मिश्रण की जैव सक्रियता का आकलन करने के लिए कई तकनीकों (जैसे, ओल्फैक्टोमीटर, लैंडिंग परख, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी) का उपयोग किया गया है। उनमें से, इलेक्ट्रोएंटेनोग्राफी (या इलेक्ट्रोएंटेनोग्राम (ईएजी)) का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि मच्छर एंटीना द्वारा गंध का पता लगाया जाता है या नहीं। यह तकनीक शुरू में श्नाइडर6 द्वारा विकसित की गई थी और तब से कई अलग-अलग कीट जेनेरा में उपयोग की गई है, जिसमें पतंगे 7,8,9, भौंरा 10,11, मधुमक्खियां12,13 और फल मक्खियां14,15 शामिल हैं। इलेक्ट्रोएंटेनोग्राफी को विभिन्न प्रोटोकॉल का उपयोग करके भी नियोजित किया गया है, जिसमें मच्छरों में एकल या एकाधिक एंटीना शामिल हैं 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25।

मच्छर अपेक्षाकृत छोटे और नाजुक कीड़े होते हैं जिनमें पतले एंटीना होते हैं। पतंगों या भौंरों जैसे बड़े कीड़ों पर ईएजी करना अपेक्षाकृत आसान है क्योंकि उनके बड़े आकार और मोटे एंटीना हैं, मच्छरों में ईएजी का संचालन चुनौतीपूर्ण हो सकता है। विशेष रूप से, एक अच्छा सिग्नल-टू-शोर अनुपात बनाए रखना और एक स्थायी उत्तरदायी तैयारी डेटा प्रजनन क्षमता और विश्वसनीयता के लिए दो प्रमुख आवश्यकताएं हैं।

यहां प्रस्तावित कम शोर ईएजी के लिए चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका सीधे इन सीमाओं के समाधान प्रदान करती है और इस प्रोटोकॉल को एडीज, एनोफिलीज, क्यूलेक्स और टॉक्सोरिंचाइट्स सहित विभिन्न जेनेरा से कई मच्छर प्रजातियों पर लागू करती है, और मादा और पुरुषों दोनों के लिए तकनीक का वर्णन करती है। इलेक्ट्रोएंटेनोग्राफी बायोएक्टिव यौगिकों को स्क्रीन और निर्धारित करने का एक त्वरित लेकिन विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है जिसे तब व्यवहार परख के साथ वैलेंस निर्धारित किए जाने के बाद चारा विकास में लाभ उठाया जा सकता है।

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Protocol

1. खारा घोल तैयार करना

  1. पहले से ही खारा तैयार करें और फ्रिज में स्टोर करें।
  2. समाधान तैयार करने के लिए बेयेनबाक और मासिया26 का पालन करें।
    नोट: एमएम में खारा नुस्खा: 150.0 NaCl, 25.0 HEPES, 5.0 ग्लूकोज, 3.4 KCl, 1.8 NaHCO3, 1.7 CaCl2, और 1.0 MgCl2. पीएच को 1 एम एनएओएच के साथ 7.1 में समायोजित किया जाता है। शेल्फ भंडारण बढ़ाने के लिए इस समय तैयारी में ग्लूकोज या सुक्रोज न जोड़ें। ईएजी (लगभग 50 एमएल प्रति प्रयोग) चलाने से ठीक पहले नमकीन में आवश्यक मात्रा जोड़ें।

2. गंध तैयारी और भंडारण

  1. 1.5 एमएल एम्बर शीशियों में पहले से गंध वाले मिश्रण या एकल यौगिक कमजोर पड़ने को तैयार करें और यौगिक क्षरण को रोकने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: सांद्रता आयोजित किए जाने वाले परीक्षण पर निर्भर करेगी। 0.1% या 1% का उपयोग आमतौर पर यह निर्धारित करने के लिए किया जाता है कि किसी यौगिक का पता लगाया जा सकता है या नहीं। खुराक-प्रतिक्रिया वक्र के लिए, किसी दिए गए रसायन के सीरियल कमजोर पड़ने तैयार करें और उन्हें सबसे कम से उच्चतम सांद्रता तक परीक्षण करें।
  2. परीक्षण किए गए रसायन की घुलनशीलता के आधार पर पानी, इथेनॉल, हेक्सेन, पैराफिन तेल, या खनिज तेल में कमजोर पड़ने की तैयारी करें।
  3. प्रयोग के लिए एक विलायक नियंत्रण (केवल विलायक युक्त शीशी) तैयार करना सुनिश्चित करें।
  4. प्रयोग शुरू करने से 30 मिनट पहले फ्रीजर से गंधकों को हटा दें ताकि उन्हें पिघलने की अनुमति मिल सके। रसायन और विलायक को अच्छी तरह से मिलाने के लिए उपयोग करने से पहले प्रत्येक शीशी भंवर।
  5. पाइपेट 10 μL घोल फ़िल्टर पेपर (0.5 सेमी x 2 सेमी) के एक टुकड़े पर एक लेबल ग्लास सिरिंज या पाश्चर पिपेट के अंदर लोड किया गया है।
  6. संदूषण को रोकने के लिए प्रत्येक यौगिक या मिश्रण को एक विशिष्ट पाश्चर पिपेट या सिरिंज में लोड करें।
    नोट: प्रयोग शुरू करने से पहले 10 मिनट लोड करें ताकि गंध सिरिंज में फैल सके लेकिन गिरावट को रोकने के लिए अधिक समय तक नहीं। प्रयोग शुरू होने से पहले रसायन के अच्छे प्रसार की अनुमति देने के लिए पाश्चर पिपेट या सिरिंज को इस समय कैप्ड रहने दें।
  7. प्रत्येक ईएजी रन के बाद, फिल्टर पेपर के टुकड़े का निपटान करें और इसे एक नए के साथ बदलें ताकि कागज को अधिक सोक होने और सुई रुकावट का खतरा न हो। सुइयों को नियमित रूप से बदलें (हर 10 रन)।

3. मच्छरों का पृथक्करण

  1. प्रयोगों के दिन मच्छरों को अलग करें।
  2. प्रयोगों के दिन कम से कम 6 दिन पुराने मच्छरों का उपयोग करें ताकि इस संभावना को बढ़ाया जा सके कि मादाओं को मेजबान से संबंधित गंधकों के प्रति उनकी प्रतिक्रिया को बढ़ाने के लिए जोड़ा जाता है।
    नोट: परियोजना के आधार पर परीक्षण के समय मच्छर की उम्र समायोजित करें। शारीरिक स्थिति की जांच करें और सामंजस्य स्थापित करें (उदाहरण के लिए, रक्त-खिलाया गया, भूखा, पहले कभी नहीं खिलाया गया, आदि)।
  3. मच्छरों को उनकी प्रेरणा और संवेदनशीलता बढ़ाने के लिए 12 घंटे तक भूखा रखें (यानी, चीनी तक पहुंच नहीं)।
  4. मच्छर के कंटेनर को फ्रिज (4 डिग्री सेल्सियस) में रखें जब तक कि वे उड़ना बंद न कर दें ताकि व्यक्तियों को आसानी से बल के साथ एकल कप में स्थानांतरित किया जा सके।
    नोट: ठंड के लिए उच्च सहनशीलता वाली प्रजातियों को सीओ2 फ्लाई पैड का उपयोग करके नीचे रखा जा सकता है। सुनिश्चित करें कि मच्छर निर्जलीकरण को रोकने के लिए लंबे समय तक इस पर नहीं रहते हैं, जिससे मच्छर ईएजी तैयारी की प्रतिक्रिया कम हो जाएगी।
  5. ईएजी करने से पहले कमरे के तापमान पर एकल मच्छरों वाले कप को स्टोर करें और किसी भी मच्छर को छोड़ दें जो दिन के दौरान उपयोग नहीं किया जा सकता है।

4. इलेक्ट्रोड धारक और केशिका तैयारी

  1. केशिका खींचना, तैयारी और भंडारण
    1. फिलामेंट्स (आईडी: 0.78 मिमी, ओ.डी: 1 मिमी) के साथ बोरोसिलिकेट केशिकाओं का उपयोग करें। उपकरण 27 के आधार पर उन्हेंखींचें।
      नोट: खींची गई केशिकाओं को पेट्री डिश में स्टोर करें। पेट्री डिश को मोम या बिना सजाए मॉडलिंग मिट्टी के टुकड़ों पर रखें ताकि उन्हें हिलने और टूटने से रोका जा सके।
    2. ईएजी प्रयोग चलाने से पहले, माइक्रोस्कोप के नीचे बल की एक जोड़ी के साथ धीरे से 2 केशिकाओं की नोक को तोड़ें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि गर्दन (बड़ी केशिका) या एंटीना (छोटी केशिका) की युक्तियों को फिट करने के लिए एक दूसरे की तुलना में थोड़ा बड़ा है। सुनिश्चित करें कि केशिका दीवार पर कोई दरार मौजूद नहीं होने के साथ कट साफ है। इसके लिए धैर्य और अभ्यास की आवश्यकता होती है।
    3. यदि अभी भी बरकरार है, तो प्रयोग समाप्त होने के बाद डी-आयनित (डीआई) पानी से कुल्ला करने के बाद इन केशिकाओं का पुन: उपयोग करें। नोक के खिलाफ धीरे से सफाई पोंछा लगाकर अतिरिक्त पानी को हटा दें। वापस भंडारण पेट्री डिश में रखें। यदि टिप टेढ़ी है, तो केशिका को त्याग दें।
  2. इलेक्ट्रोड धारक और केशिका माउंटिंग
    1. विभिन्न रंगों के लैब टेप के टुकड़ों का उपयोग करके दो इलेक्ट्रोड धारकों को "रिकॉर्डिंग" और "संदर्भ" के रूप में लेबल करें। यह मच्छर के सिर और इलेक्ट्रोड के बढ़ने का मार्गदर्शन करने में मदद करेगा।
    2. सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड धारक अंदर स्पष्ट हैं और कोई बोरोसिलिकेट मलबा मौजूद नहीं है।
    3. क्लोराइडाइजेशन: इलेक्ट्रोड धारकों के चांदी के तारों को शुद्ध ब्लीच में लगभग 5 मिनट के लिए भिगोदें। तार चमकदार हल्के भूरे से मैट गहरे भूरे रंग में बदल जाते हैं।
    4. रबर स्टॉपर को ढीला करें और 20 ग्राम सुई का उपयोग करके 10% खारा घोल के साथ केशिका के अंदर भरें।
    5. सिरिंज का उपयोग करके खारा घोल के साथ बोरोसिलिकेट केशिका भरें। सुनिश्चित करें कि न तो इलेक्ट्रोड धारक और न ही खींची गई केशिका में कोई बुलबुले मौजूद हैं।
      नोट: केशिका में बुलबुले होने की संभावना को कम करने के लिए, सुई को धीरे से बाहर खींचते हुए केशिका में खारा धक्का देते रहें और फिलामेंट के साथ केशिकाओं का उपयोग करें। 1: 3 इलेक्ट्रोड जेल और खारा समाधान से बने समाधान के साथ केशिकाओं को लोड करना संभव है। यह खारा के वाष्पीकरण को रोकने में मदद कर सकता है और ईएजी सीखते और अभ्यास करते समय विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है, क्योंकि प्रयोगकर्ता को विभिन्न चरणों को पूरा करने के लिए अधिक समय की आवश्यकता होगी।
    6. भिगोने के बाद, चांदी के तारों को डीआई पानी से धो लें और उन्हें दो केशिकाओं में डालें। सुनिश्चित करें कि तार की नोक केशिका के सिरे से 1 मिमी से कम है। सुनिश्चित करें कि केशिका बिना टूटे इलेक्ट्रोड धारक के अंदर रबर की अंगूठी से गुजरती है। धीरे से रबर स्टॉपर को कस लें। सत्यापित करें कि कोई हवा के बुलबुले मौजूद नहीं हैं।
    7. संदर्भ इलेक्ट्रोड धारक (गर्दन) पर व्यापक उद्घाटन के साथ केशिका का उपयोग करें, और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड धारक (एंटीना) पर छोटे उद्घाटन का उपयोग करें।
    8. दो माउंटेड इलेक्ट्रोड धारकों को गीले सफाई पोंछे पर छोड़ दें ताकि सिर को माउंट करने के लिए तैयार होने तक नोक को सूखने से रोका जा सके।

5. ईएजी रिग तैयारी (चित्रा 1)

  1. सुनिश्चित करें कि एयर टेबल ऊपर है, एयरलाइन में कोई रुकावट नहीं है। सुनिश्चित करें कि प्रयोग के बीच में इसे बदलने से बचने के लिए चिकित्सा हवा का टैंक अभी भी भरा हुआ है। सुनिश्चित करें कि ह्यूमिडिफायर में बुलबुले हैं।
  2. वायु और पल्स वितरण प्रणाली
    1. मेडिकल एयर गैस टैंक चालू करें।
    2. दो फ्लोमीटर के स्तर की जांच करें।
      नोट: पूरे प्रयोग के दौरान तैयारी को स्नान करने वाले मुख्य वायु प्रवाह को नियंत्रित करने वाला फ्लोमीटर 140 एमएल / मिनट पर होना चाहिए और गंध पल्स से संबंधित दूसरा 15 एमएल / मिनट पढ़ना चाहिए।
  3. यदि जीसी-ईएडी कर रहे हैं, तो मशीन, गैस टैंक चालू करें और फ़ाइल / विधि बनाएं / लोड करें।
  4. कंप्यूटर, सॉफ़्टवेयर अनुप्रयोग, वाल्व बिजली आपूर्ति चालू करें, और सॉफ़्टवेयर अनुप्रयोग के काम करने के लिए इंटरनेट कनेक्शन सत्यापित करें।
    1. सॉफ्टवेयर एप्लिकेशन: पल्स देने के लिए एक छोटी स्क्रिप्ट लिखी जा सकती है।
    2. ईएजी सॉफ्टवेयर: किसी भी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
    3. सॉफ्टवेयर में मापदंडों को लागू करें (जैसे, एम्पलीफायर, रिकॉर्डिंग की अवधि, दालों की अवधि, आदि)।
  5. यह सत्यापित करने के लिए एक नियंत्रण पल्स वितरित करें कि दालों को वितरित करने वाला वाल्व कार्यात्मक है।
  6. 5.2 V पर बिजली की आपूर्ति सेट करें। एम्पलीफायर पैरामीटर सत्यापित करें।
    नोट: यहां प्रस्तुत डेटा के लिए उपयोग किए जाने वाले पैरामीटर हैं: 0.1 हर्ट्ज का कम कट-ऑफ फ़िल्टर; 500 हर्ट्ज का उच्च कट-ऑफ फिल्टर; x100 का लाभ।

6. मच्छर के सिर की तैयारी और माउंटिंग (चित्रा 2)

  1. बर्फ पर एक एल्यूमीनियम प्लेट रखें और इसके ऊपर गीले सफाई पोंछे का एक टुकड़ा रखें।
  2. एक कोने में इलेक्ट्रोड जेल का एक छोटा सा गुड़िया डालें।
  3. बर्फ पर एक मच्छर का कप रखें और मच्छर को कुछ मिनट के लिए ठंडा होने दें, या जब तक कि यह उड़ना बंद न हो जाए।
    नोट: कुछ प्रजातियां ठंड प्रतिरोधी हैं और नीचे जाने के लिए सीओ2 फ्लाई पैड पर त्वरित संज्ञाहरण की आवश्यकता हो सकती है। कम से कम मच्छर भी इस पर रहता है, उतना ही बेहतर है।
  4. मच्छर को उसकी पीठ पर रखें और माइक्रो कैंची के साथ प्रत्येक एंटीना (अंतिम खंड का केवल एक छोटा सा हिस्सा) की नोक को क्लिप करें।
  5. मच्छर को इलेक्ट्रोड जेल डोलोप के बगल में खींचने के लिए बल का उपयोग करें और प्रत्येक एंटीना की नोक को जेल में धीरे से डुबोएं। इलेक्ट्रोड जेल में सिर्फ अंतिम खंड से अधिक डुबोने से बचें।
  6. फोर्सप्स का उपयोग करके, मच्छर एंटीना को एक-दूसरे के बगल में रखते हुए बाहर खींचें। उन्हें जेल से एक साथ बाहर आने दें। सुनिश्चित करें कि एंटीना सफाई पोंछे की सतह को नहीं छूते हैं, या वे अलग हो सकते हैं।
  7. मच्छर को इसके किनारे रखें और माइक्रो कैंची या रेजर ब्लेड का उपयोग करके सिर काट लें।
    नोट: एक बार सिर कट जाने के बाद, रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए अगले चरणों और ईएजी रिग पर जल्दी से आगे बढ़ें। तैयारी लगभग 30 मिनट के लिए उत्तरदायी होनी चाहिए।
  8. संदर्भ इलेक्ट्रोड लें और धीरे से जेल में नोक को गहरा करें। गर्दन के ऊतकों के संपर्क में रहें और सिर को उस पर चिपकने दें।
  9. इलेक्ट्रोड धारकों को ईएजी माइक्रोस्कोप के तहत स्थानांतरित करें और माइक्रोमैनिपुलेटर पर सिर (यानी, संदर्भ) इलेक्ट्रोड रखने के लिए माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखें। सुनिश्चित करें कि एंटीना केंद्र में हैं।
  10. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड को पकड़ो, इसे एंटीना युक्तियों के सामने रखें। माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करके युक्तियों के जितना संभव हो उतना करीब ले जाएं और संरेखित करें। माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की नोक को एंटीना की ओर ले जाएं।
  11. सम्मिलन के बाद उन्हें स्थानांतरित करने से रोकने के लिए युक्तियों को सम्मिलित करने से पहले दोनों इलेक्ट्रोड धारकों को एम्पलीफायर से कनेक्ट करें।
  12. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड में एंटीना युक्तियां डालें। सुनिश्चित करें कि वे सिर्फ खारा और इलेक्ट्रोड जेल से संपर्क करते हैं और केशिका के माध्यम से पारदर्शिता द्वारा दिखाई देते हैं। एंटीना "सक्शन प्रभाव" से अंदर जाता है।
  13. यदि आवश्यक हो, तो माइक्रोस्कोप के नीचे बल के साथ सिर और युक्तियों की स्थिति को समायोजित करें।
  14. एयरलाइन ट्यूबिंग को मच्छर के सिर की तैयारी (दूरी: 1 सेमी) के करीब रखें।
    नोट: यदि सिर गिर जाता है, तो विच्छेदन स्टेशन पर लौटें और सिर को फिर से माउंट करें या एक नया तैयार करें यदि यह खो गया है या यदि सिर काटे जाने के बाद 5 मिनट से अधिक समय हो गया है। केशिका और गर्दन / एंटीना के बीच एक अच्छा संबंध कम शोर और विश्वसनीय रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक है। आदर्श रूप से, एंटीना युक्तियां एक बार डालने के बाद रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के तार से 1 मिमी से कम पर होंगी।
  15. यदि उपयोग किया जाता है, तो प्रकाश स्रोत को बंद करें।
  16. मच्छर सिर तैयारी (दूरी: 20 सेमी) के पास वैक्यूम लाइन रखें और मुख्य एयरलाइन के साथ संरेखित करें।
    नोट: वैक्यूम उत्तेजना के बाद सिर की तैयारी के आसपास के रसायनों को हटाने में मदद करेगा, जिससे दालों को लागू करने के बाद ईएजी प्रतिक्रियाएं हो सकती हैं।

7. रिकॉर्डिंग

  1. एंटीना की युक्तियों के सम्मिलन के बाद, एम्पलीफायर और शोर रिड्यूसर चालू करें। बेसलाइन सिग्नल का निरीक्षण करें और सुनिश्चित करें कि यह शोर नहीं है।
    नोट: निरीक्षण करें कि क्या विद्युत संकेत में बड़े दोलन मौजूद हैं। सिग्नल साफ होने तक आवश्यकतानुसार सिर और एंटीना युक्तियों की स्थिति को समायोजित करें। फैराडे पिंजरे या एयर टेबल पर शोर का परिचय देने वाली किसी भी चीज़ को ग्राउंड करने के लिए मगरमच्छ क्लिप का उपयोग करें। आयाम में 0.01 एमवी से कम का बेसलाइन सिग्नल मिनट ईएजी प्रतिक्रियाओं का पता लगाने और भेदभाव करने के लिए आदर्श है।
  2. एक बार शोर का स्तर संतोषजनक हो जाने के बाद, एयरलाइन छेद में परीक्षण करने के लिए पहली गंध सिरिंज डालें।
  3. फैराडे पिंजरे को बंद करें। शोर को कम करने के लिए तैयारी के सामने न रहें।
  4. ईएजी सॉफ्टवेयर पर रिकॉर्ड पर क्लिक करें।
  5. सॉफ्टवेयर एप्लिकेशन का उपयोग करके पल्स (ओं) वितरित करें।
    नोट: प्रयोगों के आधार पर दालों की संख्या और अवधि अलग-अलग होगी। यहां, प्रति गंधक एकल 1 एस दालों का उपयोग किया गया है। ओडोरेंट्स को 45 सेकंड से अलग किया गया था।
  6. प्रयोगशाला नोटबुक में मच्छर एंटीना की प्रतिक्रिया पर ध्यान दें।
    नोट: यदि मच्छर एंटीना द्वारा गंधक का पता लगाया जाता है, तो सिग्नल में एक स्पष्ट विक्षेप देखा जाता है ( चित्रा 3 ए देखें)।
  7. अगली गंध या एकाग्रता के साथ आगे बढ़ें। जब तक खुराक-प्रतिक्रिया वक्र का प्रदर्शन नहीं किया जाता है, तब तक गंधकों की प्रस्तुति को यादृच्छिक बनाना न भूलें।
    नोट: प्रयोगों में एक नकारात्मक नियंत्रण और एक सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग किया जाना चाहिए। यह सुनिश्चित करेगा कि देखी गई प्रतिक्रियाएं वास्तव में घ्राण प्रतिक्रियाएं हैं और यांत्रिक या विद्युत शोर के कारण नहीं हैं।
  8. रिकॉर्डिंग के अंत में, यह सत्यापित करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण लागू करें कि एंटीना अभी भी उत्तरदायी हैं।
    नोट: 0.1% या 1% बेंजाल्डिहाइड का उपयोग करें क्योंकि अब तक परीक्षण की गई सभी मच्छर प्रजातियां इस यौगिक के प्रति उत्तरदायी रही हैं।
  9. अगले मच्छर की तैयारी के साथ आगे बढ़ें।

8. सफाई

  1. एम्पलीफायर, शोर कम करने वाले, एयरलाइन और कंप्यूटर को बंद करें।
  2. गंधकों को फ्रीजर में वापस करें।
  3. ग्लास सिरिंज से फिल्टर पेपर हटा दें और दीवारों पर अवशेष दिखाई देने पर 100% इथेनॉल से साफ करें। रात भर सफाई पोंछे पर सूखने दें।
  4. नमक के किसी भी संभावित निशान को हटाने के लिए इलेक्ट्रोड धारकों को डीआई पानी से साफ करें। सफाई पोंछे के एक टुकड़े के खिलाफ धीरे से लागू करके सुखाएं।
  5. मच्छर के अवशेषों को फ्रीजर में रखें और 24 घंटे बाद निपटाएं।
    नोट: संक्रमित मच्छरों के साथ काम करते समय, अपने संस्थान में सुरक्षा आवश्यकताओं का पालन करें।

9. डेटा विश्लेषण

  1. ईएजी प्रतिक्रियाओं को मैन्युअल रूप से या स्वचालित रूप से मापें।
    नोट: ईएजी आयाम (-एमवी) यहां मापा जाता है। औसत यदि प्रत्येक यौगिक के लिए कई दालें लागू की गई हैं। उपयोग किए गए सॉफ़्टवेयर के आधार पर, ईएजी को स्वचालित रूप से पता लगाया और मापा जा सकता है। हालांकि, प्रतिक्रिया के आकार को सत्यापित करने और संभावित कैरी-ओवर, विलंबित प्रतिक्रिया आदि का आकलन करने के लिए प्रत्येक प्रतिक्रिया का व्यक्तिगत रूप से निरीक्षण करना आवश्यक है। आदर्श ईएजी प्रतिक्रिया नाड़ी के साथ संरेखित होती है, एक स्पष्ट विक्षेप दिखाती है, और मच्छर की तैयारी के बीच दोहराने योग्य होती है (चित्रा 3)।
  2. न्यूनतम परिवर्तनशीलता, कम शोर संकेत और स्पष्ट प्रतिक्रियाओं को दिखाने के लिए कच्चे डेटा को प्रस्तुत करें (चित्रा 3 बी)।
    नोट: डेटा को सामान्यीकृत भी किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, जेड-स्कोर)। नकारात्मक नियंत्रण मूल्य (जैसे, खनिज तेल) (यानी, बेसलाइन) को प्रतिक्रिया से घटाया जा सकता है और यदि नहीं, तो आंकड़ों में प्रस्तुत किया जाना चाहिए। एक सकारात्मक नियंत्रण भी प्रस्तुत किया जाना चाहिए।
  3. किसी भी सांख्यिकी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण करें।

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Representative Results

इलेक्ट्रोएंटेनोग्राफी यह निर्धारित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है कि क्या कीट एंटीना द्वारा रसायनों के रासायनिक या मिश्रण का पता लगाया जाता है। इसका उपयोग एकाग्रता की क्रमिक वृद्धि (यानी, खुराक वक्र प्रतिक्रिया, चित्रा 4 बी) का उपयोग करके किसी दिए गए रसायन के लिए पहचान सीमा निर्धारित करने के लिए भी किया जा सकता है। इसके अलावा, मेजबान से संबंधित गंध29 की प्रतिक्रिया पर विकर्षक के प्रभावों का परीक्षण करना उपयोगी है।

ईएजी में हमेशा सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग किया जाना चाहिए। यहां, बेंजाल्डिहाइड का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था (चित्रा 3 बी, 3 सी, 4 ए)। यहयौगिक अब तक परीक्षण किए गए सभी मच्छर प्रजातियों में एंटीनल प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए पाया गया है। एक नकारात्मक नियंत्रण का भी उपयोग किया जाना चाहिए और इसमें रसायनों (जैसे, खनिज या पैराफिन तेल, हेक्सेन, आदि) को पतला करने के लिए उपयोग किए जाने वाले विलायक शामिल हो सकते हैं और प्रतिक्रिया प्राप्त नहीं करनी चाहिए (चित्रा 3 बी, 3 सी, 4 ए)।

दरअसल, ईएजी का संचालन करते समय, नियंत्रण लागू करते समय एक विक्षेपण पर ध्यान नहीं दिया जाना चाहिए (चित्रा 3 बी, 3 सी, 4 ए)। यदि एक प्रतिक्रिया देखी जाती है, तो या तो सिरिंज, विलायक नियंत्रण, और / या गंध रेखा दूषित होने की संभावना है। यदि ऐसा है, तो एक नया समाधान तैयार किया जाना चाहिए, सिरिंज को 100% इथेनॉल के साथ साफ किया जाना चाहिए और सूखना चाहिए और / या एयरलाइन को 100% इथेनॉल के साथ धोना और सुखाया जाना चाहिए। यदि चुना गया नियंत्रण एक प्रतिक्रिया (जैसे, इथेनॉल) प्राप्त करता है, तो नियंत्रण के लिए -एमवी में प्राप्त मूल्य को इथेनॉल के लिए प्राप्त मूल्य से घटाया जाना चाहिए और एंटीना पर परीक्षण किए गए रसायन के प्रभाव का आकलन करने के लिए संयुक्त रूप से परीक्षण किया जाना चाहिए।

मच्छर प्रजातियां विभिन्न यौगिकों के साथ-साथ उनकी प्रतिक्रिया के परिमाण में प्रतिक्रिया करने की उनकी क्षमता में भिन्न होती हैं। उदाहरण के लिए, टोक्सोरिंचाइट मच्छर एई एजिप्टी, एन स्टीफेंसी और सीएक्स क्विनक्वेफेसिएटस (चित्रा 3 सी, चित्रा 4 ए) की तुलना में बहुत बड़े ईएजी का उत्पादन करते हैं।

ईएजी में, दूसरी पल्स और निम्नलिखित आमतौर पर छोटे ईएजी प्रतिक्रियाओं का कारण बनते हैं। एक गंधक की प्रस्तुति निम्नलिखित की प्रतिक्रिया को भी प्रभावित कर सकती है, इसलिए गंधकों के एक पैनल का कुशलतापूर्वक परीक्षण करने के लिए गंध क्रम और कई परखों को यादृच्छिक बनाना महत्वपूर्ण है (जब तक कि खुराक-प्रतिक्रिया वक्र नहीं किया जाता है)। इसके अलावा, दालों (जैसे, 5 एस) और गंधकों (जैसे, 45 एस) प्रस्तुति को अलग करने से ईएजी प्रतिक्रियाओं को अनुकूलित करने में मदद मिलेगी।

परीक्षण किए गए रसायनों की अस्थिरता भिन्न होती है और घ्राण प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकती है और संभावित रूप से देरी से प्रतिक्रिया का कारण बन सकती है यदि परीक्षण किए गए रसायन में बहुत कम अस्थिरता है। परख को अनुकूलित करने के लिए ईएजी का संचालन करने से पहले रासायनिक अस्थिरता और घुलनशीलता ज्ञात होनी चाहिए। कमजोर पड़ने को तैयार करने के लिए उपयोग किए जाने वाले विलायक को भी सावधानीपूर्वक चुना जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, इथेनॉल, हेक्सेन, खनिज, या पैराफिन तेल)। इसके अलावा, सांद्रता को बुद्धिमानी से चुना जाना चाहिए और आदर्श रूप से पारिस्थितिक रूप से प्रासंगिक होना चाहिए। एक 1% या 0.1% एकाग्रता का उपयोग अक्सर किया जाता है लेकिन अपेक्षाकृत अधिक है और जरूरी नहीं कि कीड़े प्रकृति में क्या अनुभव कर सकते हैं। फिर भी, कुछ मामलों में अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता वाले यौगिकों को स्क्रीन करना उपयोगी है (उदाहरण के लिए, चारा विकास के लिए)। विकर्षकों को उनके व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एकाग्रता पर परीक्षण किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, डीईईटी आमतौर पर 40% एकाग्रता पर बेचा जाता है)।

यदि गैस क्रोमैटोग्राफी (यानी, जीसी-ईएडी) 25 के साथ युग्मित किया जाता है, तो प्रतिक्रिया प्राप्त करने वाले यौगिकों को जीसी-एमएस के साथ पहचाना जा सकता है और फिर विभिन्न सांद्रता में या ईएजी के साथ मिश्रण में व्यक्तिगत रूप से परीक्षण किया जा सकता है। यह उल्लेखनीय है कि परीक्षण किए गए रसायनों की वैलेंस को ईएजी के साथ निर्धारित नहीं किया जा सकता है। केवल एक पूरक व्यवहार प्रयोग (जैसे, ओल्फैक्टोमीटर, फीडिंग परख) यह आकलन कर सकता है कि एंटीना द्वारा पता लगाया गया रसायन आकर्षक, विकर्षक या मच्छर के लिए तटस्थ है या नहीं। अंत में, ईएजी प्रयोग केवल परिधीय तंत्रिका तंत्र की प्रतिक्रियाओं को दिखा रहे हैं।

Figure 1
चित्रा 1: इलेक्ट्रोएंटेनोग्राम सेटअप में शामिल हैं: ए) माइक्रोस्कोप: उपयोग किए जाने वाले माइक्रोस्कोप को प्रयोगकर्ता को रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड में मच्छर एंटीना युक्तियों को डालने की अनुमति देने की तैयारी को स्पष्ट रूप से देखने की अनुमति देनी चाहिए। बी) ठंडा प्रकाश दीपक: रिकॉर्डिंग शुरू होने पर दीपक को बंद कर दिया जाना चाहिए। सी) वैक्यूम लाइन: यह मच्छर के सिर की तैयारी के आसपास गंधकों के संचय के जोखिम को कम करता है, जिसके परिणामस्वरूप वास्तविक उत्तेजना से अलग एंटीनल प्रतिक्रियाएं हो सकती हैं। डी) माइक्रोमैनिपुलेटर्स (एक्स 2): ये बहुत अच्छे इलेक्ट्रोड धारक आंदोलनों की अनुमति देंगे, जो रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के केशिका में मच्छर एंटीना डालने के लिए आवश्यक है। ई) रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड धारक। च) संदर्भ इलेक्ट्रोड धारक। जी) हेड स्टेज: दोनों इलेक्ट्रोड को हेड स्टेज में प्लग किया जाता है जो बाद में एम्पलीफायर से जुड़ा होता है। एच) मुख्य एयरलाइन: एक निरंतर स्वच्छ वायु प्रवाह ने मच्छर के सिर को स्नान किया। प्रवाह दर को एक फ्लोमीटर द्वारा नियंत्रित किया जाता है। I) सोलनॉइड वाल्व और फ्लोमीटर से जुड़े गंध वितरण के लिए सिरिंज; जे) एयर टेबल: एयर टेबल शोर को कम करेगा। के) फैराडे पिंजरे: फैराडे पिंजरे बिजली के शोर को रोक देगा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: ईएजी रिकॉर्डिंग के लिए चरण-दर-चरण एडीज अल्बोपिक्टस मच्छर सिर तैयार करना। A) मादा मच्छर एक बर्फीली प्लेट पर अपनी पीठ पर यह सत्यापित करने के लिए कि दोनों एंटीना बरकरार हैं। बी) माइक्रो कैंची के साथ एंटीना छांटने का अंतिम खंड। सी) एंटीना इलेक्ट्रोड जेल में डूबे हुए हैं। डी) एंटीना उन्हें बाहर खींचने के बाद एक साथ चिपक जाते हैं। प्रत्येक एंटीना का केवल एक खंड इलेक्ट्रोड जेल में होना चाहिए। ई) मच्छर के सिर को काटना। एफ) संदर्भ इलेक्ट्रोड पर सिर लगाया गया। इसे ईएजी रिग में ले जाने के लिए पर्याप्त स्थिर होना चाहिए। A'-F'। पुरुष ईएजी के लिए ऊपर प्रस्तुत किए गए समान कदम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: मच्छर ईएजी और कच्चे ईएजी निशान का योजनाबद्ध। ए) ईएजी योजनाबद्ध (बाएं) और ईएजी प्रतिक्रिया (दाएं) की विशेषताएं। (बाएं) मच्छर के सिर को एक संदर्भ इलेक्ट्रोड और एक एम्पलीफायर से जुड़े रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के बीच रखा जाता है। एंटीना को एक निरंतर वायु प्रवाह में स्नान किया जाता है जिसमें गंधउत्तेजनाओं को स्पंदित किया जाता है। एक रसायन का पता लगाने से सिग्नल में एक विक्षेपण (एमवी में) होता है। (दाएं) रासायनिक पहचान से सेल डिपोलराइजेशन (डीपीआर) होता है, जिसके बाद बेसलाइन पर लौटने तक सेल रिपोलराइजेशन (आरपीआर) होता है। गंधक नाड़ी को ग्रे आयत द्वारा दर्शाया जाता है। लाल रेखा ईएजी प्रतिक्रिया के आयाम को इंगित करती है। बी) विनेडआर सॉफ्टवेयर का स्क्रीनशॉट एक क्यूलेक्स क्विनक्वेफेसिएटस मादा मच्छर के पूरे ईएजी रिकॉर्डिंग ट्रेस को उजागर करता है। शीर्ष: अनफ़िल्टर्ड (यानी, कच्चा) सिग्नल। मध्य: 1 एस गंध दालों को संख्याओं द्वारा इंगित किया जाता है। नीचे: फ़िल्टर किया गया (यानी, 1.5 हर्ट्ज कम पास) 3 गंधकों और एक नियंत्रण (खनिज तेल) को संकेत देता है। 1% 1-हेक्सानोल (1), 1% बेंजाल्डिहाइड (2), और 1% ब्यूटिरिक एसिड (3) के जवाब में विक्षेपण पर ध्यान दें। नकारात्मक नियंत्रण, खनिज तेल (4) के लिए प्रतिक्रिया की अनुपस्थिति पर ध्यान दें। सी) बाएं से दाएं: महिलाओं एडीज एजिप्टी, एनोफिलीज स्टीफेंसी, क्यूलेक्स क्विनक्वेफेसिएटस और टॉक्सोराइनचाइट्स रुटिलस सेप्टेनट्रिओनालिस में 1% बेंजाल्डिहाइड (ऊपर) और एक खनिज तेल नियंत्रण (नीचे) के लिए प्रतिनिधि ईएजी प्रतिक्रियाएं (एमवी में)। एक सेकंड की नाड़ी को ईएजी ट्रेस के ऊपर रंगीन आयत द्वारा दर्शाया जाता है। बेंजाल्डिहाइड के जवाब में बड़े विक्षेपण और खनिज तेल की प्रतिक्रिया की कमी पर ध्यान दें। इसके अलावा, टॉक्सोरिंचाइट्स रुटिलस सेप्टेंट्रिओनालिस में विभिन्न पैमाने पर ध्यान दें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: ईएजी परिणामों और उनके सांख्यिकीय विश्लेषणों का उदाहरण प्रतिनिधित्व। क्यूलेक्स क्विनक्वेफेसियाटस (एन = 8), एनोफिलीज स्टीफेंसी (एन = 10), एडीज एजिप्टी (एन = 8) और टॉक्सोरिंचाइट्स रुटिलस सेप्टेंट्रिओनालिस (एन = 7) महिलाओं की औसत ईएजी प्रतिक्रियाएं 1% हेक्सानोल (हरा), 1% ब्यूटिरिक एसिड (नारंगी), 1% बेंजाल्डिहाइड (पीला) और खनिज तेल (नीला)। 1-हेक्सानोल (बाएं) (एन = 9) और बेंजाल्डिहाइड (दाएं) (एन = 8) के लिए क्यूलेक्स क्विनक्वेफेसिएटस महिलाओं ईएजी खुराक-प्रतिक्रिया वक्र। पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं. त्रुटि पट्टियों के ऊपर दिए गए पत्र सांख्यिकीय अंतर (बोनफेरोनी सुधार के साथ जोड़ीवार विलकॉक्सन रैंक योग परीक्षण) को इंगित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

घ्राण मध्यस्थता व्यवहार कई कारकों से प्रभावित होते हैं, जिनमें शारीरिक (जैसे, उम्र, दिन का समय) और पर्यावरण (जैसे, तापमान, सापेक्ष आर्द्रता) शामिल हैं। इस प्रकार, ईएजी का संचालन करते समय, उन कीड़ों का उपयोग करना आवश्यक है जो एक ही शारीरिक स्थिति में हैं (यानी, उम्र की निगरानी, भूख, संभोग) 31 और निर्जलीकरण से बचने के लिए तैयारी के आसपास एक गर्म और आर्द्र वातावरण भी बनाए रखना है। 25 डिग्री सेल्सियस के आसपास का तापमान आदर्श है और मुख्य एयरलाइन के लिए 60% से 80% आर्द्रता है। यह मुख्य एयरलाइन सर्किट पर एक बबलर रखकर आसानी से प्राप्त किया जा सकता है।

इसके अलावा, कीट के जीव विज्ञान के लिए प्रासंगिक परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रत्येक प्रजाति की पारिस्थितिकी पर विचार करना महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, यदि एक निशाचर प्रजाति का उपयोग कर रहे हैं, तो उनकी व्यक्तिपरक रात के दौरान उनकी प्रतिक्रिया का परीक्षण करने के लिए उनके प्रकाश चक्र को प्रभावित करने पर विचार करें। दिन के विशिष्ट क्षणों (यानी, जब कीट सक्रिय होता है) पर ईएजी का संचालन करना भी महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, यदि एई एजिप्टी मच्छरों का उपयोग कर रहे हैं, तो इस प्रजाति की गतिविधि की चोटियों (यानी, दिन की शुरुआत और बाद में दोपहर) के दौरान प्रयोग करने पर विचार करें। फिर, प्रकाश चक्र को आसानी से जलवायु कक्षों या प्रकाश बक्से का उपयोग करके सुविधा के लिए स्थानांतरित किया जा सकता है, जिसमें प्रोग्राम करने योग्य टाइमर32 का उपयोग करके एक स्पष्ट प्रकाश कार्यक्रम होता है। इलर्ट्स एट अल.33 और कृष्णन एट अल.34 ने दिखाया है कि विशिष्ट गंधकों के प्रति संवेदनशीलता पूरे दिन बदलती रहती है। इस प्रकार, कीट की पारिस्थितिकी और जीव विज्ञान का एक अच्छा ज्ञान अधिक सटीक परिणाम प्राप्त करेगा।

शोर (या तो विद्युत या यांत्रिक) आसानी से ईएजी में पेश किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, ईएजी तैयारी की ओर हवा उड़ाने वाली एसी प्रणाली द्वारा यांत्रिक गड़बड़ी पैदा की जा सकती है। हम्बग के साथ विद्युत शोर को कम किया जा सकता है, लेकिन, यदि जारी रहता है, तो तत्वों को प्लग करके और मगरमच्छ क्लिप (चित्रा 3 बी) का उपयोग करके फैराडे पिंजरे में ग्राउंडिंग करके ट्रैक किया जा सकता है। यह तैयारी के आसपास मौजूद सभी तत्वों (यानी, माइक्रोस्कोप, लैंप, माइक्रोमैनिपुलेटर्स) पर लागू होता है। फैराडे पिंजरे में उपकरणों के कुछ टुकड़ों को रिकॉर्डिंग से पहले अनप्लग किया जाना चाहिए क्योंकि वे अभी भी विद्युत शोर (जैसे, ठंडे प्रकाश स्रोत) का उत्पादन कर सकते हैं या पिंजरे के बाहर रखे जा सकते हैं। एक अन्य प्रकार का "शोर" घ्राण प्रकृति का है। प्रयोगकर्ता को इत्र पहनने से बचना चाहिए या दृढ़ता से सुगंधित शैम्पू या डिटर्जेंट का उपयोग करना चाहिए। दरअसल, इनमें पाए जाने वाले कई यौगिकों का पता मच्छरों (जैसे, लिनालूल, सिट्रोनेल, गेरानिओल, यूजेनॉल) द्वारा लगाया जा सकता है और प्रयोगों के परिणामों में हस्तक्षेप और प्रभाव डाल सकता है। एयरलाइन, सिरिंज और इलेक्ट्रोड के अवांछित संदूषण को सीमित करने के लिए लैब कोट और दस्ताने पहनना भी आवश्यक है।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल में नर और मादा दोनों में सभी मच्छर प्रजातियों पर आसानी से लागू होने का लाभ है, जबकि तैयारी की दीर्घायु (> 30 मिनट) और तैयारी के बीच सीमित परिवर्तनशीलता के साथ। यह विधि ईएजी सिग्नल में बहुत कम शोर की ओर ले जाती है, जो बहुत कम सांद्रता पर रसायनों के परीक्षण की अनुमति देती है। एक बार विच्छेदन और बढ़ते कदमों में महारत हासिल करने के बाद, यह तकनीक अपेक्षाकृत कम समय में विश्वसनीय डेटा का उत्पादन कर सकती है, और सीधा डेटा विश्लेषण कर सकती है।

इलेक्ट्रोएंटेनोग्राफी केवल प्रयोगकर्ता को यह आकलन करने की अनुमति देती है कि मच्छर एक रसायन का पता लगा सकता है या नहीं। हालांकि, इस रसायन की वैलेंस निर्धारित करने के लिए, पूरक व्यवहार परख, जैसे कि ओल्फैक्टोमीटर परख, यह निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं किमच्छर नियंत्रण के लिए कुशल उपकरण विकसित करने के लिए एक विशिष्ट गंधक या मिश्रण आकर्षक, विकर्षक या तटस्थ है या नहीं।

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Disclosures

लेखक के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

मैं सहायक चर्चाओं के लिए डॉ क्लेमेंट विनौगर और डॉ जेफरी रिफेल का आभारी हूं। निम्नलिखित अभिकर्मकों को बीईआई रिसोर्सेज, एनआईएआईडी, एनआईएच के माध्यम से प्राप्त किया गया था: एनोफिलीज स्टीफेंसी, स्ट्रेन एसटीई 2, एमआरए -128, मार्क क्यू बेनेडिक्ट द्वारा योगदान दिया गया; एडीज एजिप्टी, स्ट्रेन रॉक, एमआरए -734, डेविड डब्ल्यू सेवरसन द्वारा योगदान दिया गया; क्यूलेक्स क्विनक्वेफेसिएटस, स्ट्रेन जेएचबी, अंडे, एनआर -43025। लेखक ने डॉ जेक तू, डॉ निशा दुग्गल, डॉ जेम्स वेगर और जेफरी मारानो को क्यूलेक्स क्विनक्वेफेसिएटस और एनोफिलीज स्टीफेंसी (स्ट्रेन: लिस्टन) मच्छर के अंडे प्रदान करने के लिए धन्यवाद दिया। एडीज अल्बोपिक्टस और टॉक्सोराइनचाइट्स रुटिलस सेप्टेंट्रिओनालिस न्यू रिवर वैली क्षेत्र (वीए, यूएसए) में लेखक द्वारा एकत्र किए गए क्षेत्र मच्छरों से प्राप्त होते हैं। इस काम को जैव रसायन विभाग और फ्रैलिन लाइफ साइंस इंस्टीट्यूट द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air table Clean Bench TMC https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess Noise reducer
Analog-to-digital board National Instruments BNC-2090A
Benchtop Flowbuddy Complete Genesee Scientific 59-122BC To anesthesize mosquitoes
Borosillicate glass capillary Sutter Instrument B100-78-10 To make the recording and references capillaries
Chemicals Sigma Aldrich Benzaldehyde: 418099-100 mL; Butyric acid: B103500-100mL; 1-Hexanol: 471402-100mL; Mineral oil: M8410-1L Chemicals used for the experiments presented here
CO2 Airgas or Praxair N/A To anesthesize mosquitoes
Cold Light Source Volpi NCL-150
Disposable syringes BD 1 mL (309628)  / 3 mL (309657)
Electrode cables World Precision Instruments 5371
Electrode gel salt free Parkerlabs 12-08-Spectra-360
Faraday cage TMC https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages Noise reducer
Flowmeters Bel-art 65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075) One of each
GCMS vials and caps Thermo-fisher scientific 2-SVWKA8-CPK To prepare odorant dilutions
Glass syringes (Fortuna) Sigma Aldrich Z314307 For odor delivery to the EAG prep
Humbug Quest Scientific http://www.quest-sci.com/ Noise reducer
2 mm Jack Holder, Narrow, 90 deg., With Wire A-M Systems 675748 Electrode holder
Magnetic bases Kanetec MB-FX x 2
MATLAB + Toolboxes Mathworks https://www.mathworks.com/products/matlab.html For delivering the pulses
Medical air Airgas or Praxair N/A For main airline
Microscope Nikkon SMZ-800N
Micromanipulators Three-Axis Coarse/Fine Compact Micromanipulator Narishige MHW-3 x 2
Microelectrode amplifier with headstage A-M Systems Model 1800
Mosquito rearing supplies Bioquip https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp
Needles BD 25G (305127) / 21G (305165)
Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-6A For odor delivery to the EAG prep
PTFE Tubing of different diameters Mc Master Carr N/A To connect solenoid valve, flowmeter, airline ect.
30V/5A DC Power Supply Dr. Meter PS-305DM
R version 3.5.1 R project https://www.r-project.org/ For data analyses
Relay for solenoid valve N/A Custom made
Silver wire 0.01” A-M Systems 782500
Solenoid valve (3-way) The Lee Company LHDA0533115H
WinEDR software Strathclyde Electrophysiology Software WinEDR V3.9.1 For EAG recording
Whatman paper Cole Parmer UX-06648-03 To load chemical in glass syringe / Pasteur pipette

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References

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मच्छर इलेक्ट्रोएंटेनोग्राफी के लिए एक चरण-दर-चरण गाइड
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Lahondère, C. A Step-by-Step… More

Lahondère, C. A Step-by-Step Guide to Mosquito Electroantennography. J. Vis. Exp. (169), e62042, doi:10.3791/62042 (2021).

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